VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)- DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT) “RHEUMAKUR

Gratis

0
0
123
7 months ago
Preview
Full text

  

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-

DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM

SEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT)

“RHEUMAKUR

  ®

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Andreas Suseno Wimbo Hapsoro NIM : 078114057

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2011

  

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-

DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM

SEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT)

“RHEUMAKUR

  ®

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Andreas Suseno Wimbo Hapsoro NIM : 078114057

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2011

  

Karya ini kupersembahkan bagi

kedua orang tuaku, adikku,

teman-teman dan almamaterku

yang luar biasa

  

PRAKATA

  Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang penuh kasih, karena berkat dan kasih karunia-Nya maka skripsi berjudul “VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT) RHEUMAKUR

  ®

  ” ini dapat diselesaikan oleh penulis. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  Selama penyusunan skripsi ini, banyak pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikannya, maka pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Ipang Djunarko, S.Si, Apt, M.Sc selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah banyak meluangkan waktunya dalam memberikan masukan, kritik, solusi, semangat baik selama penelitian, penyusunan skripsi maupun saat perkuliahan.

  3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Pembimbing Akademik dan Dosen Penguji yang telah banyak memberikan masukan dan semangat baik selama penyusunan skripsi maupun dalam perkuliahan.

  4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran, kritik dan semangat dalam penyusunan skripsi ini maupun dalam perkulihan.

  5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pengajar mata kuliah Validasi Metode Analisis sehingga sangat membantu dalam penyusunan skripsi, serta telah memberikan senyawa baku kurkumin kepada penulis sehingga sangat berguna dalam penelitian

  6. Dr.C.J. Soegihardjo, Apt. atas saran dan diskusi yang telah diberikan dalam penyusunan skripsi.

  7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman yang berharga sehingga berguna dalam proses penyusunan skripsi.

  8. Theresia Weliana Kosasih dan Lilis Dumaria Pasaribu selaku teman seperjuangan selama penelitian dan penyusunan skripsi.

  9. Eliz, Yunita, Venny, Katiti, Lala, Toro, Katarina, Benny, dan Dian selaku teman yang melakukan penelitian dalam satu tema yang sama, terima kasih atas dukungannya.

  10. Seluruh staf laboratorium kimia: Bimo, Kunto, Parlan, dan Wagiran yang telah membantu penulis selama penelitian di laboratorium.

  11. Cinthya, Yosafat, Edhi, Siska, Dika, Bella, Vivi, Robby, Tika, dan Puput selaku teman yang sering bekerja kelompok bersama penulis, terima kasih atas kerjasama, pengalaman, dan semangat yang luar biasa selama ini.

  12. Kak Dewi, Grace, Zi, dan Bayu, atas laporan dan saran yang sangat berguna bagi perkuliahan maupun penyusunan skripsi.

  13. Teman-teman FST angkatan 2007 dan kelompok KKN 23 angkatan XL atas pengalaman dan kebersamaannya.

  14. Semua pihak yang telah membantu penulis dan tidak tertulis di sini, terima kasih atas semua dukungan dan bantuannya.

  Penulis menyadari bahwa skripsi yang disusun ini masih banyak memiliki kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran untuk perbaikan dan perkembangan selanjutnya. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat demi perkembangan ilmu pengetahuan.

  Yogyakarta, 11 Januari 2011 Penulis

  

DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL................................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN................................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................................v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH.. vi PRAKATA............................................................................................................ vii DAFTAR ISI............................................................................................................x DAFTAR TABEL................................................................................................ xiv DAFTAR GAMBAR .............................................................................................xv DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xvii

  INTISARI........................................................................................................... xviii

  

ABSTRACT ........................................................................................................... xix

  BAB I PENGANTAR ..............................................................................................1 A. Latar Belakang ...................................................................................................1

  1. Permumusan masalah...................................................................................3

  2. Keaslian penelitian .......................................................................................3

  3. Manfaat penelitian........................................................................................4

  B. Tujuan Penelitian ...............................................................................................5

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.......................................................................6 A. Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar ..............................................................6

  B. Standarisasi Ekstrak ...........................................................................................7

  C. Ekstrak Rimpang Kunyit....................................................................................9

  D. Kurkumin ...........................................................................................................9

  E. Kromatografi Lapis Tipis.................................................................................16

  1. Kromatografi lapis tipis (KLT) secara umum............................................16

  2. Jenis fase diam dan fase gerak KLT ..........................................................16

  3. Migrasi dan retensi solut ............................................................................17

  4. Pemisahan kromatografi lapis tipis ............................................................17

  5. Proses sorpsi-adsorpsi ................................................................................18

  6. Profil puncak dan pelebaran puncak ..........................................................21

  7. Puncak asimetri ..........................................................................................23

  8. Resolusi kromatogram ...............................................................................24

  9. Analisis kualitatif .......................................................................................25

  10. Analisis kuantitatif .....................................................................................26

  11. Aplikasi penotolan sampel .........................................................................27

  F. Densitometri.....................................................................................................28

  G. Validasi Metode Analisis .................................................................................32

  1. Parameter validasi metode .........................................................................32

  2. Kategori metode analisis ............................................................................38

  H. Landasan Teori.................................................................................................39

  I. Hipotesis...........................................................................................................40

  BAB III METODE PENELITIAN.........................................................................41 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .......................................................................41

  B. Variabel dan Definisi Operasional ...................................................................41

  1. Klasifikasi variabel.....................................................................................41

  2. Definisi operasional ...................................................................................42

  C. Bahan................................................................................................................42

  D. Alat...................................................................................................................43

  E. Cara Penelitian .................................................................................................43

  1. Pembuatan metanol pH 4 ...........................................................................43

  2. Pengaktifan silika gel G 60 ........................................................................43

  3. Pembuatan dan penjenuhan fase gerak ......................................................43

  4. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum...................................44

  5. Penentuan kurva baku kurkumin................................................................44

  6. Penetapan perolehan kembali (recovery) dan koefisien variasi (KV) baku kurkumin ...........................................................................................45

  7. Penentuan selektivitas kurkumin dalam sampel serta akurasi dan presisi baku yang ditambahkan ke dalam sampel ......................................46 F. Analisis Hasil ...................................................................................................47

  1. Selektivitas .................................................................................................47

  2. Linearitas dan rentang ................................................................................48

  3. Akurasi baku kurkumin..............................................................................48

  4. Presisi baku kurkumin................................................................................49

  5. Akurasi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam sampel ...................49

  6. Presisi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam sampel .....................49

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................................51

  A. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum Kurkumin .....................52

  B. Pengamatan Profil Kromatogram Baku Kurkumin..........................................55

  C. Preparasi Sampel dan Pengamatan Profil Kromatogram Kurkumin dalam Sampel..............................................................................................................59

  D. Pembuatan Kurva Baku....................................................................................63

  E. Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri ...............................65

  1. Selektivitas .................................................................................................65

  2. Linearitas dan rentang ................................................................................67

  3. Akurasi .......................................................................................................68

  4. Presisi .........................................................................................................69

  F. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin dalam Sampel ......................69

  BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................................72 A. Kesimpulan ......................................................................................................72 B. Saran.................................................................................................................72 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................73 LAMPIRAN...........................................................................................................77 BIOGRAFI PENULIS .........................................................................................103

  

DAFTAR TABEL

  Tabel I. Daftar fase gerak ...............................................................................16 Tabel II. Parameter-parameter aplikasi penotolan yang direkomendasikan....27 Tabel III. Rentang kesalahan perolehan kembali yang diperbolehkan .............35 Tabel IV. Kriteria yang diperbolehkan untuk presisi pada kadar analit yang berbeda .....................................................................................36 Tabel V. Kategori Analisis Kimia ...................................................................39 Tabel VI. Data pengukuran panjang gelombang serapan maksimum kurkumin...........................................................................................54 Tabel VII. Data nilai R f baku dan sampel ..........................................................60 Tabel VIII. Data kurva baku kurkumin ...............................................................63 Tabel IX. Resolusi puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2.....................67 Tabel X. Hasil penentuan perolehan kembali (recovery) kurkumin baku .......68 Tabel XI. Hasil penentuan KV kurkumin baku ................................................69 Tabel XII. Perolehan kembali dan KV baku kurkumin dalam sampel...............70 Tabel XIII. Perbandingan AUC kurkumin dalam sampel dan kurkumin dalam sampel yang ditambah baku ...................................................70 Tabel XIV. Perbandingan tinggi puncak kurkumin dalam sampel dan kurkumin dalam sampel yang ditambah baku ..................................71

  

DAFTAR GAMBAR

  Gambar 1. Logo Obat Herbal Terstandar (OHT) .................................................7 Gambar 2. Seyawa Kurkumin, Demetoksi Kurkumin, dan Bis-demetoksi kurkumin...........................................................................................10 Gambar 3. Isomer geometrik cis-trans dari kurkumin .......................................10 Gambar 4. Tautomerisasi bentuk keto-enol senyawa kurkuminoid ...................12 Gambar 5. Strukutur kimia kurkumin dalam berbagai pH .................................13 Gambar 6. Produk degradasi kurkumin pada pH alkali......................................14 Gambar 7. Struktur trans-6-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl )-2,4-dioxo-5-

  hexenal ..............................................................................................15

  Gambar 8. Produk fotodegradasi kurkumin........................................................15 Gambar 9. Cara penentuan harga R f ...................................................................18 Gambar 10. Interaksi antara analit dengan fase diam silika gel ...........................19 Gambar 11. Keadaan simetris dan pelebaran puncak kromatogram ....................22 Gambar 12. Ilustrasi 3 prinsip utama yang menggambarkan puncak; (a).

  Pengaruh lintasan ganda (multiple-path effect); (b). Pengaruh difusi longitudinal; (c). Pengaruh transfer massa .............................22 Gambar 13. Isoterm sorpsi serta profil-profil puncak yang dihasilkan. (a).

  Isoterm linier (b). Puncak tailing dan (c). Puncak fronting ..............23 Gambar 14. Ilustrasi resolusi pada KLT: (a) kromatogram; (b) profil kromatografi masing-masing bercak ................................................24 Gambar 15. Pengukuran resolusi 2 puncak yang berdekatan ...............................25

  Gambar 16. Pemantulan sinar...............................................................................29 Gambar 17. Gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kurkumin................53 Gambar 18. Kromatogram panjang gelombang maksimum kurkumin ................54 Gambar 19. Kromatogram baku kurkumin 260 ppm............................................56 Gambar 20. Gugus polar dan gugus non polar pada kurkumin ............................56 Gambar 21. Interaksi hidrogen antara kurkumin dengan fase diam .....................57 Gambar 22. Interaksi kurkumin dengan fase gerak ..............................................57 Gambar 23. Interaksi antara asam asetat glasial dengan silika gel.......................58 Gambar 24. Perbandingan kromatogram sampel (A) dan kromatogram baku kurkumin (B).....................................................................................60 Gambar 25. Ilustrasi keadaan kesetimbangan pada pemisahan senyawa A

  (kurkumin) dengan senyawa lainnya ................................................61 Gambar 26. Hubungan antara konsentrasi kurkumin dengan AUC/50

  ( replikasi I).......................................................................................65 Gambar 27. Nilai Rs puncak kurkumin sampel dan kesamaan R baku

  f

  dengan puncak kurkumin pada sampel .............................................66

  

DAFTAR LAMPIRAN

  Lampiran 1. Sertifikat analisis baku kurkumin...................................................78 Lampiran 2. Hasil uji pH stabilitas kurkumin.....................................................79 Lampiran 3. Hasil kromatogram pengukuran panjang gelombang serapan maksimum ......................................................................................81 Lampiran 4. Sistem KLT-Densitometri yang digunakan....................................84 Lampiran 5. Kromatogram kurva baku kurkumin ..............................................86 Lampiran 6. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku ................88 Lampiran 7. Kromatogram hasil validasi metode...............................................90 Lampiran 8. Data penimbangan dan contoh perhitungan recovery ....................93 Lampiran 9. Contoh perhitungan SD dan CV .....................................................95 Lampiran 10. Kromatogram penentuan akurasi dan presisi baku dalam sampel..96 Lampiran 11. Data perhitungan nilai resolusi antara puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2 dan contoh perhitungannya ............................100 Lampiran 12. Data dan contoh perhitungan nilai recovery dan CV baku dalam matriks sampel..............................................................................101

  

INTISARI

  Kurkumin merupakan senyawa polifenol yang memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi namun tidak stabil terhadap pH di atas 7 dan paparan cahaya. Kandungan kurkumin dalam ekstrak kunyit dimanfaatkan dalam produksi sediaan kapsul lunak Obat Herbal Terstandar (OHT). Oleh karena itu, stabilitas kadar kurkumin pada saat distribusi dan penyimpanan sediaan OHT penting untuk diketahui.

  Metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT dilakukan secara KLT-Densitometri. Sistem KLT-Densitometri yang digunakan adalah fase normal dengan fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 :5) v/v dan fase diam silika gel G 60 yang diukur pada 425 nm.

  Parameter validasi metode yang ditentukan adalah selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang. Hasil penelitian validasi baku menunjukkan metode KLT-Densitometri memiliki selektivitas yang baik dengan nilai resolusi pada pemisahan sampel adalah 2,2399. Metode ini memiliki linearitas yang baik pada konsentrasi kurkumin 100 – 500 ppm (r = 0,9996) dan rentang 260 - 500 ppm. Perolehan kembali dan KV untuk kadar rendah, sedang dan tinggi berturut-turut adalah 104,07%, 2,72%; 99,28%, 0,34%; dan 100,11%, 0,79%. Hasil validasi baku dalam matriks sampel memiliki perolehan kembali dan KV berturut-turut yaitu 102,07% dan 3,64%.

  Kata kunci : kurkumin, kapsul lunak OHT, KLT-densitometri

  

ABSTRACT

  Curcumin is a polyphenol compound which has activity as an anti- inflammatory but not stable to pH above neutral and light exposure. The content of curcumin in turmeric extract used in the production of Scientific Based Herbal Medicine (SBHM) soft capsule. Therefore, the stability of curcumin content during distribution and storage of SBHM dosage form important to know.

  Curcumin content determination method performed by TLC- Densitometry. TLC-Densitometry system used is a normal phase with mobile phase chloroform: glacial acetic acid: hexane (85: 10: 5) v/v and stationary phase silica gel G 60 that was measured at 425 nm.

  Specified validation parameters are selectivity, linearity, accuracy, precision, and range. The results show the validation of raw-Densitometry TLC method has good selectivity with the resolution of the separation of the sample is 2.2399. This method has good linearity of concentrations of curcumin from 100 to 500 ppm (r = 0.9996) and range about 260 – 500 ppm. The recoveries and CV for low, medium and high concentration respectively is 104.07%, 2.72%, 99.28%, 0.34%, and 100.11%, 0.79%. The validation raw material in the sample matrix had the recovery and CV, respectively, are 102.07% and 3.63%.

  Key words: curcumin, SBHM soft capsule, TLC-densitometry

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kurkumin merupakan senyawa polifenol berwarna kuning oranye yang

  berkhasiat sebagai analgesik-antiinflamasi. Kurkumin yang terkandung dalam ekstrak simplisia rimpang kunyit (Curcumae domesticae Rhizoma) ditemukan bersama kedua turunannya yaitu demetoksi kurkumin dan bis-demetoksi kurkumin. Beberapa perusahaan telah mempergunakan kunyit sebagai bahan dasar pembuatan Obat Herbal Terstandar (OHT) (Usia, 2010).

  Dalam dua dasawarsa terakhir penggunaan obat tradisional mengalami perkembangan yang sangat pesat (Usia, 2010). Minat masyarakat terhadap sediaan obat tradisional meningkat karena sediaan obat tradisonal diyakini sebagai obat alam yang memiliki akses hingga seluruh lapisan masyarakat, selain itu harganya terjangkau bagi seluruh lapisan masyarakat. Oleh karena itu, Badan Pengawas Obat dan Makanan melakukan peningkatan mutu obat tradisional melalui standarisasi bahan baku dan uji praklinik menjadi produk OHT (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1994).

  Salah satu produk OHT yang mengandung kurkumin sebagai senyawa

  ® ®

  aktif dominan adalah Rheumakur . Rheumakur mengandung kurkuminoid (10

  ®

  mg) dan minyak atsiri dari ekstrak kunyit dan temulawak (100 mg). Rheumakur merupakan salah satu obat tradisional dalam sediaan kapsul lunak.

  2 Senyawa aktif yang diteliti pada penelitian ini adalah kurkumin. Kurkumin memiliki stabilitas yang rendah terhadap pH dan paparan cahaya (Stankovic, 2004). Hal ini mempengaruhi mutu sediaan karena kurkumin menjadi tidak stabil dalam proses distribusi dan penyimpanan sehingga dimungkinkan kadar kurkumin menjadi berkurang. Kadar kurkumin yang berkurang akan berpengaruh terhadap besarnya efek antiinflamasi yang ditimbulkan. Mutu sediaan OHT akan terjamin apabila jumlah dan kadar senyawa aktif pada setiap sediaan yang didistribusikan seragam dan sesuai dengan yang tertera pada kemasan. Untuk itu diperlukan penetapan kadar kurkumin dalam kapsul lunak

  ®

  OHT merk Rheumakur pada nomor batch yang sama namun berbeda apotek untuk mengetahui stabilitas kurkumin dalam penyimpanan.

  Penelitian ini merupakan serangkaian proses yaitu optimasi, validasi metode dan penetapan kadar kurkumin. Metode yang dilakukan pada penelitian analisis kurkumin ini adalah KLT-densitometri. Sistem KLT yang digunakan merupakan fase normal dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) yang merupakan hasil optimasi. Metode yang digunakan adalah KLT-densitometri karena memiliki kelebihan yaitu dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif secara simultan.

  Validasi metode diperlukan untuk membuktikan bahwa parameter

  

metode analisis yang dilakukan memenuhi persyaratan sesuai dengan yang

diharapkan. Parameter-parameter yang harus dipenuhi meliputi akurasi, presisi,

  selektivitas, linearitas dan rentang. Nilai yang baik untuk akurasi baku kurkumin

  3 ditentukan melalui perhitungan perolehan kembali (98-102%), presisi baku kurkumin ditentukan melalui perhitungan koefisien variasi (<2%), selektivitas ditentukan melalui nilai resolusi (>1,5) dan kesamaan faktor retardasi sampel dan baku, serta linearitas dengan nilai r >0,999. Sedangkan akurasi dan presisi baku kurkumin dengan kadar 0,01% dalam matriks sampel yang baik secara berturut- turut ditunjukkan melalui nilai perolehan kembali 90-107% dan KV < 5,3% (Harmita, 2004; United States Pharmacopeial Convention, 1995; Yuwono dan Indrayatno, 2005).

  1. Perumusan masalah

  Berdasarkan latar belakang, maka diperoleh permasalahan sebagai berikut: Apakah metode KLT-Densitometri yang digunakan pada penetapan kadar

  ®

  kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT “Rheumakur ” memenuhi parameter validasi meliputi selektivitas, linearitas, rentang , akurasi, dan presisi?

  2. Keaslian penelitian

  Sejauh pengetahuan penulis, penelitian validasi penetapan kadar kurkumin secara KLT-densitometri yang sudah pernah dilakukan, antara lain: Penentuan kadar kurkumin secara kromatografi lapis tipis-densitometri (Martono, 1996) dalam serbuk rhizoma Curcuma longa L. dengan fase gerak kloroform : etanol : air suling (25 : 0,96 : 0,04), Simultaneous determination of curcuminoids

  

in curcuma samples using high performance thin layer chromatography (Gupta,

  Gupta, Kumar, 1999) dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5),

  

Quantitative Analysis of Curcumin, Demethoxycurcumin and

Bisdemethoxycurcumin in the Crude Curcuminoid Extract from Curcuma longa in

  4

  Thailand by TLC-Densitometry (Pothitirat, Gritsanapan, 2005) dan Occurrence of

curcuminoids in curcuma longa: a quality standardization by HPTLC

  (Paramasivam, Aktar, Poi, Banerjee, Bandyopadhyay, 2008) dengan fase gerak kloroform : metanol (48 : 2).

  Penelitian yang dilakukan penulis memiliki perbedaan terhadap penelitian yang tercantum di atas. Penulis lebih menekankan pada penjaminan mutu obat tradisional khususnya stabilitas kadar kurkumin dalam sediaan kapsul Obat Herbal Terstandar, bukan dalam simplisia maupun ekstrak. Parameter lain yang membedakan dengan penelitian sebelumnya adalam sistem fase gerak yang digunakan penulis yaitu kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) v/v.

3. Manfaat penelitian

  a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan mampu memberikan metode baru karena digunakan sistem fase gerak yang belum dilakukan pada penelitian sebelumnya. Selain itu, penelitian ini juga diharapkan dapat memberikan pemahaman mengenai parameter validasi antara lain selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi pada validasi metode penetapan kadar kurkumin secara Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri b. Manfaat praktis. Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu memberikan suatu informasi bahwa metode KLT-Densitometri dapat digunakan untuk penetapan kadar kurkumin dalam sediaan OHT.

  5

B. Tujuan Penelitian

  Tujuan dari penelitian ini secara umum adalah untuk melakukan penjaminan mutu pada sediaan obat tradisional. Penjaminan mutu dilakukan melalui penetapan kadar kurkumin. Untuk itu, tujuan penelitian ini secara khusus adalah untuk mengetahui bahwa validasi metode KLT-Densitometri pada

  ®

  penetapan kadar kurkumin dalam kapsul lunak OHT Rheumakur memenuhi parameter validasi yang baik meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Kapsul Lunak Obat Herbal Terstandar Kapsul adalah sediaan padat yang terdiri dari obat dalam cangkang keras atau lunak yang dapat larut. Kapsul cangkang lunak umumnya terbuat dari gelatin. Cangkang gelatin lunak umumnya mengandung 6% hingga 13% air. Umumnya

  kapsul cangkang lunak diisi dengan cairan. Khususnya bahan aktif dilarutkan atau disuspensikan dalam bahan pembawa cair. Digunakan pula bahan pembawa minyak seperti minyak nabati. Keunggulan kapsul cangkang lunak adalah keseragaman kandungan dan disolusi obatnya lebih baik daripada kapsul berisi serbuk kering. Namun, kontak antara cangkang lunak atau keras dengan isi zat cair lebih besar dibandingkan dengan kapsul berisi serbuk kering (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).

  Teknik pembuatan kapsul lunak yang berisi suspensi telah banyak dilakukan pada produk obat maupun nutraceutical . Formulasi suspensi membutuhkan agen pensuspensi untuk mencegah pengendapan padatan dan menjaga homogenitas dalam kapsul. Agen pensuspensi yang banyak digunakan dengan basis minyak adalah wax, contohnya adalah beeswax, sedangkan polietilen glikol untuk basis tidak berminyak. Pada industri kapsul lunak, ekstrak kering biasa dikombinasikan dengan minyak kedelai sebagai pembawa, beeswax kuning sebagai agen pensuspensi dan pengental, dan lesitin sebagai lubrikan. Jumlah

  7 ekstrak dan bahan lain bergantung pada dosis ekstrak yang hendak diadministrasikan (Naguib, 2000).

  

Gambar 1. Logo Obat Herbal Terstandar (OHT)

  Berdasarkan PERMENKES No.246/MENKES/PER/V/1990 obat tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan galenik atau campuran dan bahan-bahan tersebut, yang secara tradisional telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman. Sedangkan kapsul lunak Obat Herbal Terstandar adalah sediaan kapsul lunak obat bahan alam yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji praklinik dan bahan bakunya telah distandarisasi (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1990).

B. Standarisasi Ekstrak

  Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Ekstrak tumbuhan obat yang dibuat dari simplisia nabati dapat digunakan sebagai bahan awal, bahan antara, atau bahan produk jadi.

  Ekstrak sebagai bahan awal dianalogkan dengan komoditi bahan baku obat yang dengan teknologi fitofarmasi diproses menjadi produk jadi. Sedangkan ekstrak sebagai bahan antara merupakan bahan yang dapat diproses lagi menjadi fraksi-

  8 fraksi, isolat senyawa tunggal ataupun tetap sebagai campuran dengan ekstrak lain (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).

  Adapun jika sebagai produk jadi berarti ekstrak yang berada dalam sediaan obat jadi siap digunakan. Ekstrak tersebut bisa dalam bentuk ekstrak kering, ekstrak kental dan ekstrak cair yang proses pembuatannya disesuaikan dengan bahan aktif yang dikandung serta maksud penggunaannya, apakah akan dibuat menjadi sediaan dalam bentuk kapsul, tablet, cairan obat dalam, pil, dan lainnya (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).

  Terpenuhinya standar mutu produk atau bahan ekstrak tidak terlepas dari pengendalian proses, artinya bahwa proses yang terstandar dapat menjamin produk yang terstandar tanpa penerapan pengujian atau pemeriksaan. Untuk menjaga kualitas bahan baku obat alam perlu dilakukan usaha budidaya dan standarisasi terhadap bahan baku tersebut, baik yang berupa simplisia maupun yang berbentuk ekstrak atau sediaan galenik (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).

  Persyaratan mutu ekstrak terdiri dari berbagai parameter standar umum dan parameter standar spesifik. Pengertian standardisasi juga berarti proses menjamin bahwa produk akhir mempunyai nilai parameter tertentu yang konstan dan ditetapkan terlebih dahulu (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).

  Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid, fenolik, dan lain-lain.

  Struktur kimia yang berbeda-beda akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas

  9 senyawa-senyawa tersebut terhadap pemanasan , udara, cahaya, logam berat dan derajat keasaman (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).

C. Ekstrak Rimpang Kunyit

  Curcumae domesticae Rhizoma (rimpang kunyit) adalah rimpang

Curcuma domestica Val. Pemerian yang dimiliki yaitu berbau khas aromatik, rasa

  agak pahit, agak pedas, dan lama kelamaan menimbulkan rasa tebal. Dosis lazim rimpang Kunyit yang diperbolehkan adalah 8 mg/kg (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1977).

  Ekstrak kental rimpang kunyit adalah ekstrak yang dibuat dari rimpang tumbuhan Curcuma domestica Val., mengandung minyak atsiri ≥ 3,2% dan kurkuminoid

  ≥ 33,9% (Badan Pengawas Obat dan Makanan, 2004). Kandungan dari ekstrak rimpang Kunyit antara lain kurkuminoid, minyak atsiri, lemak 1 -3 %, karbohidrat 3%, protein 30%, pati 8%, vitamin C 45-55%, dan garam-garam mineral (Rukmana, 1994). Dalam kurkuminoid, kandungan kurkumin sebesar 77 %, demetoksi kurkumin 17 % dan bis-demetoksi kurkumin 3% (Anggarwal, 1995).

D. Kurkumin

  Kurkumin adalah senyawa aktif polifenol dengan rumus kimia C

21 H

  20 O 6 . Kurkumin memiliki nilai log P = 2,56 dan merupakan zat warna

  kuning utama (0,5 –6%) yang terdapat dalam rhizoma Curcuma longa L atau

  

Curcuma domestica Val.. Kurkumin bersama turunan demetoksinya yaitu

  10 demetoksi kurkumin (log P = 2,69) dan bis-demetoksi kurkumin (log P = 2,81) dikenal dengan nama kurkuminoid (Martono, 1996). Kurkumin memiliki panjang gelombang serapan maksimum pada 430 nm dalam pelarut metanol dan 425 nm dalam pelarut etanol (Anggarwal, 1995). Kurkumin larut dalam alkohol dan asam asetat glasial, tetapi tidak dapat larut dalam air dan eter (Windholz, 1981). Struktur kurkumin ditampilkan sebagai berikut :

  

R R

1 2 O O OH OH R = -OCH dan R = -OCH (Kurkumin) 1 3 2

3

R = -H dan R = -OCH (Demetoksi kurkumin) 1 2 3 R = -H dan R = -H (Bis-demetoksi kurkumin) 1 2 Gambar 2. Seyawa Kurkumin, Demetoksi Kurkumin, dan bis-demetoksi kurkumin

  

(Anggarwal, 1995)

  Selain konstituen mayor (kurkumin, demetoksi kurkumin, dan bis demetoksi kurkumin), konstituen minor juga dapat diisolasi yang memiliki bentuk isomer geometrikal dari senyawa 1-3 (Gambar 2). Satu dari antaranya berbentuk isomer geometrik cis-trans (Gambar 3) memiliki titik lebur, stabilitas dalam larutan dan cahaya yang lebih rendah (Stankovic, 2004).

  

Gambar 3. Isomer geometrik cis-trans dari kurkumin (Stankovic, 2004)

  11 Kurkumin memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi pada penyakit osteoartritis. Osteoartritis adalah penyakit reumatik dengan prevalensi yang terus meningkat sesuai dengan pertambahan usia. Secara klinis osteoartritis ditandai oleh nyeri, deformitas, pembesaran sendi, hambatan gerak; disamping itu juga terjadi inflamasi tingkat ringan sampai berat (Kalim, 1996; Rahardjo, 1994).

  Ekstrak rimpang kunyit dengan kadar kurkuminoid 3,66 ± 0,65 % b/b dan 25 mL minyak atsiri rimpang temulawak yang mengandung kamfora, kamfen, kurkumen, bergamoten, germakren B, kurserenon, germakron dan xanthorrhizol mampu menurunkan angka leukosit di dalam cairan sinovial penderita osteoartritis. Sehingga produksi sitokin yang menyebabkan inflamasi menjadi berkurang (Kertia, Sudarsono, Imono, Mufrod, Catur, Rahardjo, dkk, 2005).

  Kurkuminoid mempunyai aktivitas anti inflamasi yang menarik meliputi penghambatan lipid peroksidase (anti oksidan) serta penghambatan aktivitas enzim siklooksigenase dan lipooksigenase (Timmerman, 1995; Kohli, Ali, Ansari, dan Raheman, 2005). Kurkumin mempunyai aktivitas yang paling kuat (IC 50 = 0,05 цM) dibandingkan senyawa turunannya (Agnam dkk, 1995). Selain itu, jumlah kurkumin yang aman dikonsumsi oleh manusia adalah 100 mg/hari (Commandeur dan Vermeulen, 1996). Oleh sebab itu, ekstrak rimpang kunyit dimanfaatkan sebagai bahan dalam pembuatan obat tradisional (Anggarwal, 1995).

  Parameter yang harus diperhatikan dalam pemanfaatan kurkumin dalam pembuatan sediaan obat tradisional adalah stabilits kurkumin. Stabilitas kurkumin sangat dipengaruhi oleh pH lingkungan. Dalam larutan berair, kurkumin

  12 mengalami reaksi hidrolisis dan degradasi yang disebabkan oleh adanya gugus metilen aktif pada senyawa tersebut. Reaksi tersebut sangat dipengaruhi oleh pH lingkungannya (Tonnesen dan Karlsen, 1985a).

  Kurkumin di dalam larutan mengalami tautomerisasi menjadi bentuk keto-enol bergantung pada pelarut yang digunakan. Sembilan puluh lima persen berada dalam bentuk enol (Stankovic, 2004).

  

Gambar 4. Tautomerisasi bentuk keto-enol senyawa kurkuminoid (Stankovic, 2004)

  Kinetika reaksi degradasi hidrolisis dari senyawa cis-trans (Gambar 3) terjadi pada rentang pH 1-11 (Tonnesen dan Karlsen, 1985a). Pada pH <1, diferuloilmetan pada larutan berair berwarna merah yang diindikasikan terjadi protonasi dengan membentuk (H4A+). Pada pH 1-7, sebagian besar diferuloilmetan berada dalam bentuk netral (H3A). Pada pH ini kelarutannya dalam air sangat rendah dan larutan berwarna kuning. Pada pH>7,5 warna berubah menjadi merah. Nilai pKa untuk disosiasi 3 proton asam pada senyawa kurkumin (bentuk H2A-, HA2-, dan A3-) secara berturut-turut adalah 7,8;8,5; dan 9,0 (Stankovic, 2004).

  13 HO O +

  H H A 4 H CO 3 OH OH OCH 3 HO OH H A 3 H CO 3 O OH OCH 3 - HO O H A 2 H CO 3 O OH OCH 3 2- O O HA H 3 CO O OH OCH 3 3- O O A H CO 3 O O OCH 3 Gambar 5. Strukutur kimia kurkumin dalam berbagai pH (Stankovic, 2004)

  Prinsipnya kurkumin relatif stabil pada pH asam, tetapi akan terdekomposisi secara cepat pada pH di atas netral. Pada penelitian degradasi kimia pada pH basa terhadap senyawa kurkumin (Tonnesen dan Karlsen, 1985), produk dekomposisi pada pH 7-10 ditentukan secara HPLC. Produk degradasi terbentuk setelah 5 menit dan kromatogram diperoleh setelah 28 jam pada pH 8,5 menunjukkan degradasi alkali sehingga terbentuk asam ferulat dan feruloilmetan.

  Feruloilmetan secara cepat membentuk produk kondensasi warna (kuning sampai kuning kecoklatan). Produk degradasi yang terbentuk dari hidrolisis feruloilmetan

  14 adalah vanilin dan aseton serta jumlahnya meningkat seiring bertambahnya waktu (Stankovic, 2004).

  

Gambar 6. Produk degradasi kurkumin pada pH alkali (Stankovic, 2004)

  Penelitian lain (Wang dkk, 1997) kurkumin diinkubasi pada 0,1 M buffer fosfat; pH 7,2 pada 37 ºC; dan sejumlah 90% terdekomposisi tidak kurang dari 30 menit. Trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal diprediksi sebagai produk degradasi terbanyak sedang vanilin, asam ferulat, dan feruloilmetan diidentifikasi sebagai produk degradasi minor. Pada bentuk netral, kurkumin tidak stabil pada larutan berair dengan pH >7 (Stankovic, 2004).

  15

  HO O O O O

Gambar 7. Struktur trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal(Stankovic,

2004)

  Instabilitas kurkumin juga dipengaruhi oleh adanya cahaya yang menyebabkan terjadinya degradasi fotokimia senyawa tersebut (Van der Goot, 1997). Prinsipnya, kurkumin tidak stabil terhadap cahaya, terutama dalam bentuk larutan. Setelah mengalami foto-iradiasi, akan terdeteksi produk siklisasi, sama halnya dengan produk dekomposisi asam vanilat, vanilin, dan asam ferulat (Sasaki, Sat, Abe, Sugimoto, dan Maitani, 1998).

  

Gambar 8. Produk fotodegradasi kurkumin (Stankovic, 2004)

  16

E. Kromatografi Lapis Tipis

  1. Kromatografi lapis tipis (KLT) secara umum

  Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembang campur (Mulja dan Suharman, 1995). KLT dapat dipakai untuk dua tujuan, yaitu sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, dan preparatif. Tujuan kedua yaitu dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga (Gritter, Bobit, dan Schwarting, 1991).

  2. Jenis fase diam dan fase gerak KLT

  Fase diam yang banyak terpilih adalah silika gel. Silika gel G adalah silika gel yang dicampur perekat CaSO

  4 lebih kurang 13% (Jork, Funk, Fischer,

  dan Wimmer, 1990). Fase gerak dalam mediun KLT merupakan medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa bahan pelarut yang bergerak di dalam fase diam, karena ada gaya kapiler (Stahl, 1985). Berikut ini merupakan daftar fase gerak beserta indeks polaritasnya:

  

Tabel I. Daftar fase gerak

Eluotropic Polarity Viscosity Density Refractive Boiling Value (e°) Index (cP, 25°C) (g/ml) Index Point

  (on silica) (p’) (25°) (°C) Heksana

  0.00

  0.06 0.30 0.659 1.372

  69 Kloroform

  0.31

  4.40 0.53 1.483 1.443

  61 Asam >0.73

  6.20 1.10 1.049 1.370 118 Asetat

  Glasial Metanol

  0.73

  6.60 0.54 0.791 1.326

  65 (Stahl, 1985)

  17

  3. Migrasi dan retensi solut

  Kecepatan migrasi solut melalui fase diam ditentukan oleh perbandingan distribusinya (D), dan besarnya D ditentukan oleh afinitas relatif solut pada pada kedua fase (fase diam dan fase gerak). Dalam konteks kromatografi, nilai D didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) dan dalam fase gerak (Cm) (Gandjar dan Rohman, 2007).

  (1) Jadi semakin besar nilai D maka migrasi solut semakin lambat; dan semakin kecil nilai D maka migrasi solut semakin cepat. Solut akan terelusi menurut perbandingan distribusinya. Jika perbedaan perbandingan distribusi solut cukup besar maka campuran-campuran solut akan mudah dan cepat dipisahkan (Gandjar dan Rohman, 2007).

  4. Pemisahan kromatografi lapis tipis

  Pemisahan kromatografi planar ini pada umumnya dihentikan sebelum semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap jarak ujung fase geraknya. Faktor retardasi solut (R f ) didefinisikan sebagai:

  (2) (Gandjar dan Rohman, 2007)

  18 Gambaran untuk menghitung R f terdapat dalam gambar berikut ini:

  

Gambar 9. Cara penentuan harga R (Gandjar dan Rohman, 2007)

f

  Nilai R f dihitung dengan menggunakan perbandingan sebagaimana dalam persamaan berikut: (3)

  (Gandjar dan Rohman, 2007) Nilai maksimum R f adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k’) sama dengan 0 yang berarti solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum R adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal di

  f permukaan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).

5. Proses sorpsi – adsorpsi

  Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam, sementara itu proses sebaliknya (pemindahan solut dari fase diam ke fase gerak) disebut dengan desorpsi. Kedua proses ini (sorpsi dan desorpsi) terjadi secara

  19 terus menerus selama pemisahan kromatografi karenanya sistem kromatografi berada dalam keadaan kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fase yang bersesuaian dengan perbandingan distribusinya (D) untuk menjaga keadaan kesetimbangan ini (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja. Adsorpsi pada permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan dipol-dipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipol. Solut akan bersaing dengan fase gerak untuk berikatan dengan sisi-sisi polar pada permukaan adsorben (Skoog, Holler, dan Nieman, 1998).

  Silika gel memiliki permukaan yang terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini mampu membentuk ikatan hidrogen dengan solut-solut yang agak polar sampai sangat polar (Gandjar dan Rohman, 2007).

  

Gambar 10. Interaksi antara analit dengan fase diam silika gel (Skoog, dkk, 1998)

  Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan permukaan silika gel karena air akan menutup sisi aktif silika gel.

  Hal seperti ini dapat diatasi dengan memanaskan pada suhu 105ºC (Gandjar dan Rohman, 2007).

  20 Semakin polar solut maka semakin tertahan kuat ke dalam adsorben silika gel ini. Solut-solut non polar tidak mempunyai afinitas atau mempunyai sedikit afinitas terhadap adsorben polar, sementara solut-solut yang terpolarisasi memiliki afinitas yang kecil terhadap adsorben polar disebabkan adanya interaksi dipol atau interaksi-interaksi yang diinduksi oleh dipol. Solut-solut polar, terutama yang mampu membentuk ikatan hidrogen, akan terikat kuat pada adsorben karenanya butuh fase gerak yang cukup polar untuk mengelusinya. Berikut adalah urutan polaritas solut-solut organik: alkana < alkena < aromatis < eter < ester < keton dan aldehid < tiol < amin dan amida < alkohol < fenol < asam-asam organik (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Adsorbsi solut oleh fase diam atau oleh adsorben sangat tergantung pada: (a) struktur kimia solut atau adanya gugus aktif tertentu yang berinteraksi dengan adsorben; (b) ukuran partikel adsorben. Semakin kecil ukuran partikel adsorben, maka luas permukaannya semakin luas sehingga interaksinya dengan solut juga semakin luas; (c) kelarutan solut dalam fase gerak. Solut yang semakin mudah larut dalam fase gerak akan semakin mudah lepas dari fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Kedudukan gugus fungsional tertentu dalam suatu senyawa juga menentukan interaksinya. Sorpsi adsorpsi ini umumnya terjadi pada kromatografi padat cair sebagaimana dalam kromatografi lapis tipis dan pada kromatografi gas- padat (Gandjar dan Rohman, 2007).

  21

6. Profil puncak dan pelebaran puncak

  Selama pemisahan kromatografi, solut individual akan membentuk profil konsentrasi yang simetri atau dikenal juga dengan profil Gaussian dalam arah aliran fase gerak. Profil, dikenal juga dengan puncak atau pita, secara perlahan-lahan akan melebar dan sering juga membentuk profil yang asimetrik karena solut-solut melanjutkan migrasinya ke fase diam. Prinsip yang mendasari alasan-alasan bentuk puncak dan pelebaran puncak dapat diringkas sebagai berikut:

  a. Sorpsi dan desorpsi solut yang terus menerus antara fase diam dan fase gerak, secara inheren akan menghasilkan profil konsentrasi Gaussian yang akan melebar karena solut bermigrasi lebih lanjut.

  b. Perjalanan solut melalui partikel fase diam sedikit berbeda, sehingga menyebabkan profil konsentrasinya melebar secara simetris. Keadaan seperti ini disebut dengan pengaruh lintasan ganda (multiple-path effect).

  c. Spesies solut menyebar ke segala arah dengan difusi ketika berada di dalam fase gerak. Difusi terjadi dengan arah yang sama dan berlawanan dengan aliran fase gerak (longitudinal or axial diffusion ) karenanya akan berkontribusi terjadinya pelebaran pita secara simetris.

  d. Sorpsi dan desorpsi, atau transfer massa antara fase diam dan fase gerak, bukanlah suatu proses yang instan dan terkadang proses tersebut terjadi secara lambat. Karena fase gerak berjalan secara terus-menerus, maka distribusi kesetimbangan solut yang sebenarnya tidak pernah terjadi . Profil konsentrasi dalam fase diam tertinggal sedikit dibanding profil konsentrasi dalam fase

  22 gerak yang akan mengakibatkan adanya pelebaran puncak lebih lanjut. Desorpsi yang lambat dapat juga menghasilkan puncak yang asimetris atau condong.

  e. Adanya variasi rasio distribusi solut dengan total konsentrasinya juga berperan terjadinya puncak yang asimetris atau condong (Gandjar dan Rohman, 2007).

  

Gambar 11. Keadaan simetris dan pelebaran puncak kromatogram (Gandjar dan Rohman,

2007)

Gambar 12. Ilustrasi 3 prinsip utama yang menggambarkan puncak; (a). Pengaruh lintasan

ganda (multiple-path effect); (b). Pengaruh difusi longitudinal; (c). Pengaruh transfer massa

  

(Gandjar dan Rohman, 2007)

  23

7. Puncak asimetri

  Profil konsentrasi solut yang bermigrasi akan simetris jika rasio distribusi solut (D) konstan selama kisaran konsentrasi keseluruhan puncak, sebagaimana ditunjukkan oleh isoterm sorpsi yang linier yang merupakan plot konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) terhadap konsentrasi solut dalam fase gerak (Cm).

  Meskipun demikian, kurva isoterm akan berubah menjadi 2 jenis puncak asimetris yakni membentuk puncak yang berekor (tailing) dan adanya puncak pendahulu (fronting) jika ada perubahan rasio distribusi solut kearah yang lebih besar (Gandjar dan Rohman, 2007).

  .

  

Gambar 13. Isoterm sorpsi serta profil-profil puncak yang dihasilkan. (a). Isoterm linier (b).

  

Puncak tailing dan (c). Puncak fronting (Gandjar dan Rohman, 2007)

  Adanya puncak asimetri dapat disebabkan oleh beberapa hal. Yang pertama apabila ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Yang kedua adalah interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan solut sukar terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor.

  Ketiga adalah adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu sehingga menimbulkan puncak mendahului (fronting) (Gandjar dan Rohman, 2007).

  24

8. Resolusi kromatogram

  Resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang sali

  2 – z 1 ) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W

  1

  • W

  ng berdekatan (Δz = z

  2 )/2 sebagaimana dalam ilustrasi dan persamaan berikut ini:

Gambar 14. Ilustrasi resolusi pada KLT: (a) kromatogram; (b) profil kromatografi masing-

masing bercak (Sherma dan Fried, 1996)

  (4) (Sherma dan Fried, 1996)

  Dari persamaan ini dapat diketahui bahwa yang sangat berpengaruh terhadap pemisahan suatu komponen adalah: jarak masing-masing bercak solut terhadap titik awal pengembanagn (z

  

2 dan z

1 ) serta lebar puncak masing-masing komponen yang dipisahkan ((W dan W ) (Sherma dan Fried, 1996).

  1

  

2

Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang baik (base line resolution).

  25

  Gambar 15. Pengukuran resolusi 2 puncak yang berdekatan (Gandjar dan Rohman, 2007)

9. Analisis kualitatif

  Ada 3 pendekatan untuk analisis kualitatif yaitu:

  a. Perbandingan antara data retensi solut yang tidak diketahui dengan data retensi baku yang sesuai (senyawa yang diketahui) pada kondisi yang sama.

  Untuk kromatografi lapis tipis, faktor retardasi (R ) baku dan senyawa yang

  f

  tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi secara bersama-sama untuk menghilangkan adanya variasi kondisi bahan yang digunakan dan laboratorium.

  b. Dengan cara spiking. Spiking dilakukan dengan menambah sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan diselidiki dengan senyawa baku pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara: pertama, dilakukan proses kromatografi sampel yang tidak di-spiking. Kedua, sampel yang telah di-spiking dengan senyawa baku dilakukan proses kromatografi. Jika pada puncak tertentu yang diduga mengandung senyawa yang diselidiki terjadi peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah di-spiking dibandingkan dengan tinggi puncak/luas puncak yang tidak dilakukan spiking maka dapat diidentifikasi bahwa sampel mengandung senyawa yang kita selidiki.

  26 c. Menggabungkan alat kromatografi dengan spektrometer massa. Cara ini memberikan informasi data spektra solut dengan waktu retensi tertentu.

  Spektra solut yang tidak diketahui dapat dibandingkan dengan spektra yang ada di base komputer atau diinterpretasi sendiri. Cara ini dapat dilakukan untuk solut yang belum ada baku murninya (Gandjar dan Rohman, 2007).

10. Analisis kuantitatif

  Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil dan reprodusibel, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisis kuantitatif: Analit (solut) harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen-komponen lain dalam kromatogram. Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia. Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan. Penyerap atau adsorben yang digunakan murni, begitu pula pelarutnya (Skoog, dkk, 1998). Pengukuran respon dapat dilakukan dengan mengukur tinggi puncak atau dengan menghitung luas puncak (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Salah satu metode kuantitasi untuk analisis kuantitatif dengan kromatografi dapat dilakukan dengan menggunakan metode baku eksternal.

  Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah dengan menggunakan plot kalibrasi menggunakan baku eksternal. Larutan-larutan baku ini dirujuk sebagai baku eksternal karena larutan-larutan baku ini disiapkan dan dianalisis secara terpisah dari kromatogram senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan telah

  27 disiapkan, selanjutnya diinjeksikan dan dianalisis dengan cara yang sama. Konsentrasi senyawa tersebut ditentukan dengan metode grafik dari plot kalibrasi atau secara numerik (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Larutan baku disiapkan dengan konsentrasi tertentu yang sudah diketahui. Sejumlah tertentu volume larutan ini diinjeksikan dan dianalisis, lalu respon detektor (luas puncak) diplotkan terhadap konsentrasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

11. Aplikasi penotolan sampel

  Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda. Berdasarkan pada tujuan analisis, berbagai macam jumlah sampel telah disarankan untuk digunakan dan diringkas pada tabel II.

  

Tabel II. Parameter-parameter aplikasi penotolan yang direkomendasikan

  Diameter bercak Konsentrasi Banyaknya Tujuan

  (mm) sampel (%) sampel ( μg)

  0,1-1 (untuk 2 mm untuk KLT-KT

  Densitometri volume sampel 0,5 0,02-2 1-10

  μl (konvensional) 3 mm untuk

  Identifikasi 0,1-1 1-20 volume sampel 1 μl

  Uji 4 mm untuk 5 100 kemurnian volume sampel 2

  μl (Gandjar dan Rohman, 2007)

  28

F. Densitometri Densitometri merupakan salah satu dari metode analisa KLT kuantitatif.

  Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Syarat-syarat untuk senyawa standar adalah murni, inert, dan stabil (Sastrohamidjojo, 1985).

  Metode densitometri mempunyai cara kerja yang sederhana dan cepat. Pada metode densitometri diperlukan adsorben dan fase gerak yang murni. Untuk memperoleh hasil yang baik lazimnya digunakan adsorben siap pakai yang telah mengalami pencucian (Gritter dkk, 1991).

  Alat densitometri mempunyai sumber sinar yang bergerak di atas bercak pemisahan pada lempeng kromatografi yang akan ditetapkan kadar komponennya.

  Lazimnya lempeng itu digerakkan menyusuri berkas sinar yang berasal dari sumber sinar tersebut(Sudjadi, 1988).

  Teknik pengukuran dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar yang diserap (absorbansi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau intensitas sinar yang difluoresensikan (fluoresensi). Teknik pengukuran berdasarkan refleksi di mana sinar datang sebagian diserap dan sebagian lagi dipantulkan.

  29

  Gambar 16. Pemantulan Sinar

  (Mintarsih, 1990) Sifat pemantulan ini akan menjadi sensitif dan selektif bila sinar yang datang adalah monokromatis. Disini biasanya dipilih sinar pada panjang gelombang yang diserap atau dipantulkan paling banyak oleh noda yang diteliti. Banyaknya sinar yang direfleksikan akan ditangkap oleh suatu alat yang disebut

  

reflection photomultiplier yang akan diteruskan ke pencatat atau rekorder untuk

  diubah menjadi suatu puncak atau kromatogram. Luas puncak atau tinggi puncak sesuai dengan konsentrasi senyawa pada noda yang diukur kerapatannya (Mintarsih, 1990).

  Pada beberapa TLC scanner sudah dilengkapi alat pemproses data atau mikro komputer, sehingga integrasi luas puncak atau tinggi puncak tersebut dapat langsung direkam atau dicatat sebagai data sekaligus dengan kromatogramnya dan dapat pula direkam dan dicatat langsung sebagai kadarnya, melalui teknik pemprograman tertentu. Noda yang kecil dan intensif akan menghasilkan suatu puncak yang sempit dan tajam, sebaliknya noda yang lebar dan kurang intensif akan menghasilkan puncak yang lebar maupun tumpul (Mintarsih, 1990).

  Penelusuran bercak dapat dilakukan secara horisontal maupun vertikal (scanning horizontal atau scanning vertikal). Penelusuran bercak secara horisontal

  30 dapat dilakukan satu per satu, atau apabila satu pelat bercak yang diperoleh segaris semua maka dapat dilakukan penelusuran untuk semua bercak sekaligus.

  Sedangkan cara penelusuran vertikal, hanya dapat dilakukan satu per satu (Mintarsih, 1990).

  Pada penelusuran bercak horisontal dengan penelusuran beberapa bercak sekaligus hanya dapat dilakukan apabila bercak-bercak tersebut benar-benar dalam satu baris. Cara ini akan mengalami kesulitan jika bercak yang sangat dekat dengan bercak yang ditetapkan, karena ada kemungkinan bercak yang tidak diinginkan ikut pula ditetapkan (Mintarsih, 1990).

  Berdasarkan atas jalannya sinar, penelusuran dapat dilakukan dengan dua cara yaitu penelusuran lurus dan penelusuran zig-zag (naik turun). Pada penelusuran lurus, sinar yang mengenai bercak berjalan lurus dari kiri ke kanan, sedangkan pada penelusuran zig-zag, sinar yang mengenai bercak berjalan zig-zag dari kiri ke kanan. Besarnya jarak, naik turunnya sinar dapat diatur menurut kebutuhan, yang diperhitungkan dengan besar kecilnya bercak, yang dalam operasi alat dikenal sebagai lebar penelusuran (scan widht) (Mintarsih, 1990).

  Penelusuran bercak akan mendapatkan hasil yang baik apabila dilakukan pada panjang gelombang maksimum, karena perubahan konsentrasi pada bercak sedikit saja sudah terdeteksi. Pengukuran dilakukan dengan menelusuri bercak yang akan ditetapkan kadarnya pada kisaran panjang gelombang zat tersebut (Mintarsih, 1990).

  Pelat yang digunakan untuk KLT pada densitometri sebaiknya digunakan pelat buatan pabrik, karena pada pelat buatan sendiri fase diamnya kurang

  31 kompak sehingga akan mempengaruhi hasil penelusuran dengan densitometri, yaitu berupa puncak yang lebar dan kasar. Puncak yang lebar disebabkan kurang kompaknya fase diam, sedangkan puncak yang kasar disebabkan permukaan pelat yang kurang rata (Mintarsih, 1990).

  Pada umumnya tebal lapisan tipis pada lempeng yang digunakan adalah 0,20-0,25 mm maksimum 0,33 mm, untuk mengurangi efek hamburan sinar yang disebabkan oleh fase diam terhadap linearitas hubungan serapan dan konsentrasi dari senyawa yang diteliti. Hubungan antara serapan terhadap konsentrasi dilinearkan dengan dasar teori Kubelka-Munk, menggunakan kurva kerja linear yang telah diprogramkan oleh suatu mikro komputer. Kurva serapan konsentrasi tersebut ditentukan oleh harga parameter hamburan yang disebabkan oleh fase diam. Harga parameter hamburan tersebut tergantung ukuran dan distribusi partikel fase diam pada lempeng KLT ( Supardjan, 1987).

  Ada dua cara penetapan kadar dengan alat densitometer. Pertama, setiap kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan dielusi bersama dalam satu lempeng, kemudian AUC (luas daerah di bawah kurva) sampel dibandingkan dengan harga AUC zat baku. Yang kedua, dengan membuat kurva baku hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermacam-macam konsentrasi (minimal tiga macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh dicari

  

AUC nya dengan alat densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan y = bx +

  a dimana x adalah banyaknya zat yang ditotolkan dan y adalah AUC (Supardjan, 1987).

  32

G. Validasi Metode Analisis

  Validasi metode analisis merupakan serangkaian prosedur yang digunakan untuk membuktikan apakah suatu metode analisis yang digunakan tersebut sesuai yang diharapkan dengan akurasi dan presisi yang memadai(United States Pharmacopeial Convention, 1995).

1. Parameter validasi metode

  a. Akurasi. Akurasi dapat diartikan sebagai kedekatan hasil analisis yang diperoleh menggunakan metode analisis tertentu dengan nilai yang sebenarnya. Hal tersebut diperoleh dengan cara membandingkan kadar terukur dari sejumah tertentu senyawa standar yang sengaja ditambahkan ke dalam sampel dengan jumlah tertentu pula. Harga perbandingan tersebut disebut perolehan kembali (United States Pharmacopeial Convention, 1995).

  Nilai perolehan kembali untuk bahan obat dengan kadar kecil biasanya disepakati 90-110%, untuk kadar obat yang lebih besar 95-105%, akurasi untuk bahan baku disepakati 98-102%, sedang untuk bioanalisis rentang akurasi 80- 120% masih bisa diterima (Mulja dan Suharman, 1995).

  Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spiked-

placebo recovery ) atau metode penambahan baku (standard addition method).

  

Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit

yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih

kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan).

Dalam kedua metode tersebut, persen peroleh kembali dinyatakan sebagai rasio

antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Persen perolehan

  33

  

kembali dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat,

cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya

80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis

dengan metode yang akan divalidasi. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat

sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau

karena analitnya berupa suatu senyawa endogen misalnya metabolit sekunder

pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi (Harmita, 2004).

  Metode adisi dapat dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit

dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis dengan

metode tersebut. Persen perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa

persen analit yang ditambahkan tadi dapat ditemukan. Kriteria kecermatan sangat

tergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan

metode (RSD). Selisih kadar pada berbagai penentuan (Xd) harus 5% atau kurang

pada setiap konsentrasi analit pada mana prosedur dilakukan. Harga rata-rata

selisih secara statistik harus 1,5% atau kurang. Kriteria tersebut dinyatakan secara

matematik sebagai berikut:

  (5)

  (Harmita, 2004)

  34

  Kadar analit dan perolehan kembali dalam metode penambahan baku dapat dihitung sebagai berikut:

  (6) (Harmita, 2004)

  Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan

lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu

pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan

pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dan lain-lain. Kriteria kecermatan

dilakukan sama seperti pada metode simulasi (Harmita, 2004).

  Pada percobaan penetapan kecermatan, sedikitnya lima sampel yang

mengandung analit dan plasebo yang harus disiapkan dengan kadar antara 50%

sampai 150% dari kandungan yang diharapkan. Persen perolehan kembali

seharusnya tidak melebihi nilai presisi RSD. Rentang kesalahan yang diijinkan

pada setiap konsentrasi analit pada matriks dapat dilihat pada tabel III:

  35

  Tabel III. Rentang kesalahan perolehan kembali yang diperbolehkan Rata-rata perolehan kembali Konsentrasi analit (%) Unit

  (%)

100 100 % 98-102

≥ 10 10 % 98-102

≥ 1 1 % 97-103

  0.1% 95-105 ≥ 0.1

0.01 100 ppm 90-107

0.001 10 ppm 90-107

  0.0001 1 ppm 80-110 0.00001 100 ppb 80-110 0.000001 10 ppb 60-115 0.0000001 1 ppb 40-120

  (Harmita, 2004)

  b. Presisi. Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat

  

kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual

dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang

diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004) .

  Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku

relatif (koefisien variasi). Suatu metode dikatakan memberikan presisi yang bagus

  jika koefisien variasi (KV) < 2% (Mulja dan Suharman, 1995). Akan tetapi

  

kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa,

jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa

koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis. Pada

kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar

2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm)

RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada

metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%

(Harmita, 2004).

  36

  Untuk menetapkan presisi bahan campuran dan bahan sisa pada artikel

obat, formula berikut ini harus digunakan untuk menentukan metode ketertiruan

yang tepat (interlaboratorium) (Harmita, 2004).

  RSD < 2 (1-0,5 log c)

  (7) dan untuk keterulangan : RSD < 2

  (1-0,5 log c) x 0,67 (8) c = konsentrasi analit sebagai fraksi desimal (contoh: 0,1% = 0,001)

  Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut: Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,.....................xn maka simpangan bakunya adalah

  (9)

  Simpangan baku relatif atau koefisien variasi (KV) adalah:

  (10) (Harmita, 2004)

  

Tabel IV. Kriteria yang diperbolehkan untuk presisi pada kadar analit yang berbeda

Konsentrasi analit (%) Unit Presisi (RSD) ( %)

100 100 % 1,3

  

≥ 10 10 % 2,7

≥ 1 1 % 2,8

≥ 0,1 0,1% 3,7

  

0,01 100 ppm 5,3

0,001 10 ppm 7,3

0,0001 1 ppm

  11 0,00001 100 ppb 15 0,000001 10 ppb 21 0,0000001 1 ppb

  30

  (Yuwono dan Indrayatno, 2005)

  c. Sensitivitas. LOD (Limit of Detection) merupakan konsentrasi analit terkecil dalam sampel yang masih dapat dideteksi tetapi tidak secara

  37 kuantitatif. Penentuan LOD dengan cara membandingkan respon dari pengukuran analit terhadap respon blangko. Konsentrasi analit yang mampu memberikan respon 2-3 kali respon blangko disebut LOD(United States Pharmacopeial Convention, 1995). LOQ merupakan konsentrasi analit terkecil dalam sampel yang masih dapat dianalisis dengan hasil penentuan kualitatif yang menuju akurasi yang memadai. Penentuan LOQ pada metode instrumen dengan cara membandingkan respon dari pengukuran analit terhadap respon blanko konsentrasi analit yang mampu memberikan respon 10 kali respon blanko (United States Pharmacopeial Convention, 1995).

  d. Selektivitas. Selektivitas dapat diartikan sebagai kemampuan dari suatu metode analisis untuk mengukur keberadaan analit dalam sampel secara tepat (United States Pharmacopeial Convention, 1995). Jadi metode yang

  

digunakan hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan

adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas

seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias)

metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang

ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya,

dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan

lain yang ditambahkan (Harmita, 2004).

  Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis

sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing

lainnya atau pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan

bahan-bahan tadi. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji

  38

  

keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat

diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel

yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji

lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti

kromatografi, analisis kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry.

Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas.

Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan

melalui perhitungan daya resolusinya (Rs) (Harmita, 2004).

  e. Linearitas dan rentang. Linearitas adalah rentang kadar terendah sampai kadar tertinggi yang ditentukan dengan metode analisis dan dihubungkan dengan tanggap detektor sehingga memberikan harga koefisien relasi pada tabel statistik (Mulja dan Suharman, 1995). Rentang adalah interval antara kadar terendah sampai kadar tertinggi dari analit yang dapat diukur secara kuantitif menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan presisi dan keakuratan yang mencukupi (United States Pharmacopeial Convention, 1995). Persyaratan data linearitas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) >0,999 (Snyder, Kirkland, dan Glajch, 1997).

  f. Ketidakpastian. Ketidakpastian metode merupakan tingkat kebolehjadian dari hasil tes analisis pada sampel yang sama di bawah kondisi variasi tes normal (United States Pharmacopeial Convention, 1995).

2. Kategori metode analisis

  Kategori uji umum yang harus memenuhi validitas data yaitu kategori I,

  II, dan III. Kategori I ini meliputi metode-metode analitik yang digunakan untuk

  39 mengukur secara kuantitatif sejumlah besar komponen dari serbuk obat atau senyawa aktif dalam sediaan obat jadi. Kategori II meliputi metode-metode analitik yang digunakan untuk penentuan kemurnian dalam serbuk obat atau penentuan senyawa degradasi dalam sediaan obat jadi. Kategori III meliputi metode-metode analitik yang digunakan untuk penentuan sifat-sifat khusus seperti kecepatan disolusi dan pelepasan obat. Parameter-parameter yang harus dipenuhi pada masing-masing kategori dapat dilihat pada tabel V.

  

Tabel V. Kategori Analisis Kimia

  Parameter Kategori I Kategori II Kategori III analitik Uji kuantitatif Uji kualitatif

  Akurasi Ya Ya * * Presisi Ya Ya Ya Ya Spesifikasi Ya Ya Ya * LOD Tidak

  • Tidak Ya LOQ Tidak Ya Tidak * Linearitas Ya Ya * Tidak Range Ya * Ya * Ketidakpastian Ya Ya Ya Ya *Mungkin diperlukan, tergantung sifat uji spesifik yang dilakukan

  (United States Pharmacopeial Convention, 1995).

H. Landasan Teori

  Obat Herbal Terstandar adalah sediaan obat bahan alam yang telah lulus uji praklinik dan bahan bakunya telah distandarisasi. Salah satu senyawa aktif dominan yang biasa terdapat dalam sediaan Obat Herbal Terstandar adalah kurkumin. Kurkumin memiliki stabilitas yang rendah dalam larutan dan

  40 dipengaruhi oleh pH dan paparan cahaya. Kurkumin memiliki panjang gelombang maksimum pada daerah panjang gelombang 425 nm dalam pelarut etanol.

  KLT merupakan metode pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembang campuran. Densitometri merupakan salah satu dari metode analisa KLT kuantitatif untuk penetapan kadar suatu senyawa dengan mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT.

  Validasi metode analisis adalah serangkaian prosedur yang digunakan untuk membuktikan apakah suatu metode analisis yang digunakan tersebut sesuai yang diharapkan dengan selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi yang memadai. Nilai selektivitas yang baik untuk metode KLT memiliki resolusi > 1,5.

  Linearitas dan rentang yang baik ditunjukkan melalui nilai faktor korelasi (r) >0,999. Nilai akurasi yang memadai untuk senyawa baku dengan kemurnian 100% adalah memiliki perolehan kembali 98-102%, sedangkan untuk analit dalam matriks sampel pada kadar 100 ppm adalah 90-107%. Nilai presisi yang baik untuk senyawa baku memiliki nilai KV < 2%, sedang untuk analit dalam matriks sampel pada kadar 100 ppm adalah 5,3%.

I. Hipotesis

  Validasi metode KLT-Densitometri pada penetapan kadar kurkumin

  ®

  dalam sediaan kapsul lunak OHT “Rheumakur ” memenuhi parameter validasi meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental deskriptif karena tidak ada manipulasi dan perlakuan terhadap fenomena yang diamati. B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Klasifikasi variabel

  a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah sistem kromatografi yang menghasilkan pemisahan paling optimum. Sistem kromatografi yang digunakan adalah fase normal dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak kloroform:asam asetat glasial:heksana (85 : 10 : 5) v/v.

  b. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah parameter-parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

  c. Variabel pengacau terkendali yang terdapat dalam penelitian ini adalah paparan cahaya, kemurnian pelarut dan pH. Paparan cahaya diminimalkan dengan menutup larutan dengan kertas aluminium dan pengerjaan dilakukan di ruang gelap. Pelarut dan fase gerak yang digunakan seluruhnya berkualitas

  pro analisis . Seluruh larutan diatur pada pH 4 dimana kurkumin tetap stabil dalam pelarut metanol.

  42

2. Definisi operasional

  a. Kurkumin dalam sampel kapsul lunak OHT merupakan salah satu senyawa kurkuminoid, terdapat bersama minyak atsiri yang berasal dari Curcumae

  xanthorrizae Rhizoma yang disuspensikan oleh beeswax sehingga berbentuk semi padat dalam sediaan kapsul lunak.

  b. Kromatografi lapis tipis (KLT) fase normal yang digunakan adalah seperangkat bejana kromatografi (CAMAG) dengan fase diam silika gel G 60 (E. Merck) dan fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) v/v.

  c. Kadar kurkumin dalam larutan sampel ditetapkan dengan satuan ppm

  d. Parameter validasi metode analisis yang ditetapkan adalah selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

C. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanol p.a.

  ® ®

  EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur (E. Merck), kloroform p.a. EMSURE ACS,

  ®

  ISO, Reag. Ph Eur (E. Merck), heksana p.a. EMSURE ACS (E. Merck), asam

  ®

  asetat (glasial) 100% p.a. EMPARTA ACS (E. Merck), lempeng KLT silika gel

  ®

  G 60 (E. Merck), sampel kapsul lunak OHT Rheumakur , dan kurkumin baku (hasil sintesis Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt yang telah dikonfirmasi

  1

  strukturnya dengan metode spektroskopi H-NMR dan Mass Spectra, kurkumin hasil sintesis tersebut memiliki titik lebur 181,2-182,4 °C).

  43

D. Alat

  Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi neraca; neraca analitik (OHAUS Carat Series PAJ 1003 dengan spesifikasi max 60/120g; d = 0,01/0,1 mg ;dan e = 1 mg); Densitometer (CAMAG TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER.

  No.160602); labu takar 5,0 mL; labu takar 10,0 mL; labu takar 50,0 mL, labu takar 100,0 mL; cawan arloji; pipet mikro volume 0,1-2 μL; pipet mikro volume

  0,5-5 mL; corong; flakon; pipet tetes; Bekker glass; sendok; pengaduk; ultrasonikator Retsch tipe T460 (Schwing.1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83 HF-Frequ. : 35 kHz); oven; dan bejana kromatografi (CAMAG).

E. Cara Penelitian

  1. Pembuatan metanol pH 4

  Metanol ditambahkan dengan asam asetat glasial dengan perbandingan 9:1 untuk setiap pembuatan larutan.

  2. Pengaktifan silika Gel G 60

  Lempeng silika gel G 60 dipanaskan di dalam oven pada suhu 105ºC selama 1 jam sebelum digunakan.

  3. Pembuatan dan penjenuhan fase gerak

  Fase gerak dibuat dengan perbandingan kloroform:asam asetat glasial:heksana sesuai hasil optimasi (85:10:5) v/v pada labu takar hingga 100,0 mL. Fase gerak dituang pada bejana kromatografi kemudian kertas saring dimasukkan hingga menutup 2 sisi dinding bejana. Bejana ditutup rapat dan dibiarkan hingga seluruh kertas saring terbasahi oleh fase gerak.

  44

  4. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum

  Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama, dilarutkan dalam metanol pH 4 , kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan dengan metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk diencerkan dengan metanol pH 4 hingga diperoleh seri larutan baku yang mengandung kurkumin 100; 300; dan 500 ppm. Pembuatan larutan baku kurkumin direplikasi sebanyak 3 kali. Semua larutan baku harus terlindung dari cahaya.

  Seri larutan baku ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G 60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5) v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai.

  Bercak seri larutan baku yang mengandung kurkumin 100; 300; dan 500 ppm diukur dengan densitometer pada panjang gelombang 400-500 nm. Panjang gelombang maksimum ditentukan berdasarkan serapan maksimum yang dihasilkan oleh bercak tersebut.

  5. Penentuan kurva baku kurkumin

  Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama, dilarutkan dalam metanol pH 4 , kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan dengan metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk diencerkan dengan metanol pH 4 hingga diperoleh seri larutan baku yang

  45 mengandung kurkumin 100; 180; 260; 340; 420 dan 500 ppm. Semua larutan baku harus terlindung dari cahaya.

  Seri larutan baku ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G 60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5) v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai.

  Bercak seri larutan baku kurkumin diukur AUC-nya dengan densitometer pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Puncak kromatogram dan nilai AUC yang muncul diamati. Dengan metode regresi linear, nilai konsentrasi (ppm) diplotkan terhadap nilai AUC masing-masing seri larutan baku sehingga diperoleh persamaan y = bx + a dimana y merupakan nilai respon (AUC), x merupakan konsentrasi senyawa baku (ppm), a adalah intersept, dan b adalah slope. Pembuatan kurva baku direplikasi sebanyak 3 kali.

  

6. Penetapan perolehan kembali (recovery) dan koefisien variasi (KV) baku

kurkumin

  Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama, dilarutkan dalam metanol pH 4 , kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan dengan metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk diencerkan dengan metanol pH 4 hingga diperoleh seri larutan baku yang mengandung kurkumin 100; 260; dan 500 ppm. Pembuatan larutan baku direplikasi sebanyak 3 kali. Semua larutan baku harus terlindung dari cahaya.

  46 Seri larutan baku ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G 60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5) v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai.

  Tiga replikasi bercak seri larutan baku yang mengandung kurkumin 100; 260; dan 500 ppm diukur dengan densitometer pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Puncak kromatogram dan nilai AUC yang muncul diamati. Kadar kurkumin dihitung dengan persamaan kurva baku yang telah diperoleh. Masing-masing seri kadar dihitung nilai perolehan kembali dan koefisien variasinya (KV).

  

7. Penentuan selektivitas kurkumin dalam sampel serta akurasi dan presisi

baku yang ditambahkan ke dalam sampel

  Lebih kurang 10,0 mg baku kurkumin dilarutkan dalam metanol pH 4 hingga 10,0 mL (larutan A). Sejumlah lebih kurang 1000,0 mg sampel ditambah metanol pH 4 sebanyak 40 mL (larutan B). Larutan B kemudian diultrasonikasi selama 15 menit. Sampel dipastikan sudah larut seluruhnya. Kemudian larutan B disentrifugasi selama 15 menit. Supernatan kemudian diambil seluruhnya dengan pipet. Supernatan ditambah metanol pH 4 hingga 50,0 mL (larutan C).

  Sejumlah 0,5 mL larutan A dimasukkan dalam labu takar 5 mL (masing- masing 5 kali). Sejumlah 3,2 mL larutan C dimasukkan dalam labu takar yang telah ditambahkan larutan A (masing-masing 5 kali). Masing-masing labu takar

  47 ditambahkan metanol pH 4 hingga 5,0 mL(larutan D). Semua larutan harus terlindung dari cahaya.

  Sejumlah 3,2 mL larutan C dimasukkan dalam labu takar 5,0 mL (masing-masing 5 kali). Masing-masing labu takar ditambahkan metanol pH 4 hingga 5,0 mL (larutan E). Semua larutan sampel harus terlindung dari cahaya.

  Masing-masing larutan D dan E ditotolkan sebanyak 1,0 L pada lempeng silika gel G 60 kemudian segera dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan campuran kloroform : asam asetat glasial : heksana (85:10:5) v/v selama 15 menit. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika gel G 60 segera dikeluarkan dan dikeringkan setelah pengembangan selesai. Bercak masing-masing larutan D dan E diukur dengan densitometer pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh.

F. Analisis Hasil

  Perhitungan kadar kurkumin dalam setiap larutan dilakukan dengan memasukkan nilai AUC sebagai y pada persamaan kurva baku y = bx + a sehingga diperoleh nilai x sebagai kadar dengan satuan ppm. Sedangkan kesahihan metode ditentukan dengan parameter selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi dengan rumus sebagai berikut:

1. Selektivitas

  Selektivitas ditentukan melalui pengamatan terhadap profil kromatogram sampel yang menunjukkan pemisahan analit kurkumin hingga baseline terhadap senyawa lain. Selektivitas ditunjukkan melalui kesamaan nilai R f puncak

  48 kurkumin sampel dengan R f puncak kurkumin baku. Selain itu, pemisahan yang baik ditunjukkan dengan nilai resolusi (Rs) > 1,5. Berikut ini merupakan metode perhitungan R f dan Rs:

  (11) (12)

  Z – z merupakan selisih antara nilai R maksimum kurkumin dengan

  2 1 f

  nilai R f maksimum senyawa di dekatnya. W

  1 adalah jarak yang ditempuh senyawa

  di dekat puncak kurkumin, sedangkan W

  2 adalah jarak yang ditempuh puncak kurkumin.

  2. Linearitas dan rentang

  Nilai linearitas ditunjukkan melalui nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh melalui penentuan kurva baku dengan metode regresi linear. Nilai r yang baik adalah > 0,999. Rentang yang baik ditunjukkan melalui seberapa besar rentang konsentrasi seri baku dari kadar paling rendah hingga paling tinggi yang masih memiliki linearitas, akurasi, dan presisi yang baik.

  3. Akurasi baku kurkumin

  Akurasi baku kurkumin ditentukan melalui nilai perolehan kembali (recovery). Metode memiliki akurasi bahan baku yang baik apabila memiliki nilai perolehan kembali 98-102% (Mulja dan Suharman, 1995).

  (13)

  49

  4. Presisi baku kurkumin

  Presisi baku kurkumin ditentukan melalui nilai koefisien variasi (KV) atau Coefficient Variation (CV). Metode dikatakan memenuhi presisi yang baik apabila nilai koefisien variasinya < 2% (Mulja dan Suharman, 1995).

  (14)

  5. Akurasi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam matriks sampel

  Akurasi baku kurkumin dalam matriks sampel ditentukan melalui nilai perolehan kembali (recovery) kadar baku yang ditambahkan ke dalam sampel.

  Metode memiliki akurasi bahan baku yang baik apabila memiliki nilai perolehan kembali 90-107% pada kadar 100 ppm(Harmita, 2004).

  (15) C F merupakan kadar kurkumin yang terukur dalam larutan sampel yang ditambah baku (larutan D). C A merupakan kadar kurkumin dalam larutan sampel

  • yang terukur (larutan E). C A merupakan konsentrasi teoritis baku kurkumin yang ditambahkan dalam volume pengenceran yang sama dengan larutan D dan E.

  6. Presisi baku kurkumin yang ditambahkan ke dalam matriks sampel

  Presisi baku kurkumin yang ditambahkan dalam matriks sampel ditentukan melalui nilai koefisien variasi (KV) atau Coefficient Variation (CV).

  Metode dikatakan memenuhi presisi yang baik apabila nilai koefisien variasinya < 5,3% pada kadar 100 ppm (Yuwono dan Indrayatno, 2005).

  50 Kadar kurkumin baku yang ditambahkan (x) = kadar kurkumin larutan D – kadar kurkumin larutan E

  (16) (17)

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah metode KLT- Densitometri memenuhi parameter validasi yang ditetapkan. Metode yang

  digunakan adalah KLT-Densitometri karena metode ini mampu memisahkan senyawa dalam suatu campuran. Sampel yang dianalisis pada penelitian ini merupakan Obat Herbal Terstandar yang dipastikan mengandung lebih dari satu senyawa. Selain itu, metode KLT-Densitometri memiliki kelebihan yaitu dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif secara simultan. Penelitian ini menggunakan KLT fase normal dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5).

  Pada penelitian optimasi metode telah dilakukan penentuan stabilitas kurkumin dalam pelarut metanol pH 3, 4, dan 5. Penentuan pH dimana kurkumin tetap stabil dilakukan dengan mengukur panjang gelombang serapan maksimum baku kurkumin dengan metode spektrofotometri visibel. Pelarut yang digunakan adalah metanol karena kurkumin larut dalam pelarut metanol dan sukar larut dalam air (Windholz, 1981). Metanol ditambahkan asam asetat untuk mengatur pH larutan. Hasil pengukuran menunjukkan bahwa stabilitas kurkumin pada pH 4 lebih baik karena panjang gelombang maksimum kurkumin stabil pada 432 nm.

  Stabilitas kurkumin pada pH 3 dan 5 kurang baik karena panjang gelombang maksimumnya tidak stabil dengan rentang 429 nm hingga 435 nm.

  52 Kurkumin lebih stabil pada pH 4 karena kurkumin merupakan senyawa yang bersifat asam lemah. Penambahan asam asetat glasial hingga pH 4 akan menjaga kurkumin tetap dalam bentuk molekulnya sehingga kurkumin tetap stabil dalam larutan. Pembuatan larutan baku maupun sampel dilakukan pada pH 4 dengan penambahan asam asetat glasial karena hasil menunjukkan kurkumin tetap stabil pada pH 4.

A. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum

  Penentuan panjang gelombang serapan maksimum bertujuan untuk memperoleh besar area di bawah kurva (AUC) kurkumin yang paling maksimum.

  Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan dengan mengukur kerapatan bercak dari larutan baku kurkumin kadar rendah (100 ppm), tengah (300 ppm), dan tinggi (500 ppm) pada rentang panjang gelombang 400-500 nm.

  Densitometer yang dipergunakan memiliki detektor visibel yang dapat mengukur sinar yang dipantulkan oleh bercak suatu senyawa pada panjang gelombang 380-800 nm. Untuk dapat diukur pada panjang gelombang tersebut, senyawa yang dianalisis harus memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga energi eksitasi yang dibutuhkan kecil (Gandjar dan Rohman, 2007). Kedua gugus ini bertanggungjawab terhadap penyerapan sinar radiasi elektromagnetik pada kurkumin.

  Pada struktur kimia kurkumin terdapat gugus kromofor yang berupa ikatan rangkap yang memiliki elektron π. Elektron π akan mudah tereksitasi ke tingkat yang lebih tinggi (

  π*) ketika dikenai sinar radiasi elektromagnetik. Sedang

  53 gugus auksokrom merupakan gugus yang memiliki atom dengan elektron bebas. Gugus auksokrom terikat secara langsung pada gugus kromofor. Pasangan elektron bebas pada elektron O akan berinteraksi dengan elektron

  π pada gugus kromofor. Pengikatan ini akan menyebabkan pergeseran panjang gelombang maksimum dan intensitas serapan maksimum dari kurkumin ke panjang gelombang yang lebih besar. Berikut ini merupakan gugus kromofor dan auksokrom yang terdapat pada struktur kurkumin (Gambar 17).

  

Gambar 17. Gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kurkumin

  Gugus kromofor kurkumin yang panjang terdiri dari banyak ikatan π. Energi yang dibutuhkan oleh ikatan

  π untuk mengalami eksitasi ke π* lebih rendah daripada ikatan σ ke σ*, begitupula ikatan n pada atom O gugus auksokrom dan gugus kromofor. Energi yang dibutuhkan untuk eksitasi berbanding terbalik dengan panjang gelombang serapan suatu senyawa, oleh karena itu kurkumin memiliki panjang gelombang maksimum yang besar yaitu pada daerah tampak. Hal tersebut menjadi dasar pemilihan pengukuran panjang gelombang maksimum kurkumin pada rentang 400-500 nm.

  54

  Gambar 18. Kromatogram panjang gelombang maksimum kurkumin

  Chan, Lam, Lee, dan Zhang (2004) menyatakan bahwa pergeseran panjang gelombang maksimum yang diperbolehkan untuk rentang panjang gelombang visibel adalah 3 nm. Kesesuaian panjang gelombang serapan maksimum kurkumin pada percobaan dengan panjang gelombang maksimum kurkumin teoritis menunjukkan bahwa senyawa yang dianalisis tetap stabil (tabel VI).

  

Tabel VI. Data pengukuran panjang gelombang serapan maksimum kurkumin

  Seri Kadar Panjang gelombang serapan maksimum Replikasi I Replikasi II Replikasi III 100 ppm 425 nm 425 nm 425 nm

  300 ppm 425 nm 425 nm 425 nm 500 ppm 425 nm 425 nm 425 nm

  55 Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan terhadap bercak kurkumin, sehingga yang terukur merupakan senyawa murni karena fase gerak maupun pelarut telah menguap. Anggarwal (1995) menyatakan bahwa panjang gelombang maksimum senyawa murni kurkumin adalah 425 nm. Hasil pengukuran menunjukkan bahwa seluruh bercak larutan baku kurkumin memiliki panjang gelombang maksimum 425 nm dan tidak terjadi pergeseran. Hal ini menunjukkan bahwa kualitas baku dan stabilitas kurkumin dalam larutan masih baik.

  Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum pada rentang panjang gelombang ultraviolet hingga visibel, hanya terdapat satu puncak saja. Profil tersebut menunjukkan bahwa senyawa baku kurkumin memiliki kemurnian yang tinggi dan tidak mengandung senyawa lain maupun produk degradasinya.

B. Pengamatan Profil Kromatogram Baku Kurkumin

  Pengamatan profil kromatogram kurkumin baku dilakukan untuk memastikan senyawa kurkumin dapat terelusi dengan baik. Parameter yang digunakan dalam pengamatan profil kromatografi adalah nilai faktor retardasi (R f ) dan warna bercak. R f biasa digunakan dalam analisis kualitatif. Hal ini disebabkan karena nilai R f bersifat selektif untuk senyawa tertentu dalam kondisi tertentu pula.

  Besarnya nilai R f sangat dipengaruhi oleh interaksi antara senyawa yang dianalisis (kurkumin) dengan fase gerak dan fase diam yang digunakan. Besarnya

  56 nilai R f ini ditentukan pula oleh polaritas senyawa analit, fase gerak, dan fase diam.

  

Gambar 19. Kromatogram baku kurkumin 260 ppm

  Dari kromatogram (Gambar 19) dapat diketahui bahwa sistem fase gerak pada KLT mampu mengelusi kurkumin dengan baik. Hal ini ditunjukkan dengan nilai R baku kurkumin yaitu 0,85. Pada kromatogram baku kurkumin ini hanya

  f

  terdapat 1 buah peak saja. Hal ini menunjukkan bahwa baku kurkumin yang digunakan memiliki kemurnian yang tinggi yaitu 100%. O O H CO 3 OCH 3 Gugus non polar HO OH Gugus polar

  

Gambar 20. Gugus polar dan gugus non polar pada kurkumin

  Struktur kurkumin memiliki gugus polar dan gugus non polar. Masing- masing gugus ini dapat berinteraksi dengan komponen fase gerak dan fase diam.

  Fase gerak yang digunakan adalah kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 : 5) v/v dengan indeks polaritas 4,11 dan pH 4. Gugus polar kurkumin

  57 berinteraksi dengan silika gel G 60 dan asam asetat glasial. Sedang gugus nonpolar kurkumin berinteraksi dengan heksana. Gambar 21 dan 22 menunjukkan interaksi kurkumin dengan fase diam dan fase gerak.

  

O O

O O O O Si O Si O H O O O O Si Si O H O O O Si Si O H O O Si O Si O O Si O O Si O O H H O Si O Si O O H O Si O Si O O H Si O H O Si H CH 3 CH 3 H

  

Gambar 21. Interaksi hidrogen antara kurkumin dengan fase diam

  Interaksi gugus polar kurkumin dengan fase diam merupakan interaksi hidrogen. Atom O pada silika gel, gugus metoksi dan fenol pada kurkumin memiliki pasangan elektron bebas yang mampu berinteraksi dengan atom H yang berada di dekatnya.

  O O O O O O H interaksi van Der Waals Heksana

  CH interaksi Van der Waals kloroform O 3 O H H O H O CH 3 interaksi hidrogen asam asetat glasial interaksi van Der Waals Heksana interaksi hidrogen asam asetat glasial CH 2 H CH O 3 H O H H 2 C interaksi hidrogen asam asetat glasial

H

O

O CH 3 Cl H Cl Cl Cl H Cl Cl

  

Gambar 22. Interaksi kurkumin dengan fase gerak

  58 Interaksi yang terjadi antara kurkumin dengan fase gerak adalah interaksi

  

Van der Waals antara atom C karbonil pada struktur kurkumin yang bersifat

  parsial positif dan atom Cl pada kloroform yang bersifat parsial negatif. Interaksi

Van der Waals juga terjadi pada gugus non polar kurkumin dengan heksana.

  Interaksi hidrogen terjadi antara atom O pada gugus karbonil, gugus metoksi, dan gugus fenol kurkumin dengan asam asetat glasial. H C 3 O Si O Si O Si O O O H H H O H Si O Si O Si O O O

  

Gambar 23. Interaksi antara asam asetat glasial dengan silika gel

  Interaksi hidrogen yang terjadi antara kurkumin dengan silika, kurkumin dengan asam asetat glasial serta asam asetat glasial dengan silika gel bersifat kompetitif. Besarnya kekuatan masing-masing ikatan dipengaruhi oleh perbedaan elektronegatifitas antar atom pada senyawa masing-masing.

  Semakin polar komponen, maka akan lebih kuat diadsorpsi oleh silika dan terelusi lebih lama. Polaritas fase gerak memiliki pengaruh utama dalam pemisahan. Semakin polar fase gerak, semakin kompetitif untuk proses adsorpsi sehingga analit lebih cepat terelusi. Asam asetat glasial bersifat lebih polar daripada kurkumin sehingga interaksi asam asetat glasial dengan silika gel G lebih kuat daripada interaksi kurkumin dengan silika gel G.

  59 Kurkumin tidak larut dalam air sehingga dibutuhkan fase gerak yang dapat melarutkan kurkumin. Kloroform dan heksana berfungsi untuk membantu melarutkan kurkumin. Asam asetat glasial berfungsi untuk menjaga kurkumin tetap stabil dan secara kompetitif berinteraksi dengan silika. Kekuatan adsorpsi silika terhadap kurkumin lebih lemah dibandingkan dengan asam asetat glasial. Asam asetat glasial bersifat lebih polar daripada kurkumin sehingga pada saat bercak kurkumin dilewati oleh fase gerak yang mengandung asam asetat glasial, interaksi hidrogen kurkumin dengan silika akan tergantikan oleh ikatan hidrogen asam asetat dengan silika sehingga kurkumin berada dalam bentuk bebas.

  Kurkumin dalam bentuk bebas akan lebih mudah berinteraksi dengan fase gerak sehingga kurkumin lebih terbawa fase gerak. Hasil pengembangan menunjukkan bahwa harga R f kurkumin 0,85. Harga R f yang tinggi menunjukkan bahwa fase gerak dengan indeks polaritas 4,11 mampu mengelusi kurkumin dengan baik.

C. Preparasi Sampel dan Pengamatan Profil Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Preparasi sampel dilakukan 2 tahap yaitu ultrasonikasi dan sentrifugasi.

  Ultrasonikasi merupakan cara untuk memaksimalkan proses ekstraksi. Pemberian getaran ultrasonik pada frekuensi 35 kHz akan melepas ikatan kurkumin dengan matriks sampel sehingga akan mempermudah metanol untuk menarik kurkumin dan melarutkannya. Sentrifugasi merupakan teknik pemisahan dengan prinsip gaya sentrifugal. Partikel basis kapsul lunak yang tersuspensi dengan bobot

  60 molekul lebih besar akan mengendap sehingga akan terpisah dengan kurkumin yang telah larut dalam metanol.

  R

  IV 0,84 0,83 V 0,84 0,84

  III 0,85 0,84

  II 0,83 0,84

  I 0,85 0,84

  Replikasi Baku kurkumin Kurkumin dalam sampel

  f

  

Gambar 24. Perbandingan kromatogram sampel (A) dan kromatogram baku kurkumin (B)

Tabel VII. Data nilai R f baku dan sampel

  Pengamatan profil kromatogram kurkumin dalam sampel bertujuan untuk mengetahui dan memastikan bahwa kurkumin dalam sampel memiliki bercak dengan nilai R

  B

  

A

  dan warna bercak yang sama digunakan sebagai analisis kualitatif untuk mengetahui keberadaan senyawa analit dalam sampel. Gambar 24 A merupakan data kromatogram sampel dan 24 B merupakan kromatogram baku.

  f

  dan warna yang sama dengan baku. Nilai R

  f

  Rata-rata 0,84 0,84

  61 Hasil kromatogram menunjukkan bahwa puncak kurkumin pada sampel

  (puncak 3) memiliki nilai R yang sama dengan baku. Nilai R baku yaitu 0,84

  f f

  sedangkan R f sampel yaitu 0,84. Bercak kurkumin sampel memiliki warna yang sama dengan bercak kurkumin baku yaitu kuning-oranye. Oleh karena itu, puncak 3 pada kromatogram sampel benar-benar merupakan puncak kurkumin.

  Pada kromatogram sampel (Gambar 24 A) terlihat bahwa terjadi pemisahan antara puncak kurkumin dengan puncak senyawa lain. Pemisahan dapat terjadi karena setiap molekul memiliki keadaan kesetimbangan (equilibrium

  

state ) yang berbeda dengan fase gerak serta fase diam. Keadaan setimbang

  merupakan keadaan dimana analit berpindah dari keadaan bebas ke keadaan teradsorpsi atau sebaliknya. Keadaan bebas yaitu seluruh analit terlarut dalam fase gerak, sedangkan keadaan teradsorpsi yaitu analit tertahan pada permukaan fase diam.

  

Gambar 25. Ilustrasi keadaan kesetimbangan pada pemisahan senyawa A (kurkumin)

dengan senyawa lainnya

  62 Keadaan setimbang dipengaruhi oleh polaritas dan ukuran molekul; polaritas dari fase diam; dan polaritas fase gerak. Kurkumin (BM = 368,126) bersifat tidak larut air. Puncak kurkumin terelusi lebih jauh daripada dua senyawa lain karena bersifat lebih non polar. Semakin non polar analit, adsorpsi silika terhadap analit akan lebih lemah sehingga analit akan terelusi lebih jauh.

  Polaritas silika sangat berpengaruh terhadap pemisahan kurkumin. Selisih elektronegativitas silikon (1,8) dan elektronegativitas oksigen (3,5) yaitu 1,7 membuat fase diam bersifat polar. Maka, semakin polar molekul yang akan dipisahkan, semakin kuat gaya tarik fase diam terhadap molekul tersebut.

  Kurkumin dapat terpisah dengan dua senyawa yang lain karena senyawa yang lain tertahan pada silika. Senyawa yang lain lebih kuat teradsorpsi oleh silika karena memiliki polaritas yang tidak sesuai dengan fase gerak.

  Hukum “like-dissolve-like” dapat diaplikasikan pada pemisahan kurkumin dengan sistem KLT. Molekul yang tidak larut air seperti kurkumin akan memiliki afinitas yang lebih rendah terhadap fase diam dan akan terbawa pada fase gerak yang bersifat nonpolar lebih lama. Polaritas fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana ( 85 : 10 : 5) v/v mendekati kepolaran kurkumin sehingga mampu mengelusi analit dengan baik sehingga dapat terpisah dengan senyawa lain yang memiliki polaritas yang berbeda. Ilustrasi yang menggambarkan pemisahan kurkumin dengan salah satu senyawa lain dalam sampel dapat dilihat pada gambar 25.

  63

D. Pembuatan Kurva Baku

  Pembuatan kurva baku dilakukan untuk memperoleh persamaan regresi linear. Pembuatan persamaan regresi linear dilakukan dengan mengukur AUC beberapa bercak kurkumin dengan konsentrasi yang berbeda. Pada penelitian ini, digunakan 6 seri konsentrasi kurkumin dari konsentrasi 100 hingga 500 ppm.

  Pemilihan konsentrasi ini didasarkan pada pengamatan terhadap respon detektor dan respon analit. Konsentrasi baku yang baik memiliki respon detektor yang tidak dipengaruhi oleh noise (peak pengotor) dan dalam rentang 50-150 % respon analit.

  

Tabel VIII. Data kurva baku kurkumin

  Replikasi Kadar kurkumin (ppm)

  Perhitungan regresi linear 100 5537,6 110,752 180 8894,3 177,886 260 13097,4 261,948 340 17220,8 344,416 420 20902,0 418,04

AUC AUC /50

  I 500 24813,5 496,27 A= 8,9963 B= 0,9752 r= 0,9996 α= 44,28º y = 0,9752 x + 8,9963 100 5871,6 117,432

  180 8134,9 162,689 260 13011,2 260,224 340 17132,2 342,644 420 20613,8 412,276

  II 500 25079,1 501,582 A= 4,6247 B= 0,9828 r= 0,9971 α= 44,50º y = 0,9828 x + 4,6247 101 5932,8 118,656

  181,8 8488,7 169,774 262,6 12945,1 258,902 343,4 16880,4 337,608 424,2 21156,3 423,126

  III 505 24712,4 494,248 A= 9,3083 B= 0,9607 r= 0,9981 α= 43,85º y = 0,9607 x + 9,3083

  Kurva baku menunjukkan korelasi antara kenaikan kadar dengan kenaikan respon yang berupa AUC. Dengan meningkatnya kadar maka AUC yang

  64 terukur akan meningkat sebanding dengan peningkatan kadar sehingga hubungan yang terbentuk merupakan hubungan yang proporsional. Hubungan yang proporsional dipastikan memiliki korelasi yang baik.

  Korelasi yang baik antara konsentrasi dan nilai AUC ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi. Koefisien korelasi yang baik yaitu >0,999 (Snyder, dkk, 1997). Untuk mendapatkan koefisien korelasi yang terbaik, setiap seri konsentrasi dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.

  Kurva baku yang dibuat dengan mengeplotkan nilai konsentrasi dan nilai

  

AUC menghasilkan kurva baku dengan sudut kemiringan 88º. Kurva baku tersebut

  tidak layak untuk ditampilkan karena hampir menyentuh sumbu Y. Hubungan konsentrasi dengan AUC yang baik ditunjukkan dengan kemiringan garis sebesar 45º. Oleh karena itu, faktor koreksi diperlukan untuk dapat menghasilkan segi sensitivitas yang baik tersebut. Faktor koreksi yang digunakan yaitu 50 untuk setiap perhitungan AUC.

  Hasil pembuatan kurva baku dengan mengeplotkan nilai konsentrasi dan

  

AUC /50 menunjukkan bahwa kurva baku kurkumin replikasi I memiliki nilai r

  yang memenuhi syarat yaitu sebesar 0,9996 dan kemiringan garis 44,28º. Oleh karena itu, persamaan kurva baku replikasi I digunakan untuk perhitungan kadar selanjutnya dan layak ditampilkan. Persamaan kurva baku tersebut yaitu y = 0,9752x + 8,9963.

  65

  Gambar 26. Hubungan antara konsentrasi kurkumin dengan AUC/50 (replikasi I)

E. Validasi Metode Penetapan Kadar Kurkumin

  Validasi metode analisis dilakukan dalam penelitian ini karena bertujuan untuk membuktikan bahwa metode KLT-densitometri untuk penetapan kadar kurkumin memiliki validitas yang baik. Metode yang memiliki validitas yang baik akan menghasilkan data yang terjamin realibilitas dan reprodusibilitasnya.

  Metode dapat dikatakan valid apabila memenuhi syarat parameter-parameter yang ditentukan berdasarkan pengujian yang dilakukan. Penelitian ini termasuk dalam penelitian kategori I karena bertujuan untuk menganilisis senyawa aktif dalam sampel dalam jumlah besar. Parameter-parameter yang harus dipenuhi pada penelitian kategori I antara lain selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

1. Selektivitas

  Selektivitas merupakan parameter yang menunjukkan bahwa metode analisis yang digunakan mampu mengukur zat tertentu saja secara akurat dan cermat walaupun dimungkinkan masih terdapat zat lain dalam matriks sampel. Untuk mengetahui selektivitas metode KLT-densitometri, dilakukan pengamatan

  66 terhadap profil kromatogram pemisahan sampel. Parameter selektivitas ditentukan oleh nilai resolusi. Resolusi (Rs) merupakan parameter yang menunjukkan seberapa besar senyawa yang dianalisis telah terpisah dengan senyawa yang lain. Nilai Rs yang baik adalah lebih dari 1,5 sehingga senyawa yang dianalisis telah terpisah secara sempurna dengan senyawa lain.

  Pada penelitian ini, sampel mengandung senyawa kurkuminoid dan minyak atsiri. Untuk dapat menetapkan kadar kurkumin, maka puncak kurkumin harus terpisah dengan puncak-puncak senyawa lain.

  

Gambar 27. Nilai Rs puncak kurkumin sampel dan kesamaan R baku dengan puncak

f

kurkumin pada sampel

  67

  Tabel IX. Resolusi puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2

  Resolusi puncak kurkumin dengan Replikasi puncak senyawa 2

  I 2,1818

  II 2,4762

  III 2,1818

  IV 2,2727 V 2,0870

  Rata-rata 2,2399 Hasil penelitian menunjukkan nilai R kurkumin pada baku dan puncak

  f

  kurkumin pada sampel sama yaitu 0,84 dan 0,84 (Tabel VII). Rata-rata hasil perhitungan resolusi antara puncak kurkumin dengan puncak senyawa 2 (Gambar 27) adalah 2,2399. Resolusi yang menunjukkan pemisahan yang baik adalah > 1,5. Hal ini menunjukkan bahwa kurkumin telah terpisah dengan senyawa 2 secara sempurna. Pemisahan antara puncak senyawa 2 dan kurkumin terjadi secara sempurna karena respon garis menyentuh hingga baseline. Pemisahan yang baik ini membuktikan bahwa metode KLT-Densitometri ini selektif untuk menganalisis dan memisahkan kurkumin yang terdapat bersama dengan senyawa lain. Dari hasil yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa metode KLT- Densitometri untuk penetapan kadar kurkumin dengan fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana (85 : 10 :5) v/v memiliki selektivitas yang baik.

2. Linearitas dan rentang

  Linearitas merupakan parameter yang ditunjukkan melalui besarnya koefisien korelasi (r). Nilai r diperoleh melalui perhitungan kurva baku menggunakan metode regresi linear. Metode dikatakan memiliki linearitas yang baik apabila memiliki nilai r lebih besar dari 0,999 (Snyder dkk., 1997).

  68 Kurva baku kurkumin yang memiliki linearitas yang baik ditunjukkan pada kurva baku replikasi I dengan nilai 0,9996. Sedangkan untuk replikasi II dan replikasi III berturut-turut adalah 0,9971 dan 0,9981. Metode KLT-Densitometri memiliki linearitas yang baik untuk penetapan kadar kurkumin.

  Rentang merupakan parameter yang menentukan pada rentang konsentrasi baku kurkumin berapa, metode yang digunakan masih bisa diperoleh hubungan korelasi yang baik (r > 0,999) antara konsentrasi dengan respon serta memenuhi parameter akurasi dan presisi. Metode ini memiliki rentang yang baik pada konsentrasi baku dengan konsentrasi 260 – 500 ppm.

3. Akurasi

  Akurasi merupakan kesesuaian antara kadar yang terukur dengan kadar yang sebenarnya. Besarnya nilai akurasi ditunjukkan melalui besarnya perolehan kembali (recovery). Perolehan kembali ditentukan dengan cara mengukur sedikitnya 3 seri konsentrasi dengan masing-masing 3 replikasi. Nilai perolehan kembali yang baik pada senyawa baku adalah 98-102% (Harmita, 2004).

  

Tabel X. Hasil penentuan perolehan kembali (recovery) kurkumin baku

  Level Kadar % recovery kurkumin Replikasi I Replikasi II Replikasi III Rata-rata

  Kadar rendah 103,02% 107,42% 101,77% 103,02% Kadar sedang 98,96% 99,18% 99,69% 98,96%

  Kadar tinggi 98,70% 101,26% 100,36% 98,70% Hasil penentuan perolehan kembali menunjukkan bahwa pada kadar sedang (260 ppm) dan tinggi (500 ppm) memenuhi persyaratan nilai perolehan kembali yang baik. Oleh karena itu penetapan kadar kurkumin dilakukan pada

  69 rentang konsentrasi 260 hingga 500 ppm. Hasil penetuan perolehan kembali ditunjukkan pada tabel X.

4. Presisi

  Presisi merupakan ukuran seberapa besar keseksamaan dari suatu metode analisis. Keseksamaan ini ditunjukkan melalui penentuan koefisien variasi (KV).

  Nilai KV yang semakin kecil menunjukkan bahwa presisi dari metode analisis yang dilakukan semakin baik. Harmita (2004), menyatakan bahwa metode analisis untuk senyawa baku memenuhi persyaratan akurasi apabila memiliki KV kurang dari 2%.

  

Tabel XI. Hasil penentuan KV kurkumin baku

  Level kadar SD KV Kadar rendah (100 ppm) 2,8416 2,72% Kadar tengah (260 ppm) 0,8810 0,34% Kadar tinggi (500 ppm) 3,9699 0,79%

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai KV dari konsentrasi kurkumin pada 260 dan 500 ppm memenuhi persyaratan KV yang baik. Oleh karena itu, metode penetapan kadar kurkumin secara KLT-densitometri pada level kadar tersebut memiliki presisi yang baik.

F. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin dalam Sampel

  Penentuan akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel merupakan tahap kedua dari validasi metode yang dilakukan. Percobaan ini bertujuan untuk memastikan bahwa metode ini sesuai dan mampu memberikan hasil yang reliable dan reprodusibel untuk sampel yang dianalisis. Selain itu penentuan akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel bertujuan untuk mengetahui bahwa puncak

  70 kurkumin pada kromatogram sampel betul-betul merupakan puncak kurkumin. Hal ini dibuktikan dengan penambahan baku kurkumin ke dalam sampel hanya akan menambah tinggi puncak dan AUC dari puncak kurkumin saja (puncak 3 pada gambar 27) tanpa adanya penambahan AUC dan tinggi pada puncak yang lainnya. Penentuan akurasi dan presisi baku dalam sampel juga bertujuan sebagai pedoman seberapa besar pengambilan sampel ketika penetapan kadar agar masuk dalam rentang daerah kurva baku yang memenuhi parameter validasi.

  Perolehan kembali yang baik untuk analisis senyawa baku dalam matriks sampel adalah 90-107% (Yuwono dan Indrayatno, 2005). Sedangkan untuk nilai KV yang baik berdasarkan Yuwono dan Indrayatno (2005) adalah ≤ 5,3%.

  

Tabel XII. Perolehan kembali dan KV baku kurkumin dalam sampel

  Kadar Kadar Kadar baku Perolehan kurkumin kurkumin kurkumin

  Replikasi kembali KV sampel sampel + dalam

  (%) (ppm) baku (ppm) sampel

  I 279,9853 379,9751 101,1670 101,17

  II 279,2368 382,9939 104,1858 104,19 3,64%

  III 276,9542 381,3861 102,5780 102,58

  IV 280,2027 376,8003 97,9922 97,99 V 277,6617 383,2216 104,4135 104,41

  Tabel XIII. Perbandingan AUC kurkumin dalam sampel dan kurkumin dalam

sampel yang ditambah baku

  kurkumin dalam sampel

  AUC AUC kurkumin dalam sampel

  yang ditambah baku Replikasi

  Puncak Puncak Puncak III Puncak Puncak Puncak III

  I II (kurkumin)

  I II (kurkumin) I 1203,7 2807,5 14101,9 823,4 2647,7 18977,4

  II 830,4 2437,5 14064,4 684,8 2487,6 19124,6

  III 1233,7 2457,9 13954,1 955,7 1869,9 19046,2

  IV 985,5 2809,0 14112,5 773,4 2708,0 18822,6 V 534,8 2458,8 13988,6 1050,7 2444,2 19135,7

  71

  Tabel XIV. Perbandingan tinggi puncak kurkumin dalam sampel dan kurkumin

dalam sampel yang ditambah baku

  AU kurkumin dalam sampel AU kurkumin dalam sampel

  yang ditambah baku Replikasi

  Puncak Puncak Puncak III Puncak Puncak Puncak III

  I II (kurkumin)

  I II (kurkumin) I 32,8 73,4 358,2 23,8 69,3 458,0

  II 23,8 69,2 355,9 21,9 65,8 465,7

  III 32,8 64,1 344,7 22,6 53,4 462,3

  IV 23,5 76,2 363,8 23,0 63,0 463,3 V 25,3 65,7 370,0 30,2 75,0 485,8

  Hasil pengukuran menunjukkan bahwa nilai KV dan besarnya perolehan kembali memenuhi syarat akurasi dan presisi. Hal ini menunjukkan bahwa seluruh baku kurkumin yang ditambahkan hanya terdeteksi pada puncak kurkumin saja (puncak 3 pada gambar 27). Sedangkan puncak yang lain memiliki nilai AUC dan tinggi puncak yang tidak berbeda setelah ditambahkan baku. Hal ini terlihat pada tabel XIII dan XIV bahwa tidak terjadi peningkatan tinggi dan AUC pada senyawa puncak 1 dan 2 (gambar 27 pada kromatogram sampel). Dari keseluruhan data yang diperoleh, dapat diketahui bahwa metode KLT-Densitometri pada penetapan

  ®

  kadar kurkumin dalam sampel kapsul lunak OHT “Rheumakur ” memenuhi parameter validasi.

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah diperoleh, dapat disimpulkan bahwa:

  validasi metode KLT-Densitometri dengan instrumen yang digunakan adalah CAMAC TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No.160602, fase gerak kloroform : asam asetat glasial : heksana ( 85 : 10 : 5) v/v, fase diam silika gel G 60, volume penotolan 1,0

  μL, jarak pengembangan 10 cm, pada penetapan kadar

  ®

  kurkumin dalam sediaan kapsul lunak OHT “Rheumakur ” memenuhi parameter- parameter validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.

B. Saran

  Perlu dilakukan penetapan kadar kurkumin terhadap sampel obat

  ® tradisional Rheumakur dengan menggunakan metode penelitian ini.

  73

DAFTAR PUSTAKA

  Aggarwal, B.B., 1995, Curcumin, Analogues, of Curcumin and Novel Uses

  Thereof , http://www.thepowerhour.com/curcumin/Turmeric.pdf, diakses tanggal 20 Juli 2010.

  Agnam, N., Samhoedi, H., Timmerman, H., Venie, U. A., Sugiyanto., Goot, H., 1995, The Relationship between Structure and Inhibition of Lipoxygenase Activity of Curcumin Derivates, International Symposium on Curcumin Pharmacocheimistry (ISCP) , Yogyakarta.

  Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004, Monografi

  ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia , Vol 1, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta, 51.

  Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005, Standarisasi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Salah Satu Tahapan Penting dalam Pengembangan Obat Asli Indonesia, InfoPOM, 6(4), 1-5.

  Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y. C., Zhang, X-M., 2004, Analytical Method

  Validation and Instrument Performance Verification , pp. 169, A John Wiley and Sons, Inc, Kanada.

  Commandeur, J.N. dan Vermeulen, N.P., 1996, Cytotoxicity ang cytoprotective activities of natural compounds : The case of curcumin , Xenobiotica 26, pp.

  667-680. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1977, Materia Medika

Indonesia , Jilid I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 49-52, 147.

  Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia , Jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2-4. Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, 221-225. Gritter, R.J., Bobit, J.M., Schwarting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, terbitan ke-2, 107-155, penerbit

  ITB, Bandung. Gupta, A.P., Gupta, M.M., Kumar, S., 1999, Simultaneous determination of

  curcuminoids in curcuma samples using high performance thin layer chromatography,

  http://203.190.147.121/bitstream/123456789/80/1/J_Journal_Liquid_Chrom atography_Related_Technologies_22_1561.pdf , diakses tanggal 10 Februari 2010.

  74 Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian , 1(3), 117-135. Jork, Funk, Fischer, Wimmer, 1990, Thin-Layer Chromatography, volume 1a, Hellmut Jork-Weinheim; Basel (Zwitzerland); Cambridge; New York. Kalim, H., 1996, Penyakit Sendi Degeneratif (Osteoarthritis), Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam, Jakarta, 74-86. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1990, Peraturan Menteri Kesehatan

  Republik Indonesia No.246/MENKES/PER/V/1990 tentang Izin Usaha Industri Obat Tradisional dan Pendaftaran Obat Tradisional , Departemen

  Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 1994, Keputusan Menteri Kesehatan

  Republik Indonesia No.661/MENKES/SK/VII/1994 tentang Persyaratan Obat Tradisional , Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

  Kertia, N., Sudarsono, Imono, A.D., Mufrod, Catur., E., Rahardjo, P., dkk, 2005, Pengaruh pemberian kombinasi minyak atsiri temulawak dan ekstrak kunyit dibandingkan dengan piroksikam terhadap angka leukosit cairan sendi penderita dengan osteoarthritis lutut, Majalah Farmasi Indonesia, 16 (3), 156-160.

  Kohli, K., Ali J., Ansari M. J., dan Raheman Z., 2005, Curcumin : A Natural Antiinflammatory Agent, Indian Journal of Pharmacology, New Delhi, Jarnia Hamdard University, pp. 141-142.

  Martono, S., 1996, Penentuan kadar kurkumin secara kromatografi lapis tipis- densitometri, Buletin ISFI Yogyakarta, 2(4), 11-21. Mintarsih, E.R.R., 1990, Penetapan Kadar Alkaloid Kinina dalam Akar, Batang, dan Daun Chinchona Succirubra Pavon et Klotzch dari Daerah Kaliurang secara Spektrodensitometri (TLC-Scanner), Skripsi, Fakultas Farmasi, UGM, Yogyakarta. Mulja, H.M., Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, 6. Naguib, Y., 2000, Soft Gel Capsules: An Elegant & Versatile Dosage Form,

  Supplement Industry Executive : The Business Magazine for Dietary Supplement Industry Manufactures , East Brunswick.

  Paramasivam, M., Aktar, W., Poi, R., Banerjee, H., Bandyopahyay, A., 2008,

  Occurrence of curcuminoids in Curcuma longa : A quality standardization by HPTLC,

  http://www.banglajol.info/index.php/BJP/article/viewFile/833/913, diakses tanggal 10 Februari 2010.

  75 Pothitirat, W., Gritsanapan, W., 2005, Quantitative Analysis of Curcumin,

  E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy , diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 3-7, Institut Teknologi Bandung, Bandung. Sudjadi, 1988, Metode Pemisahan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, 75. Supardjan, A.M., 1987, Pemisahan Tetrasiklin dan Hasil Uraiannya dalam

  H., 1995, New perspective for anti-inflammatory drugs,

  edition, FAO, ftp://ftp.fao.org/es/esn/jecfa/cta/CTA_61_Curcumin.pdf, diakses tanggal 1 Desember 2010. Timmerman,

  st

  61

  Stankovic, 2004, Curcumin : Chemical and Technical Assessment (CTA), JECFA

  Universitas Gadjah Mada , Yogyakarta.

  Sediaan Tetrasiklin Secara KLT-Densitometri, Laporan Penelitian Lembaga Penelitian Universitas Gadjah Mada , Yogyakarta. Supardjan, A.M., dan Meiyanto, E., 2002, Efek antiproliferatif pentagamavunon-0 terhadap beberapa sel kanker, Laporan Penelitian Lembaga Penelitian

  Edition, 13, 690, 710, 723, John Wiley & Sons, Inc., New York. Stahl,

  Demethoxycurcumin and Bisdemethoxycurcumin in the Crude Curcuminoid Extract from Curcuma longa in Thailand by TLC-Densitometry ,

  Development , 2 nd

  Snyder, L.R., Kirkland, J.J., dan Glajch, K.L., 1997, Practical HPLC Method

  Analysis , 5 th edition, Harcourt Brace College, Philadelphia, pp.329-351.

  Skoog, D.A., Holler, F.J., & Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental

  Sastrohamidjojo, H., 1985, Kromatografi, Edisi I, Liberty, Yogyakarta, 26-30. Sherma, J., Fried, B., 1996, Handbook of Thin Layer Chromatography, Marcell Dekker Inc., New York, pp. 56-57.

  Chem ., 5(1).

  http://www.bioponic.com/pdfs/TurmericAyurveda.pdf, diakses tanggal 10 Februari 2010. Rahardjo, P., 1994, Masalah dan Penanganan Osteoartritis, Konggres Ahli Rematologi Indonesia , Palembang. Rukmana, R., 1994, Kunyit, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, 2. Sasaki, S.S., Sat, K., Abe, M., Sugimoto, N., & Maitani, T, 1998, Components of turmeric oleoresin preparations and photo-stability of curcumin, Jpn. J. Food

  International Symposium on Curcumin Pharmacochemistry (ISCP) , Yogyakarta.

  76 Tonnesen, H.H. & Karlsen, J., 1985, Studies of curcumin and curcuminoids: V.

  Alkaline degradation of curcumin, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 180: 132- 134.

  Tonnesenn H.H., dan Karlsen, J., 1985a, Studies on curcumin and curcuminoids,

VI: Kinetics of Curcumin Degradation in Aqueous Solution , Original Paper, Z. Lebensm. Unters. Fosch., pp. 402-404.

  United States Pharmacopeial Convention, 1995, The United States Pharmacopeia,

  th

  23 edition, United States Pharmacopeia Convention, Rockville, pp. 1982- 1984. Usia, T., 2010, Trend Penggunaan Obat Bahan Alam , http://www.isfinational.or.id/pt-isfi-penerbitan/123/433-trend-penggunaan- obat-bahan-alam.html, diakses tanggal 31 Maret 2010. Van der Goot, H., 1997, The chemistry and qualitative structure-activity relationships of curcumin, in Recent Development in Curcumin

  Pharmacochemistry, Procedings of The International Symposium on Curcumin Pharmacochemistry (ISCP) , Yogyakarta. Wang, Y.J., Pan, M.H., Cheng, A.L., Lin, L.I., Ho, Y.S., Hsieh, C.Y., & Lin, J.K.,

  1997, Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products, J. Pharm. Biomed. Anal., pp. 1867-1876. Windholz, M., 1981, The Merck Index : An Encyclopedia of Chemicals and Drug,

  th 10 edition, Merck & Co., Inc., Rahmay, New York, pp. 2681.

  Yuwono, M. and Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methods

  of Analysis , Profile of Drugs Substances, Excipients, and Related Methodology, Elsevier Inc , 32.

  77

  LAMPIRAN

  78

  Lampiran 1. Sertifikat analisis baku kurkumin

  79

  Lampiran 2. Hasil uji pH stabilitas kurkumin

  a. Panjang gelombang serapan maksimum larutan baku kurkumin 0,4 ppm pada pH 4 b. Panjang gelombang serapan maksimum larutan baku kurkumin 1 ppm pada pH 4

  80 c. Panjang gelombang serapan maksimum larutan baku kurkumin 1,6 ppm pada pH 4

  Tabel hasil penentuan pH stabilitas kurkumin

  Konsentrasi Repliaksi pH 3 pH 4 pH 5 I 425 nm 432 nm 432 nm

  II 425 nm 432 nm 432 nm 0,4 ppm

  III 432 nm 432 nm 432 nm I 432 nm 435 nm 435 nm

  II 429 nm 435 nm 432 nm 1 ppm

  III 429 nm 433 nm 435 nm I 432 nm 433 nm 429 nm

  II 429 nm 432 nm 429 nm 1,6 ppm

  III 429 nm 432 nm 429 nm

  81

  Lampiran 3. Hasil kromatogram pengukuran panjang gelombang serapan maksimum kurkumin

  82

  Lampiran 4. Sistem KLT-Densitometri yang digunakan

  Sistem KLT-Densito yang digunakan pada penelitian ini adalah sebagai berikut:

  Stationary phase Plate size (X x Y) 7,0 x 13,0 cm dan 11,0 x 13,0 cm Material TLC plates silica gel G Manufacturer

  E. MERCK KGaA Pre-washing Yes Drying device Oven Temperature 100ºC Time

  60 Minutes Calibration parameters Calibration mode Single level Statistics mode CV Avaluation mode Peak area Sample application-Nanomat / Manual device

Instrument Graduated Disposable Micropipettes

First application position X 10,0 mm Application position Y 15,0 mm Distance between tracks 10,0 mm Application volume 1,000 μl Development – Glass tank Chamber type Twin Trough Chamber 20x20 cm Mobile phase Cloroform : Acetic Acid Glacial : Hexane

  (85 : 10 : 5) Solvent front position 100,0 mm Volume 100,0 mL Drying device Oven Temperature 60ºC Time

  5 Minutes Detection – CAMAG TLC Scanner 3

Instrument CAMAG TLC Scanner

  3 “Scanner3_160602” S/N 160602 (1. 14.28) Scan start pos. Y 15,0 mm Scan end pos. Y 115,0 mm Slit dimensions 8,00 x 0,90 mm, Macro Optimize optical system Light Scanning speed: 20 mm/s Data resolution 100

  μm/step Measurement Table Wavelength 425 Lamp D2 & W Measurement Type Remission Measurement Mode Absorption Optical filter Second order

  83

  Detector mode Automatic PM high voltage 312 V Detector properties Y-position for 0 adjust 15,0 mm Track # for 0 adjust Analog Offset 10% Sensitivity Automatic (27) Integration Properties Data filtering Savitsky-Golay 7 Baseline correction Lowest Slope Peak threshold min. slope

  5 Peak threshold min. height 10 AU Peak threshold min. area

  50 Peak threshold max. height 600 AU Display scaling 600

  84 Contoh lampiran hasil analisis :

  85

  86

  Lampiran 5. Kromatogram kurva baku kurkumin

  a. Seri baku 1: 100 ppm

  87 b. Seri baku 2: 180 ppm

  c. Seri baku 3: 260 ppm

  d. Seri baku 4: 340 ppm

  88 e. Seri baku 5: 420 ppm

  f. Seri baku 6: 500 ppm

  Lampiran 6. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku

  a. Penimbangan baku kurkumin Berat Replikasi I Replikasi II Replikasi III Berat Kertas 0,1345 gram 0,1256 gram 0,1447 gram Berat Kertas + Zat 0,1445 gram 0,1356 gram 0,1548 gram Berat Kertas + Sisa 0,1345 gram 0,1256 gram 0,1447 gram Berat Zat 0,0100 gram 0,0100 gram 0,0101 gram

  b. Skema kerja singkat pembuatan seri larutan baku Kurkumin baku 10 mg dilarutkan dalam methanol p.a pH 4 hingga 10,0 mL

  ↓

  89 Ambil 0,5;0,9;1,3;1,7;2,1; dan 2,5 mL dari larutan di atas, dan ditambahkan methanol p.a pH 4 hingga 5,0 mL c. Data AUC baku

  Repli kasi Kadar kurkumin (ppm)

  Perhitungan regresi linier 100 5537,6 110,752 180 8894,3 177,886 260 13097,4 261,948 340 17220,8 344,416 420 20902,0 418,04

AUC AUC /50

  180 8134,9 162,689 260 13011,2 260,224 340 17132,2 342,644 420 20613,8 412,276

  II 500 25079,1 501,582 A= 4,6247 B= 0,9828 r= 0,9971 α= 44,50º y = 0,9828 x + 4,6247 101 5932,8 118,656

  181,8 8488,7 169,774 262,6 12945,1 258,902 343,4 16880,4 337,608 424,2 21156,3 423,126

  III 505 24712,4 494,248 A= 9,3083 B= 0,9607 r= 0,9981 α= 43,85º y = 0,9607 x + 9,3083

  d. Contoh perhitungan kadar baku (Replikasi I) Kurkumin baku memiliki tingkat kemurnian 100% Jumlah kurkumin = 10,0 mg x 100 = 10 mg C

  I 500 24813,5 496,27 A= 8,9963 B= 0,9752 r= 0,9996 α= 44,28º y = 0,9752 x + 8,9963 100 5871,6 117,432

  1

  = C

  2 V

  2 Seri 1 : 1000 ppm x 0,5 mL = C

2 x 5 mL

  C

  2 = 100 ppm

  NB : Perhitungan kadar seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang sama dengan menyesuaikan volume pengambilan larutan stok baku kurkumin.

  1 V

  90

  Lampiran 7. Kromatogram hasil validasi metode

  a. Kromatogram Baku kurkumin kadar rendah replikasi I

  b. Kromatogram Baku kurkumin kadar rendah replikasi II

  c. Kromatogram Baku kurkumin kadar rendah replikasi III

  91 d. Kromatogram Baku kurkumin kadar sedang replikasi I

  e. Kromatogram Baku kurkumin kadar sedang replikasi II

  f. Kromatogram Baku kurkumin kadar sedang replikasi III

  92 g. Kromatogram Baku kurkumin kadar tinggi replikasi I

  h. Kromatogram Baku kurkumin kadar tinggi replikasi II i. Kromatogram Baku kurkumin kadar tinggi replikasi III

  93

  Lampiran 8. Data penimbangan dan contoh perhitungan recovery

  1. Data penimbangan untuk penentuan perolehan kembali dan KV Berat Replikasi I Replikasi II Replikasi III Berat Kertas 0,1295 gram 0,1368 gram 0,1342 gram Berat Kertas + Zat 0,1306 gram 0,1378 gram 0,1352 gram Berat Kertas + Sisa 0,1295 gram 0,1368 gram 0,1342 gram Berat Zat 0,0101 gram 0,0100 gram 0,0100 gram

  2. Data AUC kurkumin Level Kadar AUC kurkumin

  Replikasi I Replikasi II Replikasi III

AUC AUC /50 AUC AUC /50 AUC AUC /50

  Kadar rendah 5523,5 110,47 5687,4 113,748 5412,0 108,24 Kadar sedang 13104,8 262,096 13023,4 260,468 13087,9 261,758 Kadar tinggi 24752,5 495,05 25138,2 502,764 24916,4 498,328

  3. Skema kerja singkat pembuatan seri larutan baku Kurkumin baku 10 mg dilarutkan dalam methanol p.a pH 4 hingga 10,0 mL

  ↓ Ambil 0,5; 1,3; dan 2,5 mL dari larutan di atas, dan ditambahkan methanol p.a pH 4 hingga 5,0 mL

  ↓ Masing-masing larutan seri dibuat sebanyak 3 kali

  Contoh perhitungan perolehan kembali kurkumin

  Replikasi I: Perhitungan kadar teoritis Kadar kurkumin = 10,1 x 100% (tingkat kemurnian kurkumin

  = 10,1 mg

  94 Cstok = 10,1 mg/10,0 mL

  = 1010 ppm C

  1 V 1 =C

2 V

  2 Kadar rendah : 1010 ppm x 0,5 mL = C 2 x 5 mL

  C

  2 = 101 ppm

  Kadar tengah : 1010 ppm x 1,3 mL = C

  2 x 5 mL

  C = 262,26 ppm

  2 Kadar tinggi : 1010 ppm x 2,5 mL = C 2 x 5 mL

  C

  2 = 505 ppm

  Perhitungan kadar terukur: y = 0,9752 x + 8,9963 y= AUC kurkumin/50 Kadar rendah : 110,47 = 0,9752 x + 8,9963 x = 104,0542 ppm Kadar tengah : 262,096 = 0,9752 x + 8,9963 x = 259,5362 ppm Kadar tinggi : 495,05= 0,9752 x + 8,9963 x = 498,4144 ppm Perhitungan perolehan kembali (recovery):

  Recovery =

  95 Replikasi I

  Data recovery kurkumin

  Level Kadar % recovery kurkumin Replikasi I Replikasi II Replikasi III

  Kadar rendah 103,02% 107,42% 101,77% Kadar sedang 98,96% 99,18% 99,69% Kadar tinggi 98,70% 101,26% 100,36%

  Lampiran 9. Contoh perhitungan SD dan CV Tabel perhitungan SD dan CV

  2 Level Replikasi Kadar terukur Kadar rata-rata

  (x- ) kadar Kadar Replikasi I 104,0452 0,1294 rendah

  104,4049 Replikasi II 107,4156 9,0643 Replikasi III 101,7675 6,9559

  Jumlah 16,1496 Kadar Replikasi I 259,5362 0,4516 tengah

  258,8642 Replikasi II 257,8668 0,9948 Replikasi III 259,1896 0,1059

  Jumlah 1,5523 Kadar Replikasi I 498,4144 14,1158 tinggi 502,1715

  Replikasi II 506,3245 17,2474 Replikasi III 501,7757 0,1567

  Jumlah 31,5199

  96 Contoh perhitungan SD dan CV pada level kadar rendah : SD = SD = 2,8416

  CV = CV = 2,72 %

Data hasil perhitungan SD dan CV

  Level kadar SD CV Kadar rendah 2,8416 2,72% Kadar tengah 0,8810 0,34% Kadar tinggi 3,9699 0,79%

  

Lampiran 10. Kromatogram penentuan akurasi dan presisi baku dalam

sampel

  97 a. Kromatogram sampel replikasi I

  b. Kromatogram sampel replikasi II

  c. Kromatogram sampel replikasi III

  98 d. Kromatogram sampel replikasi IV

  e. Kromatogram sampel replikasi V

  f. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi I

  99 g. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi II

  h. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi III i. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi IV

  100 j. Kromatogram sampel yang ditambah baku kurkumin replikasi V

  1 puncak 2

  IV 0,58 0,83 0,08 0,14 2,2727 V 0,60 0,84 0,11 0,12 2,0870

  III 0,60 0,84 0,10 0,12 2,1818

  II 0,58 0,84 0,09 0,12 2,4762

  Rs I 0,60 0,84 0,10 0,12 2,1818

  2 kurkumin

  W

  W

  

Lampiran 11. Data perhitungan nilai resolusi antara puncak kurkumin

dengan puncak senyawa 2 dan contoh perhitungannya

  2 )

  maksimum kurkumin (z

  1 ) Rf

  maksimum puncak 2 (z

  Rf

  Replikasi

  Rata-rata 2,2399

  101

  Lampiran 11. Data dan contoh perhitungan nilai recovery dan CV baku dalam matriks sampel

Tabel penentuan recovery dan CV baku dalam matriks sampel

  Larutan E AUC AUC /50 Kadar (ppm)

  Selisih kadar larutan D- rerata kadar larutan E

  Recovery

  Baku (%) SD dan

  CV

  Replikasi I 14101,9 282,038 279,9853 101,1670 101,17 Replikasi II 14065,4 281,308 279,2368 104,1858 104,19 Replikasi III 13954,1 279,082 276,9542 102,5780 102,58 Replikasi IV 14112,5 282,25 280,2027 97,9922 97,99 Replikasi V 13988,6 279,772 277,6617 104,4135 104,41

  Rata-rata 278,8081 102,0673 Larutan D AUC AUC /50 Kadar

  (ppm) (x-x rata-rata)

  2 Replikasi I 18977,4 379,548 379,9751 0,8106 SD 3,7196

  Replikasi II 19124,6 382,492 382,9939 4,4882 CV 3,64% Replikasi III 19046,2 380,924 381,3861 0,2608 Replikasi IV 18822,6 376,452 376,8003 16,6060 Replikasi V 19135,7 382,714 383,2216 5,5046

  102

  103

BIOGRAFI PENULIS

  Penulis skripsi yang berjudul “Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri pada Penetapan Kadar Kurkumin dalam Sediaan Obat Herbal

  ®

  Terstandar (OHT) Rheumakur ” ini bernama lengkap Andreas Suseno Wimbo Hapsoro, lahir di Klaten, 12 Juni 1989. Merupakan anak sulung dari dua bersaudara pasangan Y. Nardiyo dan Sutarmi. Penulis telah menyelesaikan pendidikannya di Sekolah Dasar Negeri

  IV Prambanan pada tahun 2001, di Sekolah Menegah Pertama Negeri I Kalasan pada tahun 2004, dan di Sekolah Menengah Atas Kolese De Britto pada tahun 2007. Penulis kemudian melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2007.

  Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis pernah menjadi asisten praktikum Spektroskopi, Farmasi Fisika II, Formulasi dan Teknologi Sediaan Solid A, serta Analisis Sediaan Obat Tradisional. Selain kegiatan akademik penulis juga pernah mengikuti beberapa kegiatan non akademik yaitu pada kepanitiaan Talk Show Hari AIDS 2008 yang diadakan oleh JMKI dan Tiga Hari Temu Akrab Farmasi (TITRASI) 2009.

Dokumen baru

Tags

Dokumen yang terkait

DALAM SEDIAAN JAMU ASAM URAT DENGAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS –DENSITOMETRI
4
38
23
IDENTIFIKASI RHODAMIN B PADA KERUPUK SINGKONG DENGAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DAN DENSITOMETRI (DI PASAR KOTA MALANG)
0
17
20
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
0
0
8
PENETAPAN KADAR TRIPROLIDINA HIDROKLORIDA DAN PSEUDOEFEDRINA HIDROKLORIDA DALAM SEDIAAN SIRUP OBAT INFLUENZA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI
0
0
14
PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM TABLET TEMULAWAK (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI
0
0
8
IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR SENYAWA KUMARIN DALAM EKSTRAK METANOL Artemisia Annua L. SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS - DENSITOMETRI
0
0
12
VALIDASI METODE ANALISIS METOPROLOL DALAM PLASMA MANUSIA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)- DENSITOMETRI
0
0
17
BAB II TINJAUAN PUSTAKA - VALIDASI METODE ANALISIS METOPROLOL DALAM PLASMA MANUSIA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)- DENSITOMETRI - repository perpustakaan
0
0
9
BAB III METODE PENELITIAN - VALIDASI METODE ANALISIS METOPROLOL DALAM PLASMA MANUSIA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)- DENSITOMETRI - repository perpustakaan
0
0
8
VALIDASI METODE ANALISIS PROPRANOLOL DALAM PLASMA MANUSIA IN VITRO SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI
0
0
14
VALIDASI METODE ANALISIS METOPROLOL DALAM URIN MANUSIA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI
0
0
16
VALIDASI METODE ANALISIS ATENOLOL DALAM URIN MANUSIA SECARA IN VITRO MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS- DENSITOMETRI
0
2
17
IDENTIFIKASI SILDENAFIL SITRAT DALAM JAMU PENAMBAH STAMINA SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI
0
0
17
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS- DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR IBUPROFEN DAN PARASETAMOL DALAM TABLET MERK NEO-RHEUMACYL
1
1
107
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR MEREK RHEUMAKUR
1
1
111
Show more