VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN DALAM COKELAT BUBUK MERK “X” Skripsi

Gratis

0
1
145
3 months ago
Preview
Full text

  VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN DALAM COKELAT BUBUK MERK “X” Skripsi

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Monica Satya Resmi Yunita NIM : 088114171

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2012

  Halaman Persembahan If you have problems, don’t say, “GOD, I have BIG problem”

  But say, “Problem, I have BIG GOD” And always believe that everything will be alright Because, if GOD brings you to it,

  He will bring you through it Karya ini ku persembahkan untuk Bapak, Ibu dan Adik tercinta

  Sahabat-sahabatku tersayang Teman-teman serta almamaterku semua...

  Halaman Persembahan If you have problems, don’t say, “GOD, I have BIG problem”

  But say, “Problem, I have BIG GOD” And always believe that everything will be alright Because, if GOD brings you to it,

  He will bring you through it Karya ini ku persembahkan untuk Bapak, Ibu dan Adik tercinta

  Sahabat-sahabatku tersayang Teman-teman serta almamaterku semua...

  Halaman Persembahan If you have problems, don’t say, “GOD, I have BIG problem”

  But say, “Problem, I have BIG GOD” And always believe that everything will be alright Because, if GOD brings you to it,

  He will bring you through it Karya ini ku persembahkan untuk Bapak, Ibu dan Adik tercinta

  Sahabat-sahabatku tersayang Teman-teman serta almamaterku semua...

  

Pernyataan Keaslian Karya Pernyataan Keaslian Karya Pernyataan Keaslian Karya

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka sebagaimana layaknya karya ilmiah. dalam kutipan dan daftar pustaka sebagaimana layaknya karya ilmiah. dalam kutipan dan daftar pustaka sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Apabila di kemudian hari diberlakukan indikasi plagiarism dalam naskah Apabila di kemudian hari diberlakukan indikasi plagiarism dalam naskah Apabila di kemudian hari diberlakukan indikasi plagiarism dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang- ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang- ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang- undangan yang berlaku. undangan yang berlaku. undangan yang berlaku.

  Yogyakarta, Februari 2012 Yogyakarta, Februari 2012 Yogyakarta, Februari 2012 Penulis Penulis Penulis

  Monica Satya Resmi Yunita Monica Satya Resmi Yunita Monica Satya Resmi Yunita

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA

  

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  Yang bartanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Yang bartanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Yang bartanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Dharma: Dharma:

  Nama Nama Nama : Monica Satya Resmi Yunita : Monica Satya Resmi Yunita : Monica Satya Resmi Yunita Nomor Mahasiswa : 088114171 Nomor Mahasiswa : 088114171 Nomor Mahasiswa : 088114171

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

  

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

  

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

  

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KAFEIN DAN TEOBROMIN

DALAM COKELAT BUBUK MERK “X” DALAM COKELAT BUBUK MERK “X” DALAM COKELAT BUBUK MERK “X”

  Berserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya Berserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya Berserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. saya sebagai penulis. saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Dibuat di Yogyakarta Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal: Pada tanggal: Pada tanggal: Yang menyatakan Yang menyatakan Yang menyatakan (Monica Satya Resmi Yunita) (Monica Satya Resmi Yunita) (Monica Satya Resmi Yunita)

  

PRAKATA

  Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Bapa Yang Maha Kuasa atas segala berkat dan kasih-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Kafein Dan Teobromin Dalam Cokelat Bubuk Merk X” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini, penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pembimbing yang dengan sabar memberikan pengarahan, masukan, kritik dan saran baik selama penelitian maupun penyusunan skripsi ini.

  3. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran, masukan dan diskusi dalam penyusunan skripsi.

  4. Dra. M.M Yetty Tjandrawati, M.Si. selaku dosen penguji atas saran, kritik dan masukan yang telah diberikan.

  5. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma: Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto dan juga Pak Ketul yang telah banyak membantu selama penelitian di laboratorium.

  6. Keluarga kedua: Bulik Rini, Pakde Adi, Kris, Rio, Dio, Brio dan si kecil Karin, terima kasih atas bantuan dan dukungannya selama kuliah di Sanata Dharma.

  7. Eka Riusinta Wati dan Adi Wirasaputra, terima kasih atas semangat, dukungan, kebersamaan dan kasih sayang yang menemani selama ini.

  8. Albertus Radityo Hadi, atas kebersamaan, dukungan dan bantuannya.

  9. Melisa Darmawan dan Grup Antistress, atas perjuangan bersama selama ini. Semuanya sangat berarti dan menambah banyak pengalaman.

  10. Keluarga bahagia: Oma Dju, Tante Ucan, Brian, Kak Coz, Kak Aldosa, Vica, Cici, Cik Co, Aga dan Dimbeck, keluarga ini begitu berarti. Terima kasih sudah hadir menemani selama di sini.

  11. Farmasi kelas C dan FST B 2008, kebersamaan selama ini menjadikan hidup lebih berwarna.

  12. Florentinus Dika dan Katarina Kusmiyati, atas bantuan dan dukungannya selama ini.

  13. Kost Lovely: Mba Pepenk dan Mas Era, Mba Yuyun, Mba Mel, Mba Pia, Mba Ye, Mba Erna dan Sari. Terima kasih atas ceria dan canda tawa ketika berkumpul bersama.

  14. Mas Hendi, Mas Hanung, Mba Vera dan Mba Riris beserta keluarga, terima kasih atas bantuannya.

  Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, sehingga segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca pada khususnya ilmu pengetahuan pada umumnya.

  Penulis

  

DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL …………………………………………….…………. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……………….................. ii HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ……………………...………….… iii HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………………. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………………. v LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA……………………….. vi PRAKATA…………………………………………………………….......... vii DAFTAR ISI………………………………………………………………... x DAFTAR TABEL…………………………………………………………... xiv DAFTAR GAMBAR……………………………………………………….. xvi DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………... xviii

  INTISARI…………………………………………………………………… xx

  

ABSTRACT………………………………………………………………….. xxi

BAB I PENDAHULUAN…………………………………………………..

  1 A. Latar Belakang………………………………………………………

  1 1. Perumusan Masalah ………………………………………….....

  3

  2. Keaslian Penelitian …………………………………………...…

  3

  3. Manfaat penelitian ………………………………………………

  5 B. Tujuan Penelitian …………………………………………………...

  5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA……………………………………….......

  6

  A. Cokelat ……………………………………………………………...

  6 B. Teobromin dan Kafein ………………………………………...……

  7 C. Ekstraksi Sampel ……………………………………………………

  10 D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ………………………………….

  13 E. Validasi Metode Analisis ………………...…………………….…...

  26 1. Akurasi…………………………………………………………..

  27

  2. Presisi…..………………………………………………..………

  28 3. Linearitas ............................................................................

  29 4. Rentang ...............................................................................

  29 5. Spesifisitas ...........................................................................

  30 F. Uji Kesesuaian Sistem ……………………………………………...

  30 G. Landasan teori ………………………………………………..……..

  31 H. Hipotesis …………………………………………………………....

  32 BAB III METODE PENELITIAN……………………….……….………

  33 A. Jenis penelitian …………………………………….........................

  33 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional …..………………….

  33 1. Klasifikasi Variabel ...........................................................

  33

  2. Definisi Operasional ……………………………………....…

  33 C. Bahan-bahan Penelitian ……………………………...………….…..

  34 D. Alat-alat Penelitian …………………………………….…………....

  34 E. Tatacara Penelitian ………………………………..………………...

  35 1. Pembuatan Larutan Stok Teobromin dan Kafein ……………….

  35

  2. Pembuatan Larutan Intermediet Teobromin dan Kafein…….…

  35

  3. Pembuatan Seri Larutan Baku Campuran dan Penetapan Kurva Baku……………………………………………………………..

  35

  4. Penetapan Panjang Gelombang Pengukuran …..………….....…

  36 5. Preparasi Sampel …………………………………………...…...

  37 6. Validasi Metode Analisis ……………………………………….

  37 7. Uji Kesesuaian Sistem ………………………………………….

  39 F. Analisis Hasil ………………………………………….……………

  39 1. Akurasi………………………………………………….……….

  39 2. Presisi …………………………………………………………...

  40 3. Linearitas dan Rentang ………………………………………….

  40

  4. Spesifisitas………………………………………………………

  40 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN…..……………………..………..

  41 A. Pembuatan Fase Gerak …………………………………......………

  41 B. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan ………………....……

  47 C. Pembuatan Larutan Baku dan Penetapan Kurva Baku………..……

  51 D. Preparasi Sampel …… ………………………………………..…….

  58 E. Validasi Metode Analisis …………………………………………...

  61 1. Akurasi ……………………………….…………...…………….

  62 2. Presisi …………………………………………...…………...….

  65 3. Linearitas ………………………….………...……….………….

  68

  4. Rentang …………………………………………………………

  69 5. Spesifitas ………………………………………………………..

  69 F. Uji Kesesuaian Sistem ................................................................

  70

  BAB V KESIMPULAN DAN SARAN..…………….……………….........

  73 A. Kesimpulan ……………………………..…………………………..

  73 B. Saran ……………………………………..…………………….…....

  73 DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………....

  75 LAMPIRAN …………………………………………………………….......

  79 BIOGRAFI PENULIS ……………………………………………..….….... 124

  

DAFTAR TABEL

  55 Tabel XI Hasil penetapan % recovery baku teobromin …………...…

  67 Tabel XX Hasil penetapan CV kafein (spike ke sampel) …………..…

  66 Tabel XIX Hasil penetapan CV teobromin (spike ke sampel) …………

  66 Tabel XVIII Batasan nilai CV berdasarkan perhitungan ………………..

  66 Tabel XVII Hasil penetapan CV Baku Kafein ………………………….

  65 Tabel XVI Hasil penetapan CV Baku Teobromin…………………...…

  64 Tabel XV Hasil penetapan % recovery baku kafein (spike ke sampel)..

  63 Tabel XIV Hasil penetapan % recovery baku teobromin (spike ke sampel) ……………………………………………………..

  63 Tabel XIII Nilai rentang % recovery berdasarkan perhitungan ………..

  62 Tabel XII Hasil penetapan % recovery baku kafein ………..…………

  55 Tabel X Data kurva baku kafein (AUC) …………………………….

  Halaman Tabel I

  54 Tabel IX Data kurva baku teobromin (AUC) ………………………..

  53 Tabel VIII Data kurva baku kafein ( peak height ) …………………….

  37 Tabel VII Data kurva baku teobromin ( peak height )………………...

  31 Tabel VI Pembuatan larutan campuran tebromin dan kafein .............

  29 Tabel V Parameter uji kesesuaian sistem …………………………...

  28 Tabel IV Kriteria presisi yang dapat diterima ……………….………

  27 Tabel III Kriteria rentang recovery …………………………………..

  18 Tabel II Parameter validasi untuk tiap kategori analisis ..................

  Nilai indeks polaritas pelarut ………………………………

  67

  Tabel XXI Hasil uji kesesuaian sistem untuk teobromin …………....…

  71 Tabel XXII Hasil uji kesesuaian sistem untuk kafein …………………..

  71

  

DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Theobroma cacao ………………………………………...

  6 Gambar 2. Struktur Teobromin dan Kafein ……………............……

  7 Gambar 3. Alat sokhletasi…………………………………………….

  12 Gambar 4. Instrumentasi KCKT………………………………….......

  15 Gambar 5. Pemisahan dua senyawa ………………………………….

  20 Gambar 6. Cara mengukur t , W dan W suatu kromatogram .....….

  21 R h/2 Gambar 7 Difusi Eddy dalam kromatografi kolom ………………….

  23 Gambar 8. Transfer massa pada fase diam …………………………...

  24 Gambar 9. Transfer massa pada fase gerak …………………………..

  24 Gambar 10. Interaksi Trietilamin dengan residu silanol dalam kolom C …………………………………………………...……

  42

  18 Gambar 11. Bagian nonpolar teobromin dan kafein …………………..

  43 Gambar 12. Interaksi teobromin dengan fase diam C ……………….

  44

  18 Gambar 13. Interaksi kafein dengan fase diam C ……………………

  44

  18 Gambar 14. Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% ……………………………………….

  45 Gambar 15. Interaksi kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% ……………………………….………

  45 Gambar 16. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) 46 dengan flow rate 0,8 mL/menit …………………………..

  Gambar 17. Gugus kromofor pada kafein dan teobromin ……….……

  48 Gambar 18. Spektra serapan teobromin dengan  = 275 nm pada

  maks

  49 pelarut akuabides ……………………………………….... Gambar 19.

  Spektra serapan kafein dengan  = 275 nm pada

  maks

  50 pelarut akuabides ………………………………………… Gambar 20 . Kromatogram hasil orientasi sampel dengan fase gerak campuran metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan

  52

  flow rate 0,8 mL/menit ……………………………..……

  Gambar 21. Kurva hubungan antara konsentrasi teobromin (ppm) vs AUC/40000 ……………......………………………..……

  57 Gambar 22. Kurva hubungan antara konsentrasi kafein (ppm) vs AUC/40000 ………………………..…………………..…

  58 Gambar 23. Reaksi pembasaan kafein menggunakan NaOH …………

  60 Gambar 24. Reaksi pembasaan teobromin menggunakan NaOH …….

  60

  

DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Certificate of Analysis Teobromin …………………....….

  80 Lampiran 2. Certificate of Analysis Kafein………………………….....

  81 Lampiran 3. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein Replikasi I …………………………………..……............

  82 Lampiran 4. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein Replikasi II ……………………………............………….

  85 Lampiran 5. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein replikasi III ……………………………………….....……

  89 Lampiran 6. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku…………………………………………….…………

  92 Lampiran 7. Kromatogram hasil validasi metode pada baku (Replikasi I) ………………………………………………

  96 Lampiran 8. Kromatogram hasil validasi metode pada baku (Replikasi II) ……………………………………..………

  98 Lampiran 9. Kromatogram hasil validasi metode pada baku (Replikasi III) ………………......………………,………. 100

  Lampiran 10. Data penimbangan dan perhitungan recovery …………… 102 Lampiran 11. Kromatogram hasil spiking ke sampel Replikasi I ………. 106 Lampiran 12 Kromatogram hasil spiking ke sampel Replikasi II ….….. 108 Lampiran 13 Kromatogram hasil spiking ke sampel Replikasi III …….. 111 Lampiran 14 Data penimbangan dan perhitungan % recovery

  (spike sampel)……...……………………………………... 113 Lampiran 15 Perhitungan Rentang % recovery dan CV ....................... 117 Lampiran 16 Kromatogram hasil uji kesesuaian sistem ....................... 119 Lampiran 17 Perhitungan Tailing factor (Tf), Column Plate Number

  122 (N) dan Resolusi (Rs) ..................................................

  

INTISARI

  Teobromin dan kafein merupakan kandungan utama yang ada dalam cokelat bubuk. Kedua senyawa ini termasuk golongan ksantin yang memiliki efek stimulan. Untuk menghindari adanya pemalsuan produk, perlu dilakukan analisis kandungan teobromin dan kafein sebagai senyawa identitas pada cokelat. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang digunakan dalam penetapan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk.

  Penelitian ini bersifat non eksperimental, menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan kolom Kromasil C (250 x 4,6 mm, 5 m), fase gerak

  18

  campuran metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60), kecepatan alir 0,8 mL/menit dan detektor UV 275 nm.

  Parameter validasi yang diteliti meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang, dan spesifisitas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode memiliki linearitas yang baik yaitu r = 0,99978 (teobromin) dan r = 0,99989 (kafein). Nilai % recovery dan CV berturut-turut untuk level kadar rendah, sedang dan tinggi adalah 104,12% dan 1,24%; 99,89% dan 1,67%; 99,09% dan 0,90% untuk teobromin serta 109,99% dan 1,41%; 101,55% dan 2,86%; 98,69% dan 0,56% untuk kafein. Rentang pengukuran yaitu 2,5-120 ppm (teobromin) dan 1,25-80 ppm (kafein). Nilai resolusi yang diperoleh yaitu 2,08. Berdasarkan hasil tersebut maka metode ini memiliki validitas yang baik untuk penetapan kadar teobromin dan kafein.

  Kata kunci : teobromin, kafein, KCKT fase terbalik, validasi metode

  

ABSTRACT

  Theobromine and caffeine are major component in cocoa powder. Both of them are an alkaloid xanthine which have stimulant effect. To avoid the counterfeit of product, necessary to determine theobromine and caffeine as identity compounds of cocoa powder. This study aims to discover validity of reversed phase HPLC method which is employed in theobromine and caffeine determination.

  This is a non experimental descriptive research using reversed phase HPLC method by using Kromasil C (250 x 4,6 mm, 5 m), methanol and

  

18

  aquabidest/TEA 3% mobile phase (40 : 60), flow rate 0,8 mL/minute and UV detector 275 nm.

  Validity parameter observed included accuracy, precision, linearity, range and specificity. Result of the study shows that the method holds a decent linearity r = 0,99978 (theobromine) and r = 0,99989 (caffeine). Recovery and CV value respectively are 104,12% and 1,24%; 99,89% and 1,67%; 99,09% and 0,90% for theobromine 20, 60 and 120 ppm whereas caffeine 10, 30 and 60 ppm are 109,99% and 1,41%; 101,55% and 2,86%; 98,69% and 0,56%. Range of the measurement are 2,5-120 ppm for theobromine and 1,25-80 ppm for caffeine. Resolution value is 2,08. Based on the result, it can be summed up that this method is valid to determine theobromine and caffeine.

  Keywords : theobromine, caffeine, reversed phase HPLC, method validation

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Produk makanan berbahan dasar cokelat sekarang ini sudah dikonsumsi

  secara luas oleh penduduk dunia. Hal ini karena cokelat merupakan makanan bergizi yang mengandung asam amino (kecuali metionin dan arginin), vitamin, mineral, dan lemak (Ramli et al., 2001). Salah satu contoh produk olahan cokelat yang banyak dikonsumsi adalah cokelat bubuk (cocoa powder) yang biasanya digunakan untuk membuat minuman cokelat.

  Di dalam cokelat juga mengandung senyawa golongan alkaloid yaitu teobromin dan kafein. Kedua senyawa tersebut termasuk golongan xanthine yang memiliki efek stimulan dan bronkodilator (Henderson and Major, 2006). Oleh karena memiliki efek stimulan, maka tidak dianjurkan untuk dikonsumsi secara berlebihan karena dimungkinkan dapat menyebabkan adiksi (Czech et al., 2011).

  Banyaknya minat konsumen akan produk cokelat, maka keadaan ini dijadikan kesempatan bagi banyak produsen untuk memalsukan produk. Banyak produsen yang menggunakan pewarna makanan termasuk pewarna cokelat dengan tujuan untuk mendapatkan keuntungan. Oleh karena itu, untuk menjamin keamanan saat kita mengkonsumsi produk olahan cokelat yang berupa cokelat bubuk, maka perlu dilakukan penelitian untuk menganalisis kandungan teobromin dan kafein sebagai senyawa identitas pada cokelat. Teobromin dan kafein memiliki kemiripan struktur sehingga diperlukan metode yang dapat memisahkan antara teobromin dan kafein agar keduanya dapat diukur secara tepat. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk memisahkan senyawa dengan kemiripan struktur adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

  Penelitian mengenai teobromin dan kafein dalam produk cokelat telah dilakukan oleh Ramli et al. (2001) menggunakan kolom Bondapak (30 cm x 4,0 mm, 10 µm), fase gerak campuran metanol : asam asetat : air (20 : 1 : 79) dan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Hasil penelitian ini belum memenuhi syarat linearitas yang baik karena koefisien korelasi (teobromin dan kafein) < 0,999.

  Czech et al. (2011) juga telah melakukan penelitian tentang teobromin dan kafein dalam kopi menggunakan fase gerak campuran bufer amonium asetat 20 mM pH 7,5 dan metanol (80 : 20), kolom C Phenomenex Kinetex 2,6 µm dan

  18

  kecepatan alir 1,0 mL/menit. Hasil penelitian ini memiliki linearitas yang baik tetapi belum dapat memisahkan teobromin dari matriks sampel.

  Penelitian terdahulu seperti yang dikemukaan di atas, belum memenuhi persyaratan validasi yang ditetapkan. Oleh karena itu, dilakukan penelitian ini untuk mendapatkan suatu metode yang memenuhi parameter-parameter validasi. Penelitian ini merupakan satu rangkaian penelitian yaitu “Optimasi Komposisi dan Flow Rate Fase Gerak Pada Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein Dalam Cokelat Bubuk Dengan Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” oleh Wati (2012) dan “Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Cokelat Bubuk Merk X Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” oleh Darmawan (2012).

  Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Baba et al. (2007), cokelat bubuk mengandung teobromin dan kafein dalam jumlah yang cukup besar sehingga jenis penelitian ini tergolong penelitian kategori 1 yaitu analisis suatu senyawa dengan kadar besar (Snyder et al., 2010). Untuk analisis pada kategori 1, parameter-parameter yang harus divalidasi yaitu akurasi, presisi, linearitas, rentang dan spesifisitas. Oleh karena itu, pada penelitian ini parameter-parameter validasi tersebut akan dianalisis untuk mengetahui bahwa metode yang akan digunakan untuk penetapan kadar teobromin dan kafein pada cokelat bubuk telah valid.

  1. Perumusan Masalah

  Berdasarkan latar belakang tersebut maka permasalahan yang muncul adalah apakah metode KCKT fase terbalik dengan fase diam kolom C merek

  18 KNAUER (250 x 4,6 mm, 5 m), fase gerak campuran metanol : akuabides/TEA

  3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit mempunyai validitas yang baik untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk yang didasarkan pada parameter akurasi, presisi, linearitas, rentang, dan spesifisitas?

  2. Keaslian Penelitian

  Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang teobromin dan kafein pada buah cokelat sudah banyak dilakukan. Ramli et al. (2001) telah melakukan penelitian mengenai teobromin dan kafein dalam produk cokelat dengan metode KCKT menggunakan kolom Bondapak (30 cm x 4,0 mm, 10 µm), fase gerak campuran metanol : asam asetat : air (20 : 1 : 79). Dalam penelitian ini digunakan kolom C merek KNAUER (250 x 4,6 mm, 5 µm) dan fase gerak campuran

  18

  metanol dan akuabides/TEA 3% (40 : 60). Dengan demikian, terdapat perbedaan jenis fase gerak dan spesifikasi kolom yang digunakan antara penelitian yang dilakukan oleh Ramli et al. dengan penelitian ini.

  Czech et al. (2011) juga telah melakukan penelitian tentang teobromin dan kafein dalam kopi dengan metode KCKT menggunakan fase gerak berupa campuran bufer amonium asetat 20 mM pH 7,5 dan metanol (80 : 20) dan kolom C Phenomenex Kinetex 2,6 µm. Dengan demikian, terdapat perbedaan jenis

  18

  matriks sampel, fase gerak dan spesifikasi kolom yang digunakan antara penelitian yang dilakukan oleh Czech et al. dengan penelitian ini.

  Selain itu, Erickson (2011) juga telah melakukan penelitian yang serupa dengan metode KCKT menggunakan fase gerak campuran air dan asetonitril (90 : 10) dan kolom C Kinetex 2,6 µm (XB-100A). Pada penelitian ini digunakan

  18

  sampel daun teh hijau dan produk olahannya. Dengan demikian, terdapat perbedaan jenis fase gerak, matriks sampel, dan spesifikasi kolom yang digunakan antara penelitian yang dilakukan oleh Erickson dengan penelitian ini.

  Analisis teobromin dan kafein juga dilakukan oleh Marx et al. (2003) dengan metode kromatografi gas dengan spesifikasi Hewlett-Packard HP 5890, injektor otomatis 7673A dan kolom kapiler BPX 35 (25 m x 0,25 mm, 0,25 µm). Dengan demikian, terdapat perbedaan sistem kromatografi yang digunakan dalam penelitian ini dengan yang dilakukan oleh Marx et al. (2003).

3. Manfaat Penelitian

  Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat sebagai berikut:

  a. Manfaat Teoritis

  Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai validasi metode KCKT fase terbalik dalam penetapan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk.

  b. Manfaat Metodologis

  Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa metode KCKT fase terbalik ini dapat digunakan untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein dengan validitas yang memenuhi persyaratan.

  c. Manfaat Praktis

  Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang kefarmasian mengenai parameter- parameter validasi pada penetapan kadar teobromin dan kafein dengan metode KCKT fase terbalik.

B. Tujuan Penelitian

  Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang muncul maka penelitian ini bertujuan untuk melakukan validasi metode KCKT fase terbalik dengan fase diam kolom C merek KNAUER (250 x 4,6 mm, 5 m), fase gerak

  18

  campuran metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk dengan validitas yang baik.

  

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Cokelat

Gambar 1. Theobroma cacao

Theobroma cacao disebut juga pohon cacao atau cocoa yang merupakan

  tumbuhan asli dari daerah tropis di benua Amerika. Biji buah cokelat biasanya digunakan untuk membuat produk olahan cokelat berupa cokelat bubuk atau batangan (Anonim, 2011). Cocoa powder adalah produk olahan cokelat yang didapatkan dari transformasi mekanis biji cokelat menjadi serbuk cocoa press

  

cake. Cokelat bubuk mengandung tidak kurang dari 10-20% cocoa butter dan 80-

90% bahan cocoa bebas lemak yang telah dikeringkan (Alexander et al., 2008).

  Produk cokelat sudah dikonsumsi secara luas mengingat produk tersebut telah terbukti sangat bermanfaat terutama karena mengandung asam amino (kecuali metionin dan arginin), vitamin, mineral dan lemak dalam jumlah besar (Ramli et al., 2001). Salah satu produk olahan cokelat adalah cokelat bubuk.

  Kandungan yang terdapat dalam cokelat bubuk secara umum untuk tiap 100 g yaitu : 23,0 g protein; 11,5 g lemak; 23,1 g karbohidrat; 26,9 g serat; 7,7 g mineral; 377 mg epikatekin; 135 mg katekin; 158 mg prosianidin B2; 96,1 mg prosianidin Cl; 2192 mg teobromin dan 470 mg kafein (Baba et al., 2007).

B. Teobromin dan Kafein

1. Struktur Teobromin dan Kafein

  HN N O O N N CH CH

3

H C 3 3 O N O N CH CH 3 N N 3 (a) (b)

  

Gambar 2. Struktur Teobromin (a) dan Kafein (b)

  Teobromin dan kafein merupakan golongan ksantin yang banyak terdapat dalam kopi, teh, cokelat dan produk-produk olahannya. Teobromin dan kafein merupakan komponen utama golongan metilksantin yang terdapat pada tumbuhan

  

Theobroma cacao. Kedua senyawa inilah yang memberikan rasa pahit pada

  produk cokelat dan memiliki efek farmakologis yaitu stimulan (kafein berefek pada sistem saraf dan teobromin menyebabkan diuresis) (Ramli et al., 2001).

  Golongan ksantin diabsorpsi oleh tubuh hampir 100% dan berada dalam sirkulasi darah 5 menit setelah dikonsumsi (Henderson and Major, 2006).

2. Deskripsi Teobromin

  Teobromin termasuk golongan alkaloid yang terdapat dalam biji

  

Theobroma cacao, berbentuk serbuk putih yang dapat menyublim pada suhu

o o

  290 C sampai 295

  C. Berat molekulnya adalah 180,2 g/mol. Dalam larutan yang

  %

  bersifat asam memiliki A = 563 pada panjang gelombang 272 nm dan 274 nm

  o

  dalam larutan basa. pKa teobromin yaitu 10,0 (25 C) (Moffat et al., 2004).

  Teobromin mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 101,0% C H N O dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Berbentuk

  7

  8

  4

  2

  serbuk putih, sangat sukar larut di air dan etanol, sukar larut di amonia (Anonim, 2010).

  3. Deksripsi Kafein

  Kafein mengandung tidak kurang dari 98,5% dan tidak lebih dari 101,0% C H N O dihitung terhadap zat anhidrat (Anonim, 1995). Kelarutan kafein yaitu

  8

  10

  4

  2 o

  1 g larut dalam 50 mL air, 1 g larut dalam 6 mL air pada suhu 80

  C, 1 g larut

  o

  dalam 75 mL alkohol, 1 g larut dalam ± 25 mL alkohol pada suhu 60

  C, 1 g larut dalam 6 mL kloroform, dan 1 g larut dalam 600 mL eter (Gennaro, 2000), 50 mL aseton dan 100 mL benzen (Moffat et al., 2004).

  Kafein berbentuk kristal putih atau serbuk hablur putih dengan berat

  o

  molekul 194,2 g/mol. Kafein menyublim pada suhu 178

  C. Titik leleh kafein yaitu

  o o

  238 C dan pKa = 14,0 (25

  C) . Dalam larutan yang bersifat asam, kafein memiliki

  % A = 504 pada panjang gelombang 273 nm (Moffat et al., 2004).

  4. Metode Analisis Teobromin dan Kafein Terdahulu

  Teobromin dan kafein pada cokelat dan produk cokelat dapat diidentifikasi dan dianalisis secara kuantitatif menggunakan metode KCKT dengan kolom Bondapak (30 cm x 4,0 mm, 10 µm), fase gerak campuran metanol : air : asam asetat (20 : 79 : 1), kecepatan alir 1,0 mL/menit dan detektor UV pada panjang gelombang 280 nm. Kelebihan penelitian ini yaitu diperoleh nilai % CV

  < 5% (untuk teobromin) sehingga memiliki reprodusibilitas yang baik dan juga %

  

recovery yang baik yaitu > 90% baik untuk teobromin maupun kafein. Kelemahan

  penelitian ini yaitu nilai % CV untuk kafein tidak memenuhi syarat (% CV < 5%) dan nilai koefisien korelasi baik untuk teobromin maupun kafein kurang memenuhi persyaratan karena nilai r < 0,999 (Ramli et al., 2001).

  Czech et al. (2011) juga melakukan analisis teobromin dan kafein dalam kopi menggunakan metode KCKT dengan fase gerak berupa campuran bufer amonium asetat 20 mM pH 7,5 dan metanol (80 : 20) dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit. Fase diam berupa kolom C Phenomenex Kinetex 2,6 µm dan suhu

  

18

o

  oven kolom 35

  C. Deteksi dilakukan pada panjang gelombang 272 nm dengan menggunakan detektor UV. Kelebihan penelitian ini adalah diperoleh nilai koefisien korelasi yang baik yaitu > 0,999 baik untuk teobromin maupun kafein. Namun kelemahannya adalah metode ini belum dapat memisahkan teobromin dengan baik dari matriks sampel.

  Selain itu, telah dilakukan pula analisis teobromin dan kafein pada daun teh hijau dan produk olahannya menggunakan metode KCKT dengan fase gerak campuran air : asetonitril (90 : 10), kecepatan alir 1,0 mL/menit, fase diam berupa kolom C Kinetex 2,6 µm (XB-100A) dan detektor UV pada panjang gelombang

  18

  265 nm. Kelebihan metode ini adalah waktu penelitian relatif singkat dengan waktu retensi (t ) kurang dari 3 menit dan nilai koefisien korelasi > 0,999. Namun

  R

  dalam penelitian ini belum dapat memisahkan teobromin dan asam galat yang terdapat dalam teh (Erickson, 2011).

  Marx et al. (2003) juga melakukan analisis teobromin dan kafein pada daun Ilex paraguariensis di Argentina. Pada penelitian ini digunakan sistem kromatografi gas dengan spesifikasi Hewlett-Packard HP 5890, injektor otomatis 7673A, kolom kapiler BPX 35 (25 m x 0,25 mm, 0,25 µm) dan suhu injektor

  o

  300

  C. Sebagai gas pembawa digunakan gas helium dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit dan splitting ratio 1 : 15. Metode ini telah dapat memisahkan teobromin dan kafein dengan baik tetapi memiliki reprodusibilitas kurang baik yaitu % CV = 4% untuk kafein dan 11,3% untuk teobromin.

  Berdasarkan uraian di atas, banyak metode analisis teobromin dan kafein yang telah dilakukan namun belum memenuhi parameter validasi. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan suatu metode yang lebih sederhana dengan validitas yang lebih baik.

C. Ekstraksi Sampel

  Ekstraksi dilakukan untuk menyari zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat aktif terdapat di dalam sel baik tanaman maupun hewan sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut tertentu dalam mengekstraksinya (Harbone, 1987). Demikian pula untuk bahan alam yang mengandung banyak komponen kimia di dalamnya, perlu dilakukan ekstraksi untuk menariknya komponen kimia tersebut. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut (Anonim, 1986).

  Cairan penyari yang digunakan dalam proses ekstraksi adalah pelarut yang optimal untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau aktif. Dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan senyawa kandungan lainnya (Anonim, 2000). Cairan penyari harus dipilih berdasarkan kemampuannya dalam melarutkan kandungan zat aktif yang maksimal dan seminimal mungkin bagi unsur yang tidak diinginkan (Ansel, 1985). Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini:

  a. murah dan mudah diperoleh,

  b. stabil secara fisika dan kimia,

  c. bereaksi netral,

  d. tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar,

  e. selektif yaitu hanya menarik zat berkhasiat yang dikehendaki,

  f. tidak mudah mempengaruhi zat berkhasiat,

  g. diperbolehkan oleh peraturan dengan pertimbangan keamanan/toksisitas (Anonim, 1986).

  Salah satu contoh metode ekstraksi adalah sokhletasi. Ekstraksi menggunakan sokhlet merupakan suatu metode ekstraksi yang telah banyak digunakan untuk senyawa yang berbentuk padatan. Pada prosedur ini, sampel yang berbentuk padat ditempatkan pada kantong (terbuat dari kertas saring) lalu dimasukkan ke dalam alat sokhlet. Pelarut yang teruapkan akan mengalami kondensasi dan menetes menuju kantong sokhlet dan mengekstraksi analit yang mudah larut pada pelarut tersebut. Pada sokletasi digunakan pelarut yang mudah menguap dan analit harus stabil pada suhu pemanasan yang digunakan selama ekstraksi (Snyder et al., 1997).

  

Gambar 3. Alat sokhletasi (Mitra, 2003)

  Metode sokhletasi lebih praktis dan hanya kemungkinan kecil zat yang diekstraksi hilang selama proses ekstraksi berlangsung. (Khopkar, 1990). Metode ekstraksi menggunakan sokhlet memiliki beberapa kelebihan antara lain: a. Uap panas tidak melalui serbuk simplisia tetapi melalui pipa samping.

  b. Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit dibandingkan metode ekstraksi lainnya dan menghasilkan ekstrak yang lebih pekat.

  c. Serbuk simplisia disari dengan cairan penyari yang murni sehingga dapat menyari zat aktif lebih banyak.

  d. Penyarian dapat diteruskan sesuai keperluan tanpa menambah volume cairan penyari (Mitra, 2003).

  Selain kelebihan-kelebihan di atas, metode sokhletasi juga memiliki beberapa kekurangan antara lain sebagai berikut: a. Larutan dipanaskan terus-menerus sehingga kurang cocok untuk zat aktif yang tidak tahan pemanasan. Hal ini dapat diperbaiki dengan menambah peralatan yang dapat mengurangi tekanan udara.

  b. Cairan penyari dididihkan terus-menerus sehingga penyari yang baik harus murni (Anonim, 1986).

  Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir pelarut diuapkan menjadi ekstrak kental atau ekstrak kering (Anonim, 1986).

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

  Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion (Anonim, 1995).

  Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fase yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam, dapat berupa cair atau padat (Johnson dan Stevenson, 1991).

  Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan

  

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dikembangkan pada akhir

  tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik, serta obat dalam cairan biologis (Rohman, 2009).

  Selama prosesnya, KCKT menggunakan tekanan tinggi untuk mendorong eluen melewati kolom dengan ukuran partikel mikron, dan memberikan pemisahan yang baik pada analit dengan jumlah pikogram sampai mikrogram (Christian, 2004).

1. Manfaat, Keuntungan, dan Keterbatasan KCKT

  Secara umum, kegunaan KCKT adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, dan senyawa biologis; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non-volatil); penentuan molekul-molekul netral, ionik, dan zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sedikit (trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala industri. KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Sistem KCKT memiliki beberapa keuntungan antara lain: waktu analisis yang singkat, penentuan analit dapat dilakukan pada jumlah mikro, hasil pemisahan tinggi dan kondisi yang cukup (Roth dan Blaschke, 1985). Selain kelebihan tersebut, KCKT juga memiliki keterbatasan yaitu jika analit yang akan dianalisis sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Gandjar dan Rohman, 2007).

2. Instrumentasi KCKT

  Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas beberapa komponen yaitu: wadah fase gerak; sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan sampel; kolom; detektor; wadah penampung buangan fase gerak; tabung penghubung; dan suatu komputer, integrator atau perekam (Gandjar dan Rohman, 2007). Secara umum, instrumentasi KCKT dapat dilihat pada gambar 4 berikut.

  

Gambar 4. Instrumentasi KCKT (Kazakevich and Nair, 1996)

3. Kromatografi Partisi Fase Terbalik

  Konsep pada kromatografi partisi yaitu perlakuan sampel dalam kondisi cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat. Jika solut ditambahkan ke dalam kondisi yang terdiri atas dua pelarut yang tidak saling bercampur dan keseluruhan kondisi dibiarkan seimbang, solut akan tersebar diantara kedua fase menurut persamaan berikut:

  K = K adalah koefisien distribusi, Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam dan Cm adalah konsentrasi solut dalam fase gerak (Skoog et al., 1998).

  Kromatografi partisi dapat dibagi menjadi 2 yaitu kromatografi cair-cair dan kromatografi bonded-phase. Pada kromatografi cair-cair, fase diamnya berupa diamnya berikatan secara kimia pada suatu permukaan penyangga misalnya saja pada silika (Skoog et al., 1998).

  Sistem kromatografi dapat dibagi menjadi 2 yaitu fase normal dan fase terbalik. Pada kromatografi fase normal digunakan fase diam polar dan pelarut yang kurang polar. Kekuatan eluen ditingkatkan dengan menambahkan pelarut yang lebih polar. Sementara pada kromatografi fase terbalik digunakan fase diam bersifat nonpolar atau kurang polar dan pelarutnya lebih polar. Kekuatan eluen ditingkatkan dengan menambahkan pelarut yang kurang polar (Harris, 1995).

  Pada kromatografi fase terbalik biasanya digunakan fase diam C atau

  8 C . Adanya gugus SiOH bebas pada kolom C dapat menyebabkan peak

  18

  18

  mengalami tailing, terutama untuk senyawa yang bersifat basa. Hal ini dapat diatasi dengan capped menggunakan klorotrimetilsilan yang ukurannya yang kecil dapat berikatan dengan gugus silanol (Skoog et al., 1998). Selain itu, dapat pula digunakan trietilamin (TEA) atau dimetiloktilamin (Snyder et al., 1997).

  Pada analisis sampel, metode KCKT yang sering digunakan adalah kromatografi fase terbalik. Pada kromatografi ini biasanya digunakan kolom dengan kemasan fase terikat yang bersifat stabil karena fase diam terikat secara kimia pada penyangga sehingga tidak mudah terbawa oleh fase gerak (Skoog et

  

al., 1998). Pelarut yang biasa digunakan adalah air dan dapat ditambahkan pula

  metanol, etanol, asetontril dan tetrahidrofuran untuk mengatur kepolaran fase gerak (Snyder et al., 1997). Kromatografi fase terbalik ini dapat memberikan pemisahan yang sangat baik dan dapat mengeliminasi peak tailing (Harris, 1995).

4. Fase gerak

  Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur dan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Elusi dapat dilakukan dengan isokratik (komposisi fase gerak tetap sama selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang sama (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Pelarut yang digunakan dalam KCKT harus standar KCKT dan disaring dengan penyaring dengan ukuran pori 0,2 m. Pelarut yang digunakan harus murni dan tidak mengandung gas untuk menghindari pembentukan gelembung gas ketika melewati katup atau memasuki bejana piston. Suatu sistem degassing dibutuhkan untuk menghilangkan udara dalam larutan (Christian, 2004). Adanya gas dalam fase gerak akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Rohman, 2009).

  Syarat-syarat fase gerak untuk KCKT adalah: murni, tanpa cemaran; tidak bereaksi dengan kemasan; sesuai dengan detektor; dapat melarutkan cuplikan; mempunyai viskositas rendah; memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah (jika diperlukan); dan harganya wajar (Johnson dan Stevenson, 1991).

  Pemilihan fase gerak yang digunakan terutama berdasarkan kepolaran campuran pelarut yang semakin linier dengan pelarut murni. Tingkat kepolaran pelarut menggambarkan kekuatan pelarut dalam mengelusi suatu senyawa. Besarnya polaritas pelarut dapat dihitung dengan persamaan sebagai berikut: Keterangan: P’ = indeks polaritas  = fraksi volume pelarut (Gritter et al., 1991).

  Untuk mengetahui nilai indeks polaritas dari fase gerak yang digunakan maka dapat dilihat dari tabel berikut.

  Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut (Snyder et al., 1997) Pelarut Indeks

  Polaritas Eluotropic values UV Cut off (nm)

  Alumina C 18 Silika

Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195

Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200

Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284

Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212

Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256

Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330

Metanol 5,1 0,95 1,0 0,70 205

Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190

Air 10,2 - - - 190

  Bila kita mempunyai campuran yang mengandung 80% metanol (P’ = 5,1) dan 20% air (P’ = 10,2), maka kepolaran pelarut tersebut adalah:

  P’ =

  1 P

  1 +

  2 P

  2 P’ = (0,8 x 5,1) + (0,2 x 10,2) = 6,12

  Tabel I menunjukkan bahwa semakin besar eluotropic values dari pelarut maka semakin mudah pula dalam mengelusi sampel. Semakin besar indeks polaritas yang dimiliki oleh pelarut maka semakin bersifat polar pelarut yang digunakan (Snyder et al., 1997).

  5. Fase Diam

  Kebanyakan fase diam yang digunakan pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika bersifat polar dan sedikit asam karena adanya residu silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan pereaksi seperti klorosilan. Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan- ikatan siloksan (Si-O-O-Si). Silika yang dimodifikasi ini mempunyai karakteristik kromatografik dan selektivitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

  6. Waktu retensi (t ) dan resolusi R

  Waktu tambat atau waktu retensi (t ) merupakan selang waktu yang

  R

  diperlukan oleh analit mulai saat injeksi hingga keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor (Mulja dan Suharman, 1995). Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari 2 puncak. Daya pisah (R) diukur dengan persamaan berikut:

  t − t 2∆t Rs = = (W + W )/2 W + W

  Nilai t dan t adalah waktu retensi senyawa, diukur pada titik

R1 R2

  maksimum puncak dan t adalah selisih antara t dan t . Nilai W dan W

R1 R2

  2

  1

  adalah lebar alas puncak. Pemisahan dua senyawa dapat dilihat pada gambar 5 berikut.

  

Gambar 5. Pemisahan dua senyawa (Johnson dan Stevenson, 1991)

7. Kolom dan kinerjanya

  Kolom biasanya dibuat dari stainless steel berbentuk pipa yang mempunyai lapisan dalam. Kolom yang biasa digunakan memiliki panjang 10-30 cm dengan diameter dalam 4,5-5 mm dan diameter luar ¼ inci (6,3 mm) (Moffat and Moss, 1986).

  Kolom KCKT harganya mahal dan mudah terdegradasi oleh adsorpsi sampel dan pelarut yang tak murni yang bersifat ireversibel. Oleh karena itu, pada bagian awal kolom dilindungi oleh guard column dengan panjang 1 cm dan mengandung fase diam yang sama dengan kolom utama. Kolom kromatografi juga dapat dipanaskan untuk menurunkan viskositas pelarut. Hal ini akan mengurangi tekanan yang dibutuhkan dan dapat meningkatkan kecepatan aliran.

  Dengan menaikkan suhu dapat mengurangi volume retensi dan meningkatkan resolusi dengan mempercepat difusi solutnya. Namun hal ini dapat mendegradasi fase diam dan mengurangi umur kolom (Harris, 1995).

  Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari kemampuan kolom dalam memisahkan senyawa. Batasan yang paling sering digunakan yaitu mencegah pelebaran pita atau dapat menghasilkan puncak sangat sempit (Johnson dan Stevenson, 1991).

  a. Teori Lempeng (Plate Theory) Salah satu ukuran kinerja kolom adalah jumlah lempeng teoritik yang dihitung dengan persamaan:

  

N = 5,54 ( atau N = 16 (

/ ) )

  Dimana t adalah waktu retensi dari analit dan W adalah lebar peak pada

  h/2 setengah dari tinggi peak diukur dari baseline (Adamovics, 1997).

  

Gambar 6. Cara mengukur t , W dan W suatu kromatogram (Rohman, 2009)

R h/2

  Jumlah pelat teori berbanding lurus dengan panjang kolom. Tinggi atau jarak yang setara dengan pelat, H atau Height Equivalent to a Theoritical Plate (HETP), merupakan ukuran efisiensi kolom yang lebih disukai karena memungkinkan perbandingan antara kolom yang panjangnya berlainan. Nilai H berkaitan dengan jumlah pelat teori menurut persamaan berikut:

  H = HETP = Berdasarkan persamaan di atas, L menunjukkan panjang kolom (biasanya dalam mm) dan N menunjukkan jumlah pelat teoritis (Johnson dan Stevenson, 1991). b. Teori Laju (Rate Theory) Pada waktu migrasi, analit mengalami transfer antara fase diam dan fase gerak berkali-kali. Waktu tinggal pada fase diam ataupun fase gerak tidak teratur dan tergantung pada tersedianya energi termal dari lingkungannya yang memungkinkan transfer tersebut. Analit hanya dapat bergerak bila berada dalam fase gerak sehingga migrasi di dalam kolom tidak teratur. Hal ini mengakibatkan laju rata-rata analit relatif terhadap fase gerak bervariasi sehingga terjadi pelebaran puncak analit (Johnson dan Stevenson, 1991).

  Menurut teori laju ini, efisiensi kolom dinyatakan dengan persamaan Van Deemter yang dapat dinyatakan sebagai berikut (Rohman, 2009) :

  A B / / + H = + C μ + C μ 1 + C /μ μ Dimana : H = ukuran efisiensi kolom (makin kecil nilai H maka kolom makin efisien) µ = kecepatan alir fase gerak

  A = difusi Eddy B = difusi longitudinal C = transfer massa pada fase diam s C = transfer massa pada fase gerak m

8. Profil puncak dan pelebaran puncak

  Selama pemisahan pada kromatografi, solut secara individual akan membentuk profil konsentrasi yang simetri atau dikenal juga dengan profil Gaussian. Profil atau pita secara perlahan-lahan akan melebar dan sering membentuk profil yang asimetri karena solut mengalami migrasi ke fase diam.

  a. Difusi Eddy. Kolom biasanya dikemas dengan partikel fase diam yang berukuran kecil. Fase gerak melewati kolom dan membawa molekul sampel yang ada di dalamnya. Namun beberapa molekul sampel melewati kolom lebih cepat dibandingkan molekul lain. Adanya difusi Eddy (pengalihan/diversi) menyebabkan molekul sampel semakin lama meninggalkan kolom (Rohman, 2009). Mekanisme difusi Eddy dapat dilihat pada gambar 7 berikut.

  

Gambar 7. Difusi Eddy dalam kromatografi kolom (Rohman, 2009)

  b. Difusi longitudinal. Adanya difusi longitudinal molekul analit dalam kolom dapat menyebabkan kromatogram menjadi lebar seiring berjalannya waktu.

  Pelebaran kromatogram ini juga dipengaruhi oleh kecepatan alir dimana kontribusi pelebaran kromatogram oleh difusi longitudinal akan semakin menurun bila kecepatan alir semakin meningkat (Snyder et al., 2010).

  c. Transfer massa. Transfer massa dinyatakan dengan nilai C dan

  stationary C . Nilai C merupakan solut yang tertahan karena adanya fase diam. mobile stationary

  Suatu molekul bergerak lambat dalam fase diam, sementara molekul lainnya lebih encer (tidak terlalu kental) sehingga koefisien difusi semakin kecil. Mekanisme transfer massa pada fase diam dapat dilihat pada gambar 8 berikut.

  

Gambar 8. Transfer massa pada fase diam (Willard et al., 1988)

  C menggambarkan adanya peristiwa dimana solut dalam fase diam

  mobile

  bertemu dengan fase gerak yang masih baru. Mekanisme transfer massa pada fase gerak dapat dilihat pada gambar 9 berikut ini.

  

Gambar 9. Transfer massa pada fase gerak (Willard et al., 1988)

9. Detektor

  Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia (Gandjar dan Rohman, 2007).

  Syarat detektor yang digunakan dalam KCKT yaitu stabil, reprodusibel, tidak mendestruksi sampel (Skoog et al., 1998), sensitif pada konsentrasi rendah pada tiap analit, memberikan respon yang linear (sinyal proporsional dengan konsentrasi analit), dan tidak melebarkan peak. Detektor juga harus tidak sensitif pada perubahan suhu dan komposisi pelarut (Harris, 1995).

  Banyak senyawa organik mengabsorpsi sinar pada 254 nm dan oleh karena itu banyak digunakan detektor dengan panjang gelombang tertentu. Akan tetapi, detektor dengan variasi panjang gelombang dapat membantu untuk menaikkan sensitivitas deteksi dengan menggunakan panjang gelombang maksimum (Moffat and Moss, 1986).

  Pemilihan detektor yang tepat dapat meningkatkan selektivitas dan sensitivitas serta mengurangi baseline noise (Snyder et al., 1997). Sebagian besar analisis obat menggunakan detektor yang memberikan respon absorpsi pada sinar UV atau sinar tampak pada solut ketika melewati flow-cell. Detektor ini memberikan sensitivitas yang bagus pada banyak senyawa, tidak terpengaruhi oleh fluktuasi kecil pada kecepatan aliran dan suhu, dan bersifat non-destruktif (Moffat and Moss, 1986).

10. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif

  Suatu kromatogram hanya memberikan sepasang informasi kualitatif tentang suatu analit yaitu waktu retensi dan letak senyawa tersebut pada fase diam setelah proses elusi berlangsung (Skoog et al., 1998). Waktu retensi yang menunjukkan identitas suatu senyawa merupakan selang waktu yang diperlukan senyawa mulai pada saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor. Analisis secara kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi senyawa murni dengan waktu retensi senyawa yang dimaksud dalam sampel (Gritter et al., 1991).

  Analisis kromatografi secara kuantitatif berdasarkan atas perbandingan antara peak height atau peak area dengan satu atau lebih standar yang digunakan.

  Pengukuran berdasarkan peak height dapat dilakukan dengan ketelitian tinggi bila tidak terjadi pelebaran peak. Pengukuran berdasarkan peak area lebih banyak digunakan dibanding pengukuran berdasarkan peak height karena tidak terpengaruh oleh pelebaran peak (Skoog et al., 1998).

E. Validasi Metode Analisis

  Suatu metode perlu divalidasi atau direvalidasi apabila: sebelum metode tersebut digunakan secara rutin; suatu metode yang telah divalidasi dilakukan pada kondisi yang berbeda (misalnya pada alat yang karakteristiknya berbeda); metodenya berubah dan perubahan itu di luar jangkauan metode semula; kontrol kualitas menunjukkan metode tersebut berubah seiring berjalannya waktu; dan untuk menunjukkan ekuivalensi antara dua metode (misalnya metode baru dengan metode standar/baku) (Nash and Wachter, 2003). Validasi metode analisis dapat digunakan pada analisis senyawa obat dan produk obat (Ahuja and Rasmussen, 2007).

  Menurut Snyder et al. (2010), metode analisis dapat dikelompokkan menjadi 4 kategori yaitu:

  1. Kategori 1, merupakan metode analisis yang digunakan untuk mengukur komponen utama/jumlah besar (termasuk bahan pengawet) atau bahan aktif obat dari suatu sediaan.

  2. Kategori 2, merupakan metode analisis untuk penentuan impurities bahan obat dan degradasi produk obat, termasuk penentuan kuantitatif dan uji batas.

  3. Kategori 3, merupakan metode analisis yang digunakan untuk menentukan karakteristik sediaan farmasi (misalnya disolusi).

  4. Kategori 4, merupakan metode analisis untuk identifikasi secara kualitatif.

  Setiap kategori metode analisis memiliki persyaratan validasi yang berbeda-beda seperti tercantum pada tabel II berikut.

  

Tabel II. Parameter validasi untuk tiap kategori analisis (Snyder et al., 2010)

Parameter Kategori 2 Kategori 1 Kategori 3 Kategori 4

  Validasi Kuantitatif Uji Batas

  • Akurasi Ya Ya Tidak Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya LOD
  • Tidak Tidak Ya Tidak * LOQ Tidak Ya Tidak Tidak * Linearitas Ya Ya Tidak Tidak Rentang Ya * Ya Tidak Tidak * Mungkin dibutuhkan, tergantung dari tipe uji.

  Berdasarkan tabel II tersebut, maka penelitian ini merupakan penelitian kategori 1 karena teobromin dan kafein terdapat dalam jumlah yang besar dalam cokelat bubuk. Oleh karena itu, parameter validasi yang harus dianalisis yaitu akurasi, presisi, linearitas, rentang dan spesifisitas.

1. Akurasi

  Akurasi prosedur analitik menggambarkan tentang kedekatan/kesesuaian antara nilai sebenarnya secara konvensional atau nilai berdasarkan referensi dengan nilai yang diperoleh (Anonim, 2005a). Nilai akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Akurasi dinyatakan dengan % recovery. Akurasi dapat ditentukan dengan minimal 9 kali penetapan dengan minimal 3 level konsentrasi pada rentang tertentu, misalnya 3 konsentrasi dengan masing-masing 3 kali replikasi (Chan et al., 2004).

  Acceptance criteria untuk nilai recovery diharapkan sesuai dengan

  matriks sampel, prosedur pembuatan sampel dan konsentrasi analit. Rentang % recovery yang diperbolehkan dapat dilihat pada tabel III.

  

Tabel III. Kriteria rentang recovery (Gonzales and Herrador, 2007)

Analyte (%) Analyte fraction Unit

  Recovery range (%) 100

  1 100% 98-102

  10

  10 -1 10% 98-102

  1

  10 -2 1% 97-103 0,1 10 -3 0,10% 95-105 0,01 10 -4 100 ppm 90-107 0,001 10 -5 10 ppm 80-110 0,0001 10 -6 1 ppm 80-110 0,00001 10 -7 100 ppb 80-110 0,000001 10 -8 10 ppb 60-115 0,0000001 10 -9 1 ppb 40-120

2. Presisi

  Presisi prosedur analitik menunjukkan kedekatan (derajat persebaran) antara serangkaian pengukuran yang diperoleh dari multiple sampling sampel homogen pada kondisi yang telah ditentukan. Presisi prosedur analitik biasanya ditunjukkan sebagai standar deviasi atau koefisien variasi pada serangkaian pengukuran (Anonim, 2005a).

  Presisi suatu metode analisis dapat ditetapkan dengan minimal 9 kali penetapan pada 3 level konsentrasi dengan masing-masing 3 kali replikasi pada rentang tertentu (seperti pada akurasi) atau minimal 6 kali penetapan pada 100% konsentrasi yang ditetapkan (Chan et al., 2004). Besarnya % RSD yang dapat diterima dapat dilihat pada tabel IV berikut.

  15 0,000001 10 -8 10 ppb

  4. Rentang

  Linearitas suatu prosedur analitik merupakan kemampuan suatu prosedur analitik (dengan rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit dalam sampel (Anonim, 2005a). Linearitas dapat dinyatakan dengan koefisien korelasi (r) dimana untuk analisis komponen utama, nilai r harus > 0,999 (Snyder et al., 1997).

  3. Linearitas

  30

  21 0,0000001 10 -9 1 ppb 45,3

  32

  11 0,00001 10 -7 100 ppb 22,6

  

Tabel IV. Kriteria presisi yang dapat diterima (Gonzales and Herrador, 2007)

Analyte (%) Analyte fraction

Unit

  16

  10 -2 1% 4 2,7 0,1 10 -3 0,10% 5,7 3,7 0,01 10 -4

100 ppm

8 5,3 0,001 10 -5 10 ppm 11,3 7,3 0,0001 10 -6 1 ppm

  1

  10 -1 10% 2,8 1,8

  10

  100 1 100% 2 1,3

  Horwitz %RSD AOAC PVM %RSD

  Rentang suatu metode dapat didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dan teratas pada suatu metode analisis yang masih memiliki akurasi, presisi dan linearitas yang baik (Snyder et al., 1997). Rentang untuk penetapan kadar obat biasanya berada pada kadar 80 sampai 120 % dari analit (Anonim, 2005a).

5. Spesifisitas

  Spesifisitas adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks (Gandjar dan Rohman, 2007). Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur secara akurat dan spesifik suatu analit dalam sampel. Jika spesifisitas tidak diukur maka akurasi, presisi dan linearitas metode menjadi diragukan (Snyder et al., 1997).

  Penentuan spesifisitas metode dapat diperoleh dengan dua cara. Pertama adalah dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain (nilai resolusi senyawa yang dituju  2). Cara kedua adalah dengan menggunakan detektor yang selektif, terutama untuk senyawa-senyawa yang terelusi bersama-sama (Rohman, 2009).

F. Uji Kesesuaian Sistem

  Sebelum dilakukan analisis sampel secara rutin, perlu adanya jaminan bahwa sistem dan prosedur KCKT yang digunakan dapat memberikan data yang kualitasnya baik. Oleh karena itu, perlu dilakukan uji kesesuaian sistem untuk memastikan bahwa hasil yang diberikan masih memiliki akurasi dan presisi yang baik. Berdasarkan USP, parameter yang ditentukan dalam uji kesesuaian sistem adalah plate number (N), tailing factor (Tf), resolusi (R ) dan relative standard

  s

deviation (RSD) untuk peak height dan peak area pada beberapa kali

  penginjeksian (ripitasi) (Snyder et al., 1997). RSD yang diperbolehkan untuk 5 kali atau lebih ripitasi haruslah  2% (Anonim, 2005b). Parameter uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada tabel V berikut.

  Tabel V. Parameter uji kesesuaian sistem (Snyder et al., 2010) Parameter Rekomendasi FDA Resolusi

  R  2 s Tailing factor T < 2 F Column plate number N  2000

  Keterulangan injeksi RSD  2%, n  5

G. Landasan Teori

  Teobromin dan kafein merupakan senyawa alkaloid golongan ksantin yang terkandung dalam cokelat. Berdasarkan strukturnya, kedua senyawa tersebut memiliki kemiripan struktur sehingga perlu dilakukan pemisahan untuk mempermudah analisis. Beberapa metode instrumental telah banyak digunakan untuk penetapan kadar teobromin dan kafein, salah satunya adalah KCKT fase terbalik. Baik teobromin maupun kafein memiliki bagian polar dan non polar sehingga dapat dianalisis menggunakan KCKT berdasarkan perbedaan interaksi antara kedua senyawa tersebut dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan.

  Metode KCKT fase terbalik ini telah digunakan secara luas dimana digunakan fase diam C dengan fase gerak senyawa organik. Fase gerak dialirkan

  18

  dengan kecepatan tertentu dengan bantuan pompa bertekanan dan hasilnya dideteksi menggunakan detektor. Pada analisis teobromin dan kafein ini akan digunakan detektor UV. Baik teobromin maupun kafein memiliki kromofor sehingga memungkinkan untuk dideteksi secara UV. Selain itu, teobromin

  • 1 -1 -1 -1

  memiliki nilai  = 10.144,14 M cm dan kafein memiliki  = 9.786,41 M cm sehingga memungkinkan untuk dideteksi secara UV.

  Metode KCKT yang akan digunakan pada penetapan kadar teobromin dan kafein merupakan metode KCKT fase terbalik dengan fase diam kolom C

  18

  merek KNAUER (250 x 4,6 mm, 5 m), fase gerak campuran metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Metode tersebut telah dioptimasi oleh Wati (2012) dan memberikan hasil yang baik dilihat dari bentuk peak, resolusi, nilai HETP dan nilai tailing factor (Tf).

  Baik teobromin maupun kafein terdapat dalam jumlah yang cukup besar dalam cokelat bubuk sehingga penelitian ini termasuk kategori 1 yaitu analisis suatu senyawa dengan kadar yang besar. Pada kategori ini, parameter validasi yang harus dipenuhi adalah akurasi, presisi, linearitas, rentang dan spesifisitas.

  Oleh karena itu, sebelum dilakukan penetapan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk, metode KCKT yang telah dioptimasi perlu divalidasi terlebih dahulu untuk membuktikan bahwa metode yang digunakan memberikan hasil yang valid berdasarkan pada paramater – parameter validasi tersebut.

H. Hipotesis

  Metode KCKT fase terbalik yang digunakan dalam penetapan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk memiliki validitas yang baik didasarkan pada parameter validasi yaitu akurasi, presisi, linearitas, rentang dan spesifisitas.

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan rancangan deskriptif karena tidak dilakukan manipulasi terhadap subjek uji. B. Variabel dan Definisi Operasional

  1. Klasifikasi Variabel

  a. Variabel Bebas Konsentrasi larutan baku teobromin dan kafein yang digunakan.

  b. Variabel Tergantung Parameter validasi yaitu akurasi, presisi, linearitas, rentang, dan spesifisitas.

  c. Variabel Pengacau Terkendali Kualitas bahan baku, pelarut dan sampel cokelat bubuk yang digunakan.

  2. Definisi Operasional

  a. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan dalam penelitian adalah fase gerak berupa campuran metanol dan akuabides/TEA 3% (40 : 60) dan fase diam berupa kolom oktadesilsilan (C ).

  18

  b. Kadar teobromin dan kafein dinyatakan dengan satuan part per million (ppm). c. Parameter validasi metode yang digunakan adalah akurasi, presisi, linearitas, rentang, dan spesifisitas.

C. Bahan Penelitian

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi baku teobromin dengan Certificate of Analysis dari Sigma Aldrich, baku kafein dengan

  

Certificate of Analysis dari Brataco, Metanol (p.a., E. Merck), Petroleum eter

o

  (titik didih 40-60

  C) (p.a., E. Merck), Trietilamin (p.a., E. Merck), Kloroform teknis, Natrium hidroksida 0,1 M, Akuabides (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma) dan sampel cokelat bubuk merk “x”.

D. Alat Penelitian

  Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi: Spektrofotometer UV/Vis SP-3000plus merk OPTIMA, kuvet, seperangkat alat KCKT dengan detektor UV, Shimadzu LC-2010C, kolom C merek KNAUER C (No.

  18

  18

  25EE181KSJ (B115Y620), Dimensi 250 x 4,6 mm, 5 m), seperangkat komputer (merek Dell B6RDZ1S Connexant System RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625 730), degassing ultrasonikator (Retsch tipe T460 no V935922013 EY), organic solvent membrane filter

  

Whatman (0,45m), neraca analitik dengan kepekaan 0,001 (Ohaus Carat Series

PAJ 1003) dan seperangkat alat gelas (Pyrex).

E. Tata Cara Penelitian

  1. Pembuatan Larutan Stok Teobromin dan Kafein

  a. Larutan stok teobromin. Ditimbang seksama kurang lebih 25 mg baku teobromin dan dilarutkan dalam akuabides panas hingga larut. Kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL dan ditambahkan akuabides hingga tanda.

  b. Larutan stok kafein. Ditimbang seksama kurang lebih 25 mg baku kafein dan dilarutkan dalam akuabides panas hingga larut. Kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL dan ditambahkan akuabides hingga tanda.

  2. Pembuatan Larutan Intermediet Teobromin dan Kafein

  a. Larutan intermediet teobromin. Dipipet 12,5 mL larutan stok teobromin (dengan pipet ukur) dan diencerkan dengan akuabides dalam labu takar 25 mL hingga tanda.

  b. Larutan intermediet kafein. Dipipet 12,5 mL larutan stok kafein (dengan pipet ukur) dan diencerkan dengan akuabides dalam labu takar 25 mL hingga tanda.

  

3. Pembuatan Seri Larutan Baku Campuran dan Penetapan Kurva Baku

  Dipipet sejumlah 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0; dan 2,4 mL larutan intermediet teobromin kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Dipipet sejumlah 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; dan 1,2 mL larutan intermediet kafein kemudian ditambahkan ke dalam labu takar yang telah berisi larutan baku antara teobromin (yang telah diambil sebelumnya).

  Masing-masing labu takar diencerkan dengan akuabides sampai tanda batas.

  Masing-masing larutan seri baku campuran teobromin dan kafein disaring menggunakan millipore kemudian didegassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. Sejumlah 10 L masing-masing seri larutan baku tersebut disuntikkan ke sistem KCKT dengan kolom C (Dimensi 250 x

  18

  4,6 mm, 5 m) menggunakan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/menit. Replikasi dilakukan 3 kali dan dipilih persamaan kurva baku teobromin dan kafein yang paling baik dilihat dari nilai koefisien korelasinya (r  0,999) dan nilai intersepnya paling kecil.

4. Penetapan Panjang Gelombang Pengukuran

  Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan cara merekam spektra larutan baku teobromin dan kafein, masing-masing digunakan konsentrasi 5, 10 dan 15 ppm. Pengukuran dilakukan pada rentang panjang gelombang 200-300 nm terhadap blanko akuabides.

  Berdasarkan spektra yang diperoleh kemudian ditentukan panjang gelombang maksimum tiap senyawa dan juga dicari panjang gelombang tumpang tindih.

  Panjang gelombang ini kemudian akan digunakan pada deteksi secara KCKT.

  5. Preparasi Sampel

  Sejumlah 30 g sampel cokelat bubuk dimasukkan ke dalam kantong sokhlet. Sokhletasi pertama dilakukan menggunakan pelarut petroleum eter

  o

  sebanyak 100 mL dan dilakukan selama 4 jam pada suhu antara 40-60 C. Kemudian kantong sokhlet direndam dalam NaOH 0,1 M pH 13 selama 15 menit. Sokhletasi dilanjutkan menggunakan pelarut kloroform sebanyak 100

  

o

  mL selama 4 jam pada suhu 60-70

  C. Hasil ekstraksi dengan sokhlet tersebut kemudian diuapkan sampai diperoleh ekstrak kental dengan bobot yang tetap.

  6. Validasi Metode Analisis

  a. Pembuatan campuran teobromin dan kafein. Larutan campuran teobromin dan kafein dibuat pada 3 konsentrasi berbeda dan masing- masing direplikasi 3 kali.

  

Tabel VI. Pembuatan larutan campuran teobromin dan kafein

  Ambil dari Konsentrasi (ppm) larutan intermediet (mL) Tambahkan akuabides

  Teobromin 20 0,4 Rendah hingga

  Kafein 10 0,2 tanda dalam Teobromin 60 1,2

  Tengah labu takar

  Kafein 30 0,6 10 mL Teobromin 120 2,4

  Tinggi Kafein 60 1,2

  Masing-masing campuran tersebut disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit.

  b. Penetapan % recovery dan % CV. Masing-masing seri larutan campuran dengan kolom C (Dimensi 250 x 4,6 mm, 5 m) menggunakan fase

  18

  gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Kadar terukur baku teobromin dan kafein yang ada dalam campuran dihitung dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah diperoleh. Kemudian dihitung nilai % recovery dari kadar terukur tersebut menggunakan rumus sebagai berikut:

  kadar terukur % = 100% kadar sebenarnya

  c. Penetapan % recovery dan % CV sampel. Sejumlah 10 mg ekstrak kental yang telah diperoleh kemudian dispike dengan seri larutan baku campuran teobromin dan kafein pada 3 level konsentrasi (lihat tabel IV). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali untuk masing-masing level konsentrasi. Blanko yang digunakan adalah larutan sampel yang tidak

  dispike dengan baku. Masing-masing larutan sampel yang telah dispike

  dan juga blanko kemudian di saring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit. Sejumlah 10 L disuntikkan ke sistem KCKT dengan kolom C (Dimensi 250 x 4,6 mm, 5 m) menggunakan fase gerak

  18

  metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Kadar terukur baku teobromin dan kafein yang ada dalam campuran dihitung dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah diperoleh. Kemudian dihitung nilai % recovery dari kadar terukur tersebut menggunakan rumus sebagai berikut: kadar terukur % = 100% kadar sebenarnya

5. Uji Kesesuaian Sistem

  Pada penetapan uji kesesuaian sistem, digunakan seri larutan baku campuran pada level konsentrasi sedang (teobromin = 60 ppm dam kafein = 30 ppm). Sejumlah 10 L larutan seri tersebut disuntikkan ke sistem KCKT

  

  dengan kolom C menggunakan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40

  18

  : 60) dan kecepatan alir fase gerak 0,8 mL/menit secara berulang sebanyak 5 kali penyuntikan. Parameter yang diukur adalah resolusi, tailing factor dan

  column plate number. Selain parameter di atas, dihitung pula nilai RSD untuk peak area dan peak height untuk repetisi penyuntikan sebanyak 5 kali. Nilai

  RSD yang diperbolehkan adalah  2 % (Anonim, 2005b).

F. Analisis Hasil

  Kesahihan metode yang digunakan dalam penetapan kadar kafein dan teobromin dalam bubuk cokelat dapat ditentukan berdasarkan parameter berikut:

1. Akurasi Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery).

  kadar terukur % = 100% kadar sebenarnya Metode ini dikatakan memiliki akurasi yang baik jika nilai % recovery berada pada rentang 95-105% untuk analit pada matriks sampel 0,1% (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007).

  2. Presisi Presisi biasanya dinyatakan dengan coefficient of variation (CV).

  

SD

CV = 100%

x

  Menurut aturan AOAC, suatu metode dapat dinyatakan memiliki presisi yang baik apabila memiliki CV < 3,7% untuk konsentrasi analit 0,1% (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007).

  3. Linearitas dan Rentang

  Linearitas dinyatakan dalam koefisien korelasi (r) pada analisis regresi linear. Linearitas yang baik apabila nilai r  0,999 untuk minimal 6 seri konsentrasi (Anonim, 1995). Rentang ditentukan dari kadar kafein dan teobromin yang digunakan dalam analisis, mulai dari kadar terendah hingga tertinggi yang dapat diukur secara kuantitatif dan menghasilkan akurasi, presisi, dan linearitas yang baik.

  Parameter rentang ditetapkan dengan mencari konsentrasi terendah dan teratas yang masih memberikan linearitas yang memenuhi syarat yaitu r  0,999 (Snyder et al., 1997).

  4. Spesifisitas

  Spesifisitas metode ditentukan dengan melihat resolusi (daya pisah) antara peak kafein dan teobromin. Resolusi yang baik apabila Rs  2 (Snyder et

  al., 2010).

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pembuatan Fase Gerak Pemilihan fase gerak pada penelitian ini mengacu pada penelitian Wati (2012) yaitu menggunakan campuran metanol dan akuabides/TEA 3% (40 : 60). Dalam penelitian ini, fase gerak yang digunakan bersifat polar sedangkan fase

  diam yang digunakan yaitu C bersifat nonpolar sehingga sistem kromatografi

  18

  yang digunakan yaitu kromatografi partisi fase terbalik. Dengan digunakan sistem kromatografi fase terbalik ini, diharapkan dapat memisahkan analit dalam sampel dengan waktu analisis yang cepat (waktu retensi singkat).

  Pemilihan fase gerak yang akan digunakan sangat penting karena akan mempengaruhi waktu retensi dan pemisahan komponen-komponen dalam sampel yang akan dianalisis. Pada fase gerak digunakan metanol karena metanol merupakan pelarut organik yang sering digunakan dalam sistem KCKT fase terbalik. Selain itu, metanol memiliki viskositas yang tidak terlalu tinggi sehingga tekanan pompa yang dihasilkan tidak terlalu tinggi pula. Tekanan kolom yang terlalu tinggi dapat memperpendek umur kolom sehingga selama proses analisis berlangsung, tekanan dijaga serendah mungkin.

  Penggunaan trietilamin (TEA) dalam fase gerak berfungsi untuk menutup residu silanol dalam kolom C . Senyawa yang dianalisis, teobromin dan kafein,

  18

  bersifat basa sehingga dapat berikatan dengan residu silanol yanh bersifat asam sehingga peak yang dihasilkan dapat mengalami tailing. Dengan demikian, trietilamin yang digunakan dalam fase gerak dapat menurunkan tailing factor yang dialami oleh senyawa-senyawa yang bersifat basa (Choo et al., 1996).

  Gambar 10 berikut ini merupakan interaksi trietilamin dengan residu silanol pada kolom C .

18 Si O (CH ) CH

  2 17 3 H CH C 3

2

O Si OH N CH CH 2 3 O H CH C 3

2

Si O (CH ) CH 2 17 3 Gambar 10. Interaksi Trietilamin dengan residu silanol dalam kolom C 18 Penambahan TEA pada fase gerak berperan sebagai kompetitor senyawa

  basa, sehingga dapat menurunkan kemampuan interaksi antara residu silanol dengan senyawa analit yang melewati kolom. Dengan demikian, terjadinya tailing pada peak dapat dikurangi. Efisiensi kolom juga akan meningkat dengan semakin kecilnya tailing yang terjadi (Long et al., 2007).

  Sebelum digunakan, fase gerak perlu disaring dengan kertas Whatman ukuran pori 0,5 m untuk menghilangkan partikel asing atau senyawa pengotor yang dapat menyumbat kolom dan untuk menghindari adanya endapan dalam kolom sehingga kerusakan pompa dan kolom dapat dihindari. Setelah fase gerak disaring, dilakukan pula degassing menggunakan ultrasonicator selama 15 menit. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan gas-gas atau gelembung yang ada dalam fase gerak tersebut. Adanya gelembung gas dapat menyebabkan aliran fase gerak tidak lancar dan tekanan pompa menjadi tidak stabil sehingga dapat mempengaruhi detektor dan menghasilkan sinyal palsu (Gritter et al., 1991).

  Selain itu, gelembung gas juga dapat meningkatkan tekanan kolom sehingga dapat mengurangi efisiensi kolom.

  Apabila dua senyawa dipisahkan menggunakan sistem KCKT fase terbalik, maka proses pemisahan terjadi karena adanya perbedaan interaksi antara kedua senyawa dengan fase gerak dan fase diam yang digunakan. Senyawa yang lebih polar akan terelusi terlebih dahulu dibandingkan dengan senyawa yang lebih nonpolar. Hal ini terjadi karena senyawa yang lebih polar memiliki interaksi yang lebih kuat dengan fase gerak dibandingkan dengan fase diam, sehingga akan lebih cepat terelusi. Sebaliknya, senyawa yang bersifat lebih nonpolar akan cenderung berinteraksi lebih kuat dengan fase diam maka akan tertinggal di kolom lebih lama. Bagian nonpolar pada teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar 11 berikut:

  O O CH CH 3 3 H C 3 N N HN N N N O N O N

CH CH

3 3 (a) (b)

  

Gambar 11. Bagian nonpolar teobromin (a) dan kafein (b)

  O CH 3 N HN

N

O N CH 3 H C 3 Si O CH H C 3 3 Gambar 12. Interaksi teobromin dengan fase diam C 18 = interaksi van Der Waals

  O CH 3 N H C 3 N

N

O N CH 3 H C 3 Si O H C CH 3 3 Gambar 13. Interaksi kafein dengan fase diam C 18 = interaksi van Der Waals

  Berdasarkan gambar 12 dan 13, interaksi yang terjadi antara teobromin dan kafein dengan fase diam C adalah interaksi van Der Waals. Kafein bersifat

  18

  lebih nonpolar dibandingkan dengan teobromin sehingga jumlah interaksi yang terjadi dengan fase diam juga lebih banyak dibandingkan dengan teobromin.

  Banyaknya interaksi van Der Waals pada kafein dengan fase diam, akan menyebabkan semakin kuatnya interaksi yang terjadi antara kafein dengan fase diam sehingga kafein akan lebih lama terelusi dibandingkan dengan teobromin. Dengan demikian, waktu retensi kafein akan lebih lama dibandingkan waktu retensi teobromin.

  Teobromin dan kafein cenderung bersifat non polar namun masih memiliki bagian-bagian polar yang dapat berinteraksi dengan fase gerak yang digunakan. Interaksi antara teobromin dan kafein dengan fase gerak metanol dan akuabides dapat dilihat pada gambar 14 dan 15.

  N N H O

CH

H O H H

3

O 3 C O H N N CH 3 H O H O CH H O H 3 H H O CH H 3 H O H 3 C O H

Gambar 14. Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%

  • - - - - = interaksi hidrogen

  N N H 3 C O

CH

H O H H

3

O 3 C O H N N CH 3 H O H O CH H O H 3 H H O CH 3 Gambar 15. Interaksi kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%

  • - - - - = interaksi hidrogen

  Berdasarkan gambar 14 dan 15, interaksi yang terjadi antara teobromin dan kafein dengan fase gerak yang digunakan adalah interaksi hidrogen. Teobromin bersifat lebih polar dibandingkan dengan kafein sehingga interaksi hidrogen yang terjadi pun lebih banyak. Hal ini menyebabkan teobromin lebih terikat kuat dengan fase gerak dan lebih cepat terelusi dibandingkan dengan kafein. Dengan demikian, waktu retensi teobromin akan lebih cepat dibandingkan waktu retensi kafein.

  Berdasarkan hasil optimasi yang telah dilakukan oleh Wati (2012), komposisi fase gerak yang optimal adalah campuran metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir yaitu 0,8 mL/menit. Parameter yang diukur pada optimasi fase gerak ini adalah bentuk peak, nilai Tailing factor, resolusi dan nilai HETP. Pemisahan teobromin dan kafein menggunakan fase gerak yang optimal dapat dilihat pada gambar 16.

  Teobromin Kafein

Gambar 16. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein dengan fase gerak

metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan flow rate 0,8 mL/menit

  Berdasarkan gambar 16, dapat dilihat bahwa bentuk peak yang dihasilkan sudah runcing dengan pemisahan yang baik. Berdasarkan perhitungan, diperoleh nilai resolusi yaitu 2,95; nilai tailing factor paling kecil yaitu 1,67; dan nilai HETP paling kecil yaitu 0,04 untuk teobromin dan 0,01 untuk kafein. Baik nilai resolusi, HETP maupun tailing factor yang diperoleh telah memenuhi persyaratan yang ditentukan yaitu nilai resolusi  2 dan nilai tailing factor < 2 (Snyder et al., 2010) dan nilai HETP sekecil-kecilnya. Dengan demikian, fase gerak dengan komposisi metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit merupakan kondisi yang optimal dan akan digunakan selama proses analisis berlangsung.

B. Penetapan Panjang Gelombang Pengamatan

  Penetapan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk mengetahui panjang gelombang teobromin dan kafein yang memiliki serapan maksimum.

  Analisis suatu senyawa menggunakan KCKT memerlukan panjang gelombang maksimum dimana suatu senyawa memberikan serapan maksimum untuk dibaca pada detektor UV pada alat KCKT. Pada panjang gelombang maksimum ini diharapkan semua kadar teobromin dan kafein dalam sampel dapat terdeteksi oleh detektor UV.

  Syarat suatu senyawa agar dapat ditetapkan kadarnya menggunakan spektrofotometer UV yaitu harus memiliki gugus kromofor sehingga dapat menyerap radiasi sinar pada daerah UV. Baik teobromin maupun kafein memiliki gugus kromofor yang dapat menyerap radiasi sinar pada daerah UV sehingga dapat diukur menggunakan spektrofotometri UV. Gugus kromofor memiliki ikatan rangkap yang mengandung elektron  yang bila terkena radiasi elektromagnetik akan tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi (orbital *). Teobromin dan kafein juga memiliki atom N yang terikat langsung pada kromofor. Atom N tersebut memiliki pasangan elektron bebas yang bertanggung jawab pada perpanjangan kromofor sehingga dapat menyebabkan pergeseran panjang gelombang dan peningkatan intensitas serapan teobromin dan kafein. Gambar 17 berikut menunjukkan gugus kromofor pada teobromin dan kafein. O O H N N CH 3 CH H C 3 N N 3 O N CH

3 CH

N O N 3 N

  

(a) (b)

Gambar 17. Gugus kromofor pada teobromin (a) dan kafein (b)

Keterangan : = kromofor

  Pembacaan serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang 200–300 nm karena panjang gelombang maksimum teobromin dan kafein secara teoritis berada pada rentang tersebut. Pada penelitian ini digunakan tiga level konsentrasi untuk masing-masing senyawa. Konsentrasi yang digunakan adalah 5, 10 dan 15 ppm. Penggunaan tiga level konsentrasi ini bertujuan untuk memastikan bahwa bentuk spektra dan panjang gelombang maksimum yang didapatkan adalah sama.

  Berdasarkan penelitian Wati (2012), hasil pengukuran panjang gelombang maksimum teobromin pada tiga level konsentrasi dapat dilihat pada gambar 18 berikut ini.

  B A

  nm nm

  C

  nm

  

Gambar 18. Spektra serapan teobromin dengan  = 275 nm pada pelarut akuabides

maks

Keterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm

(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi)

  Berdasarkan gambar 18, dapat dilihat bahwa ketiga level konsentrasi teobromin dalam pelarut akuabides memiliki serapan maksimum pada 275 nm.

  Secara teoritis, serapan maksimum teobromin dalam larutan bersifat asam adalah pada panjang gelombang 272 nm. Terjadinya pergeseran panjang gelombang ini terjadi karena perbedaan pelarut yang digunakan sehingga panjang gelombang pengamatan tidak sesuai dengan panjang gelombang teoritis.

  Berdasarkan penelitian Wati (2012), hasil pengukuran panjang gelombang maksimum kafein pada tiga level konsentrasi dalam pelarut akuabides dapat dilihat pada gambar 19 berikut ini.

  A B

  nm nm

  C

  nm

  

Gambar 19. Spektra serapan kafein dengan  = 275 nm pada pelarut akuabides

maks

Keterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm

(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi)

  Berdasarkan gambar 19 di atas, dapat diketahui bahwa pada ketiga level konsentrasi kafein dengan pelarut akuabides memiliki serapan maksimum pada 275 nm. Secara teoritis, kafein dalam larutan asam memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 273 nm. Terjadinya perbedaan panjang gelombang pengukuran dengan teoritis karena adanya perbedaan pelarut yang digunakan sehingga panjang gelombang pengukuran tidak sesuai dengan panjang gelombang teoritis.

  Pada gambar 18 dan gambar 19 terlihat bahwa teobromin dan kafein memiliki spektra yang mirip karena keduanya memiliki gugus kromofor yang sama namun memiliki intensitas serapan yang berbeda. Menurut Mofat et al. % (2004), kafein dalam larutan asam memiliki nilai A yaitu 504 pada panjang

  %

  gelombang 273 nm, sedangkan teobromin dalam larutan asam memiliki A sebesar 563 pada panjang gelombang 272 nm. Berdasarkan pengukuran, baik teobromin maupun kafein memiliki serapan maksimum pada 275 nm sehingga panjang gelombang tersebut digunakan dalam pengamatan selama penelitian ini.

C. Pembuatan Larutan Baku dan Penetapan Kurva Baku

  Tujuan pembuatan kurva baku adalah untuk memperoleh persamaan regresi yang linear yang selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar teobromin dan kafein dalam sampel cokelat bubuk. Linearitas suatu kurva baku menunjukkan bahwa kenaikan respon yang terjadi karena deteksi instrumen sebanding dengan kenaikan konsentrasi baku yang digunakan. Parameter linearitas kurva baku dinyatakan dengan nilai koefisien korelasi (r) yaitu lebih besar dari 0,999 terutama untuk analisis komponen utama dalam sampel (Snyder

  

et al., 1997). Bila nilai r semakin mendekati 1 maka semakin baik pula linearitas

  yang diperoleh sehingga semakin baik pula hubungan antara peningkatan konsentrasi dengan peningkatan respon instrumen.

  Pembuatan seri larutan baku campuran hendaknya berada dalam rentang 80-120% jumlah analit dalam sampel. Namun karena tidak diketahui seberapa banyak jumlah teobromin dan kafein dalam sampel, maka kurva baku yang akan dibuat tidak dapat mewakili 80-120% jumlah analit dalam sampel. Larutan seri kurva baku campuran teobromin dan kafein yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari 6 seri konsentrasi yaitu 20, 40, 60, 80, 100 dan 120 ppm untuk teobromin dan 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 ppm untuk kafein. Konsentrasi seri baku kafein berbeda dengan teobromin karena menyesuaikan jumlah teobromin dan kafein dalam sampel cokelat bubuk. Berdasarkan hasil orientasi sampel, dilihat dari nilai AUC masing-masing senyawa, diketahui bahwa AUC teobromin : AUC kafein = 2 : 1 (AUC teobromin = 10509809, AUC kafein = 3636516). Dengan demikian, dalam pembuatan seri larutan baku kafein konsentrasinya kurang lebih dibuat ½ dari konsentrasi seri larutan baku teobromin. Gambar 20 berikut ini adalah kromatogram hasil orientasi sampel.

  Teobromin Kafein min

  

Gambar 20. Kromatogram hasil orientasi sampel dengan fase gerak campuran metanol :

akuabides/TEA 3% (40 : 60) dengan flow rate 0,8 mL/menit

  Pelarut yang digunakan untuk pembuatan seri larutan baku adalah

  o

  akuabides. Digunakan akuabides suhu tingi yaitu 80 C untuk mempercepat kelarutan karena teobromin dan kafein sukar larut bila digunakan akuabides suhu rendah. Pada proses pelarutan ini tidak digunakan pelarut organik misalnya metanol dengan pertimbangan bahwa metanol bersifat mudah menguap sehingga lebih dipilih menggunakan akuabides. Syarat pelarut yang digunakan pada KCKT yaitu tersedia dalam kemurnian yang tinggi, dapat bercampur dengan sampel dan

  Persamaan regresi linear yang didapatkan merupakan hubungan antara konsentrasi teobromin atau kafein vs AUC (Area Under Curve) yang dihasilkan dari penginjeksian pada sistem KCKT. Selain AUC juga digunakan peak height sebagai parameter respon lain yang nantinya akan dibandingkan hasilnya untuk penetapan kadar. Penggunaan pengukuran melalui peak height biasanya ditujukan pada peak overlapping atau peak yang mengalami tailing. Pada kurva digunakan hubungan antara konsentrasi teobromin atau kafein (ppm) vs AUC/40000. Sementara untuk peak height, nilai peak height akan dibagi 4000 untuk teobromin dan dibagi 2500 untuk kafein. Hal ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan kurva baku yang lebih layak saji dengan sensitivitas yang lebih baik

  o dan untuk mendapatkan nilai slope mendekati 1 atau nilai  mendekati 45 .

  Pembuatan kurva baku teobromin dan kafein dilakukan sebanyak 3 kali replikasi agar didapatkan persamaan kurva baku yang optimal. Perhitungan persamaan kurva baku teobromin dan kafein dengan parameter peak height sebagai respon dapat dilihat pada tabel VII dan VIII berikut:

  

Tabel VII. Data kurva baku teobromin ( peak height )

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi peak peak peak baku teobromin baku teobromin baku teobromin height/4000 height/4000 height/4000

  (ppm) (ppm) (ppm) 19,94 23,3200 19,94 24,0668 19,94 24,4143 39,88 42,6808 39,88 43,9883 39,88 44,1735 59,82 64,1370 59,82 64,6163 59,82 67,0613 79,76 87,4663 79,76 83,0300 79,76 88,3453 99,70 101,7588 99,70 95,5148 99,70 107,3395

  119,64 124,0823 119,64 113,7640 119,64 130,2430

a = 3,470 a = 8,6821 a = 2,9369

b = 1,009 b = 0,8905 b = 1,060

r = 0,99867 r = 0,99732 r = 0,99972

  Berdasarkan tabel VII, maka kurva baku yang paling baik adalah replikasi III karena memiliki koefisien korelasi yang diperoleh memiliki nilai paling tinggi dibandingkan replikasi lainnya yaitu 0,99972 dan dengan nilai intersep yang paling kecil yaitu 2,94. Persamaannya yaitu Y = 1,060 X + 2,9369.

  Kurva baku tersebut memenuhi persyaratan linearitas karena memiliki nilai r > 0,999 (Snyder et al., 1997).

  

Tabel VIII. Data kurva baku kafein ( peak height )

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi peak peak peak baku kafein baku kafein baku kafein height/2500 height/2500 height/2500

  (ppm) (ppm) (ppm) 15,2528 15,2576 9,958 13,9820 9,958 9,958 27,9140 27,1232

  19,916 25,6804 19,916 19,916 42,3400 41,3764 29,878 39,5964 29,878 29,878 53,3772 55,4952 39,832 52,0244 39,832 39,832 62,5244 66,0704 49,790 63,7124 49,790 49,790 72,5020 78,8884 59,748 76,6928 59,748 59,748

a = 1,2722 a = 5,5389 a = 2,4569

b = 1,2627 b = 1,1509 b = 1,2886

r = 0,99976 r = 0,99643 r = 0,99918

  Berdasarkan tabel VIII, kurva baku kafein yang paling optimal adalah replikasi I karena nilai koefisien korelasinya paling tinggi dibandingkan replikasi lainnya yaitu r = 0,99976 dan nilai intersep paling kecil yaitu 1,27. Persamaan yang diperoleh yaitu Y = 1,2627 X + 1,2722. Kurva baku tersebut memenuhi persyaratan linearitas karena memiliki nilai r > 0,999 (Snyder et al., 1997).

  Perhitungan persamaan kurva baku teobromin dan kafein yang diperoleh berdasarkan parameter respon AUC (luas kromatogram) dapat dilihat pada tabel

  IX dan X di bawah ini.

  • 3,6825. Kurva baku tersebut memenuhi persyaratan linearitas karena memiliki nilai r > 0,999 (Snyder et al., 1997).

  AUC/40000 Konsentrasi baku kafein (ppm)

  51,8274 59,748 62,1060 59,748 60,4023 59,748

  41,8911 49,79 52,2529 49,79 51,2675 49,79

  31,8467 39,832 42,2490 39,832 42,6890 39,832

  21,6419 29,874 31,7128 29,874 33,6019 29,874

  12,5954 19,916 21,2705 19,916 22,1587 19,916

  AUC/40000 9,958 11,8422 9,958 12,5424 9,958

  AUC/40000 Konsentrasi baku kafein (ppm)

  

Tabel IX. Data kurva baku teobromin (AUC)

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Konsentrasi baku teobromin (ppm)

  

Tabel X. Data kurva baku kafein (AUC)

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Konsentrasi baku kafein (ppm)

  Berdasarkan hasil yang diperoleh pada tabel IX, data kurva baku yang digunakan untuk teobromin adalah replikasi I karena memiliki nilai koefisien korelasi yang baik yaitu 0,99978 dan nilai intersep paling kecil dibandingkan replikasi lainnya yaitu 3,68. Persamaan regresi yang diperoleh yaitu Y = 1,0993 X

  119,64 135,5410 119,64 127,8667 119,64 134,3106

a = 3,6825 a = 7,5481 a = 5,363

b = 1,0993 b = 1,0054 b = 1,0691

r = 0,99978 r = 0,99914 r = 0,99985

  AUC/40000 19,94 26,1177 19,94 26,5650 19,94 26,8710 39,88 47,0445 39,88 47,1614 39,88 48,2839 59,82 68,6433 59,82 69,7333 59,82 69,3112 79,76 92,6799 79,76 89,2507 79,76 90,0595 99,70 112,3992 99,70 105,7046 99,70 111,0024

  AUC/40000 Konsentrasi baku teobromin (ppm)

  AUC/40000 Konsentrasi baku teobromin (ppm)

  61,1232

a = 1,4254 a = 3,539 a = 2,4969

b = 1,018 b = 0,9632 b =0,9848

r = 0,99989 r = 0,99893 r = 0,99986 Berdasarkan tabel X, dapat dilihat bahwa persamaan kurva baku yang paling optimal untuk kafein adalah replikasi I yaitu Y = 1,018 X + 1,4254 dengan nilai koefisien korelasi paling besar yaitu r = 0,99989 dan nilai intersep paling kecil yaitu 1,43. Kurva baku tersebut memenuhi persyaratan linearitas karena memiliki nilai r > 0,999 (Snyder et al., 1997).

  Berdasarkan semua data perhitungan kurva baku teobromin dan kafein baik dilihat dari respon AUC maupun peak height, hampir semua kurva baku yang dihasilkan sudah memiliki nilai r > 0,999 walaupun ada beberapa replikasi yang memiliki linearitas kurang baik, yaitu nilai r < 0,999. Persamaan kurva baku yang memiliki nilai koefisien korelasi yang paling besar dan nilai intersep paling kecil akan digunakan untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein dalam sampel cokelat bubuk.

  Penetapan kadar teobromin akan menggunakan persamaan kurva baku replikasi I dengan hubungan antara konsentrasi vs AUC/40000. Hal ini karena persamaan tersebut memiliki nilai koefisien korelasi yang baik dan nilai intersep paling kecil dibandingkan yang lainnya yaitu r = 0,99978 dan nilai intersep = 3,68. Demikian pula untuk penetapan kadar kafein akan menggunakan persamaan kurva baku replikasi I dengan AUC/40000 sebagai responnya. Hal ini dikarenakan persamaan tersebut memiliki nilai koefisien korelasi yang paling tinggi dibandingkan yang lainnya yaitu 0,99989 dan nilai intersep yang paling kecil yaitu 1,43. Hal tersebut menggambarkan hubungan baik antara konsentrasi dan nilai AUC.

  Analisis menggunakan peak area (AUC) lebih menguntungkan dibandingkan peak height. Analisis menggunakan peak height dapat memberikan hasil yang akurat apabila adanya variasi kondisi pada kolom tidak mempengaruhi atau tidak mengubah lebar peak selama pengamatan. Oleh karena itu, perlu adanya pengontrolan pada suhu kolom, kecepatan alir, dan kecepatan penyuntikan sampel. Analisis menggunakan peak area tidak terpengaruhi oleh adanya efek pelebaran (broadening effect) sehingga lebih banyak digunakan dibandingkan peak height (Skoog et al., 1998).

  Baik kurva baku untuk teobromin maupun kafein telah menunjukkan bahwa persamaan kurva baku tersebut mempunyai korelasi yang baik sehingga dapat digunakan untuk perhitungan kadar teobromin dan kafein dalam sampel. Gambar 21 dan 22 berikut adalah grafik kurva baku teobromin dan kafein.

  

Kurva Baku Teobromin

160 Y = 1,0993 X + 3,6825 140 r = 0,99978 120 100

  80 /4 C

  60 U A

  40

  20 50 100 150 konsentrasi baku teobromin (ppm)

  

Gambar 21. Kurva hubungan antara konsentrasi teobromin (ppm) vs AUC/40000

  

Kurva Baku Kafein

70 Y = 1,018 X + 1,4254

  60 r = 0,99989

  50

  40 /4

  30 C U A

  20

  10

  20

  40

  60

  80 konsentrasi baku kafein (ppm)

  

Gambar 22. Kurva hubungan antara konsentrasi kafein (ppm) vs AUC/40000

  Berdasarkan gambar 21 dan 22, dapat dilihat bahwa AUC teobromin dan kafein meningkat seiring dengan meningkatnya kadar sehingga dapat disimpulkan bahwa terdapat proporsionalitas yang baik antara kadar dan respon yang dihasilkan pada instrumen KCKT.

D. Preparasi Sampel

  Cokelat bubuk memiliki banyak senyawa di dalamnya antara lain karbohidrat, protein, lemak, serat dan mineral (Baba et al., 2007). Oleh karena banyaknya kandungan senyawa dalam cokelat bubuk, maka diperlukan suatu proses preparasi sehingga diharapkan hanya diperoleh teobromin dan kafein.

  Preparasi sampel juga bertujuan untuk menghilangkan senyawa-senyawa dalam cokelat bubuk yang mungkin dapat mengganggu analisis kuantitatif dengan metode KCKT.

  Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi teobromin dan kafein dengan menggunakan sokhlet. Dipilih menggunakan sokhletasi karena memiliki beberapa keuntungan yaitu lebih efektif dalam menyari karena penyari yang digunakan selalu baru oleh karena adanya penguapan pelarut diikuti sirkulasi secara berkesinambungan. Selain itu, dilihat dari sifat fisika teobromin dan kafein yaitu

  o o

  titik leleh teobromin = 295 C dan kafein = 238 C sehingga dapat dikatakan bahwa teobromin dan kafein tahan terhadap pemanasan. Pada saat pemanasan, pelarut akan menguap naik ke sistem sokhlet dan diembunkan oleh pendingin kemudian akan menetes sambil menyari senyawa dalam sampel sesuai kelarutannya. Proses ini akan berlangsung secara terus-menerus selama ekstraksi berlangsung.

  Tahap preparasi sampel dibagi dalam dua bagian yaitu tahap penghilangan lemak dan tahap ekstraksi teobromin dan kafein. Adanya lemak dalam sampel perlu dihilangkan karena molekulnya yang besar dapat menyumbat kolom KCKT sehingga dapat mengganggu pengukuran dan juga dapat mengakibatkan ketidakstabilan tekanan pompa. Lemak dalam sampel dihilangkan

  o

  menggunakan petroleum eter (titik didih 40-60

  C) karena lemak mudah larut dalam petroleum eter. Teobromin dan kafein tidak larut dalam petroleum eter sehingga tidak ikut tersari. Proses penyarian lemak dengan proses sokhletasi ini

  o

  dilakukan selama 4 jam dengan suhu 40-60 C sesuai dengan titik didih petroleum eter. Sokhletasi yang dilakukan selama 4 jam ini diharapkan telah dapat menghilangkan seluruh lemak yang ada dalam sampel cokelat bubuk.

  Tahap selanjutnya adalah ekstraksi teobromin dan kafein menggunakan kloroform. Dipilih menggunakan kloroform karena kafein dan teobromin bersifat mudah larut dalam kloroform. Hal ini karena teobromin dan kafein bersifat basa dan diusahakan dalam bentuk molekul utuh sehingga lebih mudah larut pada pelarut organik. Sebelum dilakukan tahap ekstraksi teobromin dan kafein, kantong sokhlet yang berisi sampel (telah dilakukan tahap penghilangan lemak) terlebih dahulu direndam dalam larutan NaOH 0,1 M pH 13. Dalam cokelat bubuk, teobromin dan kafein berada dalam bentuk garam karena berikatan dengan asam- asam organik. Fungsi perendaman dengan NaOH 0,1 M adalah untuk melepas teobromin dan kafein yang semula berbentuk garam yang larut air menjadi teobromin dan kafein berbentuk basa (molekul utuh) sehingga dapat larut dalam kloroform. Reaksi pembasaan teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar 23 dan 24 berikut ini. H 3 C N O CH 3 H 3 C N N O CH 3 N

  • NaX + H
  • 2 O N CH 3 N.HX + NaOH O N CH 3 N

    Kafein dalam bentuk garam Kafein dalam bentuk basa (molekul utuh)

    (larut dalam air) (larut dalam pelarut organik)

      Keterangan : HX adalah asam-asam organik

    Gambar 23. Reaksi pembasaan kafein menggunakan NaOH

    O CH 3 O CH 3 H N N H N N

    • NaX + H
    • 2 O N CH 3 N.HX + NaOH O N CH 3 N Teobromin dalam bentuk basa (molekul utuh) Teobromin dalam bentuk garam (larut dalam pelarut organik) (larut dalam air)

        Keterangan : HX adalah asam organik

      Gambar 24. Reaksi pembasaan teobromin menggunakan NaOH

        Proses ekstraksi dilakukan selama 4 jam dengan harapan seluruh teobromin dan kafein dalam sampel cokelat bubuk dapat tersari secara optimal.

        Setelah proses ekstraksi selesai, pelarut kloroform diuapkan dengan menggunakan

        

      waterbath di dalam lemari asam sampai diperoleh ekstrak kental dengan bobot

        yang tetap. Aturan bobot tetap ekstrak sesuai Farmakope Indonesia IV yaitu dari dua penimbangan, berat ekstrak yang diperoleh tidak berbeda lebih dari 0,5 mg tiap gram zat yang ditimbang. Penimbangan kedua dilakukan setelah ekstrak diuapkan/dipanaskan kembali selama 1 jam. Salah satu contohnya adalah pada penimbangan pertama diperoleh berat ekstrak 0,7895 gram. Kemudian dilakukan pemanasan kembali selama 1 jam dan ditimbang lagi. Setelah penimbangan kedua, berat ekstrak yang diperoleh tetap 0,7895 gram sehingga dapat disimpulkan bahwa telah diperoleh ekstrak dengan berat yang tetap.

      E. Validasi Metode Analisis

        Validasi metode analisis dilakukan untuk membuktikan bahwa metode KCKT yang digunakan pada penelitian ini memiliki validitas yang baik atau tidak dalam penetapan kadar teobromin dan kafein dengan kondisi percobaan sesuai hasil optimasi.

        Teobromin dan kafein merupakan golongan ksantin yang terdapat dalam jumlah yang cukup besar pada cokelat bubuk sehingga metode analisis yang digunakan termasuk dalam metode analisis kategori 1 yaitu analisis senyawa dengan kadar besar. Parameter validasi yang harus dipenuhi pada analisis kategori 1 adalah akurasi, presisi, linearitas, rentang dan spesifisitas (Snyder et al., 2010).

      1. Akurasi

        Akurasi menyatakan ukuran kedekatan nilai hasil yang diperoleh dengan nilai yang sesungguhnya. Pada penelitian ini, akurasi dinyatakan dengan persen perolehan kembali (% recovery) dari kadar yang terukur terhadap kadar sebenarnya. Semakin sedikit selisih antara keduanya maka akurasi metode analisis semakin baik. Penetapan % recovery dilakukan dengan menggunakan 3 seri konsentrasi baku dengan masing-masing 3 kali replikasi. Nilai AUC yang diperoleh pada pengukuran kemudian diolah dengan menggunakan persamaan regresi linear Y = 1,0993 X + 3,6825 untuk teobromin dan Y = 1,018 X + 1,4254 untuk kafein. Hasil penetapan % recovery teobromin dan kafein dapat dilihat pada tabel XI dan XII berikut.

        

      Tabel XI. Hasil penetapan % recovery baku teobromin

      Level Kadar Teobromin Kadar Teobromin Rata-Rata %

      % Recovery

        

      Kadar Teoritis (ppm) Teukur (ppm) Recovery

      19,94 20,7934 104,2800

      19,94 21,0077 105,3547

      rendah

        104,1391

      19,94 20,4948 102,7825

      59,82 58,9700 98,5790

      59,82 59,4112 99,3166

      sedang

        99,8899

      59,82 60,8812 101,7741

      119,64 119,7017 100,0516

      119,64 118,3744 98,9422

      tinggi

        99,0948

      119,64 117,5949 98,2906

        

      Tabel XII. Hasil penetapan % recovery baku kafein

      Level Kadar Kadar Kafein Teoritis (ppm)

        

      Kadar Kafein

      Teukur (ppm)

      % Recovery Rata-Rata % Recovery rendah

        

      9,958 11,0234 110,6992

      109,9980

      9,958 11,0603 111,0691

      9,958 10,7771 108,2257

      sedang

        

      29,874 29,8468 99,9088

      101,5510

      29,874 29,8268 99,8421

      29,874 31,3384 104,9020

      tinggi

        

      59,748 59,1422 98,9861

      98,6876

      59,748 58,5824 98,0491

      59,748 59,1670 99,0276

        Kriteria % perolehan kembali yang diperbolehkan untuk kadar 10 ppm adalah 80 -110%, untuk 100 ppm adalah 90-107% dan untuk kadar sampai dengan 0,1% adalah 95 – 105% (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007). Oleh karena itu, perlu dilakukan suatu perhitungan untuk mendapatkan rentang

        

      recovery yang tepat untuk kadar (ppm) tertentu. Berdasarkan hasil perhitungan

        (terlampir), maka rentang % recovery yang diperoleh dapat dilihat pada tabel XIII berikut.

        

      Tabel XIII. Nilai rentang % recovery berdasarkan perhitungan

      Kadar (ppm) Rentang recovery (%)

      10 80-110

      20 81,1-109,7 30 82,2-109,3 60 85,5-108,3

        120 90,1-106,6

        Berdasarkan tabel XIII di atas, dapat diketahui bahwa hasil pengukuran % recovery untuk 3 kali replikasi pada masing-masing level konsentrasi (baik teobromin maupun kafein) masih berada pada rentang yang ditetapkan sesuai hasil perhitungan. Hal ini berarti bahwa pengukuran teobromin dan kafein pada ketiga level konsentrasi tersebut memiliki akurasi yang baik.

        Setelah dilakukan pengukuran akurasi baku teobromin dan kafein, dilakukan pula pengukuran akurasi baku teobromin dan kafein dalam matriks sampel. Akurasi sampel yang dimaksud adalah penentuan akurasi baku teobromin dan kafein yang dispike ke dalam matriks sampel. Hal ini dilakukan karena peneliti tidak dapat membuat matriks yang sesuai dengan matriks sampel sehingga penentuan akurasi dilakukan dengan jalan spiking senyawa baku ke dalam matriks sampel. Digunakan 3 level konsentrasi (baik teobromin maupun kafein) dan masing-masing direplikasi sebanyak 3 kali. Untuk teobromin digunakan konsentrasi 20, 60 dan 120 ppm dan untuk kafein digunakan konsentrasi 10, 30 dan 60 ppm. Sebagai blanko digunakan sampel yang tidak dispike dengan senyawa baku. Sebelum dihitung menggunakan persamaan regresi, nilai AUC total (AUC hasil spiking) dikurangi dengan AUC blanko (tanpa spiking) sehingga diperoleh nilai AUC baku. Berdasarkan hasil perhitungan, nilai akurasi baku teobromin dan kafein (hasil spiking) dapat dilhat pada tabel XIV dan XV.

        

      Tabel XIV. Hasil penetapan % recovery baku teobromin (spike ke sampel)

      Level Kadar Teobromin Kadar Teobromin Rata-Rata

      % Recovery

        

      Kadar Teoritis (ppm) Teukur (ppm) % Recovery

      19,94 20,9930 105,2809

      19,94 21,0354 105,4935

      rendah

        105,8005

      19,94 21,2614 106,6271

      59,82 59,1467 98,8745

      59,82 59,2035 98,9694

        99,0679 sedang

        

      59,82 59,4371 99,3599

      119,64 115,7045 96,7106

      119,64 115,7947 96,7859

      96,4879 tinggi

        

      119,64 114,8152 95,9672

        

      Tabel XV. Hasil penetapan % recovery baku kafein (spike ke sampel)

      Level Kadar Kadar Kafein Teoritis (ppm)

        

      Kadar Kafein

      Teukur (ppm)

      % Recovery Rata-Rata % Recovery rendah

        

      9,958 10,8119 108,5749

      108,8164

      9,958 10,8083 108,5386

      9,958 10,8876 109,3357

      sedang

        

      29,874 29,5350 98,8652

      98,8223

      29,874 29,4162 98,4675

      29,874 29,6153 99,1340

      tinggi

        

      59,748 60,6028 101,4307

      100,7184

      59,748 60,2081 100,7701

      59,748 59,7208 99,9546

        Kriteria % perolehan kembali yang diperbolehkan untuk kadar yang diukur dapat dilihat pada tabel XIII. Berdasarkan data pada tabel XIV dan XV, dapat diketahui bahwa semua level konsentrasi baik teobromin maupun kafein telah memenuhi akurasi yang baik dilihat dari nilai % recovery. Dengan demikian, pada saat dilakukan aplikasi untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein, konsentrasi sampel dapat diarahkan pada ketiga level konsentrasi tersebut.

      2. Presisi

        Presisi adalah suatu ukuran kedekatan nilai data satu dengan data lainnya dalam suatu pengukuran pada kondisi analisis yang sama (keterulangan hasil pengukuran). Presisi dinyatakan dengan persen Relative Standard Deviation (RSD) atau Coefficient of Variation (CV). semakin kecil nilai CV maka presisinya akan semakin baik. Hasil perhitungan nilai CV pada teobromin dan kafein dapat dilihat pada tabel XVI dan XVII.

        

      Tabel XVI. Hasil penetapan CV Baku Teobromin

      Level Kadar Baku Teobromin (ppm) Nilai

        Rendah Sedang Tinggi 1,2919 1,6729 0,8904 SD (n = 5)

        1,2405% 1,6747% 0,8985% CV (n = 5)

        

      Tabel XVII. Hasil penetapan CV Baku Kafein

      Level Kadar Baku Kafein (ppm) Nilai

        Rendah Sedang Tinggi

      SD (n = 5) 1,5460 2,9023 0,5533

      CV (n = 5) 1,4055% 2,8580% 0,5607%

        Suatu metode dapat dikatakan memiliki presisi yang baik apabila memiliki nilai CV < 7,3 % untuk kadar 10 ppm, CV < 5,3 % untuk kadar 100 ppm dan CV < 3,7 % untuk kadar analit sampai dengan 0,1% (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007). Oleh karena itu, perlu dilakukan suatu perhitungan untuk mendapatkan batasan nilai CV yang tepat untuk kadar (ppm) tertentu. Berdasarkan hasil perhitungan (terlampir), maka batasan nilai CV yang diperoleh untuk kadar yang ditetapkan dapat dilihat pada tabel XVIII berikut.

        

      Tabel XVIII. Batasan nilai CV berdasarkan perhitungan

      Kadar (ppm) CV (%)

      10 7,3

      20 7,1

      30 6,8

      60 6,2

        

      120 4,9

        Berdasarkan data pada tabel XVI dan XVII, dapat diketahui bahwa pada ketiga level kadar yang diujikan untuk teobromin dan kafein memiliki nilai CV yang memenuhi syarat sesuai dengan konsentrasinya. Dengan demikian, metode KCKT yang digunakan memiliki presisi yang baik untuk ketiga level konsentrasi tersebut.

        Seperti pada tahap pengukuran akurasi, dilakukan pula pengukuran presisi baku teobromin dan kafein dalam matriks sampel. Pengukuran presisi sampel yang dimaksud adalah pengukuran presisi baku teobromin dan kafein yang dispike ke dalam matriks sampel peneliti tidak dapat membuat matriks yang sesuai dengan matriks sampel. Pada tahap ini juga digunakan 3 level konsentrasi (baik teobromin maupun kafein) dan masing-masing direplikasi sebanyak 3 kali.

        Untuk teobromin digunakan konsentrasi 20, 60 dan 120 ppm dan untuk kafein digunakan konsentrasi 10, 30 dan 60 ppm. Sebagai blanko digunakan sampel yang tidak dispike dengan senyawa baku yang digunakan. Perhitungan dilakukan dengan cara mengurangi nilai AUC total (AUC hasil spiking) dengan AUC blanko (tanpa spiking) sehingga diperoleh nilai AUC baku. Kemudain hasil pengurangan ini dimasukkan ke persamaan regresi yang telah diperoleh. Berdasarkan hasil perhitungan, nilai presisi baku teobromin dan kafein (hasil spiking) dapat dilhat pada tabel XIX dan XX berikut ini.

        

      Tabel XIX. Hasil penetapan CV teobromin (spike ke sampel)

      Level Kadar Teobromin (ppm) Nilai

        Rendah Sedang Tinggi

      SD (n = 5) 1,4631 0,5057 0,3701

      CV (n = 5) 1,4393% 0,5083% 0,3776%

        

      Tabel XX. Hasil penetapan CV kafein (spike ke sampel)

      Level Kadar Kafein (ppm) Nilai

        Rendah Sedang Tinggi

      SD (n = 5) 1,3681 0,5503 0,5787

      CV (n = 5) 1,2462% 0,5550% 0,5737% Syarat suatu metode untuk dapat memiliki presisi yang baik adalah apabila nilai % CV yang diperoleh untuk kadar yang ditetapkan memenuhi persyaratan sesuai tabel XVIII. Berdasarkan data pada tabel XIX dan XX, dapat diketahui bahwa pada ketiga level kadar baik teobromin maupun kafein memiliki nilai % CV yang memenuhi ketentuan. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa metode KCKT yang telah diaplikasikan pada matriks sampel memiliki presisi yang baik.

      3. Linearitas

        Linearitas suatu metode analitik menyatakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel yang digunakan. Linearitas suatu metode ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi. Suatu metode dikatakan memiliki linearitas yang baik apabila nilai r > 0,999 (Snyder et al., 1997). Nilai koefisien korelasi ditentukan menggunakan 6 seri larutan baku dan masing-masing dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Berdasarkan data pembuatan kurva baku teobromin (konsentrasi

        

      vs AUC), diperoleh nilai koefisien korelasi untuk replikasi I = 0,99978, replikasi

        II = 0,99914 dan replikasi III = 0,99985 sedangkan untuk nilai koefisien korelasi pada kafein yaitu 0,99989 (replikasi I); 0,99893 (replikasi II); dan 0,99986 (replikasi III). Nilai r untuk kurva baku teobromin telah memenuhi persyaratan yang ditentukan yaitu > 0,999. Sementara untuk kurva baku kafein, kurva baku replikasi I dan III telah memenuhi persyaratan dan pada replikasi II belum memenuhi persyaratan. Namun secara keseluruhan, kurva baku baik pada teobromin maupun kafein telah memiliki linearitas yang baik bila digunakan dalam penetapan kadar.

        4. Rentang

        Rentang suatu metode dapat didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dan teratas pada suatu metode analisis yang masih memiliki akurasi, presisi dan linearitas yang baik (Snyder et al., 1997). Berdasarkan hasil pengukuran, untuk rentang pengukuran teobromin yang masih memberikan linearitas yang baik yaitu antara 2,5 – 120 ppm dengan nilai r = 0,99959 dan untuk kafein memiliki rentang pengukuran antara 1,25 – 80 ppm dengan nilai r = 0,99919. Kedua hal tersebut masih memenuhi persyaratan linearitas dimana r  0,999 (Snyder et al., 1997).

        5. Spesifisitas

        Tujuan utama penggunaan kromatografi dalam suatu prosedur analisis adalah memisahkan suatu campuran dalam sampel menjadi komponen- komponennya. Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur secara akurat dan spesifik suatu analit dalam sampel. Jika spesifisitas tidak diukur maka akurasi, presisi dan linearitas metode menjadi diragukan. Spesifisitas dinyatakan dengan parameter resolusi, yaitu mengukur pemisahan antara puncak suatu analit dengan puncak terdekatnya. Resolusi suatu puncak terhadap puncak lain dikatakan baik apabila nilainya  2 (Snyder et al., 2010). Suatu senyawa yang terpisah dengan baik dari senyawa lain akan memudahkan analisis. Berdasarkan hasil pengamatan waktu retensi pada sampel, diketahui waktu retensi teobromin kurang lebih adalah 2,239 menit dan kafein adalah 3,654 menit. Berdasarkan perhitungan, diperoleh resolusi kedua senyawa  2 yaitu sekitar 2,0809. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa metode KCKT yang digunakan memiliki spesifisitas yang baik dilihat dari nilai resolusinya.

        Berdasarkan keseluruhan data validasi di atas, dapat disimpulkan bahwa metode KCKT yang digunakan pada penelitian ini memberikan validitas yang baik pada semua lever kadar teobromin dan kafein. Hampir semua parameter pada tiap level konsentrasi telah memenuhi persyaratan validasi yang ditetapkan yaitu akurasi, presisi, linearitas, rentang dan spesifisitas. Selain itu, metode ini memberikan waktu analisis yang relatif singkat yaitu kurang dari 10 menit.

      F. Uji Kesesuaian Sistem

        Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan tujuan untuk memberikan jaminan bahwa suatu sistem dan prosedur KCKT yang digunakan masih dapat memberikan data yang akurat, presisi dan reprodusibel. Pada penelitian ini, parameter yang akan ditentukan dalam uji kesesuaian sistem adalah plate number (N), tailing factor (Tf), resolusi (R ) dan relative standard deviation (RSD) peak

        s

      height dan peak area untuk beberapa 5 kali penginjeksian secara berulang

        (repetisi) (Snyder et al., 1997). RSD yang diperbolehkan untuk 5 kali ripitasi injeksi haruslah  2% (Anonim, 2005b).

        Pada penelitian ini, digunakan seri larutan baku campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm. Larutan tersebut disuntikkan ke sistem KCKT sebanyak

        5 kali secara berurutan. Data mengenai parameter uji kesesuaian sistem yang diukur untuk teobromin dan kafein dapat dilihat pada tabel XXI dan XXII.

        

      Tabel XXI. Hasil uji kesesuaian sistem untuk teobromin

      Ripitasi Tailing Column Plate Peak Peak

      Injeksi Factor (Tf) Number (N) Area Height

        1 1,357 529,2327 2852887 271971 2 1,341 526,8812 2849245 278264 3 1,375 525,0036 2851939 274116 4 1,364 526,4114 2850664 279692 5 1,357 526,8811 2849951 278252

      Rata-rata 1,3588 526,8820 2850937,2 276459

        RSD 0,911% 0,289% 0,052% 1,18%

      Tabel XXII. Hasil uji kesesuaian sistem untuk kafein

        Tailing Column Plate Peak Peak RipitasiInjeksi

        Resolusi Factor (Tf) Number (N) Area Height

        1 1,411 727,4977 1316486 86525 2,0565 2 1,400 725,9114 1318450 90630 2,0580 3 1,389 722,3487 1314825 86203 2,0809 4 1,393 722,7441 1315401 90641 2,0779 5 1,423 723,1397 1314844 89828 2,0628

      Rata-rata 1,4032 724,3283 1316001 88765,4 2,0672

        RSD 0,988% 0,312% 0,116% 2,501% 0,552%

        Berdasarkan tabel XXI dan XXII, dapat diketahui bahwa untuk nilai

        

      tailing factor baik teobromin maupun kafein telah memenuhi persyaratan (Tf < 2)

        yaitu rata-rata nilai Tf teobromin = 1,36 dan untuk kafein = 1,40. Nilai RSD untuk parameter tailing factor pada kedua senyawa tersebut juga telah memenuhi persyaratan  2%, yaitu 0,91% untuk teobromin dan 0,99% untuk kafein.

        Akan tetapi untuk nilai Column Plate Number (N) teobromin dan kafein belum memenuhi persyaratan karena nilainya tidak lebih dari 2000. Nilai N rata- rata yang diperoleh adalah 526,88 untuk teobromin dan 724,33 untuk kafein. Hal ini terjadi dikarenakan penggunaan kolom yang sudah sering digunakan untuk analisis sehingga menurunkan efisiensi kolom tersebut.

        Bila dilihat dari parameter peak area, nilai RSD pada kedua senyawa sudah memenuhi persyaratan yaitu 0,05% untuk teobromin dan 0,12% untuk kafein. Demikian pula dengan parameter peak height (untuk teobromin) juga telah memenuhi persyaratan dengan nilai CV 1,18%. Akan tetapi untuk parameter peak

        

      height (untuk kafein) belum memenuhi persyaratan karena nilai RSD > 2% yaitu

        2,50%. Hal ini dapat terjadi karena pengukuran menggunakan peak height hanya dapat memberikan hasil yang akurat apabila adanya variasi kondisi pada kolom tidak mempengaruhi atau tidak mengubah lebar peak selama pengamatan. Pada analisis ini tidak dilakukan pengontrolan kondisi kolom secara khusus (uji

        

      robustness) sehingga peak height yang dihasilkan memiliki variasi yang cukup

      besar.

        Parameter yang terakhir adalah resolusi dimana syarat yang ditentukan adalah Rs  2 (Snyder et al., 2010). Berdasarkan hasil pengukuran pada 5 kali ripitasi injeksi, diperoleh nilai resolusi rata-rata yaitu 2,07 dengan RSD = 0,55%. Dengan demikian, hasil yang diperoleh telah memenuhi persyaratan yang ditentukan.

      BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Metode KCKT yang digunakan dengan fase diam kolom C Merek

        18 KNAUER (250 x 4,6 mm, 5 m), fase gerak campuran metanol : akuabides/TEA

        3% (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit mempunyai validitas yang baik untuk pengukuran teobromin dan kafein pada semua level konsentrasi dilihat dari parameter akurasi, presisi, linearitas, rentang dan spesifisitas. Nilai % recovery dan CV berturut-turut untuk level kadar rendah, sedang dan tinggi adalah 104,12% dan 1,24%; 99,89% dan 1,67%; 99,09% dan 0,90% untuk teobromin serta 109,99% dan 1,41%; 101,55% dan 2,86%; 98,69% dan 0,56% untuk kafein.

        Koefisien korelasi (r) untuk teobromin adalah 0,99978 dan untuk kafein adalah 0,99989. Rentang untuk pengukuran teobromin yaitu 2,5-120 ppm dan 1,25-80 ppm untuk pengukuran kafein. Nilai resolusi yang diperoleh dari 3 replikasi yaitu 2,08. Berdasarkan hasil tersebut maka dapat disimpulkan bahwa metode ini dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar teobromin dan kafein dalam sampel pada ketiga level konsentrasi yaitu 20, 60 dan 120 ppm untuk teobromin dan 10, 30 dan 60 ppm untuk kafein.

      B. Saran

        1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengaplikasikan metode ini pada penetapan kadar teobromin dan kafein pada sampel cokelat bubuk.

        2. Perlu dilakukan pencatatan jumlah injeksi pada penggunaan kolom, sehingga dapat diketahui usia kolom dan jenis senyawa yang dianalisis.

      DAFTAR PUSTAKA

        nd

        Adamovics, J.A., 1997, Chromatographic analysis of pharmaceuticals, 2 Edition, Marcel Dekker Inc., New York, pp 15. Ahuja, S. and Rasmussen, H., 2007, HPLC Method development for

      pharmaceuticals, Elsevier Academic Press, Italy, pp. 442, 446.

      Alexander, J., Benford, D., Cockburn, A., Cravedi, J.P., Dogliotti, E., and

        Domenico, A.D., 2008, Theobromine as undesirable substances in animal feed, The Eur. Food Safety Agr. J., 725, pp. 8, 10. Anonim, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 5-25. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 254, 1002. Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 1-12.

        Anonim, 2005a, Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, ICH Q2 (R1) Expert Working Group, USA, pp 4, 8.

        th

        Anonim, 2005b, The United States Pharmacopeia, 28 edition, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, pp. 2389. Anonim, 2010, British Pharmacopoeia, Vol. II, The Stationery Office, London, pp. 2115. Anonim, 2011, Theobroma cacao, cacao, diakses tanggal 21 Oktober 2011. Ansel, H.C., 1985, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, Edisi Keempat, diterjemahkan oleh Farida Ibrahim, Universitas Indonesia Press, Jakarta, pp. 45. Baba, S., Osakabe, N., Kato, Y., Natsume, M., Yasuda, A., and Kido, T., 2007,

        Continuous intake of polyphenolic compounds containing cocoa powder reduce LDL oxidative susceptibility and has beneficial effects on plasma HDL-cholesterol concentrations in humans, The Am. J. of Clin. Nutr., 17, pp. 710. Chan, C.C., Lee, Y.C., Lam, H., and Zhang, X.M., 2004, Analytical method

        validation and instrument performance verification, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 17, 18.

        Choo, Khor Swan dan Tee E-Siong, 1996, Development of a HPLC method for the simultaneous determination of several B-vitamins and ascorbic acid,

        Mal. J. Nutr., 2, pp. 49-65

        Christian, G.D., 2004, Analytical chemistry, 6

        th

        edition, John Willey & Sons Inc., USA, pp. 465, 466. Czech, K., Johnson, A., and Rodeberg, N., 2011, Simultaneous determination of caffeine and theobromine in local area coffee brews, J. Anal. Chem., 2, pp. 17-22. Erickson, J., 2011, Determination of the concentration of caffeine, theobromine, and gallic acid in commercial tea samples, J. Anal. Chem., 2, pp. 31-32. Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 224, 378, 379, 381, 465. Gennaro, A.R., 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20

        th Edition, Lippincott William & Wilkins, Philadephia, pp. 1472.

        Gonzalez, A.G. and Herrador, M.A., 2007, A practical guide to analytical method validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles,

        Trends in Anal. Chem., 26, pp. 232, 234.

        Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., and Schwarting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, pp.

        10-11. Harbone, J.B., 1987, Phitochemical methods, diterjemahkan oleh Padmawinata, Kosasih dan Soediro, Iwang, Penerbit ITB, Bandung, pp. 19-21.

        Harris, D.C., 1995, Quantitative chemical analysis, W.H. Freeman and Company, New York, pp. 643, 648, 716-717. Henderson, J.W. and Major, R.E., 2006, High throughput separation of xanthines by rapid resolution HPLC, Agilent Technologies Inc., USA, pp. 1, 2. Johnson, E.L. dan Stevenson, R., 1991, Dasar Kromatografi Cair, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, pp. 1, 5, 10.

        Kazakevich, Y. and Nair, H.M., 1996, Basic Liquid Chromatohraphy Textbook

        on KCKT, , diakses pada tanggal 21 Oktober 2011.

        Khopkar S. M., 1990, Konsep Dasar Kmia Analitik, 85-102, UI Press, Jakarta, pp.

        32-34. Long, William J. dan Henderson, Jhon W. Jr., 2007 Chromatography of Nitrogen- Containing Compounds Without Triethylamine, Agilent Technology.

        Marx, F., Janssens, M.J., Urfer, P., and Scherer, R., 2003, Caffeine and Theobromine Composition of Mate (Ilex paraguarinensis) Leaves in Five Plantations of Misiones Argentina, Plant Foods Human. Nutr., 58, pp. 1- 8.

        Mitra, S., 2003, Sample preparation techniques in analytical chemistry, Willey, New York, pp. 143. Moffat, A.C. and Moss, M.S., 1986, Clarkes’s: Isolation and identification of drugs, The Pharmaceutical Press, London, pp. 201-203. Moffat, A.C., Osselton, M.D., and Widdop, B., 2004, Clarke’s: Analysis of drug and poisons, Pharmaceutical Press, USA. Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga Press, Surabaya, pp. 139-141, 164, 269. Nash, R.A. and Wachter, A.H., 2003, Pharmaceutical process validation, 3

        th

        ed., Marcel Dekker Inc., New York, pp. 542. Ramli, N., Yatim, A.M., Said, M., and Hok, H.C., 2001, HPLC Determination of

        Methylxanthines and Polyphenols Levels In Cocoa and Chocolate Products, Malay. J. Anal. Sci., 7, pp. 377-378. Rohman, A., 2009, Kromatografi Untuk Analisis Obat, Edisi I, Graha Ilmu,

        Yogyakarta, pp. 5, 6, 11, 111, 115 Roth, H.J. and Blaschke, G., 1985, Analisis Farmasi, diterjemahkan oleh Kisman, S., dan Ibrahim, S., UGM Press, Yogyakarta, pp. 371.

        Skoog, D.A., Holler, F.J., and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental

        

      Analysis, Harcourt Brace & Company, USA, pp. 695, 706, 739

        Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method

        Development, 2 nd Edition, A John Wiley & Sons Inc., New York, pp. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Dolan, J.W., 2010, Introduction to Modern

        nd Liquid Chromatography, 3 Edition, A John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 40, 55, 540, 543.

        Wati, E. R., 2012, Optimasi fase gerak pada penentuan kadar teobromin dan

        kafein dalam cokelat bubuk dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas

        Sanata Dharma, Yogyakarta. Willard, H.H., Merrit, L.L., Dean, J.A., and Settle, F.A., 1988, Instrumental

        Methods of Analysis, 7th edition, Wadsworth Publishing Company, California, pp. 525, 580.

        

      LAMPIRAN

        Lampiran 1. Sertifikat analisis baku teobromin

        Lampiran 2. Sertifikat analisis baku kafein

        

      Lampiran 3. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein replikasi I

        a. Seri 1 (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm

        b. Seri 2 (Campuran teobromin 40 ppm dan kafein 20 ppm)

        min Teobromin Kafein

        

      Lampiran 3. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein replikasi I

        a. Seri 1 (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm

        b. Seri 2 (Campuran teobromin 40 ppm dan kafein 20 ppm)

        min Teobromin Kafein

        

      Lampiran 3. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein replikasi I

        a. Seri 1 (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm

        b. Seri 2 (Campuran teobromin 40 ppm dan kafein 20 ppm)

        min Teobromin Kafein Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        c. Seri 3 (Campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        c. Seri 3 (Campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        c. Seri 3 (Campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min min min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 d. Seri 4 (Campuran teobromin 80 ppm dan kafein 40 ppm)

        d. Seri 4 (Campuran teobromin 80 ppm dan kafein 40 ppm)

        d. Seri 4 (Campuran teobromin 80 ppm dan kafein 40 ppm)

        min min min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        e. Seri 5 (Campuran teobromin 100 ppm dan kafein 50 ppm)

        e. Seri 5 (Campuran teobromin 100 ppm dan kafein 50 ppm)

        e. Seri 5 (Campuran teobromin 100 ppm dan kafein 50 ppm)

        min min min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 f. Seri 6 (Campuran teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm)

        f. Seri 6 (Campuran teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm)

        f. Seri 6 (Campuran teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm)

        min min min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

      Lampiran 4. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein replikasi II Lampiran 4. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein replikasi II Lampiran 4. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein replikasi II

      a.

        a.

        a. Seri 1 (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm) Seri 1 (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm) Seri 1 (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min min min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm

        b. Seri 2 (campuran teobromin 40 ppm dan kafein 20 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        c. Seri 3 (campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm

        b. Seri 2 (campuran teobromin 40 ppm dan kafein 20 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        c. Seri 3 (campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm

        b. Seri 2 (campuran teobromin 40 ppm dan kafein 20 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        c. Seri 3 (campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        d. Seri 4 (campuran teobromin 80 ppm dan kafein 40 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 e. Seri 5 (campuran teobromin 100 ppm dan kafein 50 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        f. Seri 6 (campuran teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        

      Lampiran 5. Kromatrogram kurva baku teobromin dan kafein replikasi III

        a. Seri 1 (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60)

        Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm b. Seri 2 (campuran teobromin 40 ppm dan kafein 20 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        c. Seri 3 (campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 d. Seri 4 (campuran teobromin 80 ppm dan kafein 40 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1

        e. Seri 5 (campuran teobromin 100 ppm dan kafein 50 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 f. Seri 6 (campuran teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada seri 1 Lampiran 6. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku

      1. Teobromin

        a. Penimbangan

        Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g)

      Berat kertas 0,2180 0,2139 0,2135

      Berat kertas + zat 0,2430 0,2389 0,2385

      Berat kertas + sisa

        0,2180 0,2139 0,2135 Berat zat

        0,0250 0,0250 0,0250 b. Data peak height

        

      Replikasi I Replikasi II Replikasi III

      Konsentrasi baku teobromin (ppm) peak height/4000

        Konsentrasi baku teobromin (ppm) peak height/4000

        Konsentrasi baku teobromin (ppm) peak height/4000

        19,94 23,3200 19,94 24,0668 19,94 24,4143 39,88 42,6808 39,88 43,9883 39,88 44,1735 59,82 64,1370 59,82 64,6163 59,82 67,0613 79,76 87,4663 79,76 83,0300 79,76 88,3453 99,70 101,7588 99,70 95,5148 99,70 107,3395 119,64 124,0823 119,64 113,7640 119,64 130,2430

      a = 3,470 a = 8,6821 a = 2,9369

      b = 1,009 b = 0,8905 b = 1,060

      r = 0,99867 r = 0,99732 r = 0,99972

        c. Data AUC

        

      Replikasi I Replikasi II Replikasi III

      Konsentrasi baku teobromin (ppm)

        AUC/40000 Konsentrasi baku teobromin (ppm)

        AUC/40000 Konsentrasi baku teobromin (ppm)

        AUC/40000 19,94 26,1177 19,94 26,5650 19,94 26,8710 39,88 47,0445 39,88 47,1614 39,88 48,2839 59,82 68,6433 59,82 69,7333 59,82 69,3112 79,76 92,6799 79,76 89,2507 79,76 90,0595 99,70 112,3992 99,70 105,7046 99,70 111,0024

        119,64 135,5410 119,64 127,8667 119,64 134,3106

      a = 3,6825 a = 7,5481 a = 5,363

      b = 1,0993 b = 1,0054 b = 1,0691

      r = 0,99978 r = 0,99914 r = 0,99985

        d. Contoh perhitungan kadar Replikasi I Tingkat kemurnian teobromin = 99,7 (berdasarkan CoA pada lampiran 1) Jumlah teobromin = 25 mg x 99,7% = 24,925 mg C stok = 24,925 mg/25 mL

        = 997 mg/1000 mL C

        1 V

        1

        = C

        2 V

        2 C baku antara

         997 ppm x 12,5 mL = C

        2

        x 25 mL C

        2

        = 498,5 ppm Seri 1

         498,5 ppm x 0,4 mL = C

        

      2

        x 10 mL C

        2

        = 19,94 ppm NB : perhitungan seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang sama dengan menyesuaikan volume larutan baku antara yang diambil.

      2. Kafein

        Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Berat kertas 0,2188 0,2147 0,2127

        Berat kertas + zat 0,2438 0,239,7 0,2377

        Berat kertas + sisa 0,2188 0,2147 0,2127 Berat zat 0,0250 0,0250 0,0250

        b. Data peak height

        

      Replikasi I Replikasi II Replikasi III

      Konsentrasi baku kafein (ppm) peak height/2500

        Konsentrasi baku kafein (ppm) peak height/2500

        Konsentrasi baku kafein (ppm) peak height/2500

        9,958 13,9820 9,958 15,2528 9,958 15,2576

        19,916 25,6804 19,916 27,9140 19,916 27,1232

        29,878 39,5964 29,878 42,3400 29,878 41,3764

        39,832 52,0244 39,832 53,3772 39,832 55,4952

        49,790 63,7124 49,790 62,5244 49,790 66,0704

        59,748 76,6928 59,748 72,5020 59,748 78,8884

      a = 1,2722 a = 5,5389 a = 2,4569

      b = 1,2627 b = 1,1509 b = 1,2886

      r = 0,99976 r = 0,99643 r = 0,99918

        a. Penimbangan

        c. Data AUC

        Replikasi I Replikasi II Replikasi III Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi

      baku kafein AUC/40000 baku kafein AUC/40000 baku kafein AUC/40000

      (ppm) (ppm) (ppm)

        12,5424 12,5954 9,958 11,8422 9,958 9,958 22,1587 21,6419 19,916 21,2705 19,916 19,916 33,6019 31,8467 29,874 31,7128 29,874 29,874 42,6890 41,8911 39,832 42,2490 39,832 39,832 51,2675 51,8274 49,79 52,2529 49,79 49,79 60,4023 61,1232 59,748 62,1060 59,748 59,748 a = 1,4254 a = 3,539 a = 2,4969 b = 1,018 b = 0,9632 b =0,9848 r = 0,99989 r = 0,99893 r = 0,99986

        d. Contoh perhitungan kadar Replikasi I Tingkat kemurnian kafein = 99,58% (berdasarkan CoA pada Lampiran 2) Jumlah teobromin = 25 mg x 99,58% = 24,895 mg C stok =24,895 mg/25 mL

        = 995,8 mg/1000 mL = 995,8 ppm

        C V = C

        V

        1

        1

        2

      2 C baku antara x 25 mL

        2

         995,8 ppm x 12,5 mL = C C = 497,9 ppm

      2 Seri 1 x 10 mL

        2

         497,9 ppm x 0,2 mL = C C = 9,958 ppm

      2 NB : perhitungan seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang sama dengan menyesuaikan volume larutan baku antara yang diambil.

        Lampiran 7. Kromatogram hasil validasi metode pada baku (Replikasi I)

        a. Kadar rendah (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60)

        Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm b. Kadar sedang (campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada kadar rendah

        c. Kadar tinggi (campuran teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada kadar rendah

        Lampiran 8. Kromatogram hasil validasi metode pada baku (Replikasi II)

        a. Kadar rendah (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60)

        Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm b. Kadar sedang (campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada kadar rendah

        c. Kadar tinggi (campuran teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada kadar rendah

        

      Lampiran 9. Kromatogram hasil validasi metode pada baku (Replikasi III)

        a. Kadar rendah (campuran teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60)

        Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm b. Kadar sedang (campuran teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada kadar rendah

        c. Kadar tinggi (campuran teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada kadar rendah

        Lampiran 10. Data penimbangan dan perhitungan recovery

        1. Teobromin

        a. Penimbangan bahan

        Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) 0,2139 0,2136 0,2254

        Berat kertas

      Berat kertas + zat 0,2389 0,2386 0,2504

      Berat kertas + sisa 0,2139 0,2136 0,2254

        0,0250 0,0250 0,0250 Berat zat

        b. Data AUC/40000

        Level kadar kafein Replikasi I Replikasi II Replikasi III 26,5407 26,7763 26,2125

        Rendah Sedang 68,5082 68,9932 70,6093 Tinggi 135,2706 133,8115 132,9546

        c. Perhitungan recovery Y = 1,0993 X + 3,6825 Replikasi I

         C1 = 19,94 ppm ; AUC = 1061629 26,5407 = 1,0993 X + 3,6825 X = 20,7934 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 104,2800%

        ,

         C2 = 59,82 ppm ; AUC = 2740328 68,5082 = 1,0993 X + 3,6825 X = 58,9700 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 98,5790%

        ,

         C3 = 119,64 ppm ; AUC = 5410825 135,2706 = 1,0993x + 3,6825 X = 119,7017 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 100,0516%

        , Replikasi II  C1 = 19,94 ppm ; AUC = 1071052

        26,7763 = 1,0993 X + 3,6825 X = 21,0077 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 105,3547%

        ,

         C2 = 59,82 ppm ; AUC = 2759729 68,9932 = 1,0993 X + 3,6825 X = 59,4112 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 99,3166%

        ,

         C3 = 119,64 ppm ; AUC = 5352459 133,8115 = 1,0993 X + 3,6825 X = 118,3744 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 98,9422%

        ,

        Replikasi III  C1 = 19,94 ppm ; AUC = 1048499

        26,2125 = 1,0993 X + 3,6825 X = 20,4948 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 102,7825%

        ,

         C2 = 59,82 ppm ; AUC = 2824730 70,6093 = 1,0993 X + 3,6825 X = 60,8812 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 101,7741%

        ,

         C3 = 119,64 ppm ; AUC = 5318183 132,9546 = 1,0993 X + 3,6825 X = 117,5949 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 98,2906 %

        ,

        2. Kafein

        a. Penimbangan bahan

        Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g)

      Berat kertas 0,2215 0,2185 0,2222

        0,2465 0,2435 0,2472 Berat kertas + zat

        0,2215 0,2185 0,2222 Berat kertas + sisa

      Berat zat 0,0250 0,0250 0,0250

        b. Data AUC/40000

        Level kadar kafein Replikasi I Replikasi II Replikasi III Rendah 12,6473 12,6848 12,3965

        31,8094 31,7891 33,3279 Sedang

        61,6322 61,0623 61,6574 Tinggi

        c. Perhitungan recovery Y = 1,018 X + 1,4254 Replikasi I

         C1 = 9,958 ppm ; AUC = 505890 12,6473 = 1,018 X + 1,4254 X = 11,0234 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 110,6992%

        ,

         C2 = 29,874 ppm ; AUC = 1272376 31,8094 = 1,018 X + 1,4254 X = 29,8468 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 99,9088%

        ,

         C3 = 59,748 ppm ; AUC = 2465288 61,6322 = 1,018 X + 1,4254 X = 59,1422 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 98,9861%

        , Replikasi II  C1 = 9,958 ppm ; AUC = 507390

        12,6848 = 1,018 X + 1,4254 X = 11,0603 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 111,0691%

        ,

         C2 = 29,874 ppm ; AUC = 1271565 31,7891 = 1,018 X + 1,4254 X = 29,8268 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 99,8421%

        ,

         C3 = 59,748 ppm ; AUC = 2442491 61,0623 = 1,018 X + 1,4254 X = 58,5824 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 98,0491%

        ,

        Replikasi III  C1 = 9,958 ppm ; AUC = 495860

        12,3965 = 1,018 X + 1,4254 X = 10,7771 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 108,2257%

        ,

         C2 = 29,874 ppm ; AUC = 1333117 33,3279 = 1,018 X + 1,4254 X = 31,3384 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 104,9020%

        ,

         C3 = 59,748 ppm ; AUC = 2466296 61,6574 = 1,018 X + 1,4254 X = 59,1670 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 99,0276%

        ,

        Lampiran 11. Kromatogram hasil spiking ke sampel Replikasi I

        a. Blanko sampel (tanpa adisi baku teobromin dan kafein)

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60)

        Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm b. Kadar Rendah (sampel dispike dengan teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada blanko sampel

        c. Kadar Sedang (sampel dispike dengan teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada blanko sampel d. Kadar Tinggi (sampel dispike dengan teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm) min

        Parameter KCKT sesuai gambar pada blanko sampel Lampiran 12. Kromatogram hasil spiking ke sampel Replikasi II

        a. Blanko sampel (tanpa adisi baku terobromin dan kafein) min

        Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm

        b. Kadar Rendah (sampel dispike dengan teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada blanko sampel c. Kadar Sedang (sampel dispike dengan teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada blanko sampel

        d. Kadar Tinggi (sampel dispike dengan teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm) min

        Parameter KCKT sesuai gambar pada blanko sampel

        Lampiran 13. Kromatogram hasil spiking ke sampel Replikasi III

        a. Blanko sampel (tanpa adisi baku terobromin dan kafein) min

        Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm

        b. Kadar Rendah (sampel dispike dengan teobromin 20 ppm dan kafein 10 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada blanko sampel

        c. Kadar Sedang (sampel dispike dengan teobromin 60 ppm dan kafein 30 ppm)

        min Parameter KCKT sesuai gambar pada blanko sampel d. Kadar Tinggi (sampel dispike dengan teobromin 120 ppm dan kafein 60 ppm) min

        Parameter KCKT sesuai gambar pada blanko sampel

      Lampiran 14. Data penimbangan dan perhitungan % recovery (spike sampel)

        1. Teobromin

        a. Penimbangan bahan

        Penimbangan Replikasi (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Berat kertas 0,2129 0,2149 0,2254 Berat kertas + zat

        0,2379 0,2396 0,2504 Berat kertas + sisa 0,2129 0,2146 0,2254 Berat zat 0,0250 0,0250 0,0250

        b. Data (AUC total – AUC blanko sampel)/40000

        Level kadar kafein Replikasi I Replikasi II Replikasi III Rendah 26,7601 26,8067 27,0552

        Sedang 68,7025 68,7649 69,0217

        

      Tinggi 130,8765 130,9756 129,8989 c. Perhitungan % recovery Y = 1,0993 X + 3,6825 ; AUC blanko = 707174 Replikasi I

         C1 = 19,94 ppm ; AUC total – AUC blanko = 1070405 26,7601 = 1,0993 X + 3,6825 X = 20,9930 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 105,2809%

        ,

         C2 = 59,82 ppm ; AUC total – AUC blanko = 2748099 68,7025 = 1,0993 X + 3,6825 X = 59,1467 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 98,8745%

        ,

         C3 = 119,64 ppm ; AUC total – AUC blanko = 5235059 130,8765 = 1,0993 X + 3,6825 X = 115,7045 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 96,7106%

        ,

        Replikasi II Y = 1,0993 X + 3,6825 ; AUC blanko = 713529

         C1 = 19,94 ppm ; AUC total – AUC blanko = 1072269 26,8067 = 1,0993 X + 3,6825 X = 21,0354 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 105,4935%

        ,

         C2 = 59,82 ppm ; AUC total – AUC blanko = 2750595 68,7649 = 1,0993 X + 3,6825 X = 59,2035 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 98,9694%

        ,

         C3 = 119,64 ppm ; AUC total – AUC blanko = 5239024 130,9756 = 1,0993 X + 3,6825

        ,

        % Recovery = x 100 % = 96,7859%

        ,

        Replikasi III Y = 1,0993 X + 3,6825 ; AUC blanko = 719884

         C1 = 19,94 ppm ; AUC total – AUC blanko = 1082208 27,0552 = 1,0993 X + 3,6825 X = 21,2614 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 106,6271%

        ,

         C2 = 59,82 ppm ; AUC total – AUC blanko = 2760867 69,0217 = 1,0993 X + 3,6825 X = 59,4371 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 99,3599%

        ,

         C3 = 119,64 ppm ; AUC total – AUC blanko = 5195954 129,8989 = 1,0993 X + 3,6825 X = 114,8152 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 95,9672%

        ,

        2. Kafein

        a. Penimbangan bahan

        Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Berat kertas 0,2130 0,2119 0,2251

        0,2380 0,2366 0,2501 Berat kertas + zat

        0,2130 0,2116 0,2251 Berat kertas + sisa Berat zat 0,0250 0,0250 0,0250

        b. Data (AUC total – AUC blanko sampel)/40000

        Level kadar kafein Replikasi I Replikasi II Replikasi III

      Rendah 12,4319 12,4282 12,5090

        31,4920 31,3711 31,5738 Sedang

        63,1191 62,7173 62,2212 Tinggi c. Perhitungan % recovery Replikasi I Y = 1,018 X + 1,4254 ; AUC blanko = 311234

         C1 = 9,958 ppm ; AUC total – AUC blanko = 497276 12,4319 = 1,018 X + 1,4254 X = 10,8119 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 108,5749%

        ,

         C2 = 29,874 ppm ; AUC total – AUC blanko = 1259681 31,4920 = 1,018 X + 1,4254 X = 29,5350 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 98,8652%

        ,

         C3 = 59,748 ppm ; AUC total – AUC blanko = 2524762 63,1191 = 1,018 X + 1,4254 X = 60,6028 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 101,4307%

        ,

        Replikasi II Y = 1,018 X + 1,4254 ; AUC blanko = 315153

         C1 = 9,958 ppm ; AUC total – AUC blanko = 497129 12,4282 = 1,018 X + 1,4254 X = 10,8083 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 108,5386%

        ,

         C2 = 29,874 ppm ; AUC total – AUC blanko = 1254843 31,43711 = 1,018 X + 1,4254 X = 29,4162 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 98,4675%

        ,

         C3 = 59,748 ppm ; AUC total – AUC blanko = 2508691

        X = 60,2081 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 100,7701%

        ,

        Replikasi III Y = 1,018 X + 1,4254 ; AUC blanko = 319071

         C1 = 9,958 ppm ; AUC total – AUC blanko = 500361 12,5090 = 1,018 X + 1,4254 X = 10,8876 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 109,3357%

        ,

         C2 = 29,874 ppm ; AUC total – AUC blanko = 1262951 31,5738 = 1,018 X + 1,4254 X = 29,6153 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 99,1340%

        ,

         C3 = 59,748 ppm ; AUC total – AUC blanko = 2488849 62,2212 = 1,018 X + 1,4254 X = 59,7208 ppm

        ,

        % Recovery = x 100 % = 99,9546%

        , Lampiran 15. Perhitungan Rentang % recovery dan CV

        a. Perhitungan rentang % recovery Rentang % recovery menurut Gonzales and Herrador (2007) adalah: 10 ppm = 80 – 110%

        100 ppm = 90 – 107% 1000 ppm = 95 – 105% Contoh perhitungan rentang % recovery untuk 30 ppm adalah:

        Selisih konsentrasi = 100 – 10 = 90 -

      • Selisih rentang bawah = 90 – 80 = 10

        Maka batas bawah = 80 + ( x 10) = 82,2% Selisih rentang atas = 107 – 100 = 3 - Maka batas atas = 110 - ( x 3) = 109,3% Jadi rentang % recovery untuk konsentrasi 30 ppm adalah 82,2 – 109,3%.

        NB : Perhitungan rentang % recovery untuk konsentrasi yang lain menyesuaikan dengan selisih dari konsentrasi dan batasan rentang yang diacu.

        b. Perhitungan CV Syarat untuk CV menurut AOAC dalam Gonzales and Herrador (2007) adalah: 10 ppm = 7,3%

        100 ppm = 5,3% 1000 ppm = 3,7% Contoh perhitungan syarat CV untuk 30 ppm adalah:

        Selisih konsentrasi = 100 – 10 = 90 - Selisih batasan CV = 7,3 – 5,3 = 2 - Maka batas bawah = 7,3 - ( x 20) = 6,8% Jadi syarat CV untuk konsentrasi 30 ppm adalah 6,8%.

        NB : Perhitungan syarat CV untuk konsentrasi yang lain menyesuaikan dengan selisih dari konsentrasi dan syarat CV yang diacu.

        Lampiran 16. Kromatogram Hasil Uji Kesesuaian Sistem

        a. Ripitasi 1

        min Fase diam : Kromasil C 18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µm Fase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60)

        Flow rate : 0,8 mL/menit Injeksi : 10 µL Detektor : UV-275 nm b. Ripitasi 2

        min Parameter KCKT sama dengan ripitasi 1

        c. Ripitasi 3

        min Parameter KCKT sama dengan ripitasi 1 d. Ripitasi 4

        min Parameter KCKT sama dengan ripitasi 1

        e. Ripitasi 5

        min Parameter KCKT sama dengan ripitasi 1

        

      Lampiran 17. Perhitungan Tailing factor (Tf), Column Plate Number (N), dan

      Resolusi (Rs) Teobromin h

        Kafein = W 1/2 = w 1 = a

        

      ½ h

      = b = w 2 min

        a. Contoh perhitungan Tailing factor

        

      , ,

        = = 1,36

      • Tf teobromin =

        

      ( , )

      , ,

        = = 1,41

      • Tf kafein =

        ( , )

        b. Contoh perhitungan nilai N (Column Plate Number)

        ,

        ) = 5,54 x ( ) = 529,2327

      • Nilai N teobromin = 5,54 x (
      • / , , ) = 5,54 x ( ) = 727
      • Nilai N kafein = 5,54 x (
      • / ,
      c. Contoh perhitungan Resolusi

        ( ) ( , , )

        Rs = = = 2,0565

        ( ) ( , , ) NB: perhitungan yang sama dilakukan pada kromatogram yang lainnya.

      BIOGRAFI PENULIS

        Penulis skripsi dengan judul “Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Kafein dan Teobromin Dalam Cokelat Bubuk Merk X” ini memiliki nama lengkap Monica Satya Resmi Yunita. Penulis dilahirkan di Klaten pada tanggal 8 Juni 1990 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara, dari pasangan Petrus Resmi Suseno dan Maria Goreti Nanis Intarti. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis yaitu TK Pertiwi Jurangbahas (1994-1996), SD Negeri 1 Jurangbahas (1996-2002), SLTP Negeri 1 Wangon (2002-2005), SMA Pangudi Luhur Van Lith Muntilan (2005-2008) dan pada tahun 2008 melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

        Yogyakarta. Selama kuliah, penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan kepanitiaan antara lain Sekretaris II Forum Komunikasi Mahasiswa Katolik Keuskupan Purwokerto (2008), Anggota UKF Voli Farmasi (2008), Peserta Seminar Herbal

        

      Medicine (2008), Peserta Talk-Show AIDS (2008), Pendamping Kelompok Titrasi

        (2009), Kepanitiaan Seminar Nasional Ilmiah (2009), Koordinator Pendamping Kelompok Titrasi (2010), Seksi Humas PpnEC (2010), Pengabdian Masyarakat Bersama Dosen (2011) dan Asisten praktikum Toksikologi Dasar (2011).

Dokumen baru

Tags

Dokumen yang terkait

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR SIKLAMAT PADA MINUMAN RINGAN DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI.
0
2
25
PENGEMBANGAN DAN UJI VALIDASI METODE ANALISIS KADAR PARASETAMOL DAN KAFEIN DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI.
8
47
28
VALIDASI METODE ANALISIS KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI UNTUK PENETAPAN KADAR AMOXICILIN DALAM PLASMA SECARA IN VITRO
0
0
8
METODE PENETAPAN KADAR MELOXICAM DALAM DARAH MANUSIA IN VITRO SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
0
1
14
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA PENETAPAN KADAR SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN
0
0
15
PENETAPAN KADAR SIMVASTATIN DALAM SEDIAAN TABLET SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI DENGAN FASE GERAK METANOL-AIR
0
0
16
VALIDASI METODE ANALISIS UNTUK PENETAPAN KADAR METFORMIN HCl DALAM TABLET FLOATING SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) - repository perpustakaan
1
1
17
ANALISIS CAMPURAN PARASETAMOL, PROPIFENAZON DAN KAFEIN DALAM TABLET DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
0
1
111
PENETAPAN KADAR CAMPURAN HIDROKORTISON ASETAT DAN KLORAMFENIKOL DALAM SEDIAAN KRIM TOPIKAL MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK SKRIPSI
0
0
100
Skripsi Berjudul OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASPARTAM DALAM MINUMAN SERBUK BERAROMA SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
0
1
130
VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR CAMPURAN PARASETAMOL DAN IBUPROFEN DENGAN PERBANDINGAN 7:4 MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
0
0
123
PENETAPAN KADAR CAMPURAN PARASETAMOL DAN IBUPROFEN DALAM TABLET MERK “X” DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK SKRIPSI
0
0
110
Persetujuan Pembimbing VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEMBAKAU
0
1
116
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS- DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR IBUPROFEN DAN PARASETAMOL DALAM TABLET MERK NEO-RHEUMACYL
0
0
107
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAM SEDIAAN KAPSUL LUNAK OBAT HERBAL TERSTANDAR MEREK RHEUMAKUR
1
1
111
Show more