Optimasi pemisahan campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek X menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik - USD Repository

Gratis

0
0
146
1 year ago
Preview
Full text

  

OPTIMASI PEMISAHAN CAMPURAN HIDROKORTISON ASETAT

DAN KLORAMFENIKOL DALAM KRIM MEREK “X”

MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

  

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

  Oleh: Henny Puspitasari

  NIM: 068114045

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

  

OPTIMASI PEMISAHAN CAMPURAN HIDROKORTISON ASETAT

DAN KLORAMFENIKOL DALAM KRIM MEREK “X”

MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

  

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

  Oleh: Henny Puspitasari

  NIM: 068114045

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

  Life is… Life is an opportunity, benefit from it Life is beauty, admire it

  Life is a dream, realize it Life is a challenge, meet it Life is a duty, complete it Life is a game, play it

  Life is a promise, fulfill it Life is a sorrow, overcome it Life is a song, sing it Life is a struggle, accept it

  Life is a tragedy, confront it Life is a adventure, dare it Life is a luck, make it Life is too precious, don’t destroy it

  Life is life, fight for it (Mother Theresa) Karya ini kupersembahkan bagi Kemuliaan Tuhan, Mama, Papa, kakak-kakakku yang luar biasa; teman-teman dan Almamaterku

KATA PENGANTAR

  Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang penuh kasih, hanya karena berkat dan kasih karunia-Nya maka skripsi yang berjudul “OPTIMASI PEMISAHAN CAMPURAN HIDROKORTISON ASETAT DAN KLORAMFENIKOL DALAM KRIM MEREK “X” MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK” ini dapat diselesaikan oleh penulis. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  Selama penyusunan skripsi ini, banyak pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikannya, maka pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktunya dalam memberikan masukan, kritik, solusi, semangat baik selama penelitian, penyusunan skripsi maupun saat perkuliahan dan telah membantu penulis dalam mendapatkan senyawa standar yang berguna dalam penelitian.

  3. Rini Dwi Astuti, M.Sc., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran, kritik dan semangat dalam penyusunan skripsi ini.

  4. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan masukan dan semangat baik selama penyusunan skripsi maupun dalam perkuliahan.

  5. Jeffry Julianus, M.Si. dan Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. atas saran dan diskusi yang telah diberikan dalam penyusunan skripsi.

  6. PT. Kalbe Farma, Tbk. yang telah bersedia memberikan senyawa standar yang berguna dalam penelitian.

  7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman yang berharga sehingga berguna dalam proses penyusunan skripsi.

  8. Happy Suryawan E.W., S.Farm. yang telah memberikan saran dan semangat dalam penyusunan skripsi.

  9. Oktavianus Tri Harjanto selaku teman seperjuangan selama penelitian dan penyusunan skripsi.

  10. Seluruh staf laboratorium kimia: Bimo, Kunto, Parlan, dan Kasiran yang telah membantu penulis selama penelitian di laboratorium.

  11. Hendro, Hendri, Hendra dan Hendiwan terimakasih telah menjadi kakak- kakak yang hebat bagi penulis.

  12. Novita Dewi atas semangat dan pengertian yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi.

  13. Lise Natalia atas pinjaman laporan yang sangat berguna selama perkuliahan, 14. Deden atas pinjaman printer warna.

  15. Marissa Winata, Vita Felicia, Handayani atas dukungan, kritik, masukan dan saran selama penelitian maupun kuliah.

  16. Yola, Adit, Nia, Lulu, Shinta, Yosephine, Lia Yumi, Ardani, Robby, Wilasto, Utami, Nika, Rico, Reni dan Linda sebagai teman yang sering satu kelompok telah memberikan pengetahuan, pengalaman berharga, dan semangat untuk ujian skripsi.

  17. Jimmy, Eka, Irene, Wiwit, Nisia, Yuvita, dan Bayu terima kasih atas pengalaman dan kebersamaanya.

  18. Teman-teman kos putri 9999 dan kos kana yang pernah menjadi teman seperjuangan di Yogyakarta.

  19. Teman-teman FST angkatan 2006 atas pengalaman dan kebersamaannya.

  20. Semua pihak yang telah membantu penulis dan tidak tertulis di sini, terima kasih atas semua bantuannya.

  Penulis menyadari bahwa skripsi yang disusun ini masih banyak memiliki kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran untuk perbaikan dan perkembangan selanjutnya. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat demi perkembangan ilmu pengetahuan.

  Yogyakarta, 2 November 2009 Penulis

  

Intisari

  Krim kloramfenikol dan hidrokortison asetat merupakan obat yang memiliki fungsi sebagai obat dermatitis dan anti infeksi. Kedua zat aktif tersebut dapat terdegradasi menjadi produk yang tidak diinginkan dalam penyimpanannya. Metode yang dapat digunakan untuk memisahkan sekaligus menetapkan kadar kedua zat aktif tersebut adalah metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik dengan detektor UV.

  Sistem KCKT yang digunakan adalah kolom Kromasil-100 C 250 x 4,6

  18

  mm, 5µm, fase gerak campuran metanol-aquabides dengan menggunakan detektor UV pada 255 nm. Parameter yang dioptimasi adalah komposisi fase gerak yaitu metanol-aquabides dan flow rate. Hasil penelitian menunjukkan kondisi pemisahan yang baik dicapai pada fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) dengan flow rate 1,2 ml/menit. Semua komponen terpisah baik dalam waktu analisis kurang dari 10 menit.

  Parameter validasi yang diteliti meliputi akurasi, presisi, linearity, spesifisitas, Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ). Hasil penelitian menunjukkan metode memiliki linearity yang baik pada konsentrasi 10

  • – 70 ppm untuk kloramfenikol (r = 0,9998) dan 12,5 – 87,5 ppm untuk hidrokortison asetat (r = 0,9999). Recovery dan CV untuk kadar rendah, sedang dan tinggi berturut-turut dari kloramfenikol adalah 100,5 %, 1,00 % ; 100,53 %, 0,79 % ; 100,00 %, 1,47 % dan untuk hidrokortison asetat adalah 100,47%, 1,14 % ; 99,44 %, 1,34 % ; dan 99,63 %, 0,62 %. Nilai LOD dan LOQ untuk kloramfenikol 1,28 ; 4,28 ppm dan hidrokortison asetat 1,44 ; 4,81ppm. Kata kunci : hidrokortison asetat, kloramfenikol, KCKT, validasi

  

Abstract

  Chloramphenicol and hydrocortisone acetate cream are possessed of dermatitis and antiinfection functions. The both active ingredients can be degradated to unwanted product in storage. The method that can be use for separating and quantifying those two active ingredient is Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with UV detector.

  The HPLC system were Kromasil-100 C

  18 250 x 4.6 mm, 5 µm column,

  mobile phase of methanol-water and UV detector at 255 nm. Optimizing parameters were mobile phase; methanol-water composition and flow rate. The result show conditions to get a good separation were methanol : water (63 : 35 v/v) mobile phase with the flow rate 1.2 ml/menit. All the component were fully resolved in less than 10 minutes.

  Validation parameters studied included accuracy, precision, sensitivity, Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantitation (LOQ). The research result showed that the method have good linearity in the range 10 – 70 ppm for chloramphenicol (r = 0.9998) and 12.5 – 87.5 ppm for hydrocortisone acetate (r = 0.9999). The recovery and CV of low, medium and high consentration were 100.5 %, 1.00 % ; 100.53 %, 0.79 % ; 100.00 %, 1.47 % for chloramphenicol and 100.47 %, 1.14% ; 99.44 %, 1.34 % ; 99.63, 0.62 % for hydrocortisone acetate.

  Value of LOD and LOQ were 1.28 ; 4.28 ppm for chloramphenicol dan 1.44 ; 4.81 ppm for hydrocortisone acetate.

  Keywords: hydrocortisone acetate, chloramphenicol, HPLC, validaton

  

DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL ..................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................ v KATA PENGANTAR .................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... ix

  INTISARI ...................................................................................................... x

  

ABSTRACT .................................................................................................... xi

  DAFTAR ISI ................................................................................................. xii DAFTAR TABEL ......................................................................................... xvi DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xvii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xx

  1 BAB I PENGANTAR ..................................................................................

  A. Latar Belakang ..................................................................................

  1 1. Permasalahan...............................................................................

  3 2. Keaslian Penelitian ......................................................................

  4 3. Manfaat Penelitian ......................................................................

  4 B. Tujuan Penelitian ..............................................................................

  4

  BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .........................................................

  5 A. Hidrokortison Asetat .........................................................................

  5 B. Kloramfenikol ...................................................................................

  7 1. Antibiotik ....................................................................................

  7 2. Sifat Kimia ..................................................................................

  8 C. Krim ..................................................................................................

  9 D. Spektrofotometer UV ........................................................................

  10 E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ....................................................

  13 1. Kromatografi Partisi Fase Terbalik .............................................

  13 2. Pemisahan Puncak dalam Kromatografi .....................................

  15 3. Analisis Kualitatif dan Analisis Kuantitatif ................................

  22 F. Kesahihan Metode Analisis Instrumental .........................................

  23 1. Akurasi ........................................................................................

  23 2. Presisi ..........................................................................................

  23 3. Linieritas .....................................................................................

  24 4. Spesifisitas ..................................................................................

  24 G. Landasan Teori ..................................................................................

  25 H. Hipotesis ...........................................................................................

  25 BAB III METODE PENELITIAN ............................................................

  26 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................

  26 B. Variabel Penelitian ............................................................................

  26 1. Variabel Utama ...........................................................................

  26

  2. Variabel Pengacau Terkendali ....................................................

  26 C. Bahan-bahan Penelitian .....................................................................

  27 D. Alat-alat Penelitian ............................................................................

  27 E. Tata Cara Penelitian ..........................................................................

  28 1. Optimasi Metode KCKT .............................................................

  28 2. Verifikasi sistem KCKT ..............................................................

  30 3. Validasi Metode ..........................................................................

  31 F. Analisis Hasil ...................................................................................

  33 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................

  34 A. Optimasi Metode ..............................................................................

  34 1. Penentuan panjang gelombang overlapping ..............................

  34

  2. Pengamatan waktu retensi hidrokortison asetat dan kloramfenikol baku .....................................................................

  36

  3. Pengamatan waktu retensi hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam sampel .......................................................

  41 4. Optimasi fase gerak .....................................................................

  43 B. Verifikasi Sistem KCKT Hasil Optimasi ..........................................

  55 1. Verifikasi sistem injeksi ..............................................................

  55 2. Uji kesesuaian sistem ..................................................................

  56 3. Verifikasi pompa .........................................................................

  57 C. Pembuatan Kurva Baku.....................................................................

  58

  D. Validasi Metode Penetapan Kadar Hidrokortison Asetat dan Kloramfenikol ...................................................................................

  62 1. Linearity ......................................................................................

  62 2. Kecermatan (akurasi) ..................................................................

  62 3. Keseksamaan (presisi) .................................................................

  64 4. Spesifisitas .................................................................................

  64 5. Batas deteksi dan batas kuantitasi ...............................................

  65 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................

  66 A. Kesimpulan .......................................................................................

  66 B. Saran ..................................................................................................

  67 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................

  68 LAMPIRAN ..................................................................................................

  72 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 126

  DAFTAR TABEL Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT ..........................

  14 Tabel II. Pemisahan yang diinginkan dalam metode KCKT ...............

  23 Tabel III. Hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 : 40) ................................................................

  47 Tabel IV. Hasil optimasi komposisi fase gerak pada flow rate 2 ml/menit ................................................................................

  53 Tabel V. Hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (65 : 35) ................................................................

  53 Tabel VI. Hasil uji kesesuaian sistem dan verifikasi presisi sistem injeksi KCKT .............................................................

  56 Tabel VII. Nilai persen penyimpangan flow rate pada uji akurasi pompa ....................................................................................

  58 Tabel VIII. Data kurva baku kloramfenikol .............................................

  59 Tabel IX. Data kurva baku hidrokortison asetat ....................................

  60 Tabel X. Hasil penetapan recovery dan CV hidrokortison asetat .........

  63 Tabel XI. Hasil penetapan recovery dan CV kloramfenikol..................

  63

  DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Rumus struktur hidrokortison asetat .....................................

  5 Gambar 2. Rumus struktur kloramfenikol ..............................................

  8 Gambar 3. Pemisahan dua senyawa ........................................................

  16 Gambar 4. Difusi Eddy ...........................................................................

  19 Gambar 5. Transfer massa fase diam ......................................................

  20 Gambar 6. Transfer massa fase gerak .....................................................

  20 Gambar 7. Penentuan peak asymmetry dan peak tailing factor .............

  21 Gambar 8. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam ..................

  21 Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom kloramfenikol dan hidrokortison asetat ...............................................................

  34 Gambar 10. Spektra panjang gelombang maksimum hidrokortison asetat dan kloramfenikol .......................................................

  35 Gambar 11. Ikatan hidrogen antara kloramfenikol dengan fase gerak metanol : aquabides ...............................................................

  37 Gambar 12. Ikatan hidrogen antara hidrokortison asetat dengan fase gerak metanol : aquabides .....................................................

  37 Gambar 13. Gugus nonpolar kloramfenikol .............................................

  38 Gambar 14. Gugus nonpolar hidrokortison asetat ...................................

  38 Gambar 15. Kromatogram waktu retensi kloramfenikol baku dengan fase gerak dan flow rate hasil optimasi .................................

  39

  Gambar 16. Kromatogram waktu retensi kloramfenikol dan hidrokortison asetat dengan fase gerak dan flow rate hasil optimasi ........................................................................

  40 Gambar 17. Kromatogram sampel ditambah baku kloramfenikol ............

  41 Gambar 18. Kromatogram waktu retensi sampel dengan fase gerak dan flow rate hasil optimasi ..................................................

  43 Gambar 19. Sturktur hidrokortison dan hidrokortison asetat ....................

  45 Gambar 20. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap kedua ........

  46 Gambar 21. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap ketiga .......

  48 Gambar 22. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap keempat ....

  49 Gambar 23. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,8 ml/menit ...........................................................

  50 Gambar 24. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,6 ml/menit ...........................................................

  50 Gambar 25. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,4 ml/menit ...........................................................

  51 Gambar 26. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,2 ml/menit ...........................................................

  51 Gambar 27. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,0 ml/menit ...........................................................

  52 Gambar 28. Kurva flow rate vs HETP dengan fase gerak metanol : aquabides (65 :35) .................................................................

  54 Gambar 29. Kurva teori Van Deemter ......................................................

  54

  Gambar 30. Hubungan antara konsentrasi kloramfenikol dengan AUC / 10000 (replikasi I) .....................................................

  60 Gambar 31. Hubungan antara konsentrasi hidrokortison asetat dengan AUC / 15000 (replikasi I) .........................................

  61

  DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Sertifikat analisis hidrokortison asetat ...............................

  73 Lampiran 2. Sertifikat analisis kloramfenikol ........................................

  74 Lampiran 3. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kloramfenikol .....................................................................

  75 Lampiran 4. Kromatogram baku kloramfenikol .....................................

  76 Lampiran 5. Contoh perhitungan N, HETP dan Rs ................................

  77 Lampiran 6. Kromatogram hasil penurunan flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 : 40 v/v) .......................................

  78 Lampiran 7. Kromatogram hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) .......................................

  81 Lampiran 8. Kromatogram dan hasil penetapan presisi injeksi ..............

  90 Lampiran 9. Kromatogram kurva baku hidrokortison asetat dan kloramfenikol replikasi I .................................................... 101 Lampiran 10. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku .................................................................................... 108 Lampiran 11. Kromatogram hasil validasi metode................................... 110 Lampiran 12. Data penimbangan dan contoh perhitungan penetapan recovery............................................................. 119 Lampiran 13. Contoh perhitungan LOD dan LOQ ................................... 123

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Hidrokortison asetat merupakan obat dermatitis dengan tingkat potensi

  lemah yang sering digunakan masyarakat. Jika pada dermatitis tersebut ditemukan adanya infeksi bakteri, maka dapat diberikan antibiotik (Anonim, 2006).

  Kombinasi obat dermatitis dan antibiotik akan memberikan penyembuhan yang sukses tanpa menyebabkan komplikasi (Orosz et al., 2007). Salah satu antibiotik yang digunakan bersamaan dengan obat dermatitis adalah kloramfenikol.

  Pada penyimpanan lama hidrokortison asetat akan terurai menjadi senyawa turunannya yaitu hidrokortison dan kortison asetat (Hajkova et al., 2003). Chauhan dan Conway (2005) menyatakan bahwa produk degradasi hidrokortison alkohol juga dapat terjadi dalam sediaan farmasi.

  Kloramfenikol merupakan antimikroba spektrum luas yang efektif terhadap bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Mekanisme kerjanya adalah menghambat sintesis protein sel mikroba (Anonim, 2009b). Kloramfenikol dalam penyimpanannya dapat terdegradasi membentuk produk-produk yang tidak diinginkan. Produk degradasi kloramfenikol pada berbagai pH (1-14) yang paling banyak dijumpai adalah produk oksidasi: p-nitrobenzaldehid, produk reduksi: arilamin (Shih, 1979) dan produk hidrolisis: 2-amino-1-(4-nitrophenyl)-propane- 1,3-diol (Khalil et al, 1993). Penetapan kadar hidrokortison dan kloramfenikol dalam sediaan tetes telinga dengan metode KCKT fase terbalik pernah dilakukan oleh Li X (1998). Fase diam yang digunakan adalah kolom YWG-C

  18 150 x 5 mm, 5 µm dan fase gerak metanol : aquabides (60 : 40).

  Hal yang membedakan penelitian ini dengan penelitian Li X (1998) antara lain: dalam penelitian ini akan ditetapkan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol sedangkan Li X hidrokortison dan kloramfenikol, sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah krim sedangkan Li X tetes telinga, merek kolom yang digunakan dalam penelitian ini adalah Kromasil dengan panjang 25 cm sedangkan Li X menggunakan kolom YWG dengan panjang 15 cm. Adanya perbedaan tersebut menyebabkan metode Li X tidak dapat digunakan untuk penetapan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim karena kondisi optimal pada penelitian Li X belum tentu memberikan kondisi optimal pada penelitian ini. Hal tersebut menjadi dasar dilakukannya penelitian optimasi pemisahan kedua senyawa tersebut dengan dengan fase gerak campuran metanol dan aquabides untuk mendapatkan kondisi optimal dan metode tervalidasi yang dapat menetapkan kadar kedua komponen tersebut secara simultan.

  Validasi metode merupakan proses yang dilakukan melalui penelitian laboratorium untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode itu memenuhi persyaratan aplikasi analitik yang dimaksudkan. Jenis karakteristik kinerja metode yang perlu dipertimbangkan dalam validasi meliputi akurasi, presisi, spesifisitas, limit deteksi, limit kuantitasi, linearity, range dan robustness (Anonim, 2007). Metode KCKT fase terbalik dipilih karena dengan metode ini diharapkan dapat dilakukan untuk pemisahan kloramfenikol dan hidrokortison asetat sekaligus penetapan kadar tiap zat aktif tersebut dalam campuran.

  1. Permasalahan

  Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat disusun permasalahan sebagai berikut: a. Apakah terdapat kondisi yang optimal untuk memisahkan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” secara simultan dengan metode KCKT fase terbalik menggunakan kolom C

  18 dan fase gerak

  campuran metanol-aquabides?

  b. Apakah metode KCKT fase terbalik yang digunakan untuk pemisahan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” secara simultan memiliki validitas yang baik?

  2. Keaslian Penelitian

  Metode analisis multikomponen dari campuran hidrokortison dan kloramfenikol dalam tetes telinga pernah dilakukan oleh Li X dengan metode KCKT dengan menggunakan kolom YWG-C column (5µm, 5 mm x 150 mm)

  18 o

  pada suhu 30 C dan fase gerak metanol : aquabides (60 : 40). Namun optimasi penetapan kadar campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim dengan metode KCKT menggunakan kolom Kromasil-C

  18 100 250 x 4,6 mm i.d., 5 µm dan fase gerak campuran aquabides dan metanol belum pernah dilakukan.

3. Manfaat Penelitian

  a. Manfaat metodologis. Dapat menghasilkan sumbangan ilmiah mengenai metode pemisahan hidrokortison asetat dan kloramfenikol secara simultan.

  b. Manfaat praktis. Dapat digunakan sebagai metode untuk analisis campuran multikomponen hidrokortison asetat dan kloramfenikol.

B. Tujuan Penelitian

  1. Mengetahui kondisi yang optimal untuk memisahkan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” menggunakan fase gerak campuran metanol-aquabides secara simultan dengan metode KCKT.

  2. Mengetahui validitas metode KCKT fase terbalik yang digunakan untuk pemisahan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” secara simultan.

  

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Hidrokortison Asetat

Hidrokortison asetat (Gambar 1) adalah suatu senyawa antiradang dari

  golongan kortikosteroid yang sangat efektif untuk pengobatan pada kulit. Pada penyakit kulit yang disebabkan oleh alergi, krim hidrokortison asetat akan segera memberi efek berkurangnya: radang, rasa gatal dan sakit (Anonim, 2009a). HO O HO O O O

H H

H

  Gambar 1. Rumus struktur hidrokortison asetat

  Hidrokortison asetat mengandung tidak kurang dari 97,0% dan tidak lebih dari 102,0% C

23 H

  32 O 6 , dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Serbuk

  hablur putih hingga praktis putih, tidak berbau. Hidrokortison asetat dalam metanol memberikan serapan maksimum pada λ 242 nm (Anonim, 1995). Satu mg hidrokortison asetat dapat larut dalam 100 ml air dan 3,9 mg dapat larut dalam 1 ml metanol (Anonim, 1989). Hidrokortison asetat dapat diekstraksi dari larutan netral dengan menggunakan etil asetat yang baru didistilasi (Clarke, 1986).

  Hidrokortison asetat dalam sediaan farmasi akan terdegradasi menjadi hidrokortison alkohol. Metode KCKT telah dilakukan untuk mengukur kadar hidrokortison asetat, hidrokortison alkohol, metil paraben dan propil paraben memiliki selektivitas dan spesifisitas adalah Zorbax SB-Phenyl. Analisis dilakukan dalam waktu kurang dari 15 menit dengan fase gerak campuran aquabides dan metanol (40 : 60 v/v) menggunakan detektor UV pada 254 nm (Chauhan dan Conway, 2005).

  Penetapan kadar hidrokortison asetat dan turunannya pernah dilakukan oleh Kamata et al (1982) menggunakan sitem KCKT fase normal dengan fase diam Zorbak SIL Column dan fase gerak etanol : kloroform : heksan (1 : 2 : 7).

  

Linearity metode ditunjukkan pada range kadar 0,01-0,1 µg dan nilai recovery

(dengan metode standar adisi) sebesar 91,0-98,2 %.

  Analisis hidrokortison asetat dalam sediaan farmasi menggunakan metode spektrofotometri kinetik dengan partial least-squares regression pernah dilakukan oleh Blanco et al. (1999). Metode ini memiliki akurasi dan presisi yang baik, namun metode ini tidak praktis dan memerlukan waktu yang cukup lama.

  Metode kolorimetri juga dapat digunakan untuk menetapkan kadar hidrokortison asetat, yaitu melalui reaksi dengan fenilhidrazin dalam suasana asam selama 20 menit pada suhu 60

  C. Senyawa berwarna yang terbentuk diukur pada 410 nm (Bartos dan Pesez, 1979).

  Penetapan kadar hidrokortison asetat, produk degradasinya yaitu hidrokortison dan kortison asetat serta metil paraben dan propil paraben dalam krim topikal dengan menggunakan dexametason sebagai internal standar telah dilakukan dengan menggunakan metode KCKT. Sistem KCKT yang digunakan adalah kolom 5 µm SUPELCO Discovery C 125 x 4 mm i.d. dan fase gerak

  18 campuran metanol, asetonitril, dan aquabides (15 : 27 : 58 v/v) dengan waktu analisis kurang dari 13 menit (Hajkova et al., 2003).

  Penetapan kadar kortikosteroid pernah dilakukan oleh Singh dan Verma (2008) dengan metode spektrofotometri visibel. Metode ini menggunakan Fe (III) sebagai agen pengoksidasi kortikosteroid sehingga akan dihasilkan Fe (II) yang kemudian akan dikompleksasi dengan potassium heksasianoferat membentuk warna biru hijau yang akan diukur absorbansinya pada 780 nm. Nilai standar deviasi dari metode ini berkisar antara 0,03-1,06 %. Metode ini dikatakan memiliki akurasi dan presisi yang baik serta waktu analisis yang cepat.

B. Kloramfenikol

1. Antibiotik

  Antibiotik adalah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba terutama fungi, yang dapat menghambat atau membasmi mikroba jenis lain. Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antibiotik yang bersifat menghambat pertumbuhan mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakteriostatik dan ada yang bersifat membunuh mikroba dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Sifat antibiotik dapat berbeda satu dengan yang lain (Ian, 1995). Kloramfenikol merupakan antibiotik yang pertama kali ditemukan dan bersifat bakteriostatik (Anonim, 2009c).

  Kloramfenikol aktif baik terhadap bakteri Gram positif maupun bakteri Gram negatif (Ian, 1995), Rickettsia, Mycoplasma, Chlamydia, dan Chlamydophila spp (Anonim, 2009c).

2. Sifat kimia

  Kloramfenikol (Gambar 2) adalah senyawa antimikroba yang bekerja dengan cara menghambat sintesis protein mikroba (Anonim, 2009b). OH OH Cl Cl O NH O O N

  Gambar 2. Rumus struktur kloramfenikol

  Kloramfenikol berbentuk serbuk hablur halus berbentuk jarum atau lempeng memanjang, putih hingga putih kelabu atau putih kekuningan, stabil dalam larutan netral atau larutan sedikit asam (Anonim, 1995). Serapan 1cm tebal larutan dengan konsentrasi 0,002 % b/v dalam air pada 278 nm adalah 0,58 sampai 0,61 (Anonim, 1979). Kloramfenikol sangat larut dalam metanol dan setiap 2,5 mg kloramfenikol larut dalam 1 ml air (Anonim, 1989). Kloramfenikol memiliki berat molekul 323,1; pKa 5,5; kelarutan dalam alkohol 1 : 2-5; dalam air 1 : 400; koefisien partisinya 12, memiliki pH antara 4,5-7,5. Larutan kloramfenikol stabil bila tidak terkena cahaya. Kloramfenikol dalam etanol mempunyai λmaks pada 271 nm (E 1%,1cm = 178) (Clarke, 1986).

  Proses degradasi kloramfenikol yang sering terjadi adalah hidrolisis, terdegradasi oleh cahaya dan oksidasi (Boer dan Pijnenburg, 1983). Penetapan kadar kloramfenikol dan produk hidrolisisnya pernah dilakukan oleh Khalil et al. dengan menggunakan KCKT fase terbalik. Metode tersebut dikatakan lebih baik dari pada metode yang disarankan oleh British Pharmacepoeia karena memiliki

  Penetapan kadar deksametason, deksametason sodium fosfat dan kloramfenikol telah dilakukan dengan metode KCKT menggunakan kolom Shim- Pack CLC-ODS (6,0 x 150 mm) dan fase gerak terdiri dari campuran larutan bufer natrium dihidrogen fosfat, asetonitril dan metanol dengan perbandingan 1,73 : 1,16 : 1 (Iqbal et al., 2006).

  Analisis kloramfenikol dalam berbagai bentuk sediaan obat pernah dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri. Titanium (III) klorida digunakan untuk mereduksi kloramfenikol kemudian senyawa hasil reduksi tersebut dikopling menggunakan p-dimetilaminobenzaldehid dan diukur pada panjang gelombang 440 nm (Eboka et al., 2003).

C. Krim

  Krim adalah bentuk sediaan setengah padat mengandung satu atau lebih bahan obat terlarut atau terdispersi dalam bahan dasar. Istilah ini secara tradisional telah digunakan untuk sediaan setengah padat yang mempunyai konsistensi relatif cair diformulasi sebagai emulsi air dalam minyak atau minyak dalam air.

  Sekarang ini batasan tersebut lebih diarahkan untuk produk yang terdiri dari emulsi minyak dalam air atau disperse mikrokristal asam-asam lemak atau alkohol berantai panjang dalam air, yang dapat dicuci dengan air dan lebih ditujukan untuk penggunaan kosmetik dan estetika (Anonim, 1995).

  Stabilitas krim rusak, jika terganggu sistem campurannya terutama disebabkan oleh perubahan suhu dan perubahan komposisi yang disebabkan penambahan salah satu fase krim secara berlebihan atau pencampuran dua tipe krim yang zat pengemulsinya tidak saling campur satu dengan yang lainnya. Zat pengemulsi yang digunakan disesuaikan dengan jenis dan sifat krim yang dikehendaki. Zat pengemulsi yang dapat digunakan antara lain: emulgid, Lemak Bulu Domba, setaseum, setilalkohol, stearialkohol, trietanolamin stearat dan golongan sorbitan, polisorbat, polietilenglikol, sabun. Zat pengawet yang sering digunakan antara lain: metil paraben dan propil paraben (Anonim, 1979).

  Untuk membuat krim digunakan zat pengemulsi, umumnya berupa surfaktan-surfaktan anionik (eter alcohol sulfat, alkil sulfat, dan sulfosuccinates), kationik (quarternary ammonium compounds) dan ninionik (lanolin , polysorbate, sorbitan ester, polyoxyethilated (POE) alkyl phenols, dan sebagainya) (Anief, 2003).

D. Spektrofotometer UV

  Spektroskopi adalah salah satu teknik analisis fisiko-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik (REM). Spektrofotometri ultraviolet adalah salah satu teknik analisis spektroskopi yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995). Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektra dengan panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan yang diabsorbsi (Khopkar, 1990).

  Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan atas interaksi yang terjadi antara radiasi elektromagnetik dengan atom atau molekul. Adanya interaksi tadi menyebabkan terjadinya perpindahan energi dari sinar radiasi ke molekul yang disebut absorbsi. Akibat absorbsi radiasi elektromagnetik oleh molekul tersebut maka akan terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektron antibonding. Ada empat tipe transisi elektronik yang mungkin

  terjadi yaitu , n , n )

  σ→σ →σ →π , dan π →π . Eksitasi elektron (σ →σ memberikan energi yang terbesar dan terjadi pada daerah ultraviolet jauh yang ) diberikan oleh ikatan tunggal, misalnya alkana. Eksitasi elektron (π →π

  • diberikan oleh ikatan rangkap dua dan tiga, juga terjadi pada daerah ultraviolet jauh. Eksitasi elektron (n ) terjadi juga pada gugus karbonil (dimetil keton dan
  • asetaldehid) yang terjadi pada daerah ultraviolet jauh (Mulya dan Suharman, 1995).

  →σ

  →π

  • Transisi elektronik yang berguna dalam penelitian adalah transisi n karena memberikan spektra pada 200-700 nm. Kedua transisi ini dan π→π
  • membutuhkan adanya kromofor dalam struktur molekulnya, yaitu suatu gugus fungsional tidak jenuh yang menyediakan orbital

  π yang dapat menyerap pada daerah ultraviolet (Skoog, 1985).

  Selain kromofor, dikenal juga istilah auksokrom yaitu merupakan gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum, cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor (Sastrohamidjojo, 2001). Gugus auksokrom paling sedikit memiliki sepasang elektron bebas yang dapat berinteraksi dengan elektron π, misalnya -OH, -NH (Skoog, 1985).

2 Spektrofotometer ultraviolet melibatkan energi elektronik yang cukup

  besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer ultraviolet lebih banyak untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Analisis kuantitatif selalu melibatkan pembacaan serapan radiasi elektromagnetik oleh molekul yang dikenal dengan absorban (A) tanpa satuan atau radiasi elektromagnetik yang diteruskan yang dikenal dengan transmitan dengan satuan persen (% T). Bouger, Lambert, dan Beer membuat formula secara matematik hubungan antara transmitan atau absorban terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang mengabsorbsi sebagai :

  I t

−Є C b

  T = = 10 (1)

  I

1 A = log = (2)

  ε. C. b

  T Dimana T = persen transmitan I = intensitas radiasi yang datang

  I = intensitas radiasi yang diteruskan t -1 -1 cm ) ε = daya serap molar (L mol -1 C = konsentrasi (mol L ) b = tebal larutan (cm) A = serapan/absorbansi

  (Mulya dan Suharman, 1995).

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

  Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan secara cepat dengan bantuan tekanan, dan hasilnya dideteksi dengan instrumen (Willard et al., 1988). Pada akhir tahun 1970, perkembangan instrumen ini dapat menghasilkan pemisahan yang baik atau menghasilkan penampilan peak yang baik sehingga sistem ini lebih dikenal dengan KCKT (Kromidas, 2000).

  KCKT merupakan teknik analisis yang paling sering digunakan dalam analisis farmasi untuk pemisahan, identifikasi dan determinasi dalam campuran yang kompleks (Skoog et al., 1998).

1. Kromatografi partisi fase terbalik

  Menurut Gritter et al. (1991), konsep pada pengembangan kromatografi cair partisi yaitu perlakuan sampel dalam kondisi cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat. Jika solut ditambahkan ke dalam kondisi yang terdiri atas dua pelarut yang tidak bercampur dan keseluruhan kondisi dibiarkan seimbang, solut akan tersebar antara kedua fase itu menurut persamaan:

  

Cs

  K = (3)

  

Cm

  K adalah koefesien distribusi, Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam dan Cm adalah konsentrasi solut dalam fase gerak (Skoog et al., 1998).

  Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pemilihan metode kromatografi partisi fase balik adalah: a. Kolom. Kolom yang digunakan pada jenis kromatografi ini adalah kemasan fase terikat. Fase diam yang biasa digunakan pada kromatografi partisi fase balik adalah oktadesilsilan (ODS). Selain ODS, dikenal pula silika dengan substitusi oktil (C8) (Munson, 1991).

  b. Fase gerak.

  Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT

  Fase gerak pada KCKT sangat berpengaruh pada tambatan sampel dan pemisahan komponen dalam campuran. Pada fase terbalik, kandungan utama fase geraknya adalah air. Pelarut yang dapat campur dengan air seperti metanol, etanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran ditambahkan untuk mengatur kepolaran fase gerak. Karakteristik beberapa pelarut yang sering digunakan pada KCKT disajikan pada tabel I.

  Pelarut Indek polaritas Nilai eluentropik UV Cut-off (nm) Alumina C18 Silika Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195 Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200

  Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284 Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212 Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256 Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330

  Metanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205 Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190 Dimetilformamida 6,4 - 7,6 - 268 Dimetilsulfoksida 7,2 0,62 - - 268

  Air 10,2 - - - 190

  (Snyder et al., 1997)

  c. Detektor. Detektor yang baik hendaknya memiliki kepekaan tinggi, rentang respon liniernya lebar, tidak dipengaruhi perubahan suhu dan aliran, memberikan hasil dengan keterulangan yang baik, dan tidak banyak noise. Secara umum detektor dibagi menjadi 2 kategori, yaitu: 1) Bulk property detectors, merupakan detektor yang mengukur perubahan sifat fisik fase gerak dan solut. Detektor tipe ini cenderung relatif tidak sensitif dan menghendaki suhu yang terkendali. Contoh detektor jenis ini yaitu detektor indeks bias.

  2) Solut property detectors,

  merupakan detektor yang hanya mengukur sifat fisik solut. Detektor tipe ini 1000 kali lebih sensitif dan mampu mengukur solut sampai satuan nanogram atau lebih kecil lagi. Contoh detektor jenis ini yaitu detektor fluoresensi, detektor penyerapan (UV-Vis), dan detektor elektrokimia (Munson, 1991).

2. Pemisahan puncak dalam kromatografi

  Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari kemampuan kolom dalam memisahkan senyawa. Kolom yang efisien mencegah pelebaran puncak atau menghasilkan puncak yang sangat sempit (Johnson dan Stevenson, 1978).

  Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari 2 puncak. Daya pisah (R), dapat diukur dengan persamaan: R =

  (t R 2 −t R 1 )1 2 �(w 1

  =

  2 Δt w 1 +w 2

  (4) Nilai t

  • w
  • 2

    )

      R2

      dan t

      R1

      adalah waktu retensi senyawa, diukur pada titik maksimum puncak dan Δt adalah selisih antara t

      R2 dan t R1. Nilai w 2 dan w 1 adalah lebar alas puncak. Pemisahan dua senyawa dapat digambarkan sebagai berikut (Gambar 3):

      

    Gambar 3. Pemisahan dua senyawa (Johnson dan Stevenson, 1978)

      Nilai R >1,5 disebut baseline resolution, yaitu pemisahan sempurna dari dua puncak dengan ukuran yang sama. Dalam praktiknya, pemisahan dengan nilai R= 1,0 (kedua puncak berhimpit lebih kurang 2%) dianggap memadai (Pescok et al., 1976).

      Pemisahan puncak-puncak dalam kromatografi erat hubungannya dengan efisiensi kolom. Pada efisiensi kolom terdapat dua teori yang menjelaskan mengenai pemisahan puncak pada kromatografi, yaitu:

      a. Teori lempeng Dalam teori lempeng dinyatakan bahwa kolom kromatografi digambarkan sebagai suatu seri lapisan tipis horizontal yang disebut lempeng teoritis. Setiap molekul analit akan mengalami keseimbangan dalam fase diam dan fase gerak. Pemisahan akan lebih baik jika terjadi keseimbangan berkali-kali dalam jumlah yang tinggi. Hal ini terjadi jika jumlah lempeng teoritis juga tinggi.

      Oleh karena itu, jumlah teoritis juga dapat digunakan sebagai ukuran efisiensi kolom (Noegrohati, 1994). Hubungan antara waktu retensi (t ), lebar alas peak

      R

      (W), dan jumlah lempeng teoritik (N) dapat dinyatakan dengan persamaan (Johnson dan Stevenson, 1978):

      2

      2 t t

    R R

      N = 16 = 5,54 (5) � � � �

      w W 1/2

      Bilangan lempeng teoritis (N) berbanding lurus dengan panjang kolom (L). Karena panjang kolom yang bermacam-macam, maka diperlukan ukuran koefisien kolom yang tidak tergantung pada panjang kolom. HETP (Height

      

    Equvalent to a Theoretical Plate) atau H merupakan ukuran koefisien kolom yang

      lebih disukai karena memungkinkan perbandingan antara kolom yang panjangnya berlainan, yang dapat diukur dengan persamaan (Munson, 1991):

      L

      H = HETP = (6)

      N

      b. Teori laju Teori lempeng hanya menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif, tetapi tidak dapat menggambarkan pengaruh variabel-variabel lain yang menyebabkan terjadinya pelebaran peak, oleh karena itu perlu diketahui teori laju. Pada waktu migrasi, solut mengalami transfer dalam fase diam dan fase gerak berkali-kali. Solut hanya dapat bergerak jika berada dalam fase gerak sehingga migrasi di dalam kolom juga tidak teratur dan mengakibatkan laju rata-rata solut relatif terhadap fase gerak juga sangat bervariasi, sehingga terjadi pelebaran peak solut (Noegrohati, 1994).

      Menurut teori laju ini, efisiensi kolom dinyatakan dengan persamaan Van Deemter yang dapat dinyatakan sebagai berikut (Willard et al., 1988):

      B

      H = A + + C .µ + C .µ (7)

      stasionery mobi ฀le µ ' 2 2 8k df

      γD

    • H = 2 µ (8) λdp + '
    • 2 2

        µ π (1 + k ) DCairan Dimana λ = tetapan ukuran ketidakteraturan kemasan dp = diameter rata-rata partikel penyangga D = kedifusian linarut dalam fase gerak ' k = faktor kapasitas

        µ = kecepatan alir γ = faktor koreksi kelikuan saluran dalam kolom

        Dari persamaan di atas dapat dilihat terdapat tiga variabel yang mempengaruhi efisiensi kolom, yaitu: 1) Difusi Eddy, yang dinyatakan sebagai A (2λdp). Difusi Eddy menggambarkan ketidakhomogenan kecepatan alir dan panjang lintasan di sekitar partikel yang terpack-ing (Gambar 5). Lintasan alir yang tidak sama pasti ditemukan dalam kolom terpack-ing. Suatu molekul solut dapat melewati kolom dekat dinding kolom di mana kerapatan kolom rendah dengan cepat mencapai akhir kolom, khususnya pada kolom dengan diameter kecil. Molekul solut yang melewati bagian tengah kolom akan mencapai akhir kolom lebih lambat. Hal ini menyebabkan perbedaan laju tiap molekul melalui kolom berbeda-beda. Untuk meminimalkan difusi Eddy ini, maka diameter rata-rata partikel dalam kolom harus sekecil mungkin dan seseragam mungkin. Difusi Eddy yang terjadi di dalam kolom dapat digambarkan sebagai berikut (Gambar 4):

        Gambar 4. Difusi Eddy (Willard et al., 1988)

        2) Difusi longitudinal, Nilai B (2γD/µ) menyatakan efek difusi longitudinal, pergerakan acak molekul dalam fase gerak. Pengaruh difusi longitudinal terhadap ketinggian lempeng menjadi signifikan hanya pada kecepatan fase gerak yang rendah/lambat. Kecepatan difusi solut yang tinggi pada fase gerak dapat menyebabkan molekul solut terdispers secara aksial sementara dengan lambat bermigrasi melalui kolom.

        3) Transfer massa Transfer massa dinyatakan dengan nilai C stasionery dan C mobile . C stasionery merupakan hasil dari ditahannya solut karena adanya fase diam. Suatu molekul bergerak lambat dalam fase diam, sementara molekul lainnya melaju melalui kolom bersama dengan fase gerak. Untuk mengatasi hal ini diperlukan fase diam yang lebih encer (tidak terlalu kental). Peristiwa ini dapat digambarkan sebagai berikut (Gambar 5):

        Gambar 5. Transfer massa fase diam (Willard et al., 1988)

        C mobile menggambarkan adanya peristiwa dimana solut dalam fase diam bertemu dengan fase gerak yang masih baru. Hal ini dapat digambarkan sebagai berikut (Gambar 6):

        Gambar 6. Transfer massa fase gerak (Willard et al., 1988)

        Pada analisis secara KCKT, kondisi percobaan yang menghasilkan puncak yang simetris selalu lebih disukai, karena puncak yang asimetris dapat menghasilkan pengukuran bilangan lempeng teoritik dan faktor resolusi yang tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan derajat resolusi dan puncak- puncak minor yang tidak terdeteksi pada ekor puncak, serta waktu retensi yang tidak reprodusibel. Parameter yang digunakan untuk menilai bentuk puncak adalah peak asymmetry factor (As), yang diukur pada 10% tinggi puncak. Peak yang simetri memiliki nilai As sama dengan 1, sedangkan puncak dengan nilai As pada rentang 0,95-1,1 masih dikatakan baik. Parameter lain yang masih dapat digunakan yaitu peak tailing factor (Tf), yang diukur pada 5% tinggi puncak. Cara penentuan As dan Tf dapat diamati pada gambar berikut (Gambar 7):

        Gambar 7. Penentuan peak asymmetry dan peak tailing factor (Snyder et al., 1997)

        Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam pada saat terjadi tailing dan leading dapat dilihat sebagai berikut (Gambar 8):

        

      Gambar 8. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam (Kuwana, 1980)

        Gugus silanol yang tidak bereaksi karena adanya halangan sterik dapat memberikan kepolaran yang tidak dikehendaki dan menyebabkan pengekoran reaksi dianjurkan dengan penambahan trimetilklorosilan yang dapat mencapai gugus silanol karena ukurannya yang lebih kecil dibanding organoklorosilan yang lain. Penambahan trimetilklorosilan dapat menutupi banyak gugus silanol yang masih bebas, namun tidak semua gugus tersebut dapat tertutupi (Skoog et al., 1998).

        Puncak kromatogram yang tidak simetri (tailing dan leading) sering dijumpai bila konsentrasi solut dalam fase gerak terlalu besar. Senyawa-senyawa polar juga berpotensi menimbulkan tailing apabila masih terdapat residu gugus silanol pada fase diam. Penyebab tailing yang lain yaitu ketidaksesuaian antara solut dan kolom, pengemasan kolom yang tidak seragam, dan faktor yang terjadi di luar kolom, seperti injektor (Noegrohati, 1994).

      3. Analisis Kualitatif dan Analisis Kuantitatif

        Waktu tambat atau waktu retensi adalah selang waktu yang diperlukan oleh linarut (solut) mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor dan dinyatakan sebagai t R (Mulya dan Suharman, 1995).

        Analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi senyawa murni dan waktu retensi senyawa yang dimaksud dalam sampel. Respon yang berupa tinggi peak maupun luas area peak dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Noegrohati, 1994).

        Beberapa aspek yang perlu dipertimbangkan untuk mendapatkan pemisahan yang baik tersaji pada tabel II berikut:

        Tabel II. Pemisahan yang diinginkan dalam metode KCKT Tujuan Keterangan

      Resolusi Presisi dan ketahanan metode analisis kuantitatif memerlukan

      nilai Rs lebih besar dari 1,5

      Waktu pemisahan < 5-10 menit merupakan waktu yang diinginkan untuk prosedur

      rutin Kuantifikasi Nilai CV ≤ 2%

      Tekanan kolom < 150 bar adalah yang diharapkan, namun biasanya < 200 bar

      masih diijinkan TInggi Peak Bentuk peak yang sempit sangat diharapkan

        Konsumsi fase gerak Jumlah fase gerak yang minimum setiap pengujian sangat diharapkan

        (Snyder et al., 1997)

      E. Kesahihan Metode Analisis Instrumental

        Parameter-parameter yang digunakan sebagai pedoman kesahihan metode analisis antara lain:

        1. Akurasi

        Akurasi adalah suatu ukuran kedekatan nilai hasil percobaan dengan nilai yang sesungguhnya. Akurasi suatu metode biasanya dinyatakan dengan persen

        

      recovery. Rentang perolehan kembali untuk kadar analit pada matriks sampel

      sebesar 100% dan lebih dari sama dengan 10% adalah 98-102 % (Harmita, 2004).

        2. Presisi

        Presisi adalah suatu ukuran kedekatan nilai data satu dengan data lainnya dalam suatu pengukuran pada kondisi analisis yang sama. Presisi seringkali diukur sebagai persen Relative Standard Deviation (RSD) atau Coefficient of

        

      Variation (CV). Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat

        dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih standar deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar 2,5%. Secara umum diterima bahwa RSD harus lebih kecil dari 2% (Harmita, 2004).

        3. Linieritas

        Linieritas suatu metode analitik adalah kemampuannya untuk memperoleh hasil uji yang proporsional dengan konsentrasi analit pada sampel yang dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Persyaratan data linieritas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Snyder et al., 1997).

        4. Spesifisitas

        Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan akurat respon analit diantara seluruh komponen sampel yang mungkin ada dalam matriks sampel (Mulja dan Hanwar, 2003). Spesifisitas metode KCKT dapat dikatakan baik jika nilai resolusi peak analit dengan senyawa lain lebih besar atau sama dengan 2 (Snyder et al.,1997).

      F. Landasan Teori

        Hidrokortison asetat dan kloramfenikol dapat ditetapkan kadarnya dengan menggunakan detektor UV karena keduanya memiliki gugus kromofor yang dapat menyerap gelombang elektromagnetik yang melewatinya.

        Metode KCKT dapat digunakan untuk menetapkan kadar kedua senyawa tersebut dalam krim merek “X” secara simultan karena adanya perbedaan interaksi hidrokortison asetat, kloramfenikol dan senyawa lain dalam krim yang mungkin ikut terekstraksi dalam metanol terhadap fase diam dan fase gerak yang digunakan. Pada penetapan kadar dengan metode KCKT ini dipilih fase terbalik karena hidrokortison asetat dan kloramfenikol cenderung bersifat non polar sehingga kedua senyawa tersebut dapat berinteraksi dengan fase diam melalui ikatan Van der Waals.

      G. Hipotesis

        Berdasarkan landasan teori di atas maka dapat disusun hipotesis sebagai berikut:

        1. Metode KCKT fase terbalik dapat digunakan untuk memisahkan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” secara simultan.

        2. Metode KCKT fase terbalik yang digunakan untuk pemisahan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” memiliki validitas yang baik.

      BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis rancangan penelitian eksperimental deskriptif dua tingkat karena pada subjek uji diberikan dua perlakuan. B. Variabel Penelitian

        1. Variabel utama a. Variabel bebas.

        1) Jenis dan perbandingan fase gerak yaitu metanol : aquabides 2) Flow rate yang digunakan b. Variabel tergantung.

        1) Pemisahan peak dari masing-masing komponen yaitu hidrokortison asetat dan kloramfenikol yang dapat dilihat dari waktu retensi masing- masing senyawa. 2) Nilai recovery dan presisi yang didapatkan dari hasil validasi metode.

        2. Variabel pengacau terkendali

        Variabel pengacau terkendali pada percobaan adalah kemurnian pelarut yang digunakan. Untuk mengatasinya digunakan pelarut yang pro analysis yang memiliki kemurnian tinggi.

      C. Bahan-bahan Penelitian

        Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah hidrokortison asetat dan kloramfenikol kualitas working standard (Kalbe Farma) dengan Sertificate of

        

      Analysis (CoA) terlampir pada lampiran 1 dan 2, metanol p.a. (E. Merck),

        aquabides (PT. Ikapharmindo Putramas), krim merek X dengan berat bersih 10 g dan tiap gram mengandung kloramfenikol basa 20 mg, hidrokortison asetat 25 mg.

      D. Alat-alat Penelitian

        Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah: Spektrofotometer UV/Vis merek Perkin Elmer Lambda 20, kuvet, seperangkat alat KCKT yang terdiri dari pompa merek Shimadzu LC-10 AD, detektor UV-Vis merek Shimadzu SPD 10 AV, CBM 101 merek Shimadzu, seperangkat komputer merek ACER, printer merek Hewlett Packard Deskjet 670 C, injektor jenis katup suntik model 77251, Kolom Kromasil-100 C 250 x 4,6 mm i.d., 5µm, syringe merek

      18 Hamilton Part, alat degassing ultrasonik merek Retsch tipe T640, penyaring

        Whatmann anorganik dan organik, Membrane filter holder merek Whatman kapasitas 300 ml, neraca analitik merek Scaltec SBC 22, vakum merek Gast model DOA-P104-BN, Milipore ukuran pori 0,45 µm, mikropipet 100-1000 µl merek Biohit, pipet volume, Beaker glass, Erlenmeyer, pipet tetes, flakon, Buret, labu takar, pengaduk, dan alat-alat gelas lainnya.

      E. Tatacara Penelitian

      1. Optimasi metode KCKT

        a. Penentuan panjang gelombang pengamatan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dengan spektrofotometer UV. Timbang seksama masing-masing kurang lebih 10 mg baku hidrokortison asetat dan kloramfenikol kemudian diencerkan dengan metanol hingga 10,0 ml. Kemudian masing-masing dipipet sebanyak 0,1 ml baku kloramfenikol dan 0,125 ml baku hidrokortison asetat dari baku hidrokortison asetat dan diencerkan dengan metanol 10,0 ml. Masing- masing larutan tersebut discan serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer UV. Kemudian diperoleh spektra yang menghubungkan antara serapan dan panjang gelombang. Tentukan panjang gelombang pengamatan yang menunjukkan hidrokortison asetat dan kloramfenikol memberikan serapan yang optimal.

        b. Pembuatan fase gerak. Fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol : aquabides dengan perbandingan 55 : 45; 60 : 40; 65 : 35 dan 70 : 30 (v/v). Masing-masing perbandingan fase gerak dibuat sesuai dengan volume yang dibutuhkan kemudian digojog dan disaring dengan penyaring Whatman anorganik dengan bantuan pompa vakum. Fase gerak kemudian didegassing selama 15 menit menggunakan ultrasonicator. c. Pembuatan larutan baku induk hidrokortison asetat 1000 ppm dan kloramfenikol 800 ppm. Sejumlah 10 mg hidrokortison asetat baku dan 8 mg kloramfenikol baku ditimbang seksama dan dilarutkan dalam metanol hingga 10,0 ml.

        d. Pengamatan waktu retensi hidrokortison asetat dan kloramfenikol baku. Sejumlah 0,5 ml larutan baku induk hidrokortison asetat dan kloramfenikol diambil kemudian diencerkan menggunakan fase gerak (yang akan dioptimasi) hingga 10,0 ml. Sejumlah 20 µl masing-masing larutan tersebut diinject ke sistem KCKT dengan fase diam C

        18 dan detektor UV pada panjang gelombang 255 nm,

        kemudian dielusi dengan fase gerak yang akan dioptimasi dan flow rate tertentu dan diamati waktu retensi masing-masing zat.

        e. Preparasi sampel krim merek “X”. Timbang seksama kurang lebih 0,25 g sampel kemudian tambahkan 10,0 ml metanol, masukkan ke dalam tabung sentrifugasi. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 30 menit. Ambil 2,0 ml dari larutan tersebut kemudian encerkan dengan fase gerak yang akan dioptimasi hingga 10,0 ml. Larutan disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit. Larutan ini akan digunakan pada optimasi pemisahan (langkah f) (ASEAN, 2005).

        f. Optimasi pemisahan campuran hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam sampel krim merek “X” dengan metode KCKT. Optimasi dilakukan pada panjang gelombang 255 nm dan dilakukan dengan menggunakan sampel yang telah dipreparasi pada langkah di atas (e) dan diinjectkan sebanyak 20 µl ke sistem KCKT dengan fase diam C

        18 . Perbandingan fase gerak yang digunakan dan

      flow rate pada sistem yang digunakan diubah-ubah sampai didapatkan

      kromatogram yang baik (memiliki resolusi dan waktu retensi yang efisien).

      2. Verifikasi sistem KCKT a. Verifikasi presisi sistem injeksi dan uji kesesuaian sistem KCKT.

        Campuran larutan baku 125 ppm hidrokortison asetat dan 100 ppm kloramfenikol diinjeksikan sebanyak 10 kali ke dalam sistem KCKT dengan fase gerak metanol : aquabides dengan perbandingan 65 : 35 dan flow rate 1,2 ml/menit. Hitung nilai CV dari AUC atau tinggi puncak yang dihasilkan dan amati waktu retensi masing- masing zat. Presisi sistem injeksi yang baik ditunjukkan oleh nilai CV

        ≤ 1,0% dan kesesuaian sistem yang memenuhi syarat ditunjukkan oleh waktu retensi masing- masing zat setiap replikasi masuk dalam range waktu retensi yaitu x

        � ± 3 SD (Snyder et al., 1997).

        b. Verifikasi akurasi pompa. Alirkan fase gerak metanol : aquabides (65 : 35) pada fllow rate 1,2 ml/menit kemudian ditampung pada labu ukur 10,0 ml dengan merek dan ketelitian yang sama. Lakukan sebanyak 10 kali. Catat waktu yang diperlukan untuk menampung 10,0 ml fase gerak dalam labu. Hitung % bias antara nilai flow rate hasil pengukuran dengan nilai flow rate yang diatur pada sistem KCKT. Perbedaan nilai flow rate hasil pengukuran sebesar ± 1% dari flow rate yang diatur (Lam, 2004).

      3. Validasi metode KCKT

        a. Pembuatan larutan baku induk campuran hidokortison asetat 1000 ppm dan kloramfenikol 800 ppm. Timbang seksama kurang lebih 10 mg hidrokortison asetat dan 8 mg kloramfenikol baku, kemudian dicampur dan dilarutkan dengan metanol hingga 10,0 ml.

        b. Pembuatan seri larutan baku hidrokortison asetat dan kloramfenikol. Dari larutan baku induk campuran hidrokortison asetat 1000 ppm dan kloramfenikol 800 ppm dalam metanol, dipipet 0,125; 0,250; 0,375; 0,500; 0,625; 0,750; dan 0,875 ml kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 ml dan diencerkan dengan fase gerak metanol : aquabides (65 : 35) sampai tanda sehingga didapatkan konsentrasi seri hidrokortison asetat 12,5; 25,0; 37,5; 50,0; 62,5; 75,0 dan 87,5 ppm dan kloramfenikol 10; 20; 30; 40; 50; 60 dan 70 ppm.

        Larutan disaring dengan Millipore dan didegassing menggunakan ultrasonicator selama 15 menit dan diinjectkan sebanyak 20 µl ke dalam sistem KCKT dengan menggunakan flow rate 1,2 ml/menit dan fase gerak metanol:aquabides (65:35). AUC (Area Under Curve) untuk tiap peak yang muncul diamati dari kromatogram yang didapat. Kemudian ditentukan persamaan regresi linear antara kadar tiap seri baku terhadap AUC analit.

        c. Penetapan perolehan kembali dan akurasi dengan menggunakan baku. Timbang seksama kurang lebih 10 mg baku hidrokortison asetat dan 8 mg baku kloramfenikol kemudian larutkan dalam 10,0 ml metanol. Kemudian dari larutan tersebut diambil 0,4; 0,5 dan 0,6 ml dan diencerkan dengan 10,0 ml fase gerak metanol : aquabides (65 : 35). Larutan disaring dengan millipore dan didegassing menggunakan ultrasonicator selama 15 menit kemudian diinjeksikan pada sistem KCKT dengan kolom C

        18 sejumlah 20 µl dengan fase gerak metanol : aquabides

        dengan perbandigan 65 : 35 dan flow rate 1,2 ml/menit. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali untuk setiap seri kadarnya. AUC (Area Under Curve) tiap peak yang muncul diamati dari kromatogram yang didapat. Kemudian kadar analit dihitung dengan memasukkan nilai AUC yang diperoleh dari tiap analit ke dalam persamaan kurva baku yang telah diperoleh dari analisis regresi linear sehingga didapatkan nilai perolehan kembali dan presisi metode yang digunakan.

      F. Analisis Hasil

        Hasil optimasi pemisahan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam krim merek “X” dapat dilihat dari kromatogram yang diperoleh dengan menggunakan fase gerak dan flow rate tertentu. Hasil optimasi ini kemudian digunakan untuk menetapkan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam campuran yang telah diketahui kadarnya. Kemudian kadar terukur dibandingkan dengan kadar sebenarnya untuk menentukan kesahihan metode (validasi metode).

        Kesahihan metode ditentukan dengan parameter akurasi dan presisi dengan rumus sebagai berikut:

        1. Akurasi ditentukan dengan nilai recovery kadar teru kur

        Recovery = x 100%

        kadar diketahui (9)

        2. Presisi diukur dengan Coefficient of variation (CV) simpangan baku CV = x 100% kadar rata - rata

        (10)

        3. Spesifisitas ditentukan dari profil pemisahan pada kromatogram yang menunjukkan pemisahan hingga baseline untuk ketiga analit. Spesifisitas metode yang dapat diterima dari suatu metode KCKT ditunjukan dengan nilai resolusi

        ≥ 2.

        4. Linieritas ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari penentuan persamaan kurva baku dengan analisis regresi linear. Nilai r yang memenuhi syarat adalah r > 0,999.

      BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Optimasi Metode

      1. Penentuan panjang gelombang overlapping

        Penentuan panjang gelombang overlapping dilakukan dengan mengukur panjang gelombang masing-masing senyawa terlebih dahulu. Penentuan panjang gelombang overlapping ini dilakukan dengan mengukur absorbansi kedua senyawa masing-masing dengan konsentrasi hidrokortison asetat 12,5 ppm dan kloramfenikol 10,0 ppm pada panjang gelombang 200-400 nm yang termasuk dalam panjang gelombang ultraviolet. Kloramfenikol dan hidrokortison asetat memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat memberikan serapan pada panjang gelombang ultraviolet (UV). Gugus auksokrom dan kromofor kedua senyawa tersebut ditunjukkan dari gambar berikut (Gambar 9):

        

      Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom kloramfenikol dan hidrokortison asetat

        Kurva serapan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dapat terlihat seperti pada gambar di bawah ini:

        

      a = overlapping pada 227 nm

      b = overlapping pada 255 nm

      Gambar 10. Spektra panjang gelombang maksimum hidrokortison asetat ( ) dan

      kloramfenikol ( )

        Hasil spektrogram (gambar 10) menunjukkan panjang gelombang pada saat serapan dari hidrokortison asetat maksimal adalah pada 241,6 nm.

        Hidrokortison asetat dalam metanol memberikan serapan maksimum pada λ 242 nm (Anonim, 1995). Hasil menunjukkan pergeseran panjang gelombang untuk hidrokortison asetat hanya sebesar 0,4 nm, hasil ini dikatakan memenuhi syarat karena pergeseran panjang gelombang yang diijinkan adalah sebesar 2 nm (Anonim, 1995). Untuk kloramfenikol, berdasarkan pengamatan panjang gelombang saat serapannya maksimal adalah pada 273,2 nm. Menurut Clarke (1986) serapan maksimal kloramfenikol dalam etanol ialah pada 271 nm. Hasil pengukuran ini menunjukkan pergeseran panjang gelombang sebesar 2,2 nm, hal ini mungkin disebabkan kondisi pengujian pada saat penelitian berbeda dengan kondisi pengujian pada literatur yang dapat mempengaruhi absorbansi dari senyawa. Selain itu, pelarut yang digunakan pada penelitian adalah metanol sedangkan yang digunakan secara teoritis adalah etanol.

        Setelah didapatkan spektrum masing-masing senyawa kemudian dicari panjang gelombang overlapping kedua senyawa tersebut yaitu panjang gelombang dimana kedua senyawa memberikan serapan yang optimum. Panjang gelombang

        

      overlapping hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam metanol ditentukan dari

        hasil perpotongan kurva dari spektrogram kedua senyawa tersebut. Panjang gelombang overlapping yang digunakan adalah pada 255 nm karena lebih dekat dengan panjang gelombang maksimum kloramfenikol dan untuk menghindari adanya absorbsi oleh senyawa-senyawa lain yang memiliki kromofor pendek sehingga dapat meningkatkan selektifitas dari detektor.

      2. Pengamatan waktu retensi hidrokortison asetat dan kloramfenikol baku

        Pengamatan waktu retensi kloramfenikol dan hidrokortison asetat baku dilakukan untuk memastikan peak kloramfenikol dan hidrokortison asetat. Waktu retensi digunakan untuk analisis kualitatif karena bersifat spesifik untuk senyawa tertentu pada kondisi tertentu. Waktu retensi suatu senyawa dipengaruhi oleh interaksi senyawa tersebut terhadap fase gerak dan fase diam yang digunakan.

        Struktur kloramfenikol dan hidrokortison asetat mempunyai gugus polar dan non polar yang dapat berinteraksi dengan fase gerak dan fase diam. Gugus polar berinteraksi dengan fase gerak melalui ikatan hidrogen sedangkan gugus non polar berinteraksi dengan fase diam oktadesisilan melalui ikatan Van Der Waals. Interaksi antara kloramfenikol dan hidrokortison asetat dengan fase gerak disajikan pada gambar 11 dan 12. H CO H H OCH 3 H H 3 H CO O H O O 3 H H H O H H H O H 3 CO O H H H O H Cl Cl O N O H N H O H O H O H OCH H 3 H CO H OCH 3 H H 3 Gambar 11. Ikatan hidrogen antara kloramfenikol dengan fase gerak metanol :

        

      aquabides

      H

      H

      OCH H 3 H CH H O H HO OCH

      H O

      3 H

      OCH

      H H

      O

      3

      H H OCH O H O H H O OCH H H OCH 3 O H 3 H 3 H 3 CO H H H

      O O

        3 O H O O

      H H

      H

      H H O O Gambar 12. Ikatan hidrogen antara hidrokortison asetat dengan fase gerak metanol

        

      : aquabides

        Dari gambar di atas dapat dilihat bahwa hidrokortison asetat (Gambar 12) memiliki kemungkinan ikatan hidrogen yang lebih banyak daripada kloramfenikol (Gambar 11) sehingga seharusnya hidrokortison asetat yang memiliki waktu retensi lebih singkat dibanding kloramfenikol. Semakin banyak jumlah ikatan hidrogen maka ikatan antara solut dengan fase gerak akan semakin kuat sehingga solut akan segera terelusi, namun pada kenyataannya kloramfenikol yang mempunyai ikatan hidrogen lebih sedikit dibanding hidrokortison asetat, memiliki waktu retensi yang lebih singkat. Hal ini disebabkan hidrokortison asetat lebih banyak memiliki gugus non polar yang dapat berikatan dengan fase diam oktadesisilan dari pada kloramfenikol. Ikatan yang terjadi tersebut adalah ikatan Van der Waals. Ikatan ini menyebabkan hidrokortison asetat tertahan lebih lama di dalam kolom dibanding kloramfenikol. Ikatan Van der Waals antara gugus nonpolar kloramfenikol dan hidrokortison asetat sulit digambarkan.

        Berikut digambarkan gugus nonpolar kloramfenikol (Gambar 13) dan hidrokortison asetat (Gambar 14) yang berperan dalam ikatan Van der Waals: OH OH Cl Cl O NH O O N

        Gambar 13. Gugus nonpolar kloramfenikol HO O HO O H C 3 O O Gambar 14. Gugus nonpolar hidrokortison asetat

        Selain dari analisis interaksi senyawa terhadap fase gerak dan fase diam yang digunakan, untuk memprediksi waktu retensi dari suatu senyawa dapat juga dilihat dari polaritas senyawa tersebut. Polaritas suatu senyawa ditunjukkan oleh senyawa tersebut. Nilai log P kloramfenikol adalah -0,23 dan hidrokortison asetat adalah 0,73. Dari nilai log P tersebut dapat disimpulkan bahwa kloramfenikol lebih polar dibanding hidrokortison asetat. Oleh sebab itu kloramfenikol akan terelusi terlebih dahulu karena fase gerak yang digunakan bersifat polar sedangkan hidrokortison asetat yang bersifat lebih nonpolar akan berinteraksi lebih kuat dengan fase diam yang bersifat nonpolar sehingga waktu retensi hidrokortison asetat jauh lebih panjang. Berikut adalah kromatogram hasil penetapan waktu retensi kloramfenikol (Gambar 15) dan hidrokortison asetat (Gambar 16):

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : kloramfenikol baku Detektor : UV 255 nm

        Gambar 15. Kromatogram waktu retensi kloramfenikol baku dengan fase gerak

      dan flow rate hasil optimasi

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit

      Injeksi : kloramfenikol dan hidrokortison asetat baku

      Detektor : UV 255 nm

        

      Gambar 16. Kromatogram waktu retensi kloramfenikol dan hidrokotison asetat baku

      dengan fase gerak dan flow rate hasil optimasi

        Pada kromatogram baku kloramfenikol (Gambar 15) kloramfenikol ditunjukkan oleh peak nomor 5 dengan waktu retensi 3,488 menit. Pada kromatogram campuran baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat (Gambar 16) dapat disimpulkan peak nomor 5 adalah kloramfenikol dengan waktu retensi 3,469 menit dan hidrokortison asetat ditunjukkan oleh peak nomor 10 dengan waktu retensi 8,553 menit.

        

      3. Pengamatan waktu retensi hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam

      sampel

        Pengamatan waktu retensi kloramfenikol dan hidrokortison asetat dalam sampel ini sekaligus menjadi parameter analisis kualitatif senyawa tersebut.

        Waktu retensi dari peak sampel akan dibandingkan dengan waktu retensi kloramfenikol dan hidrokortison asetat baku.

        Pada kromatogram sampel terdapat 2 peak yang saling berhimpit dan salah satu dari peak tersebut adalah kloramfenikol. Oleh karena itu, dilakukan penambahan baku kloramfenikol ke dalam sampel yang akan diinjeksikan untuk memastikan peak kloramfenikol dengan prinsip peak yang mengalami penambahan luas area maupun tinggi peak merupakan peak kloramfenikol. Hasil yang peroleh disajikan pada gambar 17 berikut:

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (55 : 45 v/v) Flow rate : 2 ml/menit Injeksi : sampel + baku kloramfenikol Detektor : UV 255 nm

        

      Gambar 17. Kromatogram sampel + baku kloramfenikol Dari hasil kromatogram yang diperoleh (Gambar 17), peak pada waktu retensi 3,872 menit mengalami pertambahan tinggi dan area (kromatogram sampel tanpa penambahan baku kloramfenikol dapat dilihat pada lampiran 3), sehingga dapat disimpulkan bahwa peak tersebut adalah kloramfenikol hal ini diperkuat dengan menginjeksikan baku kloramfenikol ke dalam sistem KCKT dan didapatkan waktu retensi kloramfenikol sebesar 3,871 menit (lampiran 4).

        Peak yang selalu berhimpit dengan kloramfenikol diprediksi merupakan

      peak pengawet yang sering digunakan dalam krim yaitu metil paraben atau propil

        paraben. Hal ini didasarkan pada kelarutan metil paraben dan propil paraben yang baik dalam metanol sehingga dapat ikut terekstraksi ke dalam metanol saat preparasi sampel, sedangkan senyawa lain yang digunakan dalam pembuatan krim seperti emulgator krim (misalnya trietanolamin stearat) dan basis krim (misalnya lanolin) tidak larut dalam metanol sehingga tidak akan ikut tereskstraksi pada saat preparasi sampel. Metil paraben memiliki nilai log P sebesar 1,69 sedangkan propil paraben 2,52. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa peak yang selalu berhimpit dengan peak kloramfenikol adalah metil paraben karena memiliki nilai log P yang lebih mendekati log P kloramfenikol (-0,23) sehingga waktu retensi kedua senyawa tersebut hampir sama. Kloramfenikol memiliki nilai log P yang lebih kecil daripada metil paraben, oleh karena itu peak yang lebih dahulu muncul (waktu retensi lebih pendek) merupakan kloramfenikol dan peak yang lebih lama muncul adalah metil paraben.

        Hasil pengamatan waktu retensi kloramfenikol baku dan hidrokortison asetat untuk flow rate 1,2 ml/menit dan fase gerak metanol : aquabides (65 : 35) masing-masing adalah 3,488 menit dan 8,553 menit (Gambar 15 dan 16). Pada kromatogram sampel (gambar 18) terdapat 3 peak yang besar dengan waktu retensi 3,488; 3,863; dan 8,593 menit. Jika dibandingkan dengan peak baku dapat disimpulkan bahwa peak dengan waktu retensi 3,488 dan 8,593 menit pada kromatogram sampel (Gambar 18) adalah peak kloramfenikol (9) dan hidrokortison asetat (15). Kromatogram sampel disajikan pada gambar berikut:

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        Gambar 18. Kromatogram waktu retensi sampel dengan fase gerak dan flow rate hasil

      optimasi

      4. Optimasi fase gerak

        Sistem kromatografi yang digunakan dalam penelitian ini merupakan kromatografi partisi fase terbalik yaitu fase gerak yang lebih polar dari pada fase diam. Kolom yang digunakan adalah Kromasil-C

        18 berukuran 250 x 4,6 mm i.d., aquabides yang bersifat lebih polar dari pada fase diam yang digunakan. Pada tahap optimasi fase gerak digunakan flow rate yang sama untuk setiap komposisi fase gerak yang dioptimasi sehingga bila ada perbedaan pada hasil yang diperoleh maka perbedaan tersebut dapat disimpulkan karena perbedaan komposisi fase gerak yang digunakan. Nilai flow rate yang digunakan adalah 2 ml/menit, hal ini bertujuan untuk mempercepat waktu elusi dari kedua senyawa yang akan ditetapkan.

        Fase gerak yang dioptimasi adalah metanol dan aquabides dengan berbagai perbandingan komposisi yaitu 55 : 45; 60 : 40; 65 : 35 dan 70 : 30 (v/v). Fase gerak yang telah dibuat terlebih dahulu disaring dengan penyaring Whattman anorganik untuk menyaring partikel yang dapat menyumbat kolom. Selanjutnya fase gerak dideggasing dengan menggunakan ultrasonicator untuk menghilangkan gelembung udara karena gelembung udara dapat mengganggu pemisahan sampel.

        Pemilihan komposisi fase gerak tersebut didasarkan pada penelitan sebelumnya yang dilakukan oleh Li X (1998) yaitu penetapan kadar hidrokortison dan kloramfenikol dalam tetes telinga, dalam penelitian tersebut dikatakan bahwa fase gerak yang optimal adalah metanol : aquabides dengan perbandingan 60 : 40.

        Penelitian ini dilakukan optimasi pada komposisi fase gerak yang tidak terlalu berbeda dengan penelitian Li X (1998) karena baik hidrokortison asetat maupun hidrokortison memiliki struktur yang hampir sama sehingga interaksi kedua senyawa tersebut dengan fase gerak dan fase diam juga akan mirip. Berikut ini adalah struktur kedua senyawa tersebut (Gambar 19):

        

      Gambar 19. Struktur hidrokortison (a) dan hidrokortison asetat (b)

        Pada proses optimasi fase gerak ini menggunakan sampel yang telah dipreparasi dengan tujuan agar hasil optimasi ini dapat langsung digunakan pada penetapan kadar sampel karena dalam sampel tidak hanya mengandung hidrokortison asetat dan kloramfenikol murni namun terdapat senyawa lainnya.

        Dalam proses ekstraksi mungkin senyawa lain tersebut ikut terekstraksi karena memiliki sifat yang hampir sama (dalam hal kelarutannya) dengan hidrokortison asetat dan kloramfenikol sehingga akan menyebabkan peak yang saling

        

      overlapping. Hal ini dapat dilihat dari peak kloramfenikol yang selalu diikuti oleh

      peak lain. Oleh karena itu optimasi dilakukan juga mempertimbangkan nilai

        resolusi peak kloramfenikol dan peak senyawa lain tersebut.

        Tahap optimasi pertama yang dilakukan adalah menggunakan komposisi fase gerak metanol : aquabides 55 : 45 (v/v). Hasil optimasi menggunakan fase gerak ini dapat dilihat pada gambar 17 (hlm 40). Pada kromatogram tersebut dapat dilihat bahwa waktu retensi kloramfenikol adalah 3,872 menit dan hidrokortison asetat adalah 17,233 menit. Oleh karena itu, pengunaan fase gerak dengan komposisi metanol : aquabides (55 : 45) v/v ini tidak efisien karena waktu elusi yang diperlukan sangat lama.

        Tahap optimasi kedua adalah menggunakan fase gerak metanol : aquabides (60 : 40) v/v. Pada fase gerak ini, jumlah metanol yang digunakan ditambah untuk meningkatkan eluent strength fase gerak. Peningkatan eluent

        

      strength ini diharapkan akan meningkatkan kemampuan fase gerak untuk

        mengelusi analit lebih cepat sehingga waktu retensi analit juga akan semakin pendek. Hasil dari optimasi ini dapat dilihat pada kromatogram (Gambar 20) di bawah ini:

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (60 : 40 v/v)

      Flow rate : 2 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        

      Gambar 20. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap kedua

        Pada gambar di atas (Gambar 20) peak nomor 9 adalah kloramfenikol dengan waktu retensi 3,084 menit dan peak nomor 16 adalah hidrokortison asetat dengan waktu retensi 10,070 menit. Penggunaan fase gerak ini dari segi waktu elusi lebih efisien dari pada fase gerak sebelumnya, namun pada kondisi ini tekanan kolom sebesar 300 atm, kondisi ini tidak diinginkan karena tekanan kolom yang terlalu tinggi ini akan merusak kolom yang digunakan serta menurunkan realibilitas dari sistem KCKT yang digunakan. Tekanan kolom yang diinginkan adalah tidak lebih dari 197,4 atm (Snyder et al., 1997). Oleh karena itu, dalam optimasi selanjutnya dilakukan penurunan flow rate yang digunakan, dengan menurunnya flow rate maka tekanan kolom juga akan menurun tetapi waktu retensi juga akan semakin lama sehingga akan memperpanjang waktu elusi.

        Hasil penurunan flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 : 40) v/v dapat dilihat pada tabel III dibawah ini:

        

      Tabel III. Hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 : 40)

      Resolusi klor Waktu retensi

      Flow rate Lempeng HETP Pressure

      -3 dengan (menit)

        (ml/menit) teoritis (N) (10 ) (atm) senyawa lain Klor HCA

        1,9 5748,54 4,35 2,29 4,397 14,769 279 1,8 6017,19 4,15 2,23 4,632 15,374 267 1,7 8900,29 2,80 2,36 5,096 16,413 253

      • Klor = Kloramfenikol

        HCA = Hidrokortison asetat

        Dari hasil tersebut (Tabel III) dapat diamati bahwa pada penurunan flow

        

      rate hingga 1,7 ml/menit tekanan kolom nilainya lebih dari 197,4 atm dan waktu

        retensi hidrokortison asetat (HCA) adalah 16,413 menit (contoh perhitungan N, HETP dan Rs dapat dilihat pada lampiran 5). Dengan demikian, fase gerak ini disimpulkan tidak efisien karena memerlukan waktu elusi yang panjang.

        Kromatogram hasil penurunan flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 :40 v/v) dapat dilihat pada lampiran 6.

        Tahap optimasi ketiga adalah menggunakan komposisi fase gerak metanol : aquabides dengan perbandingan 65 : 35 v/v. Jumlah metanol dalam fase gerak ini ditingkatkan agar waktu elusi dapat lebih singkat. Hasil kromatogram dari optimasi fase gerak ini dapat dilihat pada kromatogram (Gambar 21) di bawah ini:

        

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 2 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        Gambar 21. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap ketiga

        Pada gambar 21 peak nomor 7 adalah kloramfenikol dengan waktu retensi 2,342 menit dan peak nomor 14 adalah hidrokortison asetat dengan waktu retensi 5,967 menit dan tekanan kolom pada kondisi tersebut sebesar 233 atm. Pada kondisi ini tekanan kolom berada di atas 197,4 atm, sehingga langkah selanjutnya yang ditempuh untuk menurunkan tekanan tersebut adalah dengan menurunkan flow rate yang digunakan (akan dibahas kemudian).

        Tahap optimasi fase gerak keempat (terakhir) adalah metanol : aquabides dengan perbandingan 70 : 30 v/v. Fase gerak ini mengandung jumlah metanol terbanyak dari fase gerak yang telah dioptimasi sebelumnya, dengan demikian kemampuan mengelusi fase gerak ini lebih besar dari fase gerak sebelumnya.

        Hasil yang diharapkan dari penggunaan fase gerak ini adalah mendapatkan waktu elusi yang lebih singkat daripada sebelumnya. Hasil kromatogram (Gambar 22) yang didapat adalah sebagai berikut:

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)

      Flow rate : 2 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        Gambar 22. Kromatogram sampel optimasi fase gerak tahap keempat

        Pada kromatogram tersebut (Gambar 22) dapat diamati bahwa peak kloramfenikol (6) sangat dekat dengan peak nomor 7 dan peak hidrokortison asetat (12) tidak memisah dengan sempurna dari peak lainnya. Solusi yang ditempuh agar pemisahan kedua senyawa tersebut lebih baik adalah dengan menurunkan flow rate yang hasilnya dapat dilihat dari kromatogram dibawah ini (Gambar 23 – 27):

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)

      Flow rate : 1,8 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        Gambar 23. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,8

      ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)

      Flow rate : 1,6 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        

      Gambar 24. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,6 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)

      Flow rate : 1,4 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        

      Gambar 25. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,4 ml/menit

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        

      Gambar 26. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,2 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (70 : 30 v/v)

      Flow rate : 1,0 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        

      Gambar 27. Kromatogram sampel optimasi tahap keempat dengan flow rate 1,0 ml/menit

        Hasil yang diperoleh menunjukkan penurunan flow rate tidak dapat mengatasi permasalahan yang ada. Hal ini dapat dilihat dari kromatogram (Gambar 27) peak hidrokortison asetat (14) tidak memisah dengan peak lainnya, oleh karena itu tidak dilanjutkan penurunan flow rate lebih kecil karena akan memperpanjang waktu elusi.

        Dari keseluruhan optimasi fase gerak dengan flow rate 2 ml/menit maka disimpulkan bahwa fase gerak metanol : aquabides dengan perbandingan 65 : 35 v/v (Gambar 21) adalah yang optimal dilihat dari segi waktu retensi, tekanan kolom, resolusi dan nilai HETP, rangkuman hasil optimasi fase gerak secara keseluruhan dapat dilihat dari tabel IV di bawah ini:

        70

        

      Tabel IV. Hasil optimasi komposisi fase gerak pada flow rate 2 ml/menit

      Komposisi Lempeng teoritis (N)

        HETP (L/N)

        10

      • -3

        Resolusi

        klor dengan

        senyawa lain

        Waktu rentensi (menit)

        Pressure (atm) Met Aq Klor HCA

        55 45 5479,46 4,56 2,12 3,871 > 15 271

        60 40 4770,16 5,24 2,04 3,084 10,070 300

        65 35 3836,22 6,52 1,68 2,342 5,967 223

      30 HCA belum memisah dengan senyawa lain dalam sampel

      • Met: metanol Klor: kloramfenikol Aq: aquabides HCA: Hidrokortison asetat

        Dari tabel IV di atas dapat diamati nilai HETP dari fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) adalah yang terbesar, sedangkan menurut Van Deemter nilai HETP yang baik adalah yang paling kecil selain itu nilai resolusi yang dihasilkan juga tidak memenuhi syarat Rs

        ≥ 2 (Snyder et al., 1997) namun fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) tetap dipilih karena dilihat dari segi waktu retensi dan tekanan kolom yang lebih efisien sedangkan untuk nilai resolusi dapat ditingkatkan dengan penurunan flow rate yang digunakan. Hasil optimasi flow

        

      Tabel V. Hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (65 : 35)

      Flow rate

        (ml/menit) Lempeng teoritis (N) HETP

        (10

      • -3 ) Resolusi klor dengan senyawa lain Waktu retensi (menit)

        Pressure (atm) Klor HCA

        0,4 7822,13 3,20 2,42 9,920 >20

        62 0,5 9132,64 2,74 2,33 8,031 19,202

        78 0,6 8709,49 2,87 2,28 6,681 15,921

        93 0,7 6812,60 3,67 2,16 5,737 13,663 109 1,0 5994,57 4,17 2,09 5,223 12,727 129 1,1 5895,70 4,24 2,02 4,740 11,563 156

        

      1,2 5376,96 4,65 2,16 3,488 8,593 188

        1,3 4642,82 5,38 1,83 3,243 7,984 207 1,4 4537,02 5,51 1,81 3,022 7,455 220

        

      rate fase gerak tersebut dapat dilihat pada tabel V dan kromatogram hasil optimasi

      fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v) dapat dilihat pada lampiran 7.

      • Klor: kloramfenikol

        Hasil optimasi flow rate bila digambarkan dalam bentuk kurva adalah sebagai berikut (Gambar 28):

        

      Gambar 28. Kurva flow rate vs HETP dengan fase gerak metnanol : aquabides (65 : 35)

        Kurva di atas (Gambar 28) menunjukkan bahwa dengan peningkatan flow

        

      rate tidak selalu meningkatkan nilai HETP namun terdapat suatu kecepatan alir

        optimum yang dapat menghasilkan nilai HETP terkecil hal ini sesuai dengan teori Van Deemter yang ditunjukkan melalui kurva sebagai berikut:

        2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5

        6 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

        H E TP (

        10

      • -3 )

        flow rate fase gerak metanol : aquabides 65 :35 v/v (ml/menit) Dari tabel V dapat diamati bahwa nilai HETP yang paling kecil pada flow

        

      rate 0,5 ml/menit. Namun flow rate tersebut tidak dipilih sebagai kondisi

        optimum karena dari sisi waktu elusi tidak efisien. Flow rate yang dipilih adalah 1,2 ml/menit karena memiliki nilai HETP yang cukup kecil, resolusi yang memenuhi syarat, waktu elusi yang efisien dan tekanan kolom yang diinginkan (kurang dari 197,4 atm).

      B. Verifikasi Sistem KCKT Hasil Optimasi

        Verifikasi sistem KCKT ini berfungsi untuk mengetahui sistem KCKT siap untuk digunakan atau tidak dan untuk memperoleh data yang reprodusibel pada saat analisis. Beberapa uji yang dilakukan untuk menguji kesiapan sistem yang dilakukan antara lain verifikasi sistem injeksi, uji kesesuaian sistem dan verifikasi akurasi pompa.

      1. Verifikasi sistem injeksi

        Verifikasi sistem injeksi yang dilakukan pada penelitian ini adalah ketelitian injeksi. Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan suatu injektor untuk menggambarkan jumlah yang sama dari suatu sampel yang diinjeksikan secara berulang. Parameter yang digunakan untuk menilai ketelitian injektor adalah nilai CV dari respon (AUC dan tinggi peak) 10 kali hasil injeksi baku dengan konsentrasi yang sama. Nilai CV yang memenuhi syarat adalah

        ≤ 1,0 % (Snyder, 1997). Hasil penetapan presisi injeksi dapat dilihat dari tabel VI dan kromatogram dan nilai AUC, waktu retensi dan peak height verifikasi presisiKCKT dapat dilihat pada lampiran 8.

        

      Tabel VI. Hasil uji kesesuaian sistem dan verifikasi presisi sistem injeksi KCKT

      TR Tinggi peak AUC

        Nilai a Klor HCA Klor HCA Klor HCA 3,461 8,504 117770,6 135770,1 946569,1 2225359,4 ̅

        

      SD 0,009 0,055 895,593 930,234 7918,688 15302,35

      CV 0,27% 0,64% 0,76% 0,68% 0,84% 0,69%

      Range 3,433- 8,340- TR 3,489 8,667

      • a: replikasi injeksi 10 kali TR: time retention AUC: area under curve Klor: kloramfenikol HCA: hidrokortison asetat

        Dari tabel VI di atas dapat dilihat bahwa nilai CV tinggi peak dan AUC dari 10 kali injeksi baik untuk kloramfenikol maupun hidrokortison asetat (HCA) memenuhi syarat, yaitu

        ≤ 1,0 %. Dengan demikian disimpulkan bahwa sistem injeksi KCKT yang digunakan dalam kondisi yang baik dan dapat digunakan untuk analisis.

      2. Uji kesesuaian sistem

        Tujuan uji kesesuaian sistem adalah untuk meyakinkan bahwa sistem KCKT yang digunakan dapat menunjukkan hasil yang memiliki akurasi dan presisi yang dapat diterima. Uji yang dilakukan dalam penelitian ini untuk melihat kesesuaian sistem KCKT adalah waktu retensi (TR) dari 10 kali injeksi baku (kromatogram dapat dilihat pada lampiran 8). Kesesuaian sistem KCKT yang diharapkan adalah TR dari peak kloramfenikol dan HCA selama analisis

        

      Range TR yang diperoleh (Tabel VI) untuk kloramfenikol dan hidrokortison asetat

        (HCA) berturut-turut adalah 3,433-3,489; dan 8,340-8,667 menit. Range TR ini kemudian digunakan sebagai pedoman dalam langkah analisis selanjutnya yaitu pada validasi metode. Pada saat pembuatan kurva baku ataupun penetapan

        

      recovery baku, TR kloramfenikol dan HCA seharusnya tidak boleh keluar dari

      range yang dihasilkan. Namun pada saat pengujian terdapat waktu retensi yang

        berada di luar range. Akan tetapi hal ini masih dapat diterima karena hanya ada beberapa hasil yang menunjukkan penyimpangan tersebut dan nilai r ataupun

        recovery yang dihasilkan masih memenuhi persyaratan.

      3. Verifikasi akurasi pompa

        Uji ini dilakukan untuk mengetahui kinerja pompa KCKT yang digunakan karena kinerja pompa KCKT berpengaruh terhadap kemampuannya untuk mempertahankan ketepatan dan konsistensi laju fase gerak yang pada akhirnya akan berpengaruh pada keterulangan waktu retensi zat. Uji ini dilakukan dengan cara mengukur waktu yang diperlukan untuk menampung 10,0 ml fase gerak kemudian dihitung flow rate yang terukur dan dibandingkan dengan flow rate yang diatur pada sistem. Penyimpangan yang dapat diterima adalah 1 % (Lam, 2004). Hasil perhitungan penyimpangan uji akurasi pompa dapat dilihat pada tabel VII dan data perhitungan penyimpangan flow rate dapat dilihat pada lampiran 14.

        

      Tabel VII. Nilai % penyimpangan flow rate pada uji akurasi pompa KCKT

      % Replikasi penyimpangan

        1 0,83 2 0,83 3 4 0,83 5 0,83

        6 Dari tabel VII di atas dapat diamati bahwa % penyimpangan dari 6 replikasi pengukuran tidak ada hasil yang menunjukkan penyimpangan dari persyaratan. Dengan demikian maka dapat disimpulkan sistem pompa yang digunakan pada penelitian ini memiliki akurasi yang baik.

      C. Pembuatan Kurva Baku

        Pembuatan kurva baku bertujuan untuk mendapatkan persamaan regresi linear yang dapat digunakan untuk menghitung kadar kloramfenikol dan hidrokortison asetat untuk penetapan recovery dan penetapan kadar sampel. Persamaan regresi dapat diperoleh dengan mengukur respon dari beberapa konsentrasi analit. Penelitian ini menggunakan 7 seri konsentrasi untuk kloramfenikol ataupun hidrokortison asetat dengan replikasi 3 kali untuk masing- masing zat (contoh kromatogram hasil penetapan kurva baku dapat dilihat pada lampiran 9). Tujuan dilakukannya replikasi adalah untuk memperoleh kurva baku dengan nilai koefisien korelasi paling baik.

        Dari hasil pembuatan kurva baku, rata-rata sudut yang dibentuk oleh kurva hubungan konsentrasi dengan AUC baik kloramfenikol maupun hidrokortison

        o

        asetat sebesar 89,99 . Sudut yang terbentuk ini hampir tegak lurus dan sangat berdempet dengan sumbu Y. Oleh karena itu, dari segi sensitivitas kurva tersebut tidak layak ditampilkan, sehingga diperlukan faktor koreksi agar diperoleh kurva hubungan konsentrasi dan AUC memiliki kemiringan kurang lebih 45

        o

        . Faktor koreksi yang digunakan untuk kloramfenikol adalah 10000 sedangkan untuk hidrokortison asetat adalah 15000, yang selanjutnya akan digunakan sebagai faktor koreksi AUC untuk setiap perhitungan.

        Hasil pembuatan kurva baku kloramfenikol dan hidrokotison asetat dapat dilihat pada tabel VIII (penimbangan baku, contoh perhitungan kadar dan data AUC dapat dilihat pada lampiran 10).

        

      Tabel VIII. Data kurva baku kloramfenikol

      Replikasi I Replikasi II Replikasi III

      Kadar klor (ppm) AUC/ 10000 Kadar klor (ppm) AUC/ 10000 Kadar klor (ppm) AUC/ 10000

        

      99,416 88,859 102,908 92,769 106,651 9,581

      198,832 178,219 205,817 195,405 213,301 187,154

      298,247 272,721 308,725 281,764 319,952 275,658

      397,663 357,538 411,634 382,639 426,602 367,089

      497,079 442,122 514,542 474,144 533,253 480,735

      596,495 542,454 617,451 565,309 639,903 557,636

      695,911 628,667 720,359 649,958 746,554 600,542

      b 0,9043 b 0,9036 b 0,8239 a -0,0959 a 0,5462 a 14,912 r 0,9998 r 0,9997 r 0,9957

      • Klor: kloramfenikol

        80 A U C /10000 Kadar kloramfenikol baku (ppm) y=0,9043x - 0,0959

        10

        70

        60

        50

        40

        30

        20

        70

        

      Gambar 30. Hubungan antara konsentrasi kloramfenikol dengan AUC / 10000 (replikasi I)

      Tabel IX. Data kurva baku hidrokortison asetat

      Replikasi I Replikasi II Replikasi III

      Kadar HCA

        60

        50

        40

        30

        20

        10

        (ppm) AUC/ 15000 Kadar HCA (ppm) AUC/ 15000 Kadar HCA (ppm) AUC/ 15000

      12,5988 13,8566 13,0455 14,5146 12,698 14,1845

      25,1975 27,8021 26,0911 30,6417 25,396 27,7892

      37,7963 42,2318 39,1366 43,9155 38,094 41,0273

      50,3950 55,6392 52,1822 59,6708 50,792 54,5485

      62,9938 68,5642 65,2277 73,9767 63,899 71,6233

      75,5925 83,9015 78,2732 88,2325 76,1879 83,2858

      88,1913 97,2993 91,3188 100,9263 88,8859 89,5390

      b 1,1023 b 1,1073 b 1,0341 a 0,0622 a 1,0572 a 2,0492 r 0,9999 r 0,9996 r 0,9956

      • HCA: hidrokortison asetat

        120 100

        80

      y=1,1023x + 0,0622

        C

        60 U A

        40

        20

        20

        

      40

        60 80 100 Kadar hidrokortison asetat baku (ppm)

        

      Gambar 31. Hubungan antara konsentrasi hidrokortison asetat dengan AUC / 15000

      (replikasi I)

        Pada tabel VIII di atas dapat dilihat bahwa kurva baku kloramfenikol replikasi I dan II memiliki nilai r yang memenuhi syarat, namun yang dipilih untuk digunakan pada perhitungan kadar selanjutnya dalah kurva baku replikasi I karena nilai r-nya lebih besar. Kurva hubungan konsentrasi dengan AUC kloramfenikol tersaji pada gambar 29. Semakin besar nilai r menunjukkan hubungan antara konsentrasi analit dengan respon (AUC) yang ditimbulkan juga lebih besar. Demikian juga untuk hidrokortison asetat, kurva baku yang dipilih adalah replikasi I (tabel IX). Kurva hubungan konsentrasi dengan AUC hidrokortison asetat tersaji pada gambar 30. Dengan demikian persamaan kurva baku yang digunakan untuk kloramfenikol adalah y = 0,9043x - 0,0959, dengan r = 0,9998 dan untuk hidrokortison asetat adalah y = 1,1023x + 0,0622, dengan r = 0,9999.

        

      D. Validasi Metode Penetapan Kadar Hidrokortison Asetat dan

      Kloramfenikol

        Validasi metode analisis dilakukan untuk membuktikan apakah suatu metode memiliki validitas yang baik. Suatu metode dikatakan memiliki validitas yang baik jika parameter-parameter yang diujikan berdasarkan percobaan laboratorium memenuhi persyaratan. Beberapa parameter yang diujikan dalam penelitian ini adalah linearity, akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi dan batas kuantitasi.

        1. Linearity Linearity suatu metode ditunjukkan oleh besarnya nilai koefisien korelasi

        (r) kurva baku. Linearity suatu metode dikatakan baik jika nilai r lebih besar dari 0,999 (Snyder et al., 1997). Dari hasil pembuatan kurva baku nilai r untuk kloramfenikol replikasi I = 0,9998; replikasi II = 0,9997; dan replikasi III = 0,9957 dan nilai r untuk hidrokortison asetat replikasi I = 0,9999; replikasi II = 0,9996; dan replikasi III = 0,9956. Nilai r yang dihasilkan pada setiap replikasi untuk masing-masing zat cukup besar, hal ini menunjukkan metode KCKT mempunyai linearity yang baik dalam menetapkan kadar kloramfenikol dan hidrokortison asetat.

        2. Kecermatan (akurasi)

        Akurasi metode analisis dapat dilihat dari nilai recovery. Penetapan

        

      recovery baku dapat dilakukan dengan 9 pengukuran menggunakan paling sedikit

        3 seri konsentrasi dan masing-masing seri konsentrasi dilakukan replikasi

        Rentang recovery untuk kadar analit pada matriks sampel sebesar 100% dan ≥ 10% adalah 98-102 % (Harmita, 2004). Hasil penetapan recovery kloramfenikol dan hidrokortison asetat seperti ditunjukkan tabel di atas (Tabel X

        CV = 0,62% 56,0648 55,4863

        46,1030 45,6988 99,1232 47,2406 48,0384 100,6887

        ̅ = 99,6624 SD = 0,8892 CV = 0,89%

        Kadar tinggi 46,6418 46,2571 99,1752

        CV = 0,98% 38,4192 38,9546 101,3934 39,6715 39,4902 99,5430

        38,8682 38,8191 99,8738 ̅ = 100,2701 SD = 0,9868

        30,7353 30,8315 100,3129 31,4937 31,3700 99,6073 Kadar sedang

        ̅ = 100,5006 SD = 1,0004 CV = 0,99%

        Kadar rendah 31,0946 31,5864 101,5816

        

      Tabel XI. Hasil penetapan recovery dan CV kloramfenikol

      Level kadar Kadar klor teoritis (ppm) Kadar klor terukur (ppm) Recovery (%) Hasil

        98,9682 56,6606 56,7708 100,1945

        99,7227 ̅ = 99,6285 SD = 0,6186

        11). Hasil penetapan recovery kloramfenikol (Tabel X) dan hidrokortison asetat (Tabel XI) disajikan pada tabel berikut (data AUC, penimbangan dan contoh perhitungan kadar dapat dilihat di lampiran 12):

        Kadar tinggi 62,5590 62,3855

        100,5312 47,2172 46,2526 97,9570

        CV = 1,34% 46,7207 46,9689

        99,8235 ̅ = 99,4372 SD = 1,3299

        Kadar sedang 52,1325 52,0405

        99,5554 37,7737 37,8090 100,0935

        CV = 1,14% 37,3765 37,2103

        101,7527 ̅ = 100,4672 SD = 1,1477

        Kadar rendah 41,7060 42,4370

        Recovery (%) Hasil

        

      Tabel X. Hasil penetapan recovery dan CV hidrokortison asetat

      Level kadar Kadar HCA teoritis (ppm) Kadar HCA terukur (ppm)

      • HCA: hidrokortison asetat
      • Klor: kloramfenikol
      dan XI) menunjukkan masing senyawa berada pada rentang persyaratan recovery yang baik pada setiap level kadar. Dengan demikian metode KCKT yang digunakan mempunyai akurasi yang baik dalam menetapakan kada kloramfenikol dan hidrokortison asetat.

        3. Keseksamaan (presisi)

        Keseksamaan suatu metode analisis diukur sebagai koefisien variasi (KV) atau coefficient of variations (CV). Semakin kecil nilai CV, maka presisi suatu metode semakin baik. Secara umum suatu metode analisis dikatakan memiliki presisi yang baik memiliki nilai CV kurang dari 2 % (Harmita, 2004). Hasil penelitian menunjukkan nilai CV pada penetapan recovery kloramfenikol dan hidrokortison asetat masih memenuhi persyaratan pada ketiga level kadar (Tabel X dan XI). Hal ini menunjukkan bahwa metode KCKT yang digunakan untuk penetapan kadar kloramfenikol dan hidrokortison asetat memiliki presisi yang baik.

        4. Spesifisitas

        Spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya untuk mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin terdapat dalam matriks sampel. Penentuan spesifisitas metode KCKT dapat diamati dari pemisahan peak analit yang dihasilkan. Metode KCKT dikatakan memiliki spesifisitas yang dapat baik jika memiliki nilai Rs ≥ 2. Sedangkan untuk hidrokortison asetat tidak dilakukan perhitungan nilai Rs karena pada kromatogram yang diperoleh (Gambar 28) telah menunjukkan pemisahan penelitian menunjukkan nilai Rs kloramfenikol dengan senyawa lain dalam sampel sebesar 2,16; hasil yang didapatkan telah memenuhi syarat. Oleh karena itu, metode KCKT untuk penetapan kadar kloramfenikol dan hidrokortison asetat menggunakan fase gerak metanol : aquabides (65 : 35) v/v dengan flow rate 1,2 ml/menit memiliki spesifisitas yang baik.

      5. Batas deteksi dan batas kuantitasi

        Batas deteksi/limit of detection (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang masih memberikan respon berbeda signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas kuantitasi/limit of quantitation adalah parameter pada analisis yang diartikan kadar analit terkecil dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Semakin kecil nilai LOD dan LOQ suatu metode maka dikatakan metode tersebut semakin sensitif. Pada penelitian ini parameter LOD dan LOQ sebenarnya tidak diperlukan karena kloramfenikol dan hidrokortison asetat adalah kandungan utama dalam sampel yang digunakan, namun parameter ini tetap ditentukan untuk menambah kelengkapan data. Nilai LOD untuk kloramfenikol dan hidrokortison asetat berturut-turut adalah 1,28 dan 1,44 ppm sedangkan nilai LOQ 4,28 dan 4,81 ppm (lampiran 13).

        Nilai LOQ ini digunakan untuk menentukan kadar terkecil yang digunakan dalam pembuatan kurva baku. Kadar seri baku hidrokortison asetat yang paling kecil adalah 12,60 ppm sedangkan kloramfenikol 9,94 ppm. Konsentrasi kloramfenikol dan hidrokortison asetat dalam pembuatan kurva baku berada di atas nilai LOQ dari kedua senyawa tersebut, sehingga kurva baku tersebut dapat digunakan untuk perhitungan kadar.

      BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa :

        1. Kondisi yang optimal untuk memisahkan hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam campuran ialah sebagai berikut : Instrumen : Shimadzu LC-10 AD Kolom : Kromasil-100 C 250 x 4,6 mm i.d., 5µm

        18 Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35) Flow rate : 1,2 ml/menit

        AUFs/Attenuation : 0,01/7 Detektor : UV pada 255 nm

        2. Metode penetapan kadar hidrokortison asetat dan kloramfenikol dalam sampel krim topikal dengan KCKT pada kondisi optimum di atas memiliki akurasi yang baik dilihat dari rata-rata nilai recovery untuk hidrokortison asetat dan kloramfenikol 98–102%; presisi yang baik dilihat dari nilai CV < 2%; spesifisitas yang baik ditunjukkan oleh nilai resolusi peak

        ≥ 2; linearity yang baik ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) kurva baku kedua senyawa yang bernilai > 0,999; nilai LOD untuk hidrokortison asetat sebesar 1,44 ppm dan kloramfenikol sebesar 1,28 ppm dan nilai LOQ untuk hidrokortison asetat dan kloramfenikol berturut-turut 4,81 dan 4,28 ppm

      B. Saran

        Perlu dilakukan analisis multikomponen terhadap sampel yang beredar di pasaran yang mengandung kedua senyawa di atas dengan menggunakan metode pada penelitian ini.

      DAFTAR PUSTAKA

        Anief, M., 2003, Ilmu Meracik Obat, 71-72, Gajah Mada University Press, Yogyakarta. Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, edisi III, 143,293-294, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1989, The Merck Index, edisi XI, 2068, 4711, 7727, Merck & Co., Inc, New York. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 189, 436, 1066, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 2006, Obat Dermatitis, diakses tanggal 7 Februari 2009. Anonim, 2007, United State Pharmacopoeia, Edisi 30 (monograph on CD- ROM), United States Pharmacopoeia Convention, Inc. Anonim, 2009a, Hydrocortisonediakses tanggal 7 Februari 2009. Anonim, 2009b, Kloramfenikol, diakses tanggal 7 Februari 2009. Anonim, 2009c, Chloramphenicol, akses tanggal 21 Oktober 2009. ASEAN, 2005, Identification Of Hydrocortisone Acetate, Dexametasone,

        Betametasone, Betametaxone 17-Valerate, Triamcinolone Acetonide in Cosmetics Products By TLC and HPLC, diakses tanggal 7 Februari

        2009. Bartos, J. and Pesez, M., 1979, Colorimetric And Fluorimetric Determination Of

        Steroids diakses tanggal 21 agustus 2009.

        Blanco, M., Coello, J., Iturriaga, H., Maspoch, S., and Villegas, N. ,1999, Kinetic

        Spectrophotometric Determination Of Hydrocortisone Acetate In A Pharmaceutical Preparation By Use Of Partial Leastsquares Regression, Vol 124, Analyst,

        akses tanggal 20 Agustus 2009. Boer, Y. and Pijnenburg, V., 1983, HPLC Determination of Chloramphenicol

        Degradation in Eye Drops,

         diakses tanggal 7 Februari 2009. Chauhan, V. and Conway, B., 2005, Optimisation of a Selective Liquid

        

      Chromatography Procedure for Hydrocortisone Acetate,

      Hydrocortisone Alcohol and Preservatives in a Pharmaceutical Emulsion, vol Chromatographia,

        61,

        akses tanggal 11 Februari 2009. Clarke, E.G.C., 1986, Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceutical,

        Body Fluid and Post-Mortem Material, hal 246, 370, 509, Pharmaceuticals Press, London.

        Eboka, C. J., Smart, J., and Adelusi, S.A., 2003, An Alternative Colorimetric

        Method for The Determination of Chloramphenicol, Vol 2, Trop J Pharm Resdiakses tanggal

        7 Agustus 2009. Gritter, R. J., Bobbit, J. M., and Schwarting, A. E., 1991, Introduction to

        Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Edisi III, 186-187, ITB, Bandung.

        Hajkova R., Solich P., Dvorak J., and Sıcha J., 2003, Simultaneous

        Determination Of Methylparaben,Propylparaben, Hydrocortisone Acetate And Its Degradation Products In A Topical Cream By RP- KCKT, Vol 32, J. Pharm. Biomed. Anal., akses tanggal 3 Februari 2009.

        Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, 5-25, Departemen Farmasi FMIPA UI, Depok. Ian, T., 1995, Farmakologi dan Terapi, diterjemahkan oleh Ganiswara, S. G.,

        Edisi IV, 214, Bagian Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta. Iqbal, M.S., Shad, M.A., Ashraf, M.W., Bilal, M., and Saeed, M., 2006,

        Development and Validation of an HPLC Method for the Determination

      of Dexamethasone, Dexamethasone Sodium Phosphate and

      Chloramphenicol in Presence of Each Other in Pharmaceutical Preparations, Vol 64, Chromatographia,

        akses tanggal 11 Februari 2009. Johnson E. L. and Stevenson R., 1978, Basic Liquid Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 6-9,17-25,90-91,99-103, Penerbit ITB, Bandung.

        Kamata, K., Kan, T., Yoshihara, T. and Harada, H., 1982, Determination of

        Corticosteroid in Cosmetics by High Performance Liquid Chromatography,

         akses tanggal 19 Oktober 2009. Khalil, S. A. H., Shah, A. H. and Al-Shareef, H., 1993, A Reverse Phase HPLC

        Method for the Determination of Chloramphenicol and Its Hydrolytic Product in Ophthalmic Solutions,

        akses tanggal 21 Oktober 2009. Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, 189, diterjemahkan oleh A.

        Saptohardjo, Pendamping Agus Nurhadi, UI Press, Jakarta. Kromidas, S., 2000, Pratical Problem Solving in HPLC, 2, Wiley-VCH, Weinheim.

        Kuwana, 1980, Physical Methods in Modern Chemical Analysis, Vol. II, hal 13, Academic Press, New York. Lam, H., 2004, Performance Verification of HPLC, akses tanggal 19 April

        2009. Li X, 1998, Determination Of Two Components In Chloramphenicol And

        Hydrocortisone Ear Drops By High Performance Liquid Chromatography, vol 16,

        diakses tanggal 5 April 2009. Mulja, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik

        (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Indonesia Airlangga, III (2), hal 71-76, Universitas Airlangga Press, Surabaya. Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 6-11,26,31,34 Universitas Airlangga, Surabaya. Munson, J.W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan oleh Harjana, Parwa.B,15,33-34, Universitas Airlangga Press, Surabaya. Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, 16-17, UGM, Yogyakarta.

        ., 2007, Latest papers on

        Chloramphenicol Therapeutic Use,

        akses tanggal 11 April 2009. Pescok, R. L., Shields, L. D., and Cains, T., 1976, Modern Methods of Chemical

        nd Analysis, 2 ed, 51, John Wiley Sons, Canada.

        Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, 8-12, 17-19, Penerbit Liberty, Yogyakarta. Shih,I.K., 1979, Degradation Products Of Chloramphenicol, diakses tanggal 11 Februari 2009. Singh, D.K. and Verma, R., 2008, Spectrophotometric Determination of

        Corticosteroids and Its Application in Pharmaceutical Formulation,

         7,

        IJPT, diakses tanggal 24 Oktober 2009 rd

        Skoog, D. A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, 3 Ed., 185-188, Saunders College Publishing, Japan. Skoog, D.A., Holler, F.J., and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental

        th Analysis, Fifth 5 edition, 329-351, Harcourt Brace College Publishers, Philadelphia.

        Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method

        nd Development, 2 Edition, 13, 690, 710, 722-723, JohnWiley & Sons, Inc., New York.

        Willard, H.H., Merritt, Jr., Dean, J.A, and Settle Jr, F.A., 1988, Instrumental

        th Methods of Analysis, 7 Edition, 614-615, Wadsworth Publishing Company, California.

        LAMPIRAN

        Lampiran 1. Sertifikat analisis hidrokortison asetat

        Lampiran 2. Sertifikat analisis kloramfenikol

        

      Lampiran 3. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kloramfenikol

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (55 : 45 v/v)

      Flow rate : 2,0 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        Lampiran 4. Kromatogram baku kloramfenikol

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (55 : 45 v/v)

      Flow rate : 2,0 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol Detektor : UV 255 nm

        Lampiran 5. Contoh perhitungan N, HETP dan Rs

        Kromatogram: Fase gerak metanol aquabides (60 : 40) dan Flow rate 1,9 Skala pada kromatogram: 1 cm = 0,9749 menit

      • Perhitungan N W kloramfenikol = 0,14 cm x 0,9749 = 0,1365 menit

        1/2

        t R kloramfenikol = 4,397 menit

        2

        t

        R

        N = 5,54 � �

        W

        1/2

        2

        4,397 N = 5,54

        � � 0,1365

        N = 5748,54

      • Perhitungan HETP

        L

        HETP =

        N

        25 −3

        HETP = = 4,35. 10

        5748 ,54

      • Perhitungan Rs W = kloramfenikol = 0,1365 menit

        0,5.1

        W 0,5.2 = peak didekat kloramfenikol = 0,13 cm x 0,9749 = 0,1267 menit

        1,18 (tR2-tR1)

        Rs =

        W + W 0,5.1 0,5.2

        1,18 (4,907 - 4,397) =

        0.1365 + 0,1267

        = 2,29

        Lampiran 6. Kromatogram hasil penurunan flow rate fase gerak metanol : aquabides (60 : 40 v/v)

      a. Flow rate 1,9 ml/menit

        

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (60 : 40 v/v)

      Flow rate : 1,9 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      b. Flow rate 1,8 ml/menit

        

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (60 : 40 v/v)

      Flow rate : 1,8 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      c. Flow rate 1,7 ml/menit

        

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (60 : 40 v/v)

      Flow rate : 1,7 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        Lampiran 7. Kromatogram hasil optimasi flow rate fase gerak metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      a. Flow rate 0,4 ml/menit

        

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 0,4 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      b. Flow rate 0,5 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 0,5 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      c. Flow rate 0,6 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 0,6 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      d. Flow rate 0,7 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 0,7 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      e. Flow rate 1,0 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,0 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      f. Flow rate 1,1 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,1 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      g. Flow rate 1,2 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      h. Flow rate 1,3 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,3 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

      i. Flow rate 1,4 ml/menit

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,4 ml/menit Injeksi : sampel Detektor : UV 255 nm

        Lampiran 8. Kromatogram dan hasil penetapan presisi injeksi

      Nilai AUC, peak height dan waktu retensi verifikasi sistem KCKT

        Replikasi TR Tinggi peak AUC

        Klor HCA Klor HCA Klor HCA

        1 3,466 8,528 115756 133996 930712 2199544 2 3,458 8,507 117238 135796 947164 2228268 3 3,463 8,503 117761 136354 951399 2230139 4 3,457 8,476 117194 135742 941542 2213294 5 3,454 8,452 117773 136430 939418 2210788 6 3,448 8,435 117945 136994 946409 2216370 7 3,449 8,448 118493 136035 946524 2230283 8 3,469 8,545 118433 135768 952024 2239815 9 3,475 8,617 118158 134334 959270 2251120

        10 3,472 8,525 118955 136252 951229 2233973

        Replikasi 1

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        Replikasi 2

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        Replikasi 3

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        Replikasi 4

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        Replikasi 5

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        Replikasi 6

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        Replikasi 7

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        Replikasi 8

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        Replikasi 9

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        Replikasi 10

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku kloramfenikol dan hidrokortison asetat Detektor : UV 255 nm

        

      Lampiran 9. Kromatogram kurva baku hidrokortison asetat dan

      kloramfenikol replikasi I

        a. Seri 1

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (10 ppm) dan HCA (12,5 ppm) Detektor : UV 255 nm b. Seri 2

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (20 ppm) dan HCA (25 ppm) Detektor : UV 255 nm c. Seri 3

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (30 ppm) dan HCA (37,5 ppm) Detektor : UV 255 nm d. Seri 4

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (40 ppm) dan HCA (50 ppm) Detektor : UV 255 nm e. Seri 5

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (50 ppm) dan HCA (62,5 ppm) Detektor : UV 255 nm f. Seri 6

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (60 ppm) dan HCA (75 ppm) Detektor : UV 255 nm g. Seri 7

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v)

      Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (70 ppm) dan HCA (87,5 ppm) Detektor : UV 255 nm

        Lampiran 10. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku

        1. Penimbangan baku hidrokortison asetat dan kloramfenikol

        Replikasi Kloramfenikol (mg) HCA (mg)

        1 7,97 10,15 2 8,25 10,51 3 8,55 10,23

        2. Skema kerja singkat pembuatan seri larutan baku Hidrokortison asetat 10 mg dan kloramfenikol 8 mg dilarutkan dalam metanol p.a hingga 10,0 ml

        ↓ Ambil 0,125; 0,250; 0,375; 0,500; 0,625; 0,750; dan 0,875 ml dari larutan diatas, dan ditambahkan dengan 10,0 ml fase gerak metanol : aquabides

        (65 :35)

        3. Data AUC baku

        Kloramfenikol

      Replikasi I Replikasi II Replikasi III

      Kadar klor (ppm) AUC Kadar klor (ppm) AUC Kadar klor (ppm) AUC

        

      99,416 88859 102,908 92769 106,651 95810

      198,832 178219 205,817 195405 213,301 187154

      298,247 272721 308,725 281764 319,952 275658

      397,663 357538 411,634 382639 426,602 367089

      497,079 442122 514,542 474144 533,253 480735

      596,495 542454 617,451 565309 639,903 557636

      695,911 628667 720,359 649958 746,554 600542

        Klor: kloramfenikol

        Hidrokortison asetat Replikasi I Replikasi II Replikasi III Kadar Kadar HCA Kadar HCA AUC AUC AUC HCA (ppm) (ppm) (ppm)

      125,988 207849 130,455 217719 12,698 212768

      251,975 417031 260,911 459626 25,396 416838

      377,963 633477 391,366 658733 38,094 615409

      503,950 834588 521,822 895062 50,792 818228

      629,938 1028463 652,277 1109650 63,899 1074349

      755,925 1258522 782,732 1323488 761,879 1249287

      881,913 1459489 913,188 1513894 888,859 1343085

        HCA : hidrokortison asetat

        4. Contoh perhitungan kadar baku (Replikasi I) HCA

        → tingkat kemurnian 99,3 % (berdasarkan COA) Jumlah HCA = 10,15 mg x 99,3 % = 10,079 mg Cstok = 10,079 mg / 10 ml = 1007,9 ppm C V = C

        V

        1

        1

        2

        2 Seri I 2 x 10 ml

        → 1007,9 ppm x 0,125 ml = C C

        2 = 12,5988 ppm

        Kloramfenikol → tingkat kemurnian = 99,79 % (berdasarkan COA)

        Jumlah Kloramfenikol = 7,97 mg x 99,79 % = 7,953263 mg Cstok = 7,953263 mg / 10 ml = 795,3263 ppm C

        1 V 1 = C

        2 V

        2 Seri I

        → 795,3263 ppm x 0,125 ml = C2 x 10 ml C

        2 = 9,9416 ppm

        NB: Perhitungan kadar seri baku lainnya dilakukan sama seperti cara di atas dengan menyesuaikan volume pengambilan baku induk (V ) yang

        1 dilakukan.

        Lampiran 11. Kromatogram hasil validasi metode

      a. Kadar Rendah

        Replikasi I

        

      Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (32 ppm) dan HCA (40 ppm) Detektor : UV 255 nm Replikasi II

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit

      Injeksi : baku klor (32 ppm) dan HCA (40 ppm) Detektor : UV 255 nm Replikasi III

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit

      Injeksi : baku klor (32 ppm) dan HCA (40 ppm)

      Detektor : UV 255 nm

      b. Kadar sedang

        Replikasi I

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (40 ppm) dan HCA (50 ppm) Detektor : UV 255 nm Replikasi II

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit

      Injeksi : baku klor (40 ppm) dan HCA (50 ppm) Detektor : UV 255 nm Replikasi III

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit

      Injeksi : baku klor (40 ppm) dan HCA (50 ppm)

      Detektor : UV 255 nm

      c. Kadar Tinggi

        Replikasi I

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit Injeksi : baku klor (48 ppm) dan HCA (60 ppm) Detektor : UV 255 nm Replikasi II

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit

      Injeksi : baku klor (48 ppm) dan HCA (60 ppm) Detektor : UV 255 nm Replikasi III

        Instrumen : Varian Shimadzu LC-10 AD

      Fase diam : Kromasil-100 C18 250 x 4,6 mm, 5 µm

      Fase gerak : metanol : aquabides (65 : 35 v/v) Flow rate : 1,2 ml/menit

      Injeksi : baku klor (48 ppm) dan HCA (60 ppm)

      Detektor : UV 255 nm

        

      Lampiran 12. Data penimbangan dan contoh perhitungan penetapan

      recovery

        1. Penimbangan bahan

        Zat Replikasi I Replikasi II Replikasi III

        HCA (mg) 10,50 9,41 9,51 Kloramfenikol (mg) 7,79 7,7 7,89

      • * HCA: hidrokortison asetat

        2. Data AUC kloramfenikol dan hidrokortison asetat

        Level kadar HCA Klor AUC

      AUC/

      15000

      AUC AUC/ 10000

        Kadar rendah 702607 468,405 284677 284,677 616187 410,791 277850 277,850 626086 417,391 282720 282,720

        Kadar sedang 861396 574,264 350082 350,082 777540 518,360 351307 351,307 765696 510,464 356151 356,151

        Kadar tinggi 1032446 688,297 417344 417,344 918372

        612,248 412295 412,295 939610 626,407 433452 433,452

      • HCA: hidrokortison asetat Klor: kloramfenikol

        3. Contoh perhitungan recovery (Volume pengambilan larutan stok baku induk campuran hidorkortison asetat 1000 ppm dan kloramfenikol 800 ppm untuk kadar rendah 0,4 ml, kadar sedang 0,5 ml dan kadar tinggi 0,6 ml) HCA Replikasi I

      • Perhitungan kadar teoritis

        HCA = 10,5 x 99,3 % (tingkat kemurnian HCA) = 10,4265 mg Cstok = 10,4265 mg / 10,0 ml = 1042,65 ppm

        C

        1 V 1 = C

        2 V

        2 Kadar rendah x 10 ml

        2

        → 1042,65 ppm x 0,4 ml = C C

        2 = 41,706 ppm

        Kadar sedang

        2 x 10 ml

        → 1042,65 ppm x 0,5 ml = C C = 52,1325 ppm

        2 Kadar tinggi 2 x 10 ml

        → 1042,65 ppm x 0,6 ml = C C = 62,559 ppm

        2

      • Perhitungan kadar terukur y=1,1023x + 0,0622 y=AUC hidrokortison asetat/15000 Kadar rendah

        → 46,8405 = 1,1023x + 0,0622 x = 42,4370 ppm Kadar sedang

        → 57,4264 = 1,1023x + 0,0622 x = 52,0405 ppm Kadar tinggi

        → 68,8297 = 1,1023x + 0,0622 x = 62,3855 ppm

      • Perhitungan recovery kadar teru kur

        Recovery = x 100%

        kadar teor itis Replikasi I

        42,4370

        Kadar rendah x 100 % = 101,7527 % →

        41,706 52,0405

        Kadar sedang x 100 % = 99,8235 % →

        52,1325 62,3855

        Kadar tinggi x 100 % = 99,7227 % →

        62,559 Kloramfenikol replikasi I

      • Perhitungan kadar teoritis

        Klor = 7,79 mg x 99,79 % (tingkat kemurnian klor) = 7,77364 mg Cstok = 7,77364 mg / 10,0 ml = 777,364 ppm C V = C

        V

        1

        1

        2

        2 Kadar rendah 2 x 10 ml

        → 777,364 ppm x 0,4 ml = C C = 31,0946 ppm

        2 Kadar sedang 2 x 10 ml

        → 777,364 ppm x 0,5 ml = C C

        2 = 38,8682 ppm

        Kadar tinggi x 10 ml

        2

        → 777,364 ppm x 0,6 ml = C C

        2 = 46,6418 ppm

      • Perhitungan kadar terukur y = 0,9043x - 0,0959 y = AUC kloramfenikol / 10000 Kadar rendah

        → 28,4677 = 0,9043x - 0,0959 x = 31,5864 ppm Kadar sedang

        → 35,0082 = 0,9043x - 0,0959 x = 38,8191 ppm Kadar tinggi

        → 41,7344 = 0,9043x - 0,0959 x = 46,2571 ppm

      • Perhitungan recovery kadar teru kur

        Recovery = x 100%

        kadar teor itis Replikasi I

        31,5864

        Kadar rendah x 100 % = 101,5816 % →

        31,0946 38,8191

        Kadar sedang x 100 % = 99,8738 % →

        38,8682 46,2571

        Kadar tinggi x 100 % = 99,1752% →

        46,6418

        Lampiran 13. Contoh perhitungan LOD dan LOQ

        , 4443 ppm

        10 LOQ = × = 

        10

        4 1023 , 1 5307 ,

        , 8145 ppm

          = b x y Sb

           

        3 LOD = × =

        3

        1 1023 , 1 5307 ,

          n y y x y

        1. Perhitungan nilai batas deteksi dan batas kuantitasi hidrokortison asetat Kadar HCA (ppm) AUC

        − ∑ =    

        2 ' Sb 2 = = −

        1

        5 4081 ,

        ( ) 5307 ,

        y = 1,1023x + 0,0622 Contoh perhitungan AUC teoritis: y = 1,1023x + 0,0622 y = 1,1023 (12,5988) + 0,0622 y = 13.9501

        Σ=1,4081

        25,1975 417031 27,8021 27,8378 0,0358 0,0013 37,7963 633477 42,2318 41,7257 -0,5061 0,2561 50,3950 834588 55,6392 55,6135 -0,0257 0,0007 62,9938 1028463 68,5642 69,5014 0,9372 0,8783 75,5925 1258522 83,9015 83,3891 -0,5123 0,2625 88,1913 1459489 97,2993 97,2770 -0,0222 0,0005

        AUC/15000 (y) AUC teoritis (y') y'-y (y'-y)2 12,5988 207849 13,8566 13,9501 0,0935 0,0087

             = b x y Sb

        2. Perhitungan nilai batas deteksi dan batas kuantitasi kloramfenikol

        1 9043 , 3869 ,

           

        10 LOQ = × =

        10

        

      4

      9043 , 3869 ,

        , 2784 ppm

             = b x y Sb

        3 LOD = × = 

        3

        , 2835 ppm

        Kadar klor (ppm) AUC AUC/10000

          n y y x y

           

        Sb 2 = = − − ∑ =

        5 7486 , 2 '

        ( ) 3869 ,

        y = 0,9043x – 0,0959 Contoh perhitungan AUC teoritis: y = 0,9043x – 0,0959 y = 0,9043 (9,9416) – 0,0959 y = 8,8943

        Σ=0,7486

        

      19,8832 178219 17,8219 17,8845 0,0626 0,0039

      29,8247 272721 27,2721 26,8746 -0,3975 0,1580

      39,7663 357538 35,7538 35,8648 0,1110 0,0123

      49,7079 442122 44,2122 44,8550 0,6428 0,4131

      59,6495 542454 54,2454 53,8451 -0,4003 0,1602

      69,5911 628667 62,8667 62,8353 -0,0314 0,0010

        (y) AUC teoritis (y') y'-y (y'-y)2

      9,9416 88859 8,8859 8,8943 0,0084 0,0001

          = b x y Sb

      BIOGRAFI PENULIS

        Penulis skripsi yang berjudul “Optimasi Pemisahan Campuran Hidrokortison Asetat Dan Kloramfenikol Dalam Krim Merek “X” Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” ini bernama lengkap Henny Puspitasari, lahir di Ketapang, Kalimantan Barat pada tanggal 5 April 1988. Merupakan anak bungsu dari lima bersaudara pasangan

        Erwin Wijaya dan Lim Khe Ngi. Penulis telah menyelesaikan pendidikannya di Sekolah Dasar Pangudi Luhur Usaba Ketapang pada tahun 2000, di Sekolah Menengah Pertama Pangudi Luhur St. Albertus Ketapang pada tahun 2003 dan di Sekolah Menengah Atas St. Yohanes Ketapang pada Tahun 2006. Penulis kemudian melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2006. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia, Botani Dasar, Kimia Analisis, dan Analisis Sediaan Obat Tradisional.

        Selain kegiatan akademik penulis juga pernah mengikuti berbagai kegiatan non- akademik yaitu pernah menjadi pemain basket putri dalam kejuaraan Liga Basket Mahasiswa 2006 dan dalam Pharmacy Event Cup 2007 dan 2008, mengikuti kepanitiaan seperti Pharmacy Performance dan Event Cup 2008, ISMAFARSI, Sumpahan Apoteker angkatan XVI dan menjadi ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi periode 2009-2010.

Dokumen baru

Tags

Dokumen yang terkait

Validasi metode peneantuan kadar apigenin dalam ekstrak seledri dengan kromatografi cair kinerja tinggi
0
11
47
Optimasi metode bioanalisis kafein dalam sampel darah orang Jawa dengan metode kromatogafi cair kinerja tinggi fase terbalik.
0
1
80
Penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi pemutih kulit merek ``X`` secara kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik.
2
22
125
Optimasi komposisi dan kecepatan alir fase gerak metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merk ``X``.
0
10
99
Validasi metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek "X".
1
1
114
Validasi metode analisis alopurinol dalam tablet secara spektrofotometri dan jamu secara kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik serta aplikasinya.
3
12
143
Optimasi metode bioanalisis kafein dalam sampel darah orang Jawa dengan metode kromatogafi cair kinerja tinggi fase terbalik
0
4
78
Optimasi dan validasi metode penetapan kadar bisfenol A. dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik.
1
5
198
Optimasi komposisi fase gerak pada pemisahan campuran deksametason dan deksklorfeniramin maleat secara kromatografi lapis tipis densitometri.
1
13
104
Optimasi pemisahan dan penetapan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobartial dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik.
3
10
129
Analisis campuran parasetamol salisilamida dan kafein dalam tablet secara kromatografi cair kinerja tinggi [KCKT].
3
34
104
Validasi metode analisis alopurinol dalam tablet secara spektrofotometri dan jamu secara kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik serta aplikasinya
4
20
141
Pengaruh paparan radiasi sinar matahari terhadap kadar bisfenol A dalam botol plastik jenis polikarbonat yang ditetapkan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik
1
2
163
Optimasi pemisahan dan penetapan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobartial dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik - USD Repository
0
0
127
Validasi penetapan kadar campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik...[abstrak tidak bisa diupload] - USD Repository
0
3
130
Show more