Variasi DNA Kloroplas Shorea leprosula Miq. di Indonesia Menggunakan Penanda PCR RFLP

Gratis

0
4
64
2 years ago
Preview
Full text
VARIASI DNA KLOROPLAS Shorea leprosula Miq. DI INDONESIA MENGGUNAKAN PENANDA PCR-RFLP RURI SITI RESMISARI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Variasi DNA Kloroplas Shorea leprosula Miq. di Indonesia Menggunakan Penanda PCR-RFLP” adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka dibagian akhir tesis ini. Bogor, Agustus 2006 Ruri Siti Resmisari E051020291 ABSTRAK RURI SITI RESMISARI. Variasi DNA Kloroplas Shorea leprosula, Miq di Indonesia Menggunakan Penanda PCR-RFLP. Dibimbing oleh ISKANDAR ZULKARNAEN SIREGAR and ULFAH JUNIARTI SIREGAR Shorea leprosula, salah satu jenis dari famili Dipterocarpaceae yang mendominasi hutan hujan tropis di Asia Tenggara. Dalam tesis ini Dipterocarpaceae terdiri dari banyak jenis yang mempunyai nilai ekonomis dan ekologis yang penting. Penanda PCR-RFLP digunakan untuk mencari variasi cpDNA Shorea leprosula di Indonesia. Sampel daun dikumpulkan dari 13 populasi yang berasal dari pulau Jawa, Sumatera dan Kalimantan. Penelitian dimulai dengan melakukan uji polimorfisme DNA untuk mencari variasi cpDNA dengan menggunakan kombinasi 4 primer dan 10 enzim restriksi. Hasil pengujian menujukkan bahwa hanya kombinasi rbcL – Alu I yang menghasilkan pita yang polimorfik. Kombinasi ini menghasilkan dua haplotipe, yaitu haplotipe 1 dan haplotipe 2. Haplotipe 1 merupakan haplotipe dominan yang ditemukan seluruh populasi, sedangkan haplotipe 2 hanya ditemukan di Bukit Tigapuluh dan PT Asialog di Sumatera, PT. ITCIKU di Kalimantan. ABSTRACT RURI SITI RESMISARI. Chloroplast DNA Variation of Shorea leprosula, Miq in Indonesia assesed by PCR-RFLP Marker. Supervised by ISKANDAR ZULKARNAEN SIREGAR and ULFAH JUNIARTI SIREGAR Shorea leprosula is a member of Dipterocarpaceae that occurs predominately in tropical rain forests of Southeast Asia. Dipterocarps consists of many economical and ecologically important species. In this paper PCR-RFLP markers were used to observe cpDNA variation of Shorea leprosula in Indonesia. Leaf samples from individual plants were collected from 13 populations in Java, Sumatra and Kalimantan islands. cpDNA polymorphism was assessed using combination of 4 primers and 10 enzyme restrictions. The result showed that only rbcL-Alu I combination gave polymorphic bands. From these polymorphic bands, two haplotypes were identified, namely haplotype 1 as dominant haplotype in all populations and haplotype 2 , which was found only at Bukit Tigapuluh National Park and Concession Asialog in Sumatra, and Concession ITCIKU in Kalimantan. © Hak cipta milik Ruri Siti Resmisari, Iskandar Zulkarnaen Siregar, Ulfah Juniarti Siregar, tahun 2006 Hak cipta dilindungi Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotocopy, mikrofilm dan sebagain ya VARIASI DNA KLOROPLAS Shorea leprosula Miq. DI INDONESIA MENGGUNAKAN PENANDA PCR-RFLP RURI SITI RESMISARI Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains Pada Program Studi Ilmu Pengetahuan Kehutanan SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 Judul Tesis : Variasi DNA Kloroplas Shorea leprosula Miq. di Indonesia Menggunakan Penanda PCR-RFLP Nama : Ruri Siti REsmisari NIM : E051020291 Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Iskandar Z. Siregar, M.For.Sc Ketua Dr. Ir. Ulfah Juniarti Siregar, M.Agr Anggota Diketahui Ketua Program Studi Ilmu Pengetahuan Kehutanan Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dede Hermawan, M.Sc Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS Tanggal Ujian : 19 Juni 2006 Tanggal Lulus : PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kep ada Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Variasi DNA Kloroplas Shorea leprosula Miq. di Indonesia Menggunakan Penanda PCR-RFLP. Penelitian ini dilakukan mulai Maret 2005 hingga September 2005. Tesis ini di bagi dalam 5 bab, pada bab I diuraikan latar belakang, tujuan, serta ruang lingkup penelitian. Pada bab II disajikan tinjauan pustaka dengan tujuan untuk memberikan gambaran singkat tentang S. leprosula, keragaman genetik , DNA kloroplas dan penanda genetik. Bab III memberikan informasi mengenai metodologi yang digunakan dalam penelitian termasuk waktu, tempat, bahan dan alat yang digunakan serta metode analisis data yang digunakan. Hasil dan pembahasan disajikan pada Bab IV, pada bab ini dijelaskan tentang variasi cpDNA S. leprosula di Indonesia, kesimpulan dan saran disajikan pada Bab V. Penulis menyampaikan banyak terima kasih kepada Dr. Ir. Iskandar Z. Siregar, M.For.Sc dan Dr. Ir. Ulfah Juniarti Siregar, M.Agr sebagai komisi pembimbing yang telah banyak membantu dan mengarahkan penulis dalam penulisan tesis ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Departemen Silvikultur Institut Pertanian Bogor, Inst. of Forest Genetics and Forest Tree Breeding Faculty of Forest Sciences and Forest Ecology University of Goettingen Germany dan AUNP (Asean-Eu University Network Programe) yang telah memfasilitasi penulis dalam penelitian ini. Ungkapan terimakasih juga kami sampaikan kepada bapak, ibu, serta suami tercinta serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya, serta semua pihak yang telah ikut membantu penulis mulai dari persiapan hingga selesainya tesis ini. Semoga tesis ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2006 Ruri Siti Resmisari DAFTAR ISI DAFTAR ISI.............................................................................................................i DAFTAR GAMBAR ...............................................................................................ii DAFTAR TABEL...................................................................................................iii DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................................iv PENDAHULUAN ....................................................................................................1 Latar Belakang .....................................................................................................1 Permasalahan........................................................................................................4 Tujuan...................................................................................................................4 Hipotesis ...............................................................................................................4 Manfaat.................................................................................................................4 TINJAUAN PUSTAKA...........................................................................................5 Shorea leprosula Miq...........................................................................................5 Keragaman Genetik ..............................................................................................6 DNA Kloroplas ....................................................................................................7 PCR (Polymerase Chain Reaction)....................................................................10 PCR-RFLP .........................................................................................................14 (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms).14 METODE PENELITIAN .......................................................................................16 Tempat dan waktu penelitian .............................................................................16 Bahan dan Alat Penelitian..................................................................................16 Prosedur Penelitian.............................................................................................16 HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................................................25 Ekstraksi DNA ...................................................................................................25 Amplifikasi denga n PCR....................................................................................27 Uji Polimorfisme ................................................................................................28 Keragaman intra populasi...................................................................................33 Konservasi Genetik Shorea leprosula................................................................39 SIMPULAN DAN SARAN ...................................................................................41 Simpulan.............................................................................................................41 Saran...................................................................................................................41 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................42 i DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Rantai DNA ...........................................................................................9 Gambar 2. Letak cpDNA pada sel .........................................................................10 Gambar 3. Prinsip reaksi RCR ..............................................................................12 Gambar 4. Proses amplifikasi PCR........................................................................13 Gambar 5. Bagan alur penelitian di laboratorium ..................................................17 Gambar 6. Peta pengambilan contoh S. leprosula .................................................18 Gambar 7. Letak petB, psaA, trnLF dan rbcL pada peta plasmid cpDNA Nicotiana tabacum ...............................................................................21 Gambar 8. Hasil Ekstraksi DNA S . leprosula .......................................................25 Gambar 9. Elektrophoresisis cpDNA dengan berbagai pengenceran DNA dari S . leprosula ..........................................................................................26 Gambar 10. Elektroforegram hasil PCR cpDNA dengan berbagai primer : (a) petB, (b) psaA, (c) trnLF, (d) rbcL, M = marker bond ...................28 Gambar 11. Elektroforegram hasil uji polimorfisme : (a) psaA-pst I (monomorfik), (b) petB-Hinf I (monomorfik), (d) rbcL-Alu I (polimorfik), M= marker bond.............................................................30 Gambar 12. Elektroforegram hasil pemotongan cpDNA dengan menggunakan kombinasi perlakuan rbcL-Alu 1 ..........................................................32 Gambar 13. Penyebaran cpDNA S. leprosula di Indonesia berdasarkan penanda PCR-RFLP dengan menggunakan rbcL-Alu1 ......................................35 Gambar 14. Dendogram populasi S. leprosula di Indonesia dengan penanda RFLP ....................................................................................................38 ii DAFTAR TABEL Tabel 1. Lokasi pengambilam contoh S. leprosula ................................................18 Tabel 2. Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR..............................22 Tabel 3. Pengkondisian suhu dan waktu pada mesin PCR untuk primer petB, psaA, trnLFdan rbcL ...............................................................................22 Tabel 4. Jenis enzim restrksi yang digunakan utuk memotong DNA...................23 Tabel 5. Hasil uji polimorphisme ...........................................................................31 Tabel 6. Haplotipe yang teridentifikasi pada 65 individu S. leprosula berdasarkan PCR-RFLP terdapat dua haplotipe......................................33 Tabel 7. Frekuensi haplotipe dari 13 populasi .......................................................34 Tabel 8. Hasil perhitungan AMOVA berdasarkan 65 individu yang berasal dari 13 populasi.......................................................................................35 Tabel 9. Matrik signifikasi nilai (P value) pada level 0.05 ....................................36 Tabel 10. Jarak genetik S. leprosula berdasarkan analisis GSED..........................37 iii DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Tahapan ekstraksi DNA.....................................................................45 Lampiran 2. Elektroforegram S. leprosula di 13 populasi dengan rbcL-Alu I.......46 Lampiran 3. Transformasi data dari hasil analisis cpDNA Shorea leprosula.......51 iv PENDAHULUAN Latar Belakang Laju kerusakan hutan di Indonesia, berdasarkan data WALHI (Wahana Lingkungan Hidup Indonesia) tahun 2004, berada dalam situasi krisis dan kondisi yang sangat mengkhawatirkan. Pembalakan hutan, baik yang legal maupun ilegal, telah menyebabkan kerusakan hutan yang sudah tidak terkendali di hampir seluruh kawasan hutan Indonesia. Tingkat deforestasi saat ini telah mencapai 3,8 juta hektar per tahun (tahun 2004). Hal ini menunjukan bahwa Indonesia telah kehilangan hutannya seluas 7,2 hektar setiap menitnya. Berdasarkan data WWF (World Wildlife Fund) tahun 2002, pemerintah Indonesia mengakui bahwa kerusakan hutan Indonesia selama 50 tahun terakhir sekitar 40% dari tutupan hutannya (Harsono, 2004). Tuntutan kebutuhan bahan baku kayu cenderung terus meningkat terutama jenis kayu keras seperti Jati (Tectona grandis) dan Meranti (Shorea spp.) (Handadhari, 2002). Laju pembalakan yang dilakukan sekarang kurang diikuti oleh rehabilitasi lahan yang seimbang. Selain itu, kegiatan pembalakan hutan juga tidak hanya menyebabkan hilangnya keanekaragaman hayati, hancurnya habitathabitat satwa endemik, juga menyebabkan semakin merosotnya kualitas sumber daya alam Indonesia. Pengembangan skema pengalihan lapangan kerja penebangan hutan sebaiknya dialihkan ke dalam program rehabilitasi hutan dengan menggunakan dana rehabilitasi hutan. Hasil penelitian South-Central Kalimatan Production Forest Project (SCKFP) kerjasama Dephut-Uni Eropa di Kalimantan Selatan merekomendasikan rehabilitasi hutan yang dilakukan diantaranya dengan menanam Meranti (Shorea spp.). Shorea leprosula merupakan salah satu jenis Meranti Merah yang tumbuh di hutan hujan dataran rendah. Kayunya mudah dikerjakan dan tidak mudah mengkerut. Banyak digunakan sebagai bahan baku meubel, kayu lapis dan vinir. Termasuk ke dalam kelas awet dan kuat III – IV. Meranti jenis ini merupakan kayu unggulan yang memiliki nilai ekonomis tinggi, tetapi dengan eksploitasi yang terus menerus dan upaya pembudidayaan yang tidak seimbang, kayu jenis meranti ini akan semakin langka pada masa mendatang. Budidaya meranti dalam skala besar (pola HTI) mempunyai kendala dalam pengadaan bibitnya (Murjahid, 2003). Ditambahkan oleh Sudarmonowati et al. (2004), bahwa kurang majunya pembangunan sektor kehutanan di Indonesia, karena kurang ketersediaan bibit yang bermutu. Dua diantara faktor penting yang berpengaruh pada penyediaan bibit bermutu adalah sumber bibit yang unggul dan teknik propagasi yang mapan. Untuk mewujudkan faktor penting ini, diperlukan satu penelitian untuk mengetahui potensi genetik yang ada, mengingat aspek genetik meranti masih sedikit keterangannya. Penelusuran variasi genetik penting dilakukan, sehingga sebelum dilakukan suatu program konservasi dan perbaikan genetik dalam upaya penyediaan bibit bermutu, informasi yang dibutuhkan sudah tersedia. Berdasarkan pada fenomena tersebut, mutlak tersedianya kondisi genetik yang memadai sehingga tercipta suatu sistem konservasi genetik yang mapan. Analisis genetik merupakan cara yang dapat digunakan untuk menduga karakteristik genetik mengkonfirmasi sifat unggul yang telah diamati berdasarkan pengamatan morfologi di lapangan. Manfaat dari analisis genetik ini, antara lain selain dapat mendeteksi sifat unggul pada saat kecambah atau bahkan fase embrio untuk program pemuliaan bibit, juga menunjang program konservasi karena dapat mendeteksi tingkat kepunahan jenis di suatu lokasi jauh hari sebelum penurunan populasi tersebut jelas terlihat. Aplikasi nyata lainnya dari analisis genetik adalah hubungan anak, tetua, dan kerabatnya yang ditanam di lain tempat dapat diketahui, sehingga gambaran asal individu tersebut dapat diketahui. Teknik analisis genetik ini, juga lebih menghemat tenaga dan biaya karena dapat mencegah penanaman bibit yang tidak unggul. Manfaat lain dari analisis genetik ini adalah dapat mengetahui evolusi dari suatu jenis tanaman, mendeteksi keragaman atau keseragaman genetik suatu populasi, mendeteksi variasi somaklonal (terutama pada tananaman hasil kultur jaringan), sertifikasi tanaman tetua, identitas benih murni, dapat melakukan studi tentang genetik yang tahan hama dan atau penyakit, pemetaan genetik yang memberi informasi letak gen pada kromosom-kromosom yang mengatur sifat-sifat tertentu, sehingga dapat di introduksi atau di solasi untuk perbaikan mahluk hidup. 2 Teknik analisis yang banyak dikembangkan sekarang adala h berdasarkan markapenanda isozim dan markapenanda DNA. Pendugaan variasi genetik dengan teknik isozim merupakan teknik yang paling awal dikembangkan dan di aplikasikan pada tanaman. Masing- masingBerbagai teknik yang dikembangkann, masing- masing mempunyai kelemahan dan kelebihannya, hal ini disesuaikanjika dikaikan dengan tujuan dan biaya yang tersedia. MarkaPenanda DNA merupakan dasar untuk melihat adanya suatu perubahan sifat dengan mendeteksi perubahan urutan basa dan basa nukleotida DNA khas untuk setiap jenis protein atau enzim. MarkaPenanda DNA yang di maksud dapat berupaadalah markapenanda dominan dan ko-dominan. MarkaPenanda dominan adalah penanda berdasarkan ada atau tidaknya pita DNA yang muncul setelah elektroforesis, yang termasuk ke dalam markapenanda ini adalah RAPD (random amplified polymorphic DNAdna) dan RFLP (restriction fragment length polymorphism). Sedangkan markapenanda kodominan adalah penanda yang menghasilkan pita heterozigot dan homozigot. MarkaPenanda yang termasuk co-dominan adalah Mikrosatelit dan IsozimAFLP (amplified fragment length polymorphism). . Menurut Finkeldey (2003), sumber DNA yang diteliti dengan markapenanda genetik ini sebagian besar terdapat dalam nukleus (99,9%). Sisanya yang 0,1% terdapat dalam organel tertentu. Organel yang mengandung DNA ialah terdapat pada plastida yang terdiri dari mitokondria dan kloroplas. Material genetik yang di analisis dari plastida biasanya hanya berasal dari sifat satu tetuanya, kalau tidak dari tetua jantannya saja atau hanya dari betinanya, sedangkan dengan material genetik yang diambil dari inti, analisis genetiknya bisa menunjukan dua tetuanya. Pada DNA kloroplas material genetik diturunkan dari tetua betina, tetapi bisa mendeteksi tetua genetik jantannya. Melihat kondisi di atas dalam usaha melengkapi data mengenai keragaman genetik Meranti maka perlu dilakukan suatu penelitian yang dapat memberikan infomasi mengenai hal tersebut. Penulis memilih DNA kloroplas (cpDNA) sebagai bahan untuk analisis keragaman genetik Meranti dan teknik PCR–RFLP sebagai markapenanda genetik. Teknik ini sangat sederhana, cepat dan ekonomis, memiliki kisaran 50-3000 bp yang dapat dibedakan dan lebih sesuai bagi individu yang ditangani dalam jumlah banyak (Hillis et al, 1996). 3 Permasalahan Kerusakan hutan dipterokarpa yang diakibatkan oleh deforestrasi seperti pembalakan hutan secara liar, kebakaran dan lainnya dapat berdampak pada penurunan populasi S. leprosula. Penurunan populasi ini menyebabkan terjadi penurunan sumberdaya genetik dari S. leprosula, oleh karena itu perlu segera dilakukan program konservasi genetik jenis ini. Penelitian tentang keragaman genetik S. leprosula sangat diperlukan untuk memberikan landasan ilmiah dalam penggunaan stategi konservasi genetik. Tujuan Tujuan dari penelitian ini adalah untuk : 1. Mengetahui variasi keragaman cpDNA S. leprosula, yaitu jumlah haplotiype berdasarkan PCR-RLFP, yaitu titik potong (restriction site) pada DNA fragmen hasil PCR dengan menggunakan enzim restriksi 2. Mengetahui variasi cpDNA di dalam dan antar populasi S. leprosula Hipotesis Hipotesis yang diuji adalah bahwa cpDNA S. leprosula di Indonesia memiliki variasi yang rendah, dimana pola yang dijumpai dapat digunakan untuk melacak atau membedakan populasi antar pulau.karena diwariskan secara maternal. Manfaat 1. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tetang variasi genetik S. leprosula yang ada di Indonesia untuk kepentingan suatu program konservasi genetik yang berkesinambungan, dan pada akhirnya dapat digunakan untuk mendukungsuatu program pemuliaan dari jenis ini 2. Variasi cpDNA S. leprosula dapat digunakan untuk menentukan asal usul, serta aliran gen berupa migrasi benih dari jenis ini 4 TINJAUAN PUSTAKA Shorea leprosula Miq. Aspek Botanis Shorea leprosula termasuk ke dalam famili Dipterocarpaceae, Kelas Dicotyledone, dan sub-divisi angiospermae. Pohon jenis ini mempunyai tinggi total mencapai 60 m, dan tinggi bebas cabang 45 m, diameter batang umumnya mencapai 2 m dengan banir mencapai 5 m (Heyne, 1987). Samingan (1973) menambahkan, pohon jenis ini memiliki batang yang lurus, besar, bersih dan berbanir. Kulitnya mempunyai garis-garis halus dan lurus. Sering terlihat ada damar yang keluar dari kulitnya, warnanya coklat sampai kuning. Bunganya berwarna merah, kuning atau agak putih. Buah keras dengan sayap berjumlah lima yang terdiri dari 3 sayap panjang dan 2 sayap pendek, serta bentuk buahnya berbentuk bulat. Pada umumnya meranti menduduki strata tajuk lapisan paling atas (strata A) atau lapisan ke-2 (strata B). Pada umumnya meranti termasuk jenis semitoleran. Berdasarkan keadaan dan sifat kayunya S. leprosula termasuk ke dalam kelompok meranti merah. Jenis meranti merah terdiri dari pohon besar dan berbanir besar, batang merah atau bersisik, pada umumnya berdamar, kulit luar dan kulit dalam tebal, berurat- urat, warnanya merah atau kemerah- merahan, gubalnya kuning pucat, serta isi kayu berwarna merah (Al Rasyid, et al., 1991). Penyebaran dan Tempat Tumbuh Shorea leprosula secara alami menyebar mulai dari Semenanjung Thailand dan Malaysia, Sumatera dan Kalimantan Utara, biasanya ditemukan di hutan dipterokarpa di bawah 700 m menempati ruang terbuka di hutan yang mengalami gangguan. Tumbuh pada berbagai jenis tanah tetapi tidak toleran terhadap genangan. Curah hujan 1500-3500 mm pertahun, dan musim kemarau pendek perlu untuk pertumbuhan dan regenerasi. Jarang ditemukan di punggung bukit. S. leprosula merupakan meranti merah yang pertumbuhannya paling cepat jika dibandingkan dengan meranti jenis yang lain, namun kondisi ini hanya sampai umur 20 tahun, selanjutnya akan terkejar oleh meranti lain. Jenis ini mengalami penurunan populasi yang disebabkan oleh adanya penebangan liar, dan menurut daftar IUCN S. leprosula tergolong langka. 5 Pembungaan Pembungaan S. leprosula terjadi setiap 3 hingga 5 tahun sekali. Pada saat mengalami pembungaan, hampir semua pohon berbunga lebat dan serempak, bunga tersebut akan merekah pada malam hari. Jika terjadi kekeringan selama periode ini, gugur buah tertunda dan buah tidak berkembang sempurna. Pada sebaran alami, pengumpulan benih dilakukan pada bula Maret-Juli, terutama pada bulan setelah musim kemarau. Pemanenan Buah Untuk mengurangi kerusakan oleh serangga, sebaiknya buah dipetik di atas pohon. Pengumpulan hendaknya dilakukan ketika periode utama gugur buah, sebab sebelum ini biasanya belum masak dan terserang serangga. Kegunaan Kayunya ringan, merupakan kayu berharga dan sangat baik untuk (joinery), (meubel), panel, lantai, langit- langit dan juga untuk kayu lapis. Menghasilkan resin yang dikenal dengan damar daging, yang dapat digunakan obat. Kulitnya digunakan untuk produksi tannin. Keragaman Genetik Keragaman genetik suatu spesies adalah hasil dari perkembangbiakan secara seksual. Pada proses perkembangbiakan seksual, terjadi peristiwa meiosis yang mereduksi jumlah kromosom diploid (2n) dalam sel tetua menjadi haploid (n) dalam gamet, mengikuti hukum segregasi bebas seperti diungkapkan oleh Mendel (Hukum Mendel 1). Selanjutnya diperjelas lagi pada Hukum Mendel 2 meiosis kromosom homolog juga akan mengalami pindah silang dan kadangkadang terjadi perubahan susunan genetik karena mutasi yang akan menambah keturunan (Crowder, 1986). Selain perkawinan dan mutasi, ditambahkan oleh Finkeldey (2003) bahwa migrasi, aliran ge netik, penyimpangan genetik, dan proses seleksi. Keragaman genetik adalah suatu besaran yang mengukur variasi 6 fenotipe yang disebabkan oleh faktor- faktor genetik. Fenotipe salah satu tanaman akan berbeda dengan tanaman yang lainnya dalam satu atau beberapa hal. Keragaman genetik merupakan landasan bagi pemulia untuk memulai suatu kegiatan perbaikan tanaman. Besarnya keragaman genetik dapat menjadi dasar untuk menduga keberhasilan perbaikan genetik di dalam program pemuliaan (Comstock dan Moll, 1963 dalam Rachmadi 1999). Allard (1961) mengungkapkan bahwa, keragaman genetik yang luas merupakan syarat berlangsungnya proses seleksi yang efektif karena memberikan keleluasaan dalam proses pemilihan suatu genotipe. Selain itu populasi dengan keragaman genetik yang lebih luas akan memberikan peluang yang lebih besar diperolehnya karakterkarakter yang diinginkan (Simonds, 1979). Soerjanegara dan Djamhuri (1979) mempertegas bahwa dalam satu jenis pohon dapat dijumpai keragaman geografis (antar provenan), keragaman lokal (antar tempat tumbuh), dan keragaman dalam pohon serta keragaman antar pohon. Ada dua sebab yang menimbulkan keragaman, yaitu perbedaan lingkungan dan perbedaaan susunan genetik. Keragaman lingkungan biasanya disebabkan oleh keadaan perbedaan tempat tumbuh, sifat tanah, atau jarak tanam. Namun adapula keragaman yang tidak dapat diterangkan dengan perbedaan tempat tumbuh, misalnya perbedaan bentuk batang, tebang batang, tebal cabang, dan berat jenis kayu dari pohon-pohon dalam suatu tegakan. Dalam hal ini keragaman dipengaruhi oleh perbedaaan genetik yang diturunkan tetua kepada keturunannya (keragaman genetik). Adanya keragaman dalam suatu jenis perlu diketahui lebih dahulu sebelum memulai dengan pemuliaan pohon, karenakeragaman genetik merupakan syarat mutlak dalam pemuliaan, yaitu untuk memungkinkan seleksi dan untuk mencegah dihasilkannya tanman yang tidak bermutu. DNA Kloroplas Yatim (2003) mengungkapkan bahwa unit fungsional materi genetik ialah gen, berasal dari kata genos, artinya asal- usul. Sedangkan unit struktural atau unit kimiawi gen ialah DNA (deoxyribo-nucleic acid, asam deoksiribo- nukleat). Gen atau DNA itu berderet secara linier pada kromatin atau kromosom. Satu benang kromatin dibina atas nukleoprotein, yaitu gabungan asam nukleat (DNA) dan protein. DNA-nya, membentuk super- lilitan sepanjang kromatin, sedangkan 7 protein bertindak sebagai tempat melilit, protein yang jadi tempat melilit DNA disebut histon. Protein lain dalam kromatin ada yang bertindak sebagai penyekat, penyalut, unsur regulator, atau sebagai enzim bagi aktivitas DNA, mereka disebut protein nonhiston. Gen menumbuhkan dan memelihara aktivitas seharian berbagai karakter dalam tubuh. Jumlah karakter dalam satu individu ada ribuan macam. Contoh karakter: Batang (tebal, gepeng/pipih), daun (bulat, lonjong, jarum), buah (bulat/kriput). Di antara gen yang banyak itu, ada karakter yang pengatur utamanya satu gen, disebut karakter monogenik. Ada pula karakter yang diatur oleh banyak gen, disebut karakter poligenik. Satu gen dibina atas satu molekul DNA. Antara gen bersebelahan dalam satu kromosom ada urutan DNA seling (intervening sequences), tidak berperan dalam menumbuhkan suatu karakter. DNA semacam bahan organik yang memiliki BM (berat molekul) yang terbesar dalam sel, yaitu dalam ukuran juta. Monomer DNA ialah nukleotida. Satu gen dibina atas satu molekul DNA, dan satu molekul DNA dibina atas ribuan sampai puluhan ribu nukleotida. Satu nukleotida terdiri dari tiga gugus senyawa: 1) gula deoksiribosa; 2) fosfat; 3) basa-N. Gula yang membina DNA tergolong gula pentosa, yaitu gula yang atom karbonnya lima. Glukosa yang membina sebagian besar gula dalam tubuh kita dan yang menjadi sumber utama energi, tergolong gula heksosa, artinya gula yang atom karbonnya enam, gugus fosfat ialah -PO4-3. Basa-N terdiri dari dua kelompok dan tiap kelompok dibina atas dua macam basa: 1) purin; adenin (A) dan guanim (G); 2) pirimidin: timin (T) dan citosin (C). Satu molekul DNA terdiri untaian linear nukleotida, sehingga disebut juga satu utas. Agar sifat kimianya stabil maka DNA itu bersusun berpasangan, disebut utas double. Kedua utas DNA yang berpasangan (double) itu berpilin sejajar (helix) sesama, tapi arahnya berlawanan (anti-paralel). Maksudnya bagian kepala satu utas berpasangan dengan bagian ekor utas pasangan. Tegasnya DNA dalam inti sel disebut dalam susunan double helix antiparalel. Kedua utas diikat oleh ikatan hidrogen antar basa masing- masing. Perikatan antara basa itu tertentu dan tetap, yaitu antara A dari satu utas berikatan dengan T utas pasangan, dan antara G dari satu utas berikatan dengan C utas pasangan, disingkat A-T, G-C. Dengan demikian urutan nukleotida yang membina 8 sepasang utas DNA yang double helix membentuk semacam tangga spiral. Induk tangganya yang sejajar tapi berpilin ialah untaian G-P. Jadi B dari satu utas berikatan dengan B dari utas pasangan B-B. Urutan nukleotida yang membina satu molekul DNA membentuk semacam tangga spiral. Induk tangganya ialah ikatan S-P dari kedua utas, sedangkan anak tangganya ialah ikatan B-B, tangga itu berbentuk spiral, maka pegangannya kiri-kanan ialah untaian S-P, sedangkan anak tangga yang diinjak ialah pasangan B-B. Suatu gen diberi simbol dalam buku atau majalah menurut urutan pasangan basa nukleotiodanya: A-T, G-C. Alasannya ia lah: 1) P (fosfat) semua nukleotida tetap; 2) S (sugar, gula) semua nukleotida tetap, yaitu deoksiribosa; 3) variasi antara nukleotida hanya pada basa yang empat macam; 4) mutasi yang terjadi pada suatu gen sehingga menyebabkan kelainan atau penyakit, sela lu terjadi pada basa nukleotida saja. Susunan DNA disajikan seperti pada Gambar 1. Gambar 1. Rantai DNA (Hattemer et al., 1993 dalam Finkeldey, 2003) Finkeldey (2003) menambahkan, sampai saat ini masih diyakini bahwa genetik merupakan hal yang mampu mengenali dan memberikan informasi suatu organisme, hal ini di karenakan dalam gen terdapat suatu material yang berbeda 9 dengan material yang la in yaitu DNA (deoxyribonucleic acid). Materi genetik gen ialah DNA-nya. Asam ini disebut juga asam nukleat, berasal dari kata asam yang terdapat dalam nukleus, karena sebagian besar (99,9 persen) asam ini terdapat dalam inti, sisanya yang 0,1 persen terdapat dalam organel tertentu. Organel yang mengandung DNA ialah plastida yang terdiri dari mitokondria dan kloroplas. Material genetik yang di analisis dari plastida biasanya hanya berasal dari sifat satu tetuanya, kalau tidak dari tetua jantannya saja atau hanya dari betinanya saja, lain halnya dengan material genetik yang diambil dari inti analisis genetiknya, bias menunjukan dua tetuanya. Pada DNA kloroplas material genetik diturunkan dari induk betina nya saja. Sumber :www.micro.magnet.fsu.edu Gambar 2. Letak cpDNA pada sel PCR (Polymerase Chain Reaction) Polimerase chain reaction (PCR) merupakan teknik yang mulai berkembang pesat sekitar tahun 1987. Pada dasarnya PCR mampu mengenali dan memperbanyak (amplifikasi) segmen DNA sasaran walupun dalam konsentrasi yang sangat rendah menggunakan satu pasang primer 10 oligonukleotida. Reaksi amplifikasi sangat tergantung dari keberadaan enzim polimerase sebagai katalisator, terutama yang tahan pana s. Enzim yang paling terkenal dan banyak digunakan adalah polimerase DNA Taq yang diisolasi dari bakteri yang tahan panas Thermus aquaticus. Bahan utama lain yang diperlukan adalah deoxynukleotide triphospates (dNTPa). PCR adalah suatu metode untuk menggandakan atau mengamplifikasi DNA yang diisolasi pada sebuah tabung reaksi kecil dengan melalui replikasi berulang (Gambar 3). Titik awal dari reaksi (primers) adalah oligonukleotida, yakni potongan kecil DNA yang dihasilkan secara buatan (biasanya terdiri antara 10-25 nukleotida). Sekuensi basa dari primer dapat dipilih secara bebas. DNA teramplifikasi dalam reaksi campuran mengunakan enzim thermostabil (enzim tahan panas) yakni DNA polimerase dari titik awal seperti ditunjukkan oleh sekuensi pada primer. Reaksi dikendalikan oleh perubahan suhu pada thermocycler. PCR memungkinkan penggandaan potongan pendek. DNA dari semua organisme (lebih dari 2000 hingga 3000bps). Dari satu tabung reaksi tunggal dapat dihasilkan jutaan tiruan potongan DNA identik seperti pada Gambar 3 (Newbury dan Fordllyoyd, 1993 dalam Finkeldey, 2003). PCR merupakan salah satu tahapan proses dalam penentuan keanekaragaman genetik, PCR ini berfungsi untuk mendapatkan sekuensisekuensi DNA dari genom DNA. Akan tetapi menurut Gupta et al. (2002) penanda genetik ini tidak hanya PCR, penandaan lain yang biasa digunakan adalah; (i) hibridisasi berdasarkan penanda, (ii) penanda molekuler berdasarkan PCR yang dilanjutkan dengan hibridisasi, (iii) sekuensing dan chip DNA berdasarkan penanda Seiring dengan kemajuan dalam teknologi DNA, analisis PCR-RFLP dapat dilakukan tanpa menggunakan pelacak DNA dan proses hibridisasi DNA. Penemuan program PCR (polymerase chain reaction) dapat membantu mendapatkan sekuensi-sekuensi DNA tertentu dari genom DNA, kemudian dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi, atau dengan kata lain analisis PCR-RFLP dapat dilakukan terhadap sekuensi-sekuensi DNA spesifik yang telah diisolasi dengan menggunakan primer spesifik dalam program PCR 11 DNA Primer Nukleotida Taq Polymerase Tabung reaksi yang berisi larutan penyangga Proses dengan thermocycler Untuk genotif 1 Untuk genotif 2 Elektroforesis pada agarose gel Gambar 3. Prinsip reaksi RCR (Rabouam et al, 1999 dalam finkeldey, 2005) . Dalam analisis PCR, digunakan primer spesifik yang mampu mengklon sekuensi DNA tertentu yang dapat digunakan sebagai pengganti pelacak DNA dalam analisis PCR-RFLP. Sekuensi DNA yang sudah diisolasi dipotong dengan berbagai enzim restriksi, guna melihat keragaman melalui keberadaan recognition site yang memberikan ukuran potongan DNA yang berbeda-beda. Potonga n DNA dengan ukuran berbeda-beda ini merupakan gambaran adanya 12 keragaman genetik berdasarkan sekuen DNA yang diisolasi pada berbagai jenis tanaman yang dianalisis. Pada saat media contoh dipanaskan hingga suhu 94o C, atau pH media dibuat alkalis, maka DNA tersebut menjadi asam, sehingga pHnya dibawah 7, jika ditambahkan basa (NaoH) maka media itu menjadi alkalis dan DNA mengalami denaturasi. Pada saat suhu diturunkan hingga ke 50 o C atau pH diturunkan menjadi asam, maka kedua utas DNA kembali berpasangan. Peristiwa ini disebut renaturasi (re = kembali). Jika dalam media terdapat DNA lain atau RNA, dan urutan basa mereka komplemen, maka akan terjadi perpasangan atau hibrid. Adapun proses amplifikasi PCR adalah seperti pada Gambar 4. PCR: polymerase chain reaction Step 1 : denaturation Step 2 : annealing Step 3 : extension Gambar 4. Proses amplifikasi PCR (www.users.ugent.be/~avierst/principle/seq.htm) (Gailing et al., 2003 ) 13 PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms) PCR-RFLP adalah penanda dominan yang merestriksi DNA secara spesifik pada lokasi tertentu yang dikenalnya dengan enzim restriksi endonuklease (Park dan Moran, 1995). Enzim Restriksi ini akan mengenali sekuen tertentu dan memutus DNA jika bertemu dengan situs yang dikenalnya dan menghasilkan sejumlah fragmen DNA. Polimorfisme PCR-RFLP muncul karena adanya basa yang mengalami substitusi, penambahan, pengurangan dan perpindahan (translokasi) pada genom DNA. Perubahan tersebut menyebabkan perbedaan ukuran dari fragmen restriksi yang dicerna oleh enzim restriksi tertentu. Fragmen yang dihasilkan oleh enzim restriksi dapat dipilah-pilah dengan elektroforesis. DNA genom yang dipotong oleh enzim restriksi, akan menghasilkan beratus-ratus atau beribu-ribu potongan DNA. Untuk mempelajari pola pemotongan DNA yang berasal dari lokus tertentu dalam kromosom, maka ratusan atau ribuan potongan tersebut harus : (a) Dipisahkan berdasarkan ukuran dengan elektroforesis gel agarose (b) Potongan DNA tertentu yang diinginkan harus dapat dibedakan dari populasi potongan DNA dengan ukuran yang sama dengan melakukan hibridisasi menggunakan pelacak DNA (DNA probe). Pelaksanaan analisis PCR-RFLP memerlukan penggunaan bahan radioaktif atau bahan non-radioaktif tertentu untuk memberi label pada pelacak DNA. Bahan ini harganya masih relatif mahal. Selain itu, bahan radioaktif juga merupakan polutan yang berbahaya bagi lingkungan. Sebaliknya, bahan nonradioaktif walaupun tidak berbahaya, tetapi kemampua n dan sensitifitasnya untuk mendeteksi sekuensi DNA kopi tunggal masih belum efisien. Pemberian label pada pelacak DNA dilakukan dengan teknik nick translation atau dengan teknik random priming DNA labelling. Dengan teknik nick translation, salah satu untaian dari DNA yang akan dilabel diputus diberbagai titik dengan menggunakan enzim DNaseI. Untaian DNA yang baru, akan disintesis kembali oleh enzim polimerase I dari titik tempat terjadinya pemutusan tersebut. Ketika 14 proses sintesis DNA yang baru terjadi, nukleotida yang telah diberi label ikut bergabung dalam untaian DNA baru yang disintesis. Pelacak DNA yang dipakai dalam penelitian PCR-RFLP dapat berupa DNA yang berasal dari sekerabat dengan spesies tanaman yang diteliti (pelacak homolog), atau berasal dari tanaman yang tidak sekerabat (pelacak heterolog). pelacak heterolog biasanya lebih sulit dalam pemakaiannya karena biasanya ada homologi sekuensi pelacak DNA dengan DNA tanaman relatif kecil. Akibatnya, penggunaan pelacak DNA heterolog akan memberikan komplementasi yang kurang stabil antara DNA tanaman dan pelacak DNA. Pelacak heterologous dari DNA yang bersifat sangat konservatif (selalu sama untuk berbagai spesies tanaman) misalnya bagian gen small sub unit dari RUBISCO (Ribulosa Bifosfat Karboksilasi), gen major klorofil a/b binding protein atau gen RNA ribosomal. 15 METODE PENELITIAN Tempat dan waktu penelitian Pengambilan contoh daun dilakukan pada populasi S. leprosula di 13 lokasi di Indonesia (Tabel 1). Penelitian elektroforesis dan analisis DNA dilakukan di Laboratorium Silvikultur Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-Juni 2005 untuk pengambilan data primer selanjutnya bulan Juli-September 2005 untuk studi pustaka dan analisis data. Bahan dan Alat Penelitian Bahan yang digunakan untuk penelitian ini berupa daun S. leprosula yang telah kering. Selain itu juga digunakan silika gel, nitrogen cair, bahan-bahan kimia untuk membuat buffer untuk proses ekstraksi DNA, PCR, dan pemotongan DNA, agaros, serta ethidium bromida (EtBr). Alat-alat yang digunakan untuk pengambilan contoh di lapangan meliputi: tally sheet, label, alat tulis, plastik klip, gunting. Alat-alat yang digunakan untuk elektroforesis dan analisis DNA di laboratorium meliputi: mortar dan pestel, sarung tangan, pipet, pipet mikro, sentrifugasi, vortex, spatula, gelas piala, gelas ukur, koleksi tabung, cetakan gel, bak elektroforesis, tray, microwave, power supply, pH meter, gelas piala, gelas ukur, timbangan analitik, pengaduk magnet, lemari pendingin, water bath, mesin PCR, ultraviolet transiluminator, kamera digital. Prosedur Penelitian Optimasi metode Tahapan optimasi metode dilakukan untuk menjamin munculnya pita dengan resolusi yang tinggi. Tahapan optimasi metode ini meliputi 3 proses utama, yaitu ekstraksi DNA, amplifikasi PCR dan pemotongan cpDNA. Optimasi ekstraksi DNA dari daun dimulai dari penentuan ukuran daun yang diekstrak, komposisi bahan ekstraksi, suhu dan kepekatan gel agaros pada proses elektroforesis, termasuk pengenceran DNA hasil ekstraksi. Optimasi pada proses amplifikasi PCR adalah mencari komposisi bahan yang digunakan untuk PCR 16 cpDNA serta primer yang akan digunakan, pengaturan suhu pada thermocycler sesuai dengan primer yang digunakan, suhu dan kepekatan gel agaros pada proses elektroforesis. Optimasi pada proses pemotongan DNA yang dilakukan adalah mencari komposisi bahan yang digunakan untuk pemotongan DNA serta mencari jenis enzim restriksi yang akan digunakan, kondisi arus, tegangan dan persentase agaros pada elektroforesis. Skema prosedur penelitian menggunakann penanda PCR-RFLP dapat dilihat pada Gambar 5. Ekstraksi DNA Ya Tidak PCR Ya Tidak RFLP Gambar 5. Bagan alur penelitian di laboratorium Pengambilan Contoh Pengambilan contoh dilakukan di 13 populasi S. leprosula (Tabel 1), dimana pada masing- masing populasi diambil 5 contoh (Gambar 6). Pengambilan contoh daun dilakukan dengan mengambil daun ke 2 atau ke 3 dari pucuk dengan jumlah sekitar 5 daun yang berada di lokasi dan dimasukkan ke dalam plastik klip, kemudian dalam plastik tersebut dimasukkan silika gel dengan perbandingan berat daun contoh dan silika gel sebesar 1 : 5. Silika gel yang sudah berubah warna diganti dengan silika gel yang baru sampai contoh daun menjadi kering. Pada plastik klip diberi label yang meliputi: nomor pohon diameter, tinggi pohon dan 17 lokasi. Selain itu juga dilakukan pengambilan daun yang digunakan untuk herbarium untuk keperluan identifikasi jenis. Tabel 1. Lokasi pengambilam contoh S. leprosula Perkiraan Lokasi No Lokasi Provinsi Batch Garis Bujur Garis Lintang 1 Haurbentes, Bogor Jawa Barat 106041’ - 107042’ BT 6054’-7054’ LU 2 Tering Kalimantan Timur 115022’ – 116038’ BT 000 – 00010’ LS 3 Asialog, Jambi Sumatra 103015’ – 103033’ BT 2002’ – 2022’ LU 4 Pasir Mayang, Jambi Sumatra 101019’ – 103020’ BT 0008’ – 0309’ LU 5 6 7 TNBT, Riau Nanjak Makmur, Jambi Sari Bumi Kusuma Sumatra Sumatra Kalimantan Selatan 102013’ – 103014’ BT 101040’ BT 111018’ - 114042’ BT 0105’ - 0206’ LU 10022’ LU 01059’ - 00036’ LU 8 9 PT ITCI Kartika Utama Kebun Percobaan Darmaga, Bogor Bukit Bangkirai, Balikpapan Sumalindo, Samarinda Carita I Carita II Kalimantan Timur Jawa Barat 116017’ - 11706’ BT 106050’ – 1070 50’ BT 00020’ - 01018’ LU 6036’ – 7040’ LU Kalimantan Timur Kalimantan Timur Banten Banten 117032’ – 118035’ BT 115018’ – 116036’ BT 105°15' – 106011’ BT 105°15' – 106011’ BT 00014’ – 01015’ LU 00055’ – 00056’ LS 6°21' - 7°10' LU 6°21' - 7°10' LU 10 11 12 13 11 5 4 6 4 2 7 3 8 10 1 12 9 Gambar 6. Peta pengambilan contoh S. leprosula 18 Ekstraksi DNA Metode yang digunakan untuk ekstraksi DNA mengikuti prosedur yang dikeluarkan oleh QIAGEN dengan menggunakan DNeasy Plant Mini Kit untuk isolasi jaringan tanaman. Ekstraksi DNA ini meliputi tiga tahapan, yaitu tahapan prespitasi, pencucian dan elusi (Lampiran 1). Tahap pertama yaitu tahapan prespitasi dimulai dengan menggerus contoh daun meranti berukuran 2 x 1 cm yang ditambahkan nitrogen cair dengan menggunakan mortar dan pestel untuk mendapatkan serbuk. Serbuk kemudian dipindahkan ke dalam tabung yang berkuran 2 ml. Tambahkan 400 µl buffer AP1 dan 4 µl RNAse A (100 mg/ml) yang berfungsi untuk menghilangkan RNA dalam Larutan tersebut kemudian di kocok dengan menggunakan vortex. larutan. Larutan diinkubasi di dalam water bath selama 10 menit dengan suhu 65o C, kemudian dikocok 2 - 3 kali selama inkubasi dengan membalikkan tabung. Ditambahkan 130 µl buffer AP2, vortex, kemudian diinkubasikan ke dalam es selama 5 menit, kemudian di sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan penuh. dimasukkan cairan ke dalam QIAShedder spin column yang terdapat pada koleksi tabung 2 ml dan dilakukan sentrifugasi selama 2 menit denga n kecepatan maksimum. Larutan yang mengalir lewat fraksi dari dipindahkan ke tabung yang baru (tanpa penambahan). 1,5 volume buffer AP3/E (buffer sebelumnya ditambahkan dengan etanol) pada larutan bersih ditambahkan dan dicampur dengan pemipetan. dimasukkan 650 µl larutan ke DNeasy mini spin column yang di letakkan di koleksi tabung 2 ml, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm kemudian cairan yang melewati fraksi dibuang. Tahapan kedua yaitu tahapan pencucian (washing) dimulai dengan menempatkan DNeasy column pada tabung koleksi 2 ml yang baru , kemudian ditambahkan 500 µl buffer AW pada DNeasy column dan sentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 8000 rpm. Cairan yang melewati fraksi dibuang, kegiatan ini dilakukan dua kali, kemudian disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan maksimal. 19 Tahapan ketiga yaitu tahapan elution dilakukan dengan menyimpan DNeasy column pada 1,5 atau 2 ml tabung sentrifugasi dan pipet 100 µl buffer AE hangat (65o C) ke dalam membran Dneasy dan dilakukan inkubasikan selama 5 menit pada suhu ruangan, kemudian disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm, tahapan ini dilakukan dua kali, sehingga akan dihasilkan DNA hasil ekstraksi sebanyak 200 µl. DNA hasil ekstraksi kemudian dilakukan uji kualitas dengan menggunakan teknik elektroforesis agaros 1%. Gel ini dibuat dengan melarutkan agaros sebanyak 2,5 µl ke dalam 250 µl larutan TAE (tris acetate with EDTA). Kemudian larutan dipanaskan di dalam microwave sampai mendidih. Larutan gel dibiarkan sampai hangat (± 50o C) kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel dengan ketebalan 5 mm. Cetakan gel tersebut telah dipasang sisir/comb yang berfungsi untuk membuat cetakan sumur gel/well elektroforesis. Gel didinginkan sampai membeku. Kemudian sisir/comb dicabut dan gel beserta cetakannya dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer elektroforesis yaitu buffer TAE sebanyak 2300 ml. DNA hasil ekstraksi sebanyak 15 µl ditambah 3,75 µl bahan pewarna (blue juice) dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis. Setelah itu bak elektroforesis ditutup dan dialiri listrik dengan tegangan 25 volt selama 3 jam. Gel yang sudah dielektroforesis dilakukan pewarnaan dengan merendamkan gel di dalam larutan ethidium bromida (EtBr) 25 µl dan aquadest 500 ml selama 1 jam. Kemudian dideteksi dengan mengunakan ultraviolet transiluminator. Amplifikasi PCR DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR MJ Reseach PTC-100 Peltier Thermal cycler. Primer yang digunakan adalah primer universal (hampir terdapat di semua tumbuhan) yaitu petB, psaA, psbA, rbcL dan trnLF (Gambar 6) 20 Gambar 7. Letak petB, psaA, trnLF dan rbcL pada peta plasmid cpDNA Nicotiana tabacum Urutan nukleotida dari masing- masing primer adalah sebagai berikut : petB : 5’-TGGGGAACTACTCCTTTGAT-3’ 5’-CCCGAAATACCTTGCTTACG-3’ psaA : 5’-AAGAATGCCCATGTTGTGGC-3’ 5’-TTCGTTCGCCGGAACCAGAA-3’ rbcL : 5’-TGTCACCAAAAACAGAGACT-3’ 5’-TTCCATACTTCACAAGCAGC-3’ trnLF : 5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’ 5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’ 21 Primer yang akan digunakan sebelumnya dilakukan pengenceran terlebih dahulu. Pengenceran dilakukan dengan cara mengambil primer pekat dengan konsentrasi 50 µM sebanyak 20 µl kemudian ditambahkan H2 O sebanyak 180 µl. Konsentrasi akhir primer akan menjadi 5 µM. Komposisi bahan-bahan yang digunakan dalam proses amplifikasi ini tersaji pada tabel 2. Tabel 2. Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR Komponen Volume 2,0 µl 1,8 µl 1,8 µl 1,9 µl 7,5 µl Template DNA Forward primer (5 pM) Reverse primer (5 pM) Destilled water HotStar Taq® Master Mix Kit (Qiagen, Hilden) Lautan PCR untuk setiap contoh merupakan campuran dari dari berbagai komponen seperti pada Tabel 2. kemudian ditambahkan 1,9 µl destilled water hingga volume larutan mencapai 15 µl. Larutan kemudian diaduk dengan menggunakan vortex kemudian disentrifugasi. Larutan tersebut kemudian di masukan kedalam mesin PCR yang sudah di program dengan pengkondisian suhu dan waktu. Seperti pada Tabel 3. Tabel 3. Pengkondisian suhu dan waktu pada mesin PCR untuk primer petB, psaA, trnLFdan rbcL Tahapan Suhu Waktu Jumlah (o C) (menit) siklus Pemanasan Awal 95 15 1 - Denaturasi 94 1 35 - Annealing 50 & 56 1 - Extension 72 2 Pemanasan akhir 72 10 1 Penyimpanan 8 Selamanya 1 Hasil PCR kemudian di uji dengan menggunakan gel agaros dengan kepekatan 2%, yang dibuat dengan melarutkan 0,4 mg agaros dalam 40 ml TAE. Larutan hasil PCR sebanyak 3 µl dicampurkan dengan larutan pewarna (brom phenol) sebanyak 3 µl dimasukkan ke dalam sumur gel. Larutan tersebut dielektroforesis selama 30 menit. Proses berikutnya yaitu pengecekan DNA. DNA hasil PCR harus lebih banyak dari hasil ekstraksi. Apabila DNA hasil PCR masih 22 sedikit atau sama dengan hasil ekstraksi maka harus dilakukan PCR ulang dengan komposisi DNA yang lebih encer. Pengenceran ini dilakukan karena sifat DNA dari Meranti memiliki kadar fenol yang tinggi. Kadar fenol yang tinggi ini dapat menghambat daya kerja primer. Analisis PCR - RFLP Analisis polimorfik dilakukan dengan teknik PCR-RFLP untuk melihat jumlah basa antar fragmen. DNA kloroplas hasil PCR dipotong dengan menggunakan enzim restriksi untuk analisis keragaman genetik. Dibawah ini adalah jenis-jenis enzim restriksi yang digunakan dalam penelitian ini. Tabel 4. Jenis enzim restrksi yang digunakan utuk memotong DNA No Nama Sumber 1 Alu I Anthrobacter loteus 2 Taq I Thermus aquticus 3 Hinf I Haemophilus influenzae 4 Rsa I Rhodopseudomonas sphaeroides 5 Cfo I Clostridium formicoaceticum 6 Msp I Moraxella sp. 7 Dra I Deinococcus radiopilus 8 BamH I Bacillus amyloliquefaciens H. 9 Hind III Haemophilus influenzae 10 Pst I Providensia stuartii Situs pemotongan AG↓CT TC↑GA T↓CGA AGC↑T G↓ANTC CTNA↑G GT↓AC CA↑TG GCG↓C C↑GCG C↓CGG GGC↑C TTT↓AAA AAA↑TTT C↓GATC CTAG↑G A↓AGCT TCGA↑G TGCA↓G G↑ACGT Temperatur Inkubasi (oC) 37 65 37 37 37 37 37 37 37 37 Larutan yang digunakan untuk p

Dokumen baru

Download (64 Halaman)
Gratis

Dokumen yang terkait

Identifikasi Kemiripan Genetik Beberapa Genotipe Saccharum spp.Sumatera Utara denganVarietas Tebu Toleran Kekeringan (PS 864 dan PSJT 941) Menggunakan Penanda Random Amplified Polymorphism DNA
1
41
124
Karyotipe Kromosom Kantong Semar (Nepenthes reinwardtiana Miq. dan Nepenthes tobaica Danser.) dengan Menggunakan Metode Pencet (Squash)
3
31
55
Genom Kloroplas
0
15
4
Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction)
2
11
82
Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)
1
8
66
Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan
1
10
70
Perbandingan antara metode SYBR green dan metode hydrolysis probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan menggunakan real time PCR
1
32
90
Analysis of T RFLP data using analysis o
0
4
10
PENGARUH ASAL POPULASI DAN KLON TERHADAP KERAGAMAN PERTUMBUHAN STEK PUCUK Shorea leprosula Miq (Effect of Population Sources and Clones to Growth Variation of Shorea leprosula Miq Shoot Cuttings)
0
0
10
Analisis Keragaman Genetik Temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) Menggunakan Penanda Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
0
0
8
Amplifikasi DNA dengan teknik PCR
0
0
7
Perbandingan Metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time PCR
0
0
8
Analisis D-loop DNA Mitokondria untuk Memposisikan Ayam Hutan Merah dalam Domestikasi Ayam di Indonesia
0
0
9
Comparison of DNA Extraction Methods Between Conventional, Kit, Alkali and Buffer-Only for PCR Amplification on Raw and Boiled Bovine and Porcine Meat
0
1
5
Identifikasi Serkaria Fasciolopsis buski dengan PCR untuk Konfirmasi Hospes Perantara di Kabupaten Hulu Sungai Utara, Kalimantan Selatan, Indonesia
0
0
8
Show more