Sintesis turunan arilamida-5 dan uji aktivitas in vitro terhadap enzim matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) sebagai kandidat anti-kanker payudara - USD Repository

Gratis

0
0
46
3 weeks ago
Preview
Full text
(1)PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-5 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi Diajukan oleh : Reynaldo Tiara NIM : 158114097 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2019

(2) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-5 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO TERHADAP ENZIM MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi Diajukan oleh : Reynaldo Tiara NIM : 158114097 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2019 i

(3) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ii

(4) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI iii

(5) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN 2 Korintus 10:4 Karena senjata kami dalam perjuangan bukanlah senjata duniawi, melainkan senjata yang diperlengkapi dengan kuasa Allah, yang sanggup untuk meruntuhkan benteng-benteng. KARYA INI KUPERSEMBAHKAN UNTUK: Allah Bapa, Tuhan Yesus Kristus, dan Roh Kudus yang telah menuntunkan dalam setiap perjalanan kehidupanku dengan semua hikmat dan kasih setiaNya. Papah Tersayang Andry Yatti dan Mamah Tercinta Linda Sunarto atas cinta, kasih sayang, dan senantiasa mendoakan kesuksesanku. Kedua adik kesayanganku, Figo Stefanus Tiara dan Varel Tiara. You are my best brothers ever. dan tentunya, Almamaterku terkasih Universitas Sanata Dharma iv

(6) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI v

(7) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI vi

(8) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji Tuhan penulis panjatkan pada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas penyertaan dan cinta kasih-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan Arilamida-5 dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara dapat diselesaikan dengan baik dan tepat waktu. Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt. yang didanai oleh Indonesia Toray Science Foundation (ITSF) Periode 2017-2018 dengan judul “Synthesis, Enzymatic Assay, and Molecular Modelling of Purine Derivatives Targeting Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9 (PEX-9) in The Discovery of Novel Anti-Breast Cancer”. Skripsi ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penyelesaian naskah skripsi ini tidak lepas dari dukungan berbagai pihak, baik langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada: 1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 3. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi yang telah membimbing tim penelitian dengan sabar, kasih, semangat, dukungan, motivasi, kritik, dan saran dari awal hingga akhir penyusunan skripsi ini. 4. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. dan Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dan saran yang sangat berharga dalam penulisan naskah ini dari awal hingga akhir. 5. Papah Andry Yatti dan Mamah Linda Sunarto yang telah memberikan pengertian, dukungan, semangat, cinta, kasih, dan doa dalam penulisan naskah ini dari awal dan akhir. 6. Figo Stefanus Tiara dan Varel Tiara yang telah memberikan dukungan, semangat, dan doa dalam penulisan ini dari awal hingga akhir serta penulis berharap agar adik-adik tersayang kelak sukses selalu. vii

(9) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7. Wisnu, Krisna, Kevin, Sangga, dan Ervan, selaku teman seperjuangan skripsi, penulis berterima kasih karena telah bersedia menanggung beban kehidupan bersama dan bertahan hingga akhir. 8. Kelompok “Unknown” Bryant, Tommy, Vani, Alicia, Pipit, Siska, Epen, Elsa, dan Tata, selaku sahabat seperjuangan dan sepermainan selama menjalani aktivitas perkuliahan dari awal hingga akhir. Penulis mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani. 9. Kelompok “Dolan Squad” Wisnu, Krisna, Retha, Lina, Inge, dan Mas Rudi, selaku teman kelas yang berjuang melewati dunia perkuliahan. Penulis mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani. 10. Denny, Chintya, Davor, Beben, dan Alen, selaku sahabat terbaik. Penulis mengucapkan terima kasih atas persahabatan yang dijalani. 11. Bapak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, dan Mas Bimo, selaku laboran yang telah membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian. 12. Seluruh anggota Drug Discovery Research Group, terutama Tito, Diana, Eko, Pandu, Jason, Try, Angel, dan Wiwy, serta Divisi Penelitian dan Pengembangan BEMF Farmasi 2018 penulis berterima kasih atas kerjasama dan dukungan moralnyaselama perjalanan ini. 13. Kak Donny dan Kak Resti, selaku teman Divisi Pengabdian Masyarakat BEMF Farmasi yang selalu memberikan dukungan bagi penulis. 14. Teman-teman FSM C 2015 serta Angkatan 2015 Farmasi yang telah memberikan banyak kenangan dalam masa perkuliahan. 15. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah mendukung dalam penyelesaian penyusunan naskah skripsi ini. Penulis menyadari bahwa naskah penelitian ini masih jauh dari kata sempurna dan masih memiliki banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang dapat membangun. Terima kasih. Yogyakarta, 30 Januari 2019 Penulis viii

(10) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRAK Salah satu indikator kanker payudara tipe triple negative dan HER2positive adalah terjadinya over ekspresi enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9). Enzim ini mendegradasi matriks ekstraseluler yang mengawali terjadinya migrasi sel kanker dan proses metastasis. Penghambat enzim MMP-9 yang telah dirancang selama ini hanya untuk menghambat MMP pada sisi catalytic domain sehingga gagal pada tahap uji klinik, karena bersifat non-selektif terhadap salah satu jenis MMP dan menyebabkan efek samping yang merugikan seperti contohnya nyeri muskuloskeletal dan inflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mensintesis senyawa turunan arilamida-5 serta menguji aktivitasnya sebagai penghambat MMP-9 secara selektif, karena dirancang untuk berikatan dengan hemopexin domain. Sintesis telah dilakukan dengan mereaksikan sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin pada suhu kamar. Senyawa hasil sintesis yang terbentuk berupa serbuk kuning, negatif terhadap DAB-HCl, larut dalam DMSO, dan memiliki titik lebur 193-200°C dengan rendemen sebesar 67,13%. Senyawa hasil sintesis berhasil dipastikan strukturnya dengan metode spektrofotometri inframerah, spektrometri resonansi magnetik inti, dan kromatografi gas-spektrometri massa. Senyawa hasil sintesis diuji aktivitasnya terhadap MMP-9 secara in vitro dan didapatkan nilai persentase penghambatan terhadap enzim MMP-9 sebesar 93% pada 200 µg/mL dan nilai IC50 sebesar 199 µM. Kesimpulannya senyawa turunan arilamida-5 aktif menghambat MMP-9, sehingga poten sebagai kandidat obat kanker payudara. Kata kunci: arilamida-5, hemopexin domain, kanker payudara, MMP-9, uji aktivitas in vitro ix

(11) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT One of indicators in triple negative and HER2-positive breast cancer is the overexpression of the Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) enzyme. This enzyme degrades the extracellular matrix which initiates cancer cell migration and metastasis. To date, MMP-9 enzyme inhibitors have been designed only to inhibit MMP on the catalytic domain which unfortunately fails at the clinical trial, due to the non-selective inhibition across MMP subfamilies while causing adverse side effects such as musculoskeletal pain and inflammation. This study aims to synthesize arylamide-5 and test its activity as MMP-9 inhibitors. The synthesis was carried out by reacting sulfamerazine and 3-bromopropionyl chloride using pyridine as the catalyst at room temperature. The physical appearance of the synthesized compound (yield 67,13%) is yellow powder, which negatively reacts with DAB-HCl, soluble in DMSO, and having melting range: 193-200°C. The synthesized compound was successfully confirmed its structure by FTIR, NMR, and GC-MS. The synthesized compound was tested for its activity against MMP-9 in vitro showing percentage inhibition of the MMP-9 enzyme being 93% at 200 µg/mL while the IC50 value was equal to 199 µM associating with its potency as breast cancer drug candidate. Keywords: arylamide-5, hemopexin domain, breast cancer, MMP-9, in vitro assay x

(12) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii HALAMAN PENGESAHAN..................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... v PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... vi PRAKATA .................................................................................................. vii ABSTRAK .................................................................................................. ix ABSTRACT ................................................................................................ x DAFTAR ISI ............................................................................................... xi DAFTAR TABEL ....................................................................................... xii DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xiii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiv PENDAHULUAN ...................................................................................... 1 METODE PENELITIAN ............................................................................ 3 HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................... 5 KESIMPULAN ........................................................................................... 19 SARAN ....................................................................................................... 19 UCAPAN TERIMA KASIH ....................................................................... 19 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 20 LAMPIRAN ................................................................................................ 23 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 31 xi

(13) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-5 .......................... 9 Tabel II. Perhitungan %penghambatan turunan arilamida-5 terhadap MMP-9 .......................................................................................... 18 xii

(14) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Struktur dan farmakofor dari (a) compound 2; (b) senyawa Adhipandito dan Ludji ; dan (c) turunan arilamida-5 ............... 2 Gambar 2. Mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) antara sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida menggunakan katalisator piridin ...................................................................... 6 Gambar 3. Produk hasil sintesis senyawa turunan arilamida-5 setelah dilakukan proses penetralan pH dan pengeringan (a) dan sulfamerazin (b) ....................................................................... 7 Gambar 4. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-5 yang menunjukkan 2 noda yang berbeda, yaitu sulfamerazin (A) dan senyawa turunan arilamida-5 (B) ....................................... 8 Gambar 5. Spektrum IR senyawa turunan arilamida-5 .............................. 10 Gambar 6. Spektrum IR sulfamerazin (diadaptasi dari Prajapat et al., 2018) ......................................................................................... 10 Gambar 7. Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa turunan arilamida-5 ................................................................................ 13 Gambar 8. Spektrum resonansi magnetik inti 13C senyawa turunan arilamida-5 ................................................................................ 15 Gambar 9. Kromatogram hasil kromatografi gas senyawa turunan arilamida-5 ................................................................................ 16 Gambar 10. Spektrum massa senyawa turunan arilamida-5 ......................... 16 Gambar 11. Kurva hubungan log konsentrasi turunan arilamida-5 dengan persentase inhibisi ..................................................................... 19 xiii

(15) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Tahap sintesis senyawa turunan arilamida-5 ....................... 23 Lampiran 2. Mekanisme reaksi sulfamerazin dengan DAB-HCl ............ 23 Lampiran 3. Hasil uji DAB-HCl .............................................................. 24 Lampiran 4. Perhitungan bahan dan rendemen ....................................... 24 Lampiran 5. Perbesaran pada sinyal 2,85 ppm dan 2,98 ppm ................. 25 Lampiran 6. Perbesaran pada sinyal 3,72 ppm dan 3,87 ppm ................. 25 Lampiran 7. Perbesaran pada sinyal 7,76 ppm dan 7,93 ppm ................. 26 Lampiran 8. Perbesaran pada sinyal 7,62 ppm dan 8,31 ppm ................. 26 Lampiran 9. Mekanisme pola fragmentasi m/z 334................................. 27 Lampiran 10. Mekanisme pola fragmentasi base peak m/z 55 .................. 27 Lampiran 11. Rancangan microwell plate untuk uji aktivitas in vitro ....... 28 Lampiran 12. Perhitungan Nilai IC50 Senyawa Turunan Arilamida-5....... 29 xiv

(16) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PENDAHULUAN Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan sel yang tumbuh secara tidak normal dan disebabkan oleh mutasi genetik. Mutasi tersebut terjadi berulang kali dan menyebabkan sel dapat menghindari mekanisme pengendalian normal (Pecorino, 2012). Salah satu enzim yang berperan penting dalam perkembangan kanker adalah Matrix Metalloproteinase (MMP). MMP merupakan protease yang akan mendegradasi matriks ekstraseluler (ECM) dan menyebabkan metastasis, sehingga sel kanker dapat bermigrasi (Merdad et al., 2014). MMP-9 diekspresikan oleh sel kanker payudara jenis triple-negative dan HER2-positive dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan pada sel payudara normal, sehingga kedua jenis kanker payudara tersebut disebut sebagai highly metastatic (Mehner et al., 2014; Yousef et al., 2014). Marimastat merupakan salah satu MMP-9 inhibitor yang telah dirancang untuk menghambat progresi dari kanker payudara namun tidak selektif dalam menghambat salah satu jenis MMP, sehingga mengakibatkan efek samping berupa nyeri muskuloskeletal dan inflamasi (Cathcart et al., 2015). Seluruh kelompok MMP memiliki struktur berupa signal peptide, pro-peptide domain, catalytic domain, dan hemopexin domain (Bauvois, 2012). Marimastat dirancang dengan menargetkan catalytic domain yang memiliki homologi sekuens asam amino yang cukup tinggi (43-65%) pada seluruh jenis MMP, sehingga aktivitas dari MMP selain MMP-9 akan terhambat (Vandenbroucke dan Libert, 2014). Sedangkan pada hemopexin domain MMP-9 (PEX-9) hanya terdapat homologi sebesar 2535% dengan PEX pada MMP lainnya. Hal ini menjadikan PEX-9 sebagai target protein yang lebih selektif dalam menghambat MMP-9 (Dufour et al., 2011). Penelitian mengenai MMP inhibitor yang selektif terhadap PEX-9 telah dilakukan oleh Dufour et al., (2011) yang menemukan senyawa CID135415473 (~{N}-[4-(difluoromethoxy)phenyl]-2-[(6-oxo)-4-propyl-1~{H}-pyrimidin-2-yl) sulfanyl]acetamide) (www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) atau disebut juga Compound 2 dengan nilai Kd = 2,2 μM. Gugus yang diduga berperan penting dalam aktivitas penghambatan PEX-9 adalah cincin planar yang berinteraksi dengan kantung aktif pada blade PEX-9 yang dihubungkan oleh rantai alkil yang 1

(17) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI memberikan efek fleksibel bagi cincin arilamida untuk berinteraksi di permukaan kantung aktif yang disajikan pada Gambar 1a. 1a Interaksi tersebut diduga berperan dalam penghambatan proses pembentukan homodimer pada PEX PEX-9, sehingga dapat mencegah proses migrasi sel kanker (Dufour et al,, 2010). Sementara itu, gugus difluorometoksi ksi (-OCF ( Electron Withdrawing 2) yang bersifat EWG (Electron Group) dan EDG (Electron Electron Donating Group Group)) belum dijelaskan pengaruhnya PEX terhadap aktivitas penghambatan PEX-9. Cincin arilamida Rantai alkil Cincin planar Gugus difluorometoksi (a) (b) Gugus sulfonamid-4-metilpirimidin metilpirimidin (c) Gambar 1. Struktur dan farmakofor dari (a) compound 2;; (b) senyawa Adhipandito (2017; R= H) dan Ludji (2017; R= NO2); dan (c) turunan arilamida arilamida-5 Alford et al., al (2017) juga telah menemukan senyawa yang aktif dan selektif terhadap MMP-9 MMP yaitu Senyawa 3c dengan Kd = 0,32 µ µM dan memiliki farmakofor yang serupa dengan Compound 2. Adhipandito (2017) dan Ludji (2017) mensintesis 2 senyawa turunan arilamida (Gambar 1b) yang merupakan fragmen dari Compound 2 dengan %penghambatan terhadap MMP MMP-9 sebesar masing-masing 11% dan 67%. Berdasarkan strukturnya, penambahan gugus EWG seperti nitro pada turunan arilamida, meningkatkan aktivitas penghambatan terhadap MMP-9.. Penelitian ini melanjutkan seri dari senyawa senyawa Adhipandito dan Ludji dengan menambahkan gugus sulfonamid-4-metilpirimidin sulfonamid pirimidin (Gambar 1c) yang bersifat EWG dan EDG sehingga diharapkan meningkatkan aktivitas penghambatan terhadap MMP-9. MMP 2

(18) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI METODE PENELITIAN Bahan Penelitian Seluruh bahan kimia yang digunakan bermutu analisis, kecuali disebutkan lain. Bahan utama yang digunakan untuk sintesis antara lain sulfamerazin (4-amino-N-(4-methylpyrimidin-2-yl)benzenesulfonamide) mutu obat, 3-bromopropionil klorida, piridin, natrium karbonat mutu teknis (Na2CO3) 10%, akuades, n-heksana, etil asetat, dimetilsulfoksida (DMSO), plat silika gel GF254 (Merck 7730), dan dimetilaminobenzaldehid HCl (DAB-HCl). Bahan untuk elusidasi struktur yaitu pellet kalium bromida untuk spektrofotometri inframerah dan pelarut DMSO-D6 untuk spektrometri resonansi magnetik inti. Bahan untuk uji aktivitas in vitro yaitu kit enzim MMP-9 yang didapatkan dari Biovision terdiri dari enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat peptida Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)-based MMP-9, dapar Tris HCl, peptida NNGH inhibitor (Asparagin-Asparagin-Glisin-Histidin) sebagai kontrol positif, gliserol untuk mengencerkan enzim, dan dimetilsulfoksida sebagai pelarut sampel. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain timbangan analitik (Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven (Memmert GmbH+Co.KG), labu alas bulat (Pyrex), pengaduk magnetik, lempeng panas, bejana (chamber) kromatografi lapis tipis (KLT), lampu UV254, alat uji titik lebur (Mettler Toledo®), dan alat gelas pada umumnya. Alat untuk elusidasi struktur digunakan spektrofotometer inframerah (Shimadzu), spektrometer nuclear magnetic resonance (Bruker 176 dan 700MHz), kromatografi gasspektrometer massa (GC-MS QP2010S Shimadzu). Alat untuk uji aktivitas in vitro digunakan pipet mikro (Eppendorf), micro well plate 96, pipet tips, inkubator, vortex, dan ELISA microplate reader fluorescence (Tecan Infinite 200 PRO). Prosedur Penelitian Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-5 (Diadaptasi dari Arifiyanto, 2001) Dalam labu alas bulat, dimasukkan sulfamerazin sebanyak 3,59 mmol (0,95 g) dan ditambahkan piridin sebagai katalisator sebanyak 7,18 mmol (0,58 3

(19) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar lalu ditambahkan 3bromopropionil klorida tetes demi tetes sebanyak 5,39 mmol (0,61 mL). Campuran diaduk kembali selama 30 menit pada suhu kamar. Hasil sintesis disaring kemudian dinetralkan dengan Na2CO3 10% hingga pH netral dan dicuci dengan akuades serta dikeringkan di oven pada suhu 40ºC. Uji Pendahuluan dan Elusidasi Struktur Produk hasil sintesis yang terbentuk dilakukan uji pendahuluan dengan menggunakan DAB-HCl. Kemudian dilanjutkan pengujian dengan KLT menggunakan fase diam plat silika gel GF254 dan fase gerak n-heksana : etil asetat (1:3). Kemudian produk hasil sintesis diuji secara organoleptis (bentuk dan warna), kelarutan, titik lebur, dan perhitungan rendemen senyawa hasil sintesis. Elusidasi struktur dilakukan dengan metode spektrofotometri inframerah, spektrometri resonansi magnetik inti (1H dan 13 C), dan kromatografi gas- spektrometri massa yang dilakukan di Fakultas MIPA Universitas Gadjah Mada dan Institut Farmasetikal dan Nutrasetikal Malaysia. Uji Aktivitas In Vitro Uji aktivitas in vitro dilakukan di Universitas Padjadjaran. Enzim yang terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µL gliserol 30% dalam deionised water. Enzim yang telah terekonstitusi dilarutkan dalam 550 µL dapar dan siap digunakan untuk pengujian. Senyawa sampel disiapkan dengan cara dilarutkan dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 200 µg/mL di dalam 96-microwell plate. Konsentrasi akhir DMSO dalam wellplate tidak lebih dari 2%. Sampel sebanyak 1 µL dicampurkan dengan dapar (44 µL) dan enzim (5 µL) pada setiap sumuran. Sebanyak 2 µL inhibitor NNGH (2mM) dipipet dan dimasukkan ke dalam sumuran lainnya dan ditambahkan 5 µL enzim MMP-9 dan 43 µL dapar sebagai kontrol positif. Kemudian sebanyak 5 µL enzim MMP-9 dipipet dan dimasukkan ke dalam sumuran lainnya dan ditambahkan 45 µL dapar sebagai kontrol negatif. Dapar dipipet sebanyak 100 µL dan dimasukkan ke dalam sumuran lainnya sebagai blanko. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah inkubasi selesai, masing-masing sumuran ditambahkan dengan 50 µL larutan 4

(20) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI substrat dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 60 menit. Rancangan microwell plate secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 11. Setelah inkubasi selesai, fluorosensi dari masing-masing sumuran dibaca dengan menggunakan Tecan Infinite 200 Pro Microplate Reader pada panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 393 nm. Hasil fluorosensi senyawa sampel, kontrol positif, dan kontrol negatif dikurangi dengan blanko dan akan didapatkan persentase aktivitas enzim dengan rumus ( x 100%). Persentase penghambatan enzim MMP-9 didapatkan dengan rumus (100% - persentase aktivitas enzim (%)). Pada perhitungan IC50, dibuat seri larutan dengan 4 konsentrasi 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL, dan 300 µg/mL. IC50 dihitung dengan menggunakan persamaan nonregresi linier polinomial y = ax2 + bx + c yang didapatkan dari kurva hasil pengukuran seri larutan. HASIL DAN PEMBAHASAN Sintesis Senyawa Turunan Arilamida-5 Senyawa turunan arilamida-5 disintesis dengan mengadaptasi farmakofor berupa cincin arilamida dengan perpanjangan rantai alkil. Pada posisi para cincin arilamida ditambahkan gugus sulfonamid-4-metilpirimidin yang bertujuan untuk mengeksplorasi fungsi gugus -OCF2 pada Compound 2 berdasarkan karakternya yang bersifat penarik elektron sekaligus pendonor elektron. Pada penelitian ini, kedua karakter tersebut diwakili oleh gugus sulfonamid-4-metilpirimidin sehingga diharapkan memiliki kontribusi dalam aktivitas penghambatan terhadap MMP-9 . Dalam tahap sintesis senyawa turunan arilamida-5, berlangsung reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) antara sulfamerazin sebagai nukleofil karena memiliki amina primer dan 3-bromopropionil klorida yang memiliki gugus asil dengan menggunakan katalisator piridin yang berfungsi untuk mempercepat reaksi. Piridin akan mensubstitusi gugus klorida, karena gugus klorida masih bersifat elektronegatif yang terikat kuat dengan C karbonil yang bersifat elektropositif dengan membentuk 3-bromopropionil piridin. Piridin sebagai gugus pergi sangat reaktif, karena N positif cenderung tolak-menolak dengan C karbonil 5

(21) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI yang elektropositif, sehingga amina primer dari sulfamerazin akan lebih mudah menyerang. Gugus amida dapat disintesis melalui beberapa metode, salah ssatunya dengan mereaksikan amina primer dengan asil klorida sehingga Cl pada C karbonil akan tersubstitusi oleh amina. Reaksi SNA berlangsung ketika nu nukleofil (amina primer (-NH2) yang memiliki pasangan elektron bebas dari sulfamerazin) menyerang ang C karbonil pada 3-bromopropionil piridin dan gugus piridin akan lepas sebagai gugus pergi yang menghasilkan senyawa turunan arilamida arilamida-5 (Koltunov et al., 2016). Mekanisme reaksinya ditunjukkan pada Gambar 2. Gambar 2. Mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) antara sulfamerazin dan 3-bromopropionil 3 bromopropionil klorida menggunakan katalisator piridin Uji Pendahuluan Produk awal sintesis yang dihasilkan berupa semisolid berwarna kuning. Produk masih berada dalam pH asam, karena produk samping yang dihasilkan berupa asam klorida (HCl). (HCl). HCl dapat menghidrolisis gugus C karbonil pada cincin arilamida, sehingga perlu dinetralkan dengan Na2CO3 10% dengan membentuk NaCl, H2O, dan CO2 yang dapat dicuci dengan akuades. Senyawa kemudian dikeringkan dan menjadi serbuk berwarna kuning seperti ditunjukkan pada Gambar 3. Serbuk sulfamerazin berwarna putih dan serbuk senyawa turunan arilamida-55 berwarna kuning, sehingga sintesis dinyatakan telah berhasil dilakukan. Perubahan warna antara hasil sintesis dengan bahan awal disebabkan oleh perpanjangan kromofor (ikatan rangkap yang terkonjugasi) sehingga menjadi berwarna. 6

(22) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI (a) (b) Gambar 3. Produk hasil sintesis senyawa turunan arilamida-5 setelah dilakukan proses penetralan pH dan pengeringan (a) dan sulfamerazin (b) Senyawa hasil sintesis diuji dengan DAB-HCl untuk identifikasi awal bahwa senyawa turunan arilamida-5 telah berhasil disintesis. Senyawa yang mengandung gugus amina primer akan bereaksi dengan DAB-HCl untuk membentuk basa Schiff yang berwarna jingga, sedangkan jika senyawa amina primer sudah tersubstitusi, maka tidak dapat bereaksi dengan DAB-HCl (Adegoke, 2011). Senyawa turunan arilamida-5 tidak menghasilkan basa Schiff jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi. Senyawa hasil sintesis sudah berwarna kuning sehingga perubahan intensitas warnanya tidak terlalu tampak ketika ditambahkan DAB-HCl. Hal ini telah berbeda dengan sulfamerazin yang berwarna jingga ketika bereaksi dengan DAB-HCl sehingga untuk sementara dapat disimpulkan produk sintesis sudah terbentuk. Mekanisme reaksi DAB-HCl dengan sulfamerazin ditunjukkan pada Lampiran 2 dan hasil reaksinya berupa produk berwarna jingga ditunjukkan pada Lampiran 3. Pengujian dilanjutkan dengan KLT untuk melihat bahwa senyawa baru telah terbentuk beserta kemurniannya. Gambar 4 merupakan profil KLT dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (1:3) yang menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis mempunyai noda yang berbeda dari bahan baku yang digunakan untuk sintesis (sulfamerazin). Hal tersebut juga ditunjukkan dengan nilai Rf (Retention Factor) yang berbeda antara sulfamerazin dengan 0,51 dan senyawa hasil sintesis dengan 0,55. Perbedaan Rf antara sulfamerazin dan senyawa hasil sintesis sebesar 0,04 disebabkan oleh kemiripan polaritas dari kedua sampel. Pada senyawa hasil sintesis meskipun terjadi penambahan gugus etilen yang bersifat non polar namun diimbangi dengan C karbonil dan atom Br yang bersifat polar. 7

(23) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Hasil rendemen dari senyawa turunan arilamida-5 yang terbentuk adalah sebanyak 67,13%. Perhitungan rendemen ditunjukkan pada Lampiran 4. Rendemen yang dihasilkan sudah lebih dari 50% namun masih dapat dioptimasi dengan cara melakukan variasi metode sintesis seperti mol reaktan, suhu reaksi, dan waktu pengadukan pada penelitian selanjutnya. Rf= 0,55 B A Rf= 0,51 Gambar 4. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-5 yang menunjukkan 2 noda yang berbeda, yaitu sulfamerazin (A) dan senyawa turunan arilamida-5 (B) Setelah diperoleh senyawa turunan arilamida-5, produk diuji titik leburnya yang bertujuan untuk mengetahui titik lebur senyawa hasil sintesis dan mendukung kualitas kemurniannya. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa titik lebur produk hasil sintesis adalah 193-200ºC yang sudah berbeda dengan sulfamerazin yang memiliki titik lebur 234-238ºC (O’Neil et al., 2001). Sehingga dapat disimpulkan bahwa produk hasil sintesis berbeda dari senyawa awalnya yang dilihat dari perbedaaan jarak leburnya. Suatu senyawa dinyatakan murni jika jarak leburnya adalah 0,5-1,5ºC (Mohrig et al., 2014). Jarak lebur produk hasil sintesis adalah sebesar 7ºC, sehingga dapat disimpulkan bahwa masih terdapat impurities pada produk hasil sintesis. Hal ini disebabkan karena tidak dilakukan proses pemurnian kembali untuk mendapatkan senyawa hasil sintesis yang murni. Selain organoleptis, uji warna, dan titik lebur juga dilakukan uji kelarutan senyawa, terutama untuk kepentingan pengujian secara spektroskopi. Uji kelarutan senyawa turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Tabel I. Dari hasil uji kelarutan, senyawa turunan arilamida-5 bersifat semipolar karena larut dalam pelarut semipolar, seperti DMSO. 8

(24) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-5 Pelarut Senyawa Turunan Arilamida-5 n-heksana tidak larut Kloroform tidak larut Etil asetat tidak larut Aseton agak sukar larut (1:80) Etanol tidak larut Air tidak larut DMSO larut (1:20) Elusidasi Struktur Terhadap Senyawa Turunan Arilamida-5 Spektrofotometri Inframerah Elusidasi struktur yang dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri inframerah (IR) bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan gugus-gugus fungsional pada senyawa hasil sintesis. Gugus fungsional dengan momen dipol yang tinggi sangat efektif dalam menyerap radiasi IR, sehingga menyebabkan ikatannya bervibrasi secara mengulur (stretching) maupun menekuk (bending) (Supratman, 2010). Hasil elusidasi struktur senyawa turunan arilamida-5 dan keberadaan gugus-gugus fungsionalnya dengan menggunakan spektrofotometri IR ditunjukkan pada Gambar 5. Berdasarkan spektrum yang dihasilkan, terdapat pita pada daerah dengan bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukkan gugus karbonil (C=O). Gugus karbonil tersebut diprediksi sebagai gugus C=O amida pada daerah dengan ῡ 1597 cm-1. Keberadaan gugus amida tersebut juga diperkuat dengan adanya pita yang melebar pada daerah dengan ῡ 3387–3479 cm-1 yang diduga sebagai gugus -NH amida. Senyawa turunan arilamida-5 diprediksi telah terbentuk dengan dukungan pada daerah sidik jari dengan ῡ 500-1500 cm-1 yang berbeda dengan daerah sidik jari sulfamerazin sebagai starting material yang ditunjukkan pada Gambar 6. Pada spektrum IR sulfamerazin tidak dijumpai pita ulur tajam pada daerah dengan ῡ 1500 cm-1. Pada daerah dengan bilangan gelombang 3300 cm-1, pita gugus NH terlihat sebagai pita kembar yang tidak melebar, hal ini dikarenakan gugus amina pada sulfamerazin tidak tersubstitusi (Vollhardt dan Schore, 2014). Hasil ini menandakan bahwa produk hasil sintesis sudah sesuai pada aspek gugus fungsionalnya. 9

(25) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Daerah sidik jari Gambar 5. Spektrum IR senyawa turunan arilamida-5 Daerah sidik jari Gambar 6. Spektrum IR sulfamerazin (diadaptasi dari Prajapat et al., 2018) Spektrometri Resonansi Magnetik Inti 1H dan 13C Berdasarkan hasil uji kelarutan, senyawa turunan arilamida-5 larut dalam dimetilsufoksida (DMSO), sehingga digunakan DMSO-d6 sebagai pelarut pada pengujian dengan spektrometri resonansi magnetik inti 1H dan 13 C. Elusidasi struktur yang dilakukan dengan menggunakan spektrometri resonansi magnetik inti 1H dan 13 C bertujuan untuk mengetahui kerangka hidrokarbon dari senyawa hasil sintesis (Supratman, 2010). Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Gambar 7. Sinyal pada geseran kimia 2,00–3,00 ppm merupakan daerah proton alkil (Vollhardt dan Schore, 2014). Sinyal pada geseran kimia 2,31 ppm (integrasi= 3) menunjukkan sinyal dari proton HG. Proton HG merupakan proton rantai alkil 10

(26) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI yang berada pada gugus metil yang berdekatan dengan cincin pirimidin. Sinyal pada geseran kimia 2,31 ppm menunjukkan sinyal singlet (tunggal). Hal ini telah sesuai dengan teori, karena tidak memiliki proton tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda. Sinyal pada geseran kimia 3,72 ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,87 ppm (integrasi= 2) (J= 6,3 Hz) menunjukkan sinyal dari proton HA, sedangkan sinyal yang terdapat pada geseran kimia 2,85 ppm (integrasi= 2) (J= 7 Hz) dan 2,98 ppm (integrasi= 2) (J= 7 Hz) menunjukkan sinyal dari proton HB. Dengan munculnya set proton HA dan HB yang merupakan rantai etilen, menegaskan bahwa senyawa turunan arilamida-5 telah terbentuk. Proton HA merupakan proton pada rantai etilen yang berdekatan dengan atom halogen (Br), sedangkan proton HB merupakan proton pada rantai etilen yang berdekatan dengan gugus karbonil. Proton HA terdapat pada geseran kimia yang lebih jauh daripada proton HB, karena berdekatan dengan atom Br yang bersifat lebih elektronegatif dibandingkan dengan gugus karbonil pada amida sehingga proton HA kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded). Kedua sinyal tersebut seharusnya menunjukkan pola splitting masing-masing satu triplet, karena kedua set proton tersebut memiliki jumlah proton yang tidak ekuivalen secara magnetik sebanyak dua. Namun hasil penelitian menunjukkan adanya dua sinyal triplet pada jarak yang berdekatan untuk masing-masing proton HA dan HB. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh efek ikatan tunggal pada rantai etilen bersifat rotatable, sehingga pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang sama dapat memiliki lingkungan kimia yang berbeda. Hal ini menyebabkan setiap proton mengenali tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua sinyal triplet. Fenomena ini dipastikan dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut sebanding dengan dua proton. Nilai J coupling constant untuk kedua sinyal triplet tersebut adalah 6,3 dan 7 Hz, yang menunjukkan bahwa kedua set proton tersebut bertetangga secara langsung. Perbesaran spektrum proton HA dan HB ditunjukkan pada Lampiran 5 dan 6. Sinyal pada geseran kimia 7,00–8,00 ppm merupakan daerah proton aromatik (Vollhardt dan Schore, 2014). Pada geseran kimia tersebut ditemukan 4 11

(27) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI sinyal yang berbeda, yaitu pada 7,62 ppm (integrasi= 1) (J= 8,4 Hz); 7,76 ppm (integrasi= 2) (J= 8,4 Hz); 7,93 ppm (integrasi= 2) (J= 9,1 Hz); dan 8,31 ppm (integrasi= 1) (J= 5,6 dan 6,3 Hz). Sinyal pada geseran kimia 7,76 ppm menunjukkan proton HC, sedangkan sinyal pada geseran kimia 7,93 ppm merupakan proton HD. Proton HC dan HD merupakan proton yang berada pada gugus benzena cincin arilamida. Proton HC lebih terlindungi (shielded) dibandingkan dengan proton HD, karena proton HC berada pada lingkungan kimia yang berdekatan dengan gugus NH yang memiliki karakter EWG yang lebih lemah dibandingkan dengan gugus O=S=O yang berdekatan dengan proton HD. Sinyal pada geseran kimia 7,76 ppm dan 7,93 ppm menunjukkan sinyal doublet. Hal ini telah sesuai dengan teori, karena memiliki satu proton tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda. Perbesaran spektrum proton HC dan HD ditunjukkan pada Lampiran 7. Sinyal pada geseran kimia 7,62 ppm menunjukkan proton HF, sedangkan sinyal pada geseran kimia 8,31 ppm merupakan proton HE. Proton HF dan HE merupakan proton yang berada pada cincin pirimidin. Proton HF terletak pada posisi para dari gugus sulfonamida sehingga lebih terlindungi dari medan magnet luar (shielded). Sementara itu, proton HE kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded) dibandingkan dengan proton HF, karena terletak pada posisi meta dari gugus sulfonamida. Sinyal pada geseran kimia 7,62 ppm menunjukkan sinyal doublet. Hal ini telah sesuai dengan teori, karena memiliki satu proton tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda. Sinyal pada geseran kimia 8,31 ppm menunjukkan sinyal triplet. Hal ini tidak sesuai dengan teori yang seharusnya muncul sebagai sinyal doublet, karena memiliki satu proton tetangga dalam lingkungan kimia yang berbeda. Namun, fenomena ini mungkin terjadi disebabkan oleh long range coupling. Fenomena ini muncul, karena antara proton HE dan salah satu atom H pada HG terhubung oleh rantai hidrokarbon yang membentuk seperti huruf ‘W’, sehingga jaraknya semakin mendekat dan dapat merasakan proton tetangga yang jauh. Proton ini muncul sebagai triplet, karena bisa merasakan dua proton tetangga yang berasal dari HF dan HG (Dona et al., 2016). Perbesaran spektrum proton HE dan HF ditunjukkan pada Lampiran 8. 12

(28) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Gambar 7. Spektrum resonansi magnetik inti 1H senyawa turunan arilamida-5 Spektrometri resonansi magnetik inti 13 C hanya dapat digunakan untuk mengindikasikan pergeseran kimia dan tidak mengindikasikan pola splitting, integrasi, dan J coupling constant. Hal ini disebabkan karena 13C memiliki momen magnetik yang rendah yaitu 67,28% radians/Tesla. Selain itu, kelimpahan 13 C di alam sangat rendah, yaitu sebesar 1,08% sehingga menyebabkan pola splitting dan integrasi menjadi tidak spesifik (Pavia et al., 2015). Spektrum resonansi magnetik inti 13C senyawa turunan arilamida-5 ditunjukkan pada Gambar 8. Menurut tabel geseran kimia untuk spektrometri resonansi magnetik inti 13 C, rantai alkil berada pada rentang geseran kimia 10,0-60,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CM berada pada geseran kimia 22,8 ppm yang menunjukkan atom C pada alkil yang berdekatan dengan cincin pirimidin. Atom CB berada pada geseran kimia 28,3 ppm yang menunjukkan atom C yang berdekatan dengan gugus karbonil pada amida, sedangkan atom CA berada pada geseran kimia 39,4 ppm yang menunjukkan atom C yang berdekatan dengan atom Br yang bersifat elektronegatif dibandingkan dengan gugus karbonil pada amida sehingga kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded). Pada gugus benzena yang tersubstitusi, geseran kimia berada pada rentang 100,0-160,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CD, CE, CF, dan CG 13

(29) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI merupakan atom C yang terletak pada gugus benzena cincin arilamida. Atom CE berada pada geseran kimia 111,4 ppm, sedangkan atom CF pada 127,2 ppm. Atom CF kurang terlindungi dibandingkan dengan atom CE, karena atom CF terletak berdekatan dengan gugus O=S=O yang memiliki karakter EWG yang lebih kuat daripada gugus NH yang berdekatan dengan atom CE. Atom CD berada pada geseran kimia 129,4 ppm, sedangkan atom CG pada 168,1 ppm. Atom CG kurang terlindungi dibandingkan dengan atom CD, hal ini juga disebabkan karena atom CG berdekatan dengan gugus O=S=O yang memiliki karakter EWG yang lebih kuat daripada gugus NH yang berdekatan dengan atom CD. Pada cincin pirimidin, terdapat atom CI, CJ, CK, dan CL yang berada pada geseran kimia 156,3 ppm; 142,1 ppm; 117,6 ppm; dan 128,5 ppm secara berturutturut. Atom CK paling terlindungi (shielded) dibandingkan dengan ketiga atom C lainnya pada cincin pirimidin, karena atom CK tidak berdekatan dengan atom elektronegatif. Atom CL berikatan dengan atom N yang bersifat elektronegatif dan gugus metil, sehingga lebih terlindungi dibandingkan dengan atom CJ yang berikatan dengan atom N dan atom H. Hal ini disebabkan, karena gugus metil bersifat EDG dibandingkan dengan atom H. Atom CI paling tidak terlindungi (deshielded), karena atom CI berikatan dengan atom N heterosiklik yang bersifat EWG. C karbonil (C=O) amida berada pada rentang geseran kimia 150,0-180,0 ppm (Silverstein et al., 2005). Hasil elusidasi struktur menunjukkan bahwa atom C pada amida berada pada geseran kimia 168,3 ppm yaitu atom CC sehingga telah sesuai dengan teori. Berdasarkan hasil elusidasi struktur dengan menggunakan spektrometri resonansi magnetik inti 1 H dan 13 C, dapat disimpulkan bahwa struktur hidrokarbon produk hasil sintesis telah sesuai dengan struktur senyawa turunan arilamida-5. 14

(30) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Gambar 8. Spektrum resonansi magnetik inti 13C senyawa turunan arilamida-5 Kromatografi Gas-Spektrometri Massa Elusidasi struktur dengan kromatografi gas-spektrometri massa bertujuan untuk mengetahui bobot molekul senyawa hasil sintesis. Kromatografi gas dapat dilakukan pada senyawa hasil sintesis, karena berdasarkan hasil dari uji titik lebur menunjukkan titik lebur senyawa hasil sintesis <200°C sehingga dapat dilakukan pada kromatografi gas dengan suhu detektor 300°C. Kromatografi gas dilakukan pada senyawa hasil sintesis dengan tujuan untuk memastikan kemurnian dari senyawa hasil sintesis dan suatu senyawa dapat dinyatakan murni jika pada hasil kromatogramnya hanya muncul satu puncak. Hasil penelitian menunjukkan terdapat tiga puncak, yaitu puncak A, B, dan C pada kromatogram yang mengindikasikan bahwa senyawa hasil sintesis tidak 100% murni. Hal ini sesuai dengan hasil dari pengujian titik lebur yang masih memiliki jarak lebur yang lebar (>1,5°C) yang menunjukkan bahwa masih terdapat impurities pada produk hasil sintesis, namun dengan kemurnian setidaknya 80% senyawa masih dapat dibaca spektra massanya (Triono, 2007). Pada penelitian selanjutnya, disarankan untuk melakukan pemurnian lebih lanjut. Puncak C pada waktu retensi 37 menit merupakan puncak tertinggi yang menunjukkan bahwa puncak tersebut adalah 15

(31) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI senyawa turunan arilamida-5, arilamida karena memiliki intensitas relatif yang paling tinggi. Kromatogram dari produk hasil si sintesis ntesis ditunjukkan pada Gambar 99. C A B Gambar 9. Kromatogram hasil kromatografi gas senyawa turunan arilamida arilamida-5 dengan intensitas relatif A (15%), B (22,5%), dan C (62,5 62,5%) Bobot molekul dari puncak yang terpisah akan dideteksi dengan spektrometer massa yang menunjukkan massa relatif per ion (m/z) terbesar adalah 334. Bobot molekul utuh produk hasil sintesis seharusnya adalah 399. Kehilangan massa relatif per ion sebesar 65 diduga akibat fenomena fragmentasi SO2. sulfonamida Fenomena yang unik dari setiap senyawa yang memiliki gugus sulfonamid adalah selalu terjadi proses fragmentasi SO2 diikuti dengan penataan ulang gugus amina pada sulfonamida yang terikat pada posisi para dari benzena setelah SO2 terlepas sebagai m/z 65 (Sun et al.,., 2008). Mekanisme fragmentasi dan penataan ulang ini dapat dilihat ilihat pada Lampiran 9.. Fragmen yang tertinggi ((base peak) menunjukkan fragmentasi yang paling banyak te terjadi dan stabil yang muncul pada massa relatif per ion sebesar 55. Mekanisme fragmentasi yang menghasilkan base peak dapat dilihat pada Lampiran 10. Gambar 10. arilamida-5 10 Spektrum massa senyawa turunan arilamida 16

(32) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Secara keseluruhan berdasarkan hasil elusidasi struktur dengan spektrofotometri inframerah, spektrometri resonansi magnetik inti 1H dan 13C, dan kromatografi gas-spektrometer massa dapat disimpulkan bahwa produk hasil sintesis dipastikan strukturnya sebagai senyawa turunan arilamida-5. Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Enzim MMP-9 Setelah senyawa turunan arilamida-5 berhasil disintesis, dilakukan uji aktivitas in vitro untuk melihat aktivitas penghambatannya terhadap enzim MMP9. Enzim MMP-9 merupakan suatu protease, sehingga dapat memotong ikatan peptida pada substrat melalui aktivitas proteolisis. Substrat yang digunakan dalam pengujian merupakan suatu peptida yang terikat dengan gugus fluorofor. Enzim MMP-9 akan memotong ikatan peptida pada substrat, sehingga fluorofor akan terlepas dan terbaca fluorosensinya ketika dilakukan pengukuran dengan menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang 325/393 nm yang menunjukkan aktivitas enzim. Semakin tinggi fluorosensi yang terbaca menunjukkan semakin tinggi pula aktivitas enzim dalam memotong ikatan peptida pada substrat (Nicolotti, 2012). Senyawa turunan arilamida-5 memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim MMP-9 yang ditunjukkan dengan persentase penghambatan sebesar 93% pada konsentrasi 200 µg/mL. Senyawa turunan arilamida-5 menunjukkan persentase penghambatan lebih dari 50 %, sehingga dapat ditentukan nilai IC50nya. IC50 merupakan konsentrasi terkecil dari sampel yang dapat menghambat aktivitas enzim sedikitnya 50%. Nilai IC50 didapatkan dengan membuat 4 seri konsentrasi larutan, yaitu 50, 100, 200, dan 300 µg/mL. Kurva hubungan log konsentrasi turunan arilamida-5 dengan persentase inhibisi ditunjukkan pada Gambar 9. Kurva tersebut menunjukkan peningkatan konsentrasi sampel proporsional terhadap persentase inhibisi enzim MMP-9. Secara statistik, korelasi dapat dikatakan kuat karena memiliki r2 sebesar 0,989. Berdasarkan non-regresi linier polinomial, diperoleh persamaan y = -169,6x2 + 807,6x – 878,0. y adalah persentase inhibisi dan x adalah log konsentrasi sampel. Untuk mendapatkan nilai IC50, angka 50 dimasukkan sebagai y sehingga diperoleh x sebagai konsentrasi minimal yang menghambat 50% aktivitas enzim MMP-9. Menurut Zhu et al., 17

(33) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI (2013), spektrum aktivitas secara umum untuk aktivitas biologi dari suatu senyawa dibagi menjadi 6 yaitu <1 µM (sangat aktif), 1-25 µM (aktif), 25-50 µM (sedang), 50-100 µM (rendah), 100-500 µM (sangat rendah), dan >500 µM (tidak aktif). IC50 yang terhitung adalah 199 µM sehingga aktivitas dari senyawa turunan arilamida-5 termasuk dalam kategori aktivitas rendah. Namun Zhu et al., (2013) juga menyebutkaan dalam review-nya bahwa terdapat 56 publikasi penelitian yang menyatakan bahwa IC50 100-500 µM sudah dapat dikatakan aktif untuk studi pendahuluan seperti yang dilakukan dalam penelitian ini. Sintesis dan uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5 merupakan studi pendahuluan yang belum pernah dilakukan sebelumnya. Sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa turunan arilamida-5 aktif dalam menghambat enzim MMP-9 secara in vitro. Tabel II menyajikan pengolahan data uji aktivitas in vitro arilamida-5. Tabel II. Perhitungan %penghambatan turunan arilamida-5 terhadap MMP-9 Sampel Reading 1 Reading 2 Reading 3 Purata Blanko 9683 9349 9217 9416 Kontrol Negatif 32989 33687 30321 32332 Kontrol Positif 5946 5946 7898 6597 Senyawa Turunan 10903 11453 10444 10933 Arilamida-5 Sampel Purata – Aktivitas Inhibisi Blanko Enzim (%) Enzim (%) Kontrol Negatif (KN) 22916 100 0 Kontrol Positif (KP) -2819 -12 112 Senyawa Turunan Arilamida- 1517 7 93 Blanko (B) 5 (S) 18

(34) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Log konsentrasi Gambar 11. Kurva hubungan log konsentrasi turunan arilamida-5 dengan %penghambatan KESIMPULAN Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa turunan arilamida-5 dapat disintesis dengan mereaksikan sulfamerazin dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA). Senyawa turunan arilamida-5 memiliki aktivitas penghambatan terhadap enzim MMP-9 setelah melalui uji in vitro. Pada uji aktivitas in vitro menunjukkan persentase penghambatan sebesar 93% pada konsentrasi 200 µg/mL dan nilai IC50 sebesar 199 µM dalam menghambat aktivitas enzim MMP-9 sedikitnya 50%. SARAN Berdasarkan hasil dari uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5 dalam menghambat enzim MMP-9, dapat dilakukan penelitian lebih lanjut yaitu uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-5 pada sel kanker payudara MDA MB-231. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis berterima kasih kepada Indonesia Toray Science Foundation (ITSF) Periode 2017-2018 dan Divisi Penelitian & Pengembangan BEMF Farmasi USD 2018 atas dukungan dana untuk penelitian ini. 19

(35) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Adegoke, O.A., 2011. Analytical, Biochemical, and Synthetic Applications of Para-Dimethylaminobenzaldehyde. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 11 (2), 17-29. Adhipandito, C.F., 2017. Sintesis Analog Purin (FFUSD-001) dan Studi In Silico Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 Hemopexin Domain sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma. Arifiyanto, A., 2001. Pengaruh Penambahan Basa Natrium Hidroksida dan Piridin dalam Sintesis Benzoilanilida. Skripsi. Universitas Sanata Dharma. Alford, V.M., Kamath, A., Ren, X., Kumar, K., Gan, Q., Awwa, M., et al., 2017. Targeting the Hemopexin-like Domain of Latent Matrix Metalloproteinase-9 (proMMP-9) with a Small Molecule Inhibitor Prevents the Formation of Focal Adhesion Junctions. ACS Chemical Biology, 12, 1-44. Bauvois, B., 2012. New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers: Outside-in signaling and relationship to tumor progression. Biochimica et Biophysica Acta, 1825, 29-36. Cathcart, J., Pulkoski-Gross, A., dan Cao, J., 2015. Targeting matrix metalloproteinases in cancer: Bringing new life to old ideas. Genes & Diseases, 2, 26-34. Dirjen POM RI. 2014. Farmakope Indonesia. Edisi V. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta. Dona, A.C., Kyriakides, M., Scottb, F., Shephardb, E.A., Varshavic, D., Veselkov, K., dan Everettc, J.R., 2016. A guide to the identification of metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal, 19. Dufour, A., Zucker, S., Sampson, N.S., Kuscu, C., dan Cao, J., 2010. Role of Matrix Metalloproteinase-9 Dimers in Cell Migration: Design of Inhibitory Peptides. Journal of Biological Chemistry, 285 (46), 3594435956. Dufour, A., Sampson, N.S., Li, J., Kuscu, C., Rizzo, R.C., DeLeon, J.L., et al., 2011. Small-Molecule Anticancer Compounds Selectively Target the Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9. Cancer Research, 71 (14), 4977-4988. Koltunov, K.Y., Sobolev, V.I., dan Bondareva, V.M., 2016. Oxidation, oxidative esterification and ammoxidation of acrolein over metal oxides: Do these reactions include nucleophilic acyl substitution?. Catalysis Today, 279, 1-5. Ludji, D.P.K.S., 2017. Sintesis Analog Purin (FUSD-002) dan Studi In Silico Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 Hemopexin Domain sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma. 20

(36) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Mehner, C., Hockla, A., Miller, E., Ran, S., Radisky, D.C., dan Radisky, E.S., 2014. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer. Oncotarget, 5 (9), 2736-2749. Merdad, A., Karim, S., Schulten, H.J., Dallol, A., Buhmeida, A., Al-Thubaity, F., et al., 2014. Expression of Matrix Metalloproteinases (MMPs) in Primary Human Breast Cancer: MMP-9 as a Potential Biomarker for Cancer Invasion and Metastasis. Anticancer Research, 34, 1355-1366. Mohrig, J.R., Alberg, D.G., Hofmeister, G.E., Schatz, P.F., dan Hammond, C.N., 2014. Laboratory Techniques in Organic Chemistry: Supporting InquiryDriven Experiments. 4th Edition. W.H. Freeman and Company. USA. Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A., et al., 2012. Design, synthesis and biological evaluation of 5-hydroxy, 5substituted pyrimidine-2,4,6-triones as potent inhibitors of gelatinases MMP-2 and MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry, 58, 368-376. O’Neil, M.J., Smith,A., Heckelman, P.E., Obenchain Jr., J.R., Gallipeau, J.A.R., et al., 2001. The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. 13th Edition. MERC & CO., INC. 1406. Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S., dan Vyvyan, J.R., 2015. Introduction To Spectroscopy. 5th Edition. Cengage Learning. United States of America. Pecorino, L., 2012. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and Therapeutics. 3rd Edition. Oxford University Press. United Kingdom. Prajapat, G., Gupta, R., dan Bhojak, N., 2018. Thermal, Spectroscopic and Antimicrobial Properties of Novel Nickel (II) Complexes with Sulfanilamide and Sulfamerazine Drugs. Chemical Science International Journal., 24 (2), 1-13. Silverstein, R.M., Webster, F.X., dan Kiemle, D.J., 2005. Spectrometric Identification of Organic Compound. 7th Edition. John Wiley & Sons, Inc. USA. Sun, M., Dai, W., dan Liu, Q.D., 2008. Fragmentation of aromatic sulfonamides in electrospray ionization mass spectrometry: elimination of SO2 via rearrangement. Journal of Mass Spectrometry, 43, 383-393. Supratman, U., 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Widya Padjadjaran. Indonesia. Triono, S., 2007. Konsultasi GC-MS. Wawancara oleh Maywan Hariono pada tahun 2007 di Fakultas MIPA Kimia Universitas Gadjah Mada. Vandenbroucke, R.E., dan Libert, C., 2014. Is there new hope for therapeutic matrix metalloproteinase inhibition. Nature Reviews Drug Discovery, 3. 21

(37) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Vollhardt, P. dan Schore, N., 2014. Organic Chemistry Structure and Function. 7th Edition. W. H. Freeman and Company. USA. Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., dan Gaboury, L.A., 2014. MMP-9 expression varies according to molecular subtypes of breast cancer. BMC Cancer, 14 (609), 1–12. Zhu, T., Cao, S., Su, P.C., Patel, R., Shah, D., Chokshi, H.B., et al., 2013. Hit Identification and Optimization in Virtual Screening: Practical Recommendations Based Upon a Critical Literature Analysis. Journal of Medicinal Chemistry, 56 (17), 7. 22

(38) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LAMPIRAN Lampiran 1. Tahap ahap sintesis senyawa turunan arilamida-5 a 5 setelah dilakukan proses oses pengadukan selama 30 menit Lampiran 2. Mekanisme reaksi antara sulfamerazin dengan DAB DAB-HCl asa Schiff yang berwarna jingga membentuk basa 23

(39) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 3. Hasil uji DAB-HCl dengan sulfamerazin (A) dan senyawa turunan arilamida-5 (B). Pembentukan basa Schiff ditandai dengan warna jingga A B Lampiran 4. Perhitungan Bahan Sintesis dan Hasil Rendemen Senyawa Turunan Arilamida-5 Perhitungan bahan: 1. Sulfamerazin digunakan x 3,59 mmol = 0,00359 mol Berat molekul = 264,30 g/mol  0,00359 mol x 264,30 g/mol = 0,95 g 2. Piridin digunakan x 7,18 mmol = 0,00718 mol Berat molekul = 79,1 g/mol Massa jenis = 0,982 g/mL  0,00718 mol x 79,1 g/mol = 0,57 g atau 0,57 g:0,982 g/mL = 0,58 mL 3. 3-bromopropionil klorida digunakan x 5,39 mmol = 0,00539 mol Berat molekul = 171,418 g/mol Massa jenis = 1,701 g/mL  0,00539 mol x 171,418 g/mol = 0,92 g atau 0,92 g:1,701 g/mL = 0,61 mL Hasil rendemen: Senyawa turunan arilamida-5 yang seharusnya (teoritis) = 0,00359 mol x 399,225 g/mol = 1,43 g Senyawa turunan arilamida-5 = = , , x 100% x 100% = 67,13 % 24

(40) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 5. Perbesaran pada sinyal 2,85 ppm (integrasi= 2) dan 2,98 ppm (integrasi= 2) menunjukan sinyal triplet of triplet. Integrasi= 2 menandakan bahwa terdapat 2 atom H yang terdeteksi yaitu proton HB dari senyawa turunan arilamida-5 Lampiran 6. Perbesaran pada sinyal 3,72 ppm (integrasi= 2) dan 3,87 ppm (integrasi= 2) menunjukan sinyal triplet of triplet. Integrasi= 2 menandakan bahwa terdapat 2 atom H yang terdeteksi yaitu proton HA dari senyawa turunan arilamida-5 25

(41) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 7. Perbesaran pada sinyal 7,76 ppm (integrasi= 2) dan 7,93 ppm (integrasi= 2) menunjukan sinyal doublet. Integrasi= 2 menandakan bahwa terdapat 2 atom H yang terdeteksi yaitu proton HC (7,76 ppm) dan HD (7,93 ppm) dari senyawa turunan arilamida-5 Lampiran 8. Perbesaran pada sinyal 7,62 ppm (integrasi= 1) dan 8,31 ppm (integrasi= 1) menunjukan sinyal doublet dan triplet. Integrasi= 1 menandakan bahwa terdapat 1 atom H yang terdeteksi yaitu proton HE (8,31 ppm) dan HF (7,62 ppm) dari senyawa turunan arilamida-5 26

(42) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 9. Mekanisme pola fragmentasi m/z 334 senyawa turunan arilamida arilamida-5 pada kromatografi gas gas-spektrometri massa Lampiran 10. Mekanisme pola fragmentasi base peak m/z 55 senyawa turunan gas-spektrometri massa arilamida-55 pada kromatografi gas 27

(43) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 11. Rancangan microwell plate untuk uji aktivitas in vitro 1 2 3 4 5 6 7 8 9 B43 B43 B43 B45 B45 B45 KP2 KP2 KP2 A B100 B100 B100 E5 E5 E5 E5 E5 E5 S50 S50 S50 S50 S50 S50 B44 B44 B44 STA1 STA1 STA1 B E5 E5 E5 S50 S50 S50 C D E F G H Keterangan: B100 = Dapar 100 µL B45 = Dapar 45 µL B44 = Dapar 44 µL B43 = Dapar 43 µL E5 = Enzim 5 µL S50 = Substrat 50 µL KP2 = Kontrol Positif (NNGH inhibitor) 2 µL STA1 = Senyawa Turunan Arilamdia-5 1 µL 28 10 11 12

(44) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 12. Perhitungan Nilai IC50 Senyawa Turunan Arilamida-5 1. Perhitungan purata dari 3 reading semua sampel Sampel Blanko Kontrol Negatif Konsentrasi 50 µg/mL Konsentrasi 100 µg/mL Konsentrasi 200 µg/mL Konsentrasi 300 µg/mL Reading 1 9683 40684 42337 18355 17306 15205 Reading 2 9349 41975 41688 25247 16518 15348 Reading 3 9217 41625 37109 21114 16267 13311 Purata 9416 41428 40378 21572 16697 14621 2. Perhitungan persentase aktivitas enzim dan persentase inhibisi enzim Purata Blanko 32012 30962 12156 7281 5205 Sampel Kontrol Negatif Konsentrasi 50 µg/mL Konsentrasi 100 µg/mL Konsentrasi 200 µg/mL Konsentrasi 300 µg/mL Aktivitas Enzim (%) 100 97 38 23 16 Inhibisi Enzim (%) 0 3 62 77 84 3. Perhitungan log konsentrasi sebagai x dan persentase inhibisi enzim sebagai y untuk kurva regresi non linier Konsentrasi Sampel 50 µg/mL 100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL Log Konsentrasi (x) 1,7 2,0 2,3 2,5 %Inhibisi Enzim (y) 3 62 77 84 4. Perhitungan SD dari persentase inhibisi enzim pada 4 konsentrasi senyawa turunan arilamida-5 Konsentrasi Sampel R1 50 R2 µg/mL R3 R1 100 R2 µg/mL R3 R1 200 R2 µg/mL R3 Reading 42337 41688 37109 18355 25247 21114 17306 16518 16267 Reading Blanko 32921 32272 27693 8939 15831 11698 7890 7102 6851 29 %Aktivitas %Inhibisi Enzim Enzim 103 -3 101 -1 87 13 28 72 49 51 37 63 25 75 22 78 21 79 SD 9 11 2

(45) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI R1 R2 R3 300 µg/mL 15205 15348 13311 5789 5932 3895 18 19 12 5. Persamaan regresi non linier y = 50 untuk IC50 y = -169,6x2 + 807,6x – 878,0 50 = -169,6x2 + 807,6x – 878,0 0 = -169,6x2 + 807,6x – 878,0 - 50 0 = -169,6x2 + 807,6x – 928 6. Perhitungan nilai IC50 ±√ X1,2 = X1,2 = , ± X1,2 = , ±√ X1,2 = , ±√ X1,2 = , X1 = , X1 = , , ± , ( , , ( , , , , , , , ) , )( ; X2 = ; X2 = X1 = 1,9 ; X2 = 2,8 , ) , , , , , AntiLog X1 = 101,9 = 79,4 ppm AntiLog X2 = 102,8 = 631 ppm 7. Perhitungan nilai IC50 dalam satuan mikromolar (µM) X= X1 = X2 = , x 1000 x 1000 = 199 µM x 1000 = 1582 µM 30 82 81 88 4

(46) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi dengan judul “Sintesis Turunan Arilamida-5 dan Uji Aktivitas In Vitro terhadap Enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara” bernama lengkap Reynaldo Tiara. Penulis merupakan anak sulung dari pasangan Andry Yatti dan Linda Sunarto. Penulis lahir di Bandung, 23 Agustus 1997. Pendidikan formal penulis diawali di TKK BPK Penabur Cirebon (2002-2003), kemudian melanjutkan pendidikan ke SDK BPK Penabur Cirebon (2003-2009), SMPK 1 BPK Penabur Cirebon (2009-2012), dan SMAK Terang Bangsa Cirebon (2012-2015). Pendidikan dilanjutkan hingga perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat dalam beberapa kegiatan organisasi dan kepanitiaan, antara lain anggota divisi Pengabdian Masyarakat Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas (BEMF) Farmasi 2016, koordinator divisi Publikasi dan Dokumentasi kegiatan PROTON 2017, koordinator divisi Konsumsi kegiatan Faction 2016, anggota divisi Perlengkapan kegiatan DESA MITRA 2015 serta menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Sel dan Molekuler (2016), Mikrobiologi Farmasi (2017), Kimia Analisis (2017 dan 2018), Kimia Organik (2018), dan FarmakologiToksikologi (2018). Penulis mengikuti beberapa perlombaan tingkat nasional antara lain sebagai Peserta PICS 2017 di Institut Teknologi Bandung dan Peserta Poster Competition Pharmacious 2018 di Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. 31

(47)

Dokumen baru

Download (46 Halaman)
Gratis

Tags

Dokumen yang terkait

Analisis in vitro toleransi isolat bakteri asam laktat asal daging sapi terhadap pH lambung, pH usus dan garam empedu sebagai kandidat probiotik
0
13
62
Pengaruh ekstrak tempuyung (Sonchus arvensis) terhadap aktivitas xantin oksidase secara in vitro sebagai dasar uji kinetika
1
13
52
Daya inhibisi ekstrak air dan etanol temu putih (Curcuma zedoaria) terhadap aktivitas enzim tirosin kinase secara in vitro
0
6
22
Daya inhibisi ekstrak daging buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) terhadap aktivitas enzim tirosin kinase secara in vitro
0
3
15
Sintesis dan uji sitotoksik in vitro senyawa 2-Hidroksinikotinil oktilamida terhadap sel kanker leukimia murin p388
0
2
9
isolasi dan uji aktivitas enzim lipase termostabil dari bekteri termofilik pasca erupsi merapi
0
0
11
Sintesis o-(4-bromobenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
15
Sintesis O-(3,4-diklorobenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
15
Sintesis o-(4-metilbenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (Mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
15
Sintesis o-(4-klorobenzoil)piroksikam dan uji aktivitas analgesik pada mencit (mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
27
Sintesis o-(4-nitrobenzoil)piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
14
Sintesis O-(4-fluorobenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (Mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
15
Sintesis O-(4-fluorobenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (Mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
16
Uji potensi ekstrak etanol daun salam (syzygium polyanthum) hasil soxhletasi terhadap aktivitas inhibisi enzim HMG-COA reductase secara in vitro - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
11
Sintesis turunan arilamida-1 dan uji aktivitas in vitro terhadap Enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) sebagai kandidat anti-kanker payudara - USD Repository
0
0
41
Show more