Uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak metanol daun Piper Crocatum Ruiz - USD Repository

Gratis

0
0
48
3 weeks ago
Preview
Full text
(1)PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK METANOL DAUN Piper Crocatum Ruiz & Pav. TERHADAP Staphylococcus aureus RESISTEN AMPICILLIN SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Diajukan oleh: Anastasianus Hendriana NIM : 158114032 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2018

(2) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK METANOL DAUN Piper Crocatum Ruiz & Pav. TERHADAP Staphylococcus aureus RESISTEN AMPICILLIN SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Diajukan oleh: Anastasianus Hendriana NIM : 158114032 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2018 i

(3) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ii

(4) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 99 iii

(5) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN “Therefore do not worry about tomorrow For tomorrow will worry about itself Each day has enoµgh trouble of it’s own” Matthew 6 : 34 Karya ini kupersembahkan untuk : Allah Bapa di Surga, Tuhan Yesus Kristus, Serta Bunda Maria Pengantara Doaku Bapak, Ibu, Mas Banar, Mas Ardi, serta seluruh keluarga besar tercinta Anindyasari dan seluruh teman-teman yang selalu menyemangatiku Serta almamaterku Universitas Sanata Dharma iv

(6) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI v

(7) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI vi

(8) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala rahmat penyertaan, bimbingan dan kasih karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK METANOL DAUN Piper Crocatum Ruiz & Pav. TERHADAP Staphylococcus aureus RESISTEN AMPICILLIN” dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Dalam penyusunan skripsi ini, penulis mendapatkan banyak bantuan, dukungan, dan bimbingan dari berbagai banyak pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta serta selaku Dosen Pembimbing skripsi yang telah sabar memberikan banyak sekali ilmu, saran, masukan, bantuan dan bimbingan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini 2. Ibu Dr. Chrstine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan izin untuk penggunaan segala fasilitas laboratorium selama penelitian, serta selaku penguji skripsi yang telah memberikan saran, masukan dan bantuan selama penyusunan skripsi ini. 4. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan saran, masukan dan bantuan selama penyusunan skripsi ini. 5. Mas Antonius Dwi Priyana dan Mas Sarwanto selaku Sekretariat S1 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang memberikan informasi selama perkuliahan dan ujian serta membantu dalam kelancaran skripsi ini. vii

(9) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 6. Pak Yohanes Wagiran dan Mbak Intan yang telah membantu pengerjaan penelitian skripsi ini di laboratorium. 7. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah mengajar dan membantu saya selama perkuliahan 8. Orang Tua saya Bapak Waradi Margiyanta dan Ibu Yohana Mujiem yang telah mendidik serta menyayangi saya hingga sampai saat ini, Mas Ardi, Mas Banar dan seluruh keluarga besar yang telah menyemangati dan memberi dukungan selama proses pengerjaan skripsi ini. 9. Josephine Anindyasari Kristanto yang telah memberikan semangat dalam bentuk cinta dan kasih sayang selama proses pengerjaan skripsi ini 10. Johannes Sianturi Baskoro teman seperjuangan dari SMA hingga kuliah ini yang selalu memberikan dukungan selama kuliah dan pengerjaan skripsi ini. 11. Teman-teman meja 2, Tommy, Epen, Cinta, Misty, Galang, Tiara dan Erlin yang selalu semangat dalam bekerjasama dalam keadaan senang dan sedih setiap praktikum 12. Teman-teman skripsi saya, Nadia, Epen, Manda, Galang, Pipit, Bryant yang selalu membantu dan menyemangati saya dalam proses pengerjaan skripsi ini. 13. Teman-teman kelas FSMA 2015 serta seluruh angkatan 2015 yang telah memberikan keceriaan didalam kelas maupun diluar kelas selama saya berkuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma ini. 14. Pengurus inti PSM Cantus Firmus 2017/2018, Erlin, Charles, Kevin, Nindy, Yovita, Klara, Rista yang telah menyemangati saya selama ini. 15. Segenap keluarga besar PSM Cantus Firmus yang telah memberikan warna dalam dinamika kehidupan dan perkuliahan lewat alunan lagu yang sering kita nyanyikan bersama 16. Pengurus Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma periode 2016/2017 serta seluruh teman-teman kepanitiaan viii

(10) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ix

(11) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRAK Latar belakang : Meningkatnya resistensi bakteri Staphylococcus aureus terhadap antibiotik memerlukan pengobatan lain salah satunya dengan daun sirih merah, ekstrak metanol daun sirih merah diketahui memiliki senyawa antibakteri seperti fenol, flavonoid dan terpenoid, maka dalam penelitian ini dibuat fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah untuk mengetahui aktivitas antibakteri, serta dideteksi dengan metode bioautografi kontak untuk melihat senyawa antibakteri yang berperan dalam menghambat bakteri Staphylococcus aureus resisten ampicillin. Metode : Uji zona hambat, KHM dan KBM serta metode bioautografi kontak digunakan untuk menguji aktivitas senyawa antibakteri yang berperan dalam menghambat bakteri Staphylococcus aureus. Uji statistik menggunakan KruskalWallis dan perbedaan tiap kelompok uji dengan post hoc Mann-Whitney. Hasil : Uji aktivitas antibakteri fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah menunjukkan bahwa fraksi 3 dan 4 memiliki aktivitas antibakteri dengan zona hambat berturut-turut 8,33 mm dan 4,17 mm dan nilai KBM pada konsentrasi 250 mg/ml. Analisis statistik dengan post hoc Mann-Whitney menunjukkan adanya perbedaan bermakna dari tiap perlakuan dengan nilai signifikansi <0,05. Kesimpulan : Fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus resisten ampicillin dengan diameter zona hambat sebesar 8,33 ± 0,2887 mm dan nilai KHM 15,6 mg/ml serta KBM 250 mg/ml, metode bioautografi kontak dalam penelitian ini belum mendeteksi senyawa antibakteri yang berperan secara spesifik dan melalui uji kualitatif dideteksi terdapat salah satu senyawa antibakteri yaitu flavonoid. Kata kunci : Staphylococcus aureus, sirih merah, antibakteri, bioautografi, resistensi antibiotic. x

(12) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT Background The increasing resistance of Staphylococcus aureus to antibiotics requires another treatment, one of which is red betel leaf, methanolic extract of red betel leaf is known to have antibacterial compounds such as phenols, flavonoids and terpenoids, in this study VLC fraction of methanol extract of red betel leaves was used to determine antibacterial activity , and detected by contact bioautography methods to see antibacterial compounds that play a role in inhibiting ampicillinresistant Staphylococcus aureus. Method : The inhibitory zone test, KHM, KBM and bioautography methods are used to test the aktivitas of antibacterial compounds that play a role in inhibiting Staphylococcus aureus bacteria. Statistical tests using Kruskal-Wallis and differences in each test group with post-hoc Mann-Whitney. Results : The antibacterial aktivitas of methanol fraction of red betel leaf showed that fractions 3 and 4 had antibacterial aktivitas with inhibition zones, respectively 8.33 mm and 4.17 mm and KBM values at a concentration of 250 mg / ml. The post hoc Mann-Whitney statistical analysis showed a significant difference from each treatment with a significance value <0.05. Conclusion : VLC fraction from methanol extract of red betel leaf has antibacterial activity against ampicillin-resistant Staphylococcus aureus with inhibition zone diameter of 8.33 ± 0.2887 mm and MIC value of 15.6 mg / ml and KBM 250 mg / ml, contact bioautography method in research this has not detected antibacterial compounds that play a specific role and through qualitative tests detected there is one antibacterial compound, namely flavonoids. Keywords: Staphylococcus aureus, red betel, antibacterial, bioautography, antibiotic resistance. xi

(13) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL........................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iii HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... iv LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................ v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.............................. vi PRAKATA .......................................................................................................... vii ABSTRAK .......................................................................................................... x ABSTRACT .......................................................................................................... xi DAFTAR ISI ....................................................................................................... xii DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv PENDAHULUAN .............................................................................................. 1 METODE PENELITIAN .................................................................................... 3 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................... 8 KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 20 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 21 LAMPIRAN ........................................................................................................ 24 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 32 xii

(14) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel 1. Penggabungan fraksi berdasarkan uji KLT ........................................... 10 Tabel 2. Keterangan nilai Rf dan warna pada deteksi flavonoid dengan KLT ... 19 xiii

(15) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Profil KLT hasil fraksi VLC ekstrak metanol daun sirih merah ....... 9 Gambar 2. Kontrol media dan kontrol pertumbuhan bakteri .............................. 10 Gambar 3. Uji resistensi bakteri Staphylococcus aureus .................................... 11 Gambar 4. Uji zona hambat fraksi dari ekstrak metanol daun sirih merah ........ 12 Gambar 5. Uji KHM fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah ........... 14 Gambar 6. Uji KBM fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah ........... 15 Gambar 7. Optimasi fase gerak etil asetat : toluen (9:1 v/v) ............................... 15 Gambar 8. Uji bioautogtafi kontak...................................................................... 16 Gambar 9. Uji Tabung senyawa flavonoid ......................................................... 17 Gambar 10. Uji KLT senyawa flavonoid ............................................................ 18 xiv

(16) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat determinasi tanaman Piper crocatum Ruiz & Pav. ............... 24 Lampiran 2. Surat identifikasi bakteri Staphylococcus aureus ........................... 25 Lampiran 3. Sertifikat pengujian statistik dengan SPSS ..................................... 26 Lampiran 4. Hasil perhitungan statistik .............................................................. 27 xv

(17) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PENDAHULUAN Staphylococcus aureus merupakan bakteri patogen yang menyebabkan infeksi klinis. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri Staphylococcus aureus yaitu bakteremia, endokarditis infektif, osteoartikular, infeksi pada kulit dan jaringan lunak serta pleuropulmonari (Tong et al, 2015). Infeksi akibat bakteri ini sering terjadi melalui folikel rambut, tusukan jarum atau melalui saluran pernafasan. Bakteri ini dapat menghasilkan enzim koagulase yang mengkoagulasi fibrin disekitar lesi dan didalam saluran getah bening, mengakibatkan pembentukan jaringan fibrosis. Salah satu obat untuk mengatasi infeksi akibat bakteri ini adalah antibiotik, namun penggunaan antibiotik yang kurang tepat (irrasional), terlalu singkat, dosis yang terlalu rendah, diagnosa awal yang salah dapat menjadi beberapa faktor yang menyebabkan resistensi terhadap bakteri ini. Faktor yang berhubungan dengan pasien yaitu pengetahuan pasien yang rendah akan pengobatan cenderung menganggap penggunaan antibiotik wajib digunakan dalam penanganan penyakit yang tidak sesuai indikasinya seperti flu, batuk, pilek dan demam yang bukan karena infeksi bakteri. Kemampuan ekonomi pasien dalam membeli obat juga mempengaruhi ketuntasan regimen terapi yang dijalani pasien (Triana, 2014). Intensitas penggunaan antibiotik yang relatif tinggi dapat menimbulkan permasalahan bagi kesehatan terutama terjadinya resistensi bakteri terhadap antibiotik. Resistensi ini berdampak pada morbiditas dan mortalitas, juga memberi dampak negatif terhadap ekonomi dan sosial yang sangat tinggi. Pada awalnya resistensi terjadi di tingkat rumah sakit, tetapi lambat laun juga berkembang di lingkungan masyarakat, khususnya Streptococcus pneumoniae (SP), Staphylococcus aureus, dan Escherichia coli. Penggunaan antibiotik seperti penisilin dan metisilin di pertengahan abad ke-20 efektif untuk melawan bakteri Staphylococcus aureus. Namun, bakteri Staphylococcus aureus cepat mengalami resistensi terhadap antibiotik tersebut karena penggunaan antibiotik yang kurang tepat di masyarakat, seperti penicillin-resistance Staphylococcus aureus (PRSA) hingga methicillin-resistance Staphylococcus aureus (MRSA) yang sulit untuk diobati (Dantes et al, 2011). Mesikpun terdapat perkembangan pengobatan, MRSA 1

(18) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI tetap menjadi ancaman bagi kesehatan manusia di dunia. Menurut data dari central for Disease Kontrol and Prevention (2014), Diestimasi terdapat 72.444 kasus infeksi MRSA yang terjadi di Amerika Serikat pada tahun 2014. Menurut Kementrian Kesehatan Republik Indonesia (2015), angka kematian akibat resistensi antimikroba sampai tahun 2014 sebesar 700.000 per tahun. Kejadian resistensi bakteri terhadap antibiotik yang terus meningkat dapat diatasi dengan penggunaan tanaman obat sebagai alternatif antibiotik. Salah satu tanaman obat yang sering digunakan yaitu sirih merah. Tanaman sirih diketahui memiliki efek antiseptik. Sirih merah diolah secara tradisional menjadi sediaan infusia dan digunakan sebagai antiseptik, anti diabetes, anti kanker, dan untuk mengobati berbagai penyakit infeksi (Lister et al. 2014). Senyawa fitokimia pada tanaman yang memiliki aktivitas antibakteri yaitu fenol, polifenol, quinon, flavonoid, tannin, terpenoid, alkaloid. Ekstraksi dengan pelarut metanol dapat digunakan untuk melarutkan senyawa terpenoid, tannin, flavonoid dan alkaloid (Pharsant et al, 2011). Penelitian sebelumnya menunjukkan hasil ekstrak metanol daun sirih merah dengan konsentrasi 150 mg/mL, 300 mg/mL, 450 mg/mL dan 600 mg/mL memiliki zona hambat sebesar 9,0 mm; 11,2 mm; 13,6 mm dan 15,7 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus resisten metisilin (MRSA), serta melalui skrining fitokimia didapatkan senyawa flavonoid, triterpenoid, saponin dan tannin (Rinanda, 2012). Pada penelitian (Reveny et al. 2012) fraksi hasil VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah dapat menghambat bakteri Staphylococcus aureus dengan KHM 10% serta pada penelitian (Rachmawaty et al, 2018) KBM dan KHM ekstrak metanol daun sirih merah pada konsentrasi 12,5% dan melalui uji KLT didapatkan senyawa tannin dan flavonoida. Pada penelitian (Kusumaningtyas et al, 2008) metode bioautografi kontak digunakan untuk mendeteksi senyawa antibakteri dari bahan alam yang berperan dalam menghambat bakteri. Oleh karena itu, peneliti ingin mengetahui KHM dan KBM fraksi hasil VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus resisten antibiotik serta mengetahui senyawa antibakteri teraktif yang terdapat pada daun sirih merah dengan metode bioautografi kontak. 2

(19) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini : Erlenmeyer, tabung reaksi, labu ukur, pipet tetes, pH meter, cawan petri, batang pengaduk, gelas ukur, sendok, pelubang sumuran, shaker, autoclave, oven, rotary evaporator, incubator, microbiology safety cabinet, neraca analitik, bunsen, jarum ose, flakon, chamber, mikrokapiler, kertas saring, lempeng KLT. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini : Bakteri Staphylococcus aureus, media Nutrient Agar, Nutrient Broth, DMSO 10%, marker kuersetin, etil asetat, metanol, kloroform, toluen, Bufferd Pepton water, aquades steril dan daun sirih merah. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman sirih merah dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta Pengumpulan Bahan Uji Daun sirih merah diperoleh dari daerah Sleman, Yogyakarta. Daun sirih merah yang dipilih adalah daun sirih dengan permukaan halus, tidak berlubang dan bewarna hijau kemerahan dan keperakan. Pembuatan Simplisia Daun sirih merah dipisahkan dari pengotor dan dibersihkan dengan air mengalir. Setelah dicuci, daun dijemur selama 1 hari di sinar matahari tidak secara langsung namun ditutup kain hitam, kemudian daun dipotong melintang. Setelah dipotong, daun dikeringkan dengan oven dengan suhu 60°C. Daun yang telah kering diserbuk dengan blender dan diayak dengan pengayak nomor 50 (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011; Departemen Kesehatan RI, 1985). 3

(20) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah Pada penelitian ini ekstraksi berdasarkan penelitian sebelumnya dilakukan dengan pelarut kloroform terlebih dahulu, ampas dari hasil ekstraksi dengan pelarut kloroform kemudian diekstraksi dengan pelarut metanol. Tahapan maserasi yaitu dengan merendam 10 gram serbuk daun sirih merah, kemudian dilarutkan dalam 100 ml metanol. Maserasi dilakukan selama 1x24 jam dengan bantuan shaker. Hasil maserat yang diperoleh disaring dengan corong Buchner yang dilapisi kertas saring dengan bantuan pompa vakum. Serbuk hasil penyaringan dimaserasi dengan pelarut metanol kembali sebanyak 100 ml selama 1x24 jam. Hasil maserat pertama dan kedua kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 60°C untuk menguapkan pelarut pada ekstrak. Ekstrak diletakan pada cawan petri dan diuapkan kembali pada waterbath pada suhu 60°C untuk menghilangkan pelarut yang mungkin masih ada dalam ekstrak. Ekstrak yang didapat merupakan ekstrak kental dengan bobot tetap yang telah dipersyaratkan. Selanjutnya, rendemen dihitung dengan rumus: Bobot ekstrak (g) % Rendemen = x 100% Bobot simplisia yang dihitung (g) Pembuatan Fraksi VLC dari Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah (FMDSM) Fraksinasi dilakukan dengan metode Vacum Liquid Chromatography dengan fase gerak yang digunakan secara berturut-turut dalam volume 200 ml adalah kloroform 200 ml; kloroform-metanol (6:4 v/v); kloroform-metanol (5:5 v/v); kloroform-metanol (2:8 v/v); dan metanol 200 ml (Hartini et al, 2013). Hasil dari fraksinasi akan diuapkan dengan rotary evaporator untuk menghilangkan pelarut yang masih tertinggal dalam fraksi, lalu setiap fraksi akan dielusi dalam 15 ml volume fase gerak kloroform-metanol (1:9 v/v) lalu diamati profil senyawanya pada KLT, profil senyawa yang diamati adalah jarak faktor retensi (Rf), pengamatan visual berupa warna senyawa pada setiap spot yang nampak pada lempeng KLT setelah disinari dengan sinar UV 254 nm dan UV 365 nm (Kumar et al, 2012). Hasil profil senyawa yang sama akan digabungkan menjadi satu fraksi. 4

(21) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Pembuatan Larutan Stok Ciprofloxacin Tablet ciprofloxacin 500 mg digerus dan dilarutkan dalam 100 ml aquadest steril sehingga didapat konsentrasi 5 mg/ml, lalu diambil 1 ml kemudian dimasukkan pada labu takar 100 ml dan ditambahkan aquadest steril hingga batas tanda atau tepat pada volume 100 ml, sehingga didapatkan konsentrasi larutan antibiotik ciprofloxacin sebesar 50 µg/ml. Uji Resistensi Bakteri Staphylococcus aureus terhadap Ampicillin Biakan bakteri diinokulasikan pada medium NA dengan cara spread plate. Cakram ampicillin 10 µg diletakkan pada permukaan medium kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Zona hambat yang dihasilkan disekitar cakram diukur. Dinyatakan resisten bila diameter zona hambat ≤28 mm, intermediet dan sensitif bila zona hambat ≥29 mm (CLSI, 2017). Penyiapan Bakteri Uji dan Suspensi Bakteri Penyiapan bakteri uji mengikuti pedoman Clinical and Laboratory Standards Institute (2017). Kultur bakteri Staphylococcus aureus diambil 2-3 ose ke NB steril dan digores ke NA miring kemudian diinkubasi (37°C, 24 jam) untuk mendapatkan stok bakteri. Sebelum digunakan, stok bakteri diambil secukupnya dan diencerkan dengan Buffered Pepton Water (BPW) kemudian disetarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mc Farland 0.5 dengan nephelometer Pembuatan Kontrol Pertumbuhan dan Kontrol Kontaminasi Media Kontrol pertumbuhan bakteri dibuat dengan cara menambahkan 1 mL suspensi bakteri pada media NA steril yang masih cair, lalu divortex agar media NA dengan suspensi bakteri dapat tercampur, kemudian secara pour dituang didalam cawan petri lalu biarkan memadat, dan diinkubasi selama 24 jam lalu dilakukan pengamatan. Kontrol kontaminasi media dibuat dengan cara menuangkan 20 mL media NA steril secara pour plate didalam cawan petri lalu biarkan memadat, dan diinkubasi selama 24 jam lalu dilakukan pengamatan. 5

(22) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Uji Daya Antibakteri Fraksi VLC dari Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah Penyiapan cawan petri, dituang 5 ml NA steril ke dalam cawan petri lalu dibiarkan memadat sebagai base layer agar. Lalu diambil 1 ml suspensi bakteri Staphylococcus aureus, lalu diinokulasikan ke dalam 15 ml media NA secara pour plate, kemudian dituang secara merata sebagai seed layer agar diatas base layer agar, lalu dibiarkan memadat. Dibuat 6 sumuran dengan pelubang sumuran no.4, setiap sumuran berisi 50 µL kontrol positif (berupa antibiotik ampicillin), 50 µL kontrol negatif (berupa DMSO 10%), dan sisanya berisi 50 µL tiap fraksi lalu diinkubasi selama 24 jam. Lalu dilihat fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri paling baik, dilihat dari diameter zona hambat yang dihasilkan. Pengukuran zona hambat dilakukan setelah inkubasi dan dalam satuan mm. Zona hambat yang terukur adalah zona di sekitar sumuran yang keruh namun masih lebih jernih dibandingkan dengan pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus sekitarnya. Uji Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) Penentuan nilai KHM menggunakan dilusi cair. Fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah dilarutkan dalam DMSO 10% dan dibuat dalam konsentrasi 250; 125; 62,5; 31,3; 15,6; 7,8; 3,9; 1,9 mg/ml. Kemudian masingmasing konsentrasi fraksi yang telah dilarutkan diambil 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 10 mL media NB, kemudian diinokulasikan 1 mL suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan di vortex, lalu di inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dan dilakukan pengamatan. Pada media NB pada konsentrasi fraksi terkecil yang tidak terdapat pertumbuhan bakteri ditandai dengan tingkat kekeruhanya ditentukan sebagai KHM. Identifikasi Kualitatif Senyawa Flavonoid Uji kualitatif senyawa flavonoid dilakukan dengan uji tabung dan uji KLT. Sampel fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah yang paling aktif dilarutkan dengan metanol dan ditambahkan logam Mg dan 5-6 tetes asam klorida, larutan akan terbentuk menjadi warna merah jika terdapat flavonol dan terbentuk 6

(23) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI warna oranye jika terdapat flavanon. Uji secara KLT dengan fase diam silica gel dan fase gerak etil asetat : toluen (9:1 v/v) akan terbentuk warna kuning pada sinar tampak, pemadaman pada sinar UV 254 nm, dan warna hitam, kuning, biru atau hijau pada sinar UV 365 nm (Hartini et al, 2013). Preparasi Lempeng Kromatografi Lapis Tipis untuk Uji Bioautografi Kontak Senyawa antibakteri pada fraksi teraktif dari ekstrak metanol daun sirih merah diambil meggunakan pipa kapiler lalu diteteskan sebanyak 10 tetes pada lempeng KLT dengan fase diam silika gel dan dielusi dalam 15 ml volume fase gerak dengan perbandingan pelarut etil asetat : toluen (9:1 v/v). Uji Bioautografi Kontak Lempeng KLT yang sudah dipreparasi di tempelkan menghadap lapisan media NA yang sudah berisi suspensi bakteri Staphylococcus aureus yang telah di spread pada permukaan media, kemudian ditunggu selama 45 menit agar senyawa dalam lempeng KLT dapat terdifusi dalam media NA, kemudian lepas lempeng KLT tersebut dan diinkubasi selama 24 jam untuk melihat daya hambat yang terjadi. Adanya daya hambat bakteri ditunjukan dengan zona jernih dari setiap spot yang terdapat pada permukaan media agar. Tata Cara Analisis Hasil Analisis data diukur secara statistik yang diawali dengan menguji distribusi normalitas dengan uji Shapiro-Wilk. Uji homogenitas dilakukan dengan uji Levene. Apabila didapati data terdistribusi normal dengan nilai p > 0,05 dan variansi data homogen, maka dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA. Apabila ditemukan perbedaan, maka dilanjutkan Post-Hoc Tukey pada taraf kepercayaan 95%. Jika data tidak terdistribusi secara normal yaitu p < 0,05 maka dilanjutkan dengan uji Kruskal-Wallis, jika terdapat perbedaan dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney pada taraf kepercayaan 95%. 7

(24) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HASIL DAN PEMBAHASAN Determinasi sampel tanaman daun sirih merah dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Determinasi dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri morfologi pada tanaman sirih merah dengan acuan kepustakaan, disertai dengan surat keterangan (Lampiran 1). Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah Piper crocatum Ruiz & Pav. dan dikenal dengan nama lokal yaitu sirih merah. Daun sirih merah yang telah dikumpulkan kemudian dilakukan sortasi basah untuk memisahkan sampel yang hendak diambil dengan bahan-bahan lain yang kemungkinan terdapat pada sampel, misalnya batang, pengotor dan bagian tanaman lain yang tidak diperlukan dan dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya dilakukan proses pengeringan bertujuan untuk mempermudah proses penyerbukan daun sirih merah dan mengurangi kadar air pada simplisia sehingga diharapkan tidak ditumbuhi oleh bakteri ataupun jamur. Pengeringan dilakukan dalam oven, dan dilakukan hingga daun sirih merah telah kering sempurna, ditandai dengan daun mudah diremas sehingga mudah dibuat dalam bentuk serbuk, hasil penimbangan setelah daun sirih merah kering yaitu 244 gram. Selanjutnya dilakukan penyerbukan dan pengayakan simplisia daun sirih merah kering dan didapatkan serbuk daun sirih merah sebanyak 236 gram. Selanjutnya ditetapkan kadar air dengan destilasi toluena, diestilasi toluena digunakan untuk menentukan kadar air terutama bagi bahan alam yang mengandung senyawa aromatik, destilasi dilakukan pada suhu 40-60ºC (Steltenphol et al, 2005). Sirih merah diketahui memiliki beberapa senyawa aromatik salah satunya yaitu terpenoid (Pharsant et al, 2011) dan pada penelitian ini suhu yang digunakan untuk destilasi toluena yaitu 50 ºC dan hasil kadar air yang didapatkan sebesar 4,8879%. Kadar air pada serbuk simplisia yang baik <10% (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011) sehingga kadar air pada simplisia daun sirih merah yang digunakan sudah memenuhi kriteria serbuk simplisia yang baik. Pada penelitian ini pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi, digunakan ekstrasi dengan cara maserasi karena bertujuan agar senyawa yang tidak tahan panas seperti minyak atsiri dan flavonoid tidak menguap dan hilang, senyawa 8

(25) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI tersebut yang diharapkan terdapat dalam pengujian efek antibakteri (Liu et al. 2014). Ekstrak yang didapat kemudian disaring menggunakan corong Buchner dan serbuk hasil penyaringan dilakukan remaserasi kembali menggunakan pelarut metanol. Hasil maserasi kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 60°C selanjutnya didapatkan ekstrak kental dan diukur bobot tetap yaitu dengan cara 2 kali penimbangan secara berturut-turut tidak lebih dari 0,5 mg (Depkes RI, 1986). Ekstrak kental yang didapatkan yaitu sebesar 21,1446 gram dan rendemen yang didapatkan sebesar 9,087%. Selanjutnya dilakukan fraksinasi hasil ekstrak metanol daun sirih merah, fraksinasi dilakukan menggunakan Vacuum Liquid Chromatography. Pelarut yang digunakan berturut-turut sebanyak 200 ml yaitu dengan kloroform 200 ml; kloroform-metanol (6:4 v/v); kloroform-metanol (5:5 v/v); kloroform-metanol (2:8 v/v); dan metanol 200 ml. Hasil fraksinasi ditampung dalam gelas beker kemudian diuapkan dalam rotary evaporator sehingga didapatkan fraksi kental. Setiap fraksi kemudian diuji pada lempeng KLT dengan fase gerak kloroform: metanol (1:9 v/v) dalam 15 ml didalam chamber, KLT yang digunakan adalah lempeng KLT silika gel GF254 yaitu lempeng silika gel yang dapat berflouresensi pada panjang gelombang 254 nm. Setelah dilakukan pengamatan KLT (gambar 1) didapatkan hasil 4 fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah (tabel 1). A B C D E A B C D E UV 365 nm UV 254 nm Gambar 1. Profil KLT hasil fraksi VLC ekstrak metanol daun sirih merah 9

(26) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Keterangan gambar : A. Fraksi 1 (metanol 200 ml); B. Fraksi 2 (Kloroformmetanol 2:8 v/v); C. Fraksi 3 (Kloroform-metanol 5:5 v/v); D. Fraksi 4 (Kloroformmetanol 6:4 v/v); E. Fraksi 5 (Kloroform 200 ml). Tabel 1. Penggabungan fraksi berdasarkan hasil uji KLT fraksi hasil VLC ekstrak metanol daun Piper crocatum Ruiz & Pav. Selanjutnya dilakukan sterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan untuk uji antibakteri. Pertama dilakukan uji kontrol kontaminasi media yaitu dengan menuangkan 20 ml media NA steril kedalam cawan petri lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, selanjutnya pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji, bakteri Staphylococcus aureus yang digunakan telah dideterminasi di laboratorium (lampiran 2) yaitu dengan menuangkan 20 ml media NA yang telah diitambahkan 1 ml bakteri Staphylococcus aureus dan telah divortex ke dalam cawan petri dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, lalu dilakukan pengamatan. (a) (b) Gambar 2. (a) kontrol media ; (b) kontrol pertumbuhan bakteri 10

(27) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa pada kontrol kontaminasi media terlihat jernih, maka media NA yang digunakan tidak terdapat kontaminan, sedangkan pada kontrol pertumbuhan bakteri, didapatkan bakteri Staphylococcus aureus dapat tumbuh dan tersebar merata, sehingga media NA yang digunakan dapat digunakan untuk menumbuhkan bakteri Staphylococcus aureus. Selanjutnya dilakukan uji resistensi bakteri Staphylococcus aureus terhadap antibiotik ampicillin, dengan cara menuangkan 0,2 ml bakteri staphylococcus aureus ke permukaan media NA yang telah memadat dengan bantuan spreader, dilakukan hingga suspensi bakteri tersebar merata, lalu di tengah diletakkan cakram ampicillin 10 µg dan diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C. Gambar 3. Uji resistensi bakteri Staphylococcus aureus terhadap ampicillin Menurut CLSI (2017) zona hambat ampicillin terhadap bakteri Staphylococcus aureus diukur dan dinyatakan resisten apabila diameter zona hambat ≤ 28 mm, intermediet dan sensitif bila ≥ 29 mm, dari hasil pengamatan diperoleh diameter zona hambat sebesar 1 mm hal tersebut membuktikan bahwa bakteri Staphylococcus aureus yang digunakan resisten terhadap antibiotik ampicillin. Selanjutnya persiapan uji antibakteri dari masing-masing fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah. Pertama, dilakukan pemilihan pelarut fraksi yang akan digunakan yaitu DMSO 10%, pelarut tersebut digunakan karena tidak memiliki efek antibakteri dan dapat digunakan sebagai kontrol. Kemudian 11

(28) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI dilakukan pengenceran setiap fraksi dengan DMSO 10% yaitu sebesar 250 mg/mL setiap fraksi. Kemudian dilakukan pengenceran antibiotik sebagai kontrol positif yaitu antibiotik ciprofloxacin sebesar 50 µg/ml dan pembuatan suspensi bakteri uji Staphylococcus aureus dengan konsentrasi setara 0,5 larutan Mc Farland. Kemudian, pembuatan base layer yaitu dengan menuangkan 5 mL media NA steril kedalam cawan petri dan ditunggu hingga memadat, dilanjutkan 15 mL media NA yang telah ditambahkan 1 mL suspensi bakteri Staphylococcus aureus yang telah di vortex dituangkan pada permukaan base layer dan dibiarkan memadat sehingga terbentuk seed layer. 5 . 4 . 3 . 1 2 . 6 . Gambar 4. Uji zona hambat fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah Keterangan gambar: 1. Kontrol positif (ciprofloxacin 50 µg/ml), 2. Kontrol negatif (DMSO 10%), 3. Fraksi 1 (250 mg/ml); 4. Fraksi 2 (250 mg/ml); 3. Fraksi 3 (250 mg/ml); 4. Fraksi 4 (250 mg/ml). Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah yaitu fraksi 3, fraksi 4 dan kontrol positif (antibiotik ciprofloxacin 50 µg/ml) membentuk zona hambat disekitar lubang sumuran, secara berturut-turut diameter zona hambat yang terbentuk yaitu 8,33; 4,17 dan 18,5 mm, sedangkan pada fraksi 1 dan fraksi 2 tidak terdapat zona hambat yang terbentuk, dikarenakan pada fraksi 1 dan fraksi 2 memungkinkan adanya kontaminasi sehingga tidak terbentuk zona hambat, serta adanya endapan pada fraksi tersebut mengakibatkan adanya bercak pada sekeliling lubang sumuran dan cairan fraksi yang meluber ke sekeliling lubang sumuran juga berdampak pada pekatnya zona 12

(29) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI yang terbentuk diskeliling lubang sumuran, sehingga pada fraksi 1 dan 2 tidak terbentuk zona hambat bakteri yang ditandai dengan adanya zona jernih. Pada kontrol negatif yaitu DMSO 10% tidak terbentuk zona hambat, hal ini membuktikan bahwa pelarut yang digunakan dalam pembuatan konsentrasi tiap fraksi tidak memiliki efek antibakteri sedangkan pada penelitian sebelumnya (Rinanda, 2012) menunjukkan hasil ekstrak metanol daun sirih merah dengan konsentrasi 150 mg/mL, 300 mg/mL, 450 mg/mL dan 600 mg/mL memiliki zona hambat sebesar 9,0 mm; 11,2 mm; 13,6 mm dan 15,7 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus resisten antibiotik. Dari hasil tersebut dapat dikatakan bahwa fraksi 3 dengan konsentrasi 250 mg/ml merupakan fraksi teraktif yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus resisten ampicillin namun aktivitas antibakteri yang dihasilkan tidak sebesar aktivitas antibakteri dari ekstrak metanol daun sirih merah pada penelitian sebelumnya (Rinanda, 2012). Menurut (Nopiyanti et al, 2016) dikatakan diameter zona hambat sangat kuat jika ≥ 20 mm, kuat jika 10-20 mm, sedang 5-10 mm dan dikatakan lemah jika ≤ 5mm, maka zona hambat fraksi 3 sebesar 8,3 mm menunjukkan zona hambat yang sedang terhadap bakteri Staphylococcous aureus resisten ampicillin. Konsentrasi hambat minimum (KHM) merupakan konsentrasi terkecil dari senyawa antibakteri yang dapat menghambat penuh pertumbuhan bakteri. Pada penentuan KHM ini digunakan fraksi 3 karena memiliki aktivitas antibakteri paling besar dibandingkan fraksi yang lain. KHM ditentukan dengan menggunakan dilusi cair dengan media yang digunakan adalah nutrient broth (NB) dan hasilnya dibandingkan dengan kontrol pertumbuhan bakteri dan kontrol media. Fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah dibuat dalam berbagai varian konsentrasi, yaitu 250; 125; 62,5; 31,3; 15,6; 7,8; 3,9; 1,9 mg/ml, setiap varian konsentrasi fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah dimasukkan kedalam tabung yang berisi NB dan 1 ml bakteri Staphylococcus aureus lalu divortex dan diinkubasi selama 24 jam. Dari hasil pengamatan terlihat bahwa konsentrasi 15,6; 7,8; 3,9; dan 1,9 masih terlihat keruh sama seperti kontrol pertumbuhan, sedangkan konsentrasi 250; 125; 62,5; dan 31,3 terdapat perbedaan warna dikarenakan adanya warna yang dihasilkan dari fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah yang digunakan. 13

(30) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan bahwa konsentrasi 15,6 mg/ml fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah merupakan KHM sedangkan pada penelitian (Rachmawaty et al, 2018) KHM ekstrak metanol daun sirih merah pada konsentrasi 12,5%, hasil tersebut menunjukkan bahwa fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah memiliki KHM yang lebih besar dibandingkan ekstrak metanol daun sirih merah, sehingga dibutuhkan konsentrasi fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah untuk menghambat bakteri Staphyloccous aureus resisten ampicillin. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gambar 5. Hasil uji konsentrasi hambat minimum (KHM) fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah Keterangan gambar : 1. Kontrol media, 2. FMDSM 250 mg/ml; 3. FMDSM 125 mg/ml; 4. FMDSM 62,5 mg/ml; 5. FMDSM 31,3 mg/ml; 6. FMDSM 15,6 mg/ml; 7. FMDSM 7,8 mg/ml; 8. FMDSM 3,9 mg/ml ; 9. FMDSM 1,9 mg/ml dan 10. Kontrol pertumbuhan. Selanjutnya dilakukan pengujian konsentrasi bunuh minimum (KBM). KBM merupakan konsentrasi terkecil dari senyawa antibakteri yang dapat membunuh penuh bakteri. KBM dilakukan dengan cara sub kultur dari media NB dari konsentrasi FMDSM 250; 125; 62,5 dan 31,3 mg/ml kedalam media NA steril yang telah dibagi menjadi 4 kuadran dengan cara streak plate dan diinkubasi selama 24 jam. Hasil yang didapatkan bahwa FMDSM 125; 62,5 dan 31,3 mg/ml masih terdapat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus sedangkan pada FMDSM 250 mg/ml terlihat jernih dan tidak terdapat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus. Sehingga nilai KBM fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah adalah pada konsentrasi 250 mg/ml, sedangkan pada penelitian (Rachmawaty et al, 14

(31) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2018) KBM ekstrak metanol daun sirih merah pada konsentrasi 12,5% sehingga pada penilitan ini dibutuhkan lebih banyak konsentrasi fraksi VLC dari ekstrak metanol untuk membunuh bakteri Staphyloccous aureus resisten ampicillin. Gambar 6. Hasil uji konsentrasi bunuh minimum UV 365 nm (KBM) fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih Gambar UV 254 nm 7. Optimasi merah. Keterangan gambar: 1. FMDSM 250 mg/ml; fase gerak etil asetat : 2. FMDSM 125 mg/ml; 3. FMDSM 62,5 mg/ml; 4. toluen (9:1 v/v) FMDSM 31,3 mg/ml. Selanjutnya dilakukan optimasi fase gerak pada lempeng KLT untuk melihat pemisahan profil senyawa pada fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah, fase gerak yang digunakan yaitu etil asetat : toluen (9:1 v/v) dalam volume 15 ml, optimasi dilakukan dengan meneteskan 2 tetes fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah yang teraktif yaitu fraksi 3 dengan konsentrasi 250 mg/ml dan didapatkan hasil pemisahan senyawa yang cukup baik pada gambar 7. Selanjutnya dilakukan bioautografi, uji ini menggunakan metode bioautografi kontak, metode ini dugunakan untuk mendeteksi adanya senyawa antibakteri ditandai dengan adanya daerah jernih yang tidak ditumbuhi oleh bakteri (Kusumaningtyas et al., 2018). Lempeng KLT ditotolkan FMSDM 250 mg/ml sebanyak 10 tetes dan dielusi dengan fase gerak etil asetat : toluen (9:1 v/v), lempeng KLT yang sudah kering lalu ditempelkan pada media NA yang permukaannya sudah berisi bakteri Staphylococcus aureus, lalu ditunggu selama 45 menit agar senyawa berdifusi dalam media agar, lalu lempeng KLT diangkat dan 15

(32) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI media diinkubasi selama 24 jam. Hasil bioautografi menunjukkan adanya aktivitas antibakteri dengan ditunjukannya zona jernih pada permukaan media NA pada gambar 8B, namun senyawa yang berperan dalam menghambat bakteri pada uji bioautografi ini tidak jelas karena senyawa tidak terpisah secara sempurna atau tailing pada gambar 8A, hal tersebut dikarenakan beberapa fakor lain seperti fase gerak yang tidak bisa memisahkan senyawa secara baik, konsentrasi zat antibakteri yang terlalu kecil, sifat lipofilitas senyawa antibakteri dengan media agar yang digunakan, jika sifatnya tidak sama maka kemampuan senyawa antibakteri untuk berdifusi pada media sangat rendah, sehingga menyebabkan terbentuknya zona jernih pada permukaan media agar kurang baik (Dewanjee et al, 2014). Pada uji bioautografi kontak tidak adanya aktivitas antibakteri bisa terjadi karena interaksi beberapa senyawa pada fraksi (Ambarwati, 2017) serta konsentrasi fraksi hasil kromatografi yang didapat terlalu kecil dapat berpengaruh terhadap aktivitas antibakteri yang terjadi karena kandungan komponen senyawa yang terdapat pada fraksi menentukan aktifitas bioaktif dari bahan tersebut (Ali et al, 2016). A B Gambar 8. Uji aktivitas antibakteri fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah dengan metode kontak bioautografi. Keterangan gambar : A. Hasil profil senyawa elusi pada plat KLT, B. Hasil profil bioautografi kontak pada media NA setelah inkubasi 24 jam Selanjutnya dilakukan uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid pada fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah. Menurut (Kesarkar et al, 2009) dalam 0,05% larutan senyawa dalam pelarut metanol mengandung sekitar 5-10 µg 16

(33) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI flavonoid, maka dalam penilitan ini dilakukan 2 uji kualitatif yaitu dengan uji tabung dan uji KLT, Uji tabung dilakukan melarutkan fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah kemudian ditambahkan logam Mg dan 5-6 tetes asam klorida, larutan akan menjadi merah untuk flavonol dan oranye untuk flavanon (Hartini et al, 2013). (a) (b) Gambar 9. Uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid dengan uji tabung Dari hasil pengamatan terdapat perubahan warna menjadi warna merah setelah dilakukan uji tabung pada fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah, perubahan warna merah mengindikasikan adanya senyawa flavonol yaitu salah satu jenis flavonoid dan dapat dikatakan bahwa fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah mengandung senyawa flavonoid. Senyawa flavonol contohnya adalah kuersetin, maka pada uji kualitatif selanjutnya dilakukan uji KLT dengan marker kuersetin. Selanjutnya dilakukan uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid pada fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah, sebagai marker digunakan senyawa kuersetin. Senyawa kuersetin dan fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah dengan konsentrasi 250 mg/ml di totolkan pada lempeng KLT dan dielusi dengan fase gerak etil asetat : toluen (9:1 v/v), adanya flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning pada sinar tampak, pemadaman pada sinar UV 254 nm, dan warna hitam, kuning, biru atau hijau pada sinar UV 365 nm (Hartini, 2013) . 17

(34) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5 4 1* 3 4 3 2 2 1 1* 1* 3 2 1 1 * A B a.UV 365 nm * A * B b.UV 254 nm A B c FeCl3 Gambar 10. Uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid dengan metode KLT Keterangan gambar : A. Marker Kuersetin B. FMDSM Pada uji KLT didapatkan hasil bahwa fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah memiliki kandungan flavonoid yaitu kuersetin, dengan nilai rf marker kuersetin sebesar 0,71 dan nilai Rf kandungan flavonoid pada FMDSM sebesar 0,7. Deteksi senyawa flavonoid digunakan penyemprotan FeCl3, sehingga senyawa flavonoid terdeteksi menjadi warna biru kehitaman. Menurut (Kesarkar et al, 2009) pada sinar UV 254 nm flavonoid dapat berflouresensi hal tersebut ditunjukan pada lempeng KLT gambar 10b bahwa pada deteksi sinar UV 254 nm senyawa flavonoid pada no 3 bewarna kuning kehitaman, sedangan pada sinar UV 365 nm senyawa flavonoid akan tampak dengan warna kuning, hal tersebut sesuai pada lempeng KLT gambar 10a dengan deteksi sinar UV 365 nm, terdapat warna kuning pada no.3, senyawa flavonol seperti kuersetin, myricetin dan senyawa glikosida lain akan menghasilkan warna oranye-kuning saat penyemprotan reagen, menurut (Alcantara et al, 2017) reagen FeCl3 dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa flavonoid dan fenol dan menurut (Ghosh, 1987) reagen yang paling efektif untuk mendeteksi senyawa flavonoid adalah AlCl3, pada penelitian ini deteksi senyawa flavonoid menggunakan penyemprotan reagen FeCl3 dan didapatkan warna kuning kehitaman pada gambar 10c no.3 pada lempeng KLT setelah penyemprotan. 18

(35) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel 2. Keterangan nilai Rf dan warna pada deteksi flavonoid dengan KLT UV 365 nm nm UV 254 nm nm Berdasarkan analisis statistik (lampiran 4) untuk mengetahui kebermaknaan perbedaan antara masing-masing fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah dengan kontrol positif dan kontrol negatif didapatkan uji ShapiroWilk dengan nilai signifikansi <0,05 menunjukkan data tidak terdistribusi secara normal. Uji Levene dengan nilai signifikansi <0,05 menunjukkan distribusi data tidak homogen, sehingga dilanjutkan uji Kruskal-Wallis yang menunjukkan adanya perbedaan signifikan pada data dengan nilai signifikansi <0,05 selanjutnya dilanjutkan uji Post-Hoc Mann-Whitney. Diameter zona hambat fraksi 3 dan fraksi 4 berbeda bermakna secara statistik terhadap kontrol positif dan kontrol negatif, pada perbandingan dengan kontrol negatif didapatkan perbedaan nilai zona hambat yang bermakna karena pada kontrol negatif tidak ada nilai zona hambat yang terbentuk. Sedangkan pada kontrol positif nilai zona hambat yang dihasilkan jauh lebih besar dibandingkan nilai zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 3 dan 4 sehingga terlihat perbedaan yang bermakna, maka didapatkan bahwa daya aktivitas antibakteri fraksi 3 > fraksi 4 dalam konsentrasi fraksi 250 mg/ml. 19

(36) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI KESIMPULAN DAN SARAN Fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah teraktif yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus yaitu pada fraksi 3 dengan konsentrasi 250 mg/ml dan dengan hasil diameter zona hambat sebesar 8,33 ± 0,2887 mm, sedangkan nilai KHM 15,6 mg/ml dan KBM fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah berada pada konsentrasi 250 mg/ml. Deteksi senyawa antibakteri dengan metode bioautografi kontak belum terdeteksi secara baik karena senyawa antibakteri mengalami tailing pada permukaan media agar, dan uji kualitatif senyawa antibakteri didapatkan positif senyawa flavonoid pada fraksi VLC dari ekstrak metanol daun sirih merah. Saran, perlu dilakukan uji bioautografi kontak dengan fase gerak lain yang dapat memisahkan senyawa secara baik, dengan mempertimbangkan sifat lipofilitas senyawa dan media agar yang digunakan, serta konsentrasi senyawa yang dapat berdifusi pada media agar sehingga didapatkan senyawa antibakteri spesifik yang menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus resisten ampicillin, atau dapat menggunakan uji bioautografi yang lain seperti direct TLC bioautographic detection dan immersion or agar overlay bioautography untuk mendeteksi senyawa antibakteri. Perlu dilakukan identifikasi senyawa antibakteri lain selain flavonoid, dan dilakukannya isolasi senyawa antibakteri dari daun sirih merah. 20

(37) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Alcantara, K.P., Abirs M.J.C., Calpotura, M.P., Macarasami S., Manalo, Matias, F.C, and Tamodong C., 2017. Phytochemical Analysis and Determination of Angio Suppresive and Antioxidant Properties of Leaf Extract of Dillenia sibuyanensis (Dilleniaceae): A Pioneer Study. Journal of Cancer Biology & Research 5(3).pp 1-6. Ali, A., Kursia, S., and Nadia. 2016. Deteksi Antibakteri Pada Ekstrak Daun Murbei (Morus Albal.) Dari Beberapa Lokasi Pengambilan Sampel Tanaman Di Sulawesi Selatan. Jurnal Bionature 17(2). pp 69-75. Ambarwati, N.S.S., Malik, A., Listari, A., Nirwana, Elya, B and Hanafri, M., 2017. Antibacterial Activity Of Fractions Of Ethyl Acetate Extract Of Garcinia Lattissima Miq. Fruits. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 10(5). pp.81-84. Centers for Disease Kontrol and Prevention. 2014. Active Bacterial Core Surveillance Report, Emerging Infections Program Network, MethicillinResistant Staphylococcus aureus. https://www.cdc.gov/abcs/reports- findings/survreports/mrsa14.pdf. Diakses tanggal 14 Juni 2018. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2017. M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 27th Edition. pp 55-58. Dantes R, et al., 2013. National burden of invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections, United States, 2011. JAMA Intern Med. 8(21). p.173. Departemen Kesehatan RI, 1985. Cara Pembuatan Simplisia. Jakarta: Departemen Kesehatan RI, 1-18. Departemen Kesehatan RI, 2000. Parameter Standar Umum Esktrak Tumbuhan Obat. Cetakan 1, Jakarta: Departemen Kesehatan RI, hal. 9-12. Dewanjee, S., et al. 2014. Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry. Journal of Pharmaceutical Analysis. pp. 1-8. 21

(38) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Direktorat Jendral Bina Kefarmasian Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011. Farmakope Herbal. Suplemen II. Edisi I, Jakarta: Kementerian Kesehatan RI, hal. 110-111. Gosh, P., Sil P., and Thakur, S., 1987. Spray Reagent for the Detection of Coumarins and Flavonoids on Thin Layer Plates. Journal of Chromatography 403. Pp. 285-287. Hartini, Y. S., Wahyuono, S., Widyarini, S., dan Yuswanto, A., 2013. Uji Aktivitas Fagositosis Makrofag Fraksi-fraksi dari Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Secara In Vitro. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 11 (2), pp. 108-115. Kesarkar, S., Bhandage, A., Deshmukh, S., Shevkar., K and Abhyankar, M., Flavonoids : An Overview. Journal of Pharmacy Research 2(6). Poona Districts Education Association’s Seth Govid Raghunath Sable College of Pharmacy, Saswad, Pune. pp. 1148-1154. Kumar, S., Jyotirmayee, K., and Sarang, M., 2012. Thin Layer Chromatography: A Tool of Biotechnology for Isolation of Bioactive Compounds from Medicinal Plants. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research 18 (1). pp. 126-132. Kusumaningtyas, E., Astuti, E., & Darmono., 2008. Sensitivitas Metode Bioautografi Kontak dan Agar Overlay dalam Penentuan Senyawa Antikapang. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 6 (2), 75-79. Lister I.N.E., et al. 2014. Antimicrobial activities of metanol extract of Sirih Merah (Piper crocatum L.) leaf. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 6(12). pp. 650-654. Liu, L., Wang. Y.G., Leng, F.F., Li., Y.C., 2014. Optimization of Total Flavonoids Extraction from Coreopsis tinctoriaNytt. by Respone Surface Methodology. School of Life Science and Engineering, 391-396. 22

(39) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Nopiyanti, H.T., Agustirani, F., Isnaini, M. 2016. Screening of Nypa Fructions as Antibacterial of Bacillus subtilis, E. coli and S. aureus. Journal Maspori. 8:2, pp. 83-90. Prashant Tiwari, B., Kumar, M.K. & Gurpreet Kaur, H.K., 2011. Phytochemical screening and extraction - A review. Internationale Pharmaceutica Sciencia, 1(1), pp.98–106. Rachmawaty, F. J., 2018. Optimasi Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah (Piper Crocatum) sebagai Antibakteri terhadap Bakteri Staphylococcus aureus. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Mutiara Medika. Vol 18 (1). pp 13-19. Reveny, J., 2011. Antimicrobial Aktivitas of the Extract and Fraction of Red Betel Leaf (Piper betle Linn.). Jurnal Ilmu Dasar 12 (1). p.8. Rinanda, T., et al. 2012. Antibacterial aktivitas of red betel (Piper crocatum) leaf methanolic extracts against methicillin resistant Staphylococcus aureus. 8th Uniterd Bioscience. pp 270-273. Steltenpohl, P., Chlebovec, M., and Graczová, E., 2005. Simulation of Toluene Extractive Distillation from a Mixture with Heptane. Chem. Pap. 59 (6a). pp 421—427. Triana, D., 2014. Frekuensi β-Lactamase Hasil Staphylococcus aureus Secara Iodometri Di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Andalas. Jurnal Gradien 10 (2). pp. 992-995. Tong, S.Y.C., et al., 2015. Staphylococcus aureus Infections: Epidemiology, Pathophysiology, Clinical Manifestations, and Management. Journal of American Society for Microbiology. 28(3). p.604 23

(40) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 1. Surat determinasi tanaman sirih merah 24

(41) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 2. Surat identifikasi bakteri Staphylococcus aureus 25

(42) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 3. Sertifikat pengujian statistik dengan SPSS 26

(43) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 4. Hasil perhitungan statistik Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Perlakuan Zona Hambat Statistik Kontrol Positif df Shapiro-Wilk Sig. Statistik df Sig. .175 3 . 1.000 3 1.000 Kontrol Negatif . 3 . . 3 . Fraksi 1 . 3 . . 3 . Fraksi 2 . 3 . . 3 . Fraksi 3 .385 3 . .750 3 .000 Fraksi 4 .385 3 . .750 3 .000 Test of Homogeneity of Variances Zona Hambat Levene Statistik df1 df2 Sig. Based on Mean 3.855 5 12 .026 Based on Median 1.333 5 12 .315 Based on Median and with 1.333 5 6.000 .364 3.659 5 12 .030 adjusted df Based on trimmed mean 27

(44) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Kruskal-Wallis Test Ranks Replikasi Zona Hambat N Mean Rank Kontrol Positif 3 17.00 Kontrol Negatif 3 5.00 Fraksi 1 3 5.00 Fraksi 2 3 5.00 Fraksi 3 3 14.00 Fraksi 4 3 11.00 Total 18 Test Statistiksa,b Zona Hambat Kruskal-Wallis H 16.799 df 5 Asymp. Sig. .005 a. Kruskal Wallis Test b. Grouping Variable: Replikasi Mann-Whitney Test Ranks Perlakuan Zona Hambat N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Negatif 3 2.00 6.00 Fraksi 3 3 5.00 15.00 Total 6 28

(45) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Test Statistiksa Zona Hambat Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 6.000 Z -2.121 Asymp. Sig. (2-tailed) .034 .100b Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Grouping Variable: Replikasi b. Not corrected for ties. Mann-Whitney Test Ranks Perlakuan Zona Hambat N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Negatif 3 2.00 6.00 Fraksi 4 3 5.00 15.00 Total 6 Test Statistiksa Zona Hambat Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .000 6.000 -2.121 .034 .100b a. Grouping Variable: Replikasi b. Not corrected for ties. 29

(46) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Mann-Whitney Test Ranks Replikasi Zona Hambat N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Positif 3 5.00 15.00 Fraksi 3 3 2.00 6.00 Total 6 Test Statistiksa Zona Hambat Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 6.000 Z -1.993 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .046 .100b a. Grouping Variable: Replikasi b. Not corrected for ties. Mann-Whitney Test Ranks Replikasi Zona Hambat N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Positif 3 5.00 15.00 Fraksi 4 3 2.00 6.00 Total 6 30

(47) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Test Statistiksa Zona Hambat Mann-Whitney U Wilcoxon W Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .000 6.000 -1.993 .046 .100b a. Grouping Variable: Replikasi b. Not corrected for ties. 31

(48) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi bernama Anastasianus Hendriana, lahir di Sleman, 22 April 1995. Penulis akrab dipanggil Rian merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan Warady Margiyanta dan Yohana Mujiem. Penulis menempuh pendidikannya di SD Kanisius Demangan Baru, SMP Negeri 4 Depok, SMA Kolese De Britto dan SMA Sang Timur Yogyakarta, pada tahun 2015 melanjutkan pendidikan di Program Studi Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama perkuliahan penulis aktif dalam mengikuti kegiatan kepanitian dan organisasi seperti Pharmacy Performance Road to School, Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma 2016/2017 dan Unit Kegiatan Mahasiswa Paduan Suara Cantus Firmus serta kepanitian fakultas maupun universitas lainnya. Selain itu, penulis juga pernah menjadi juara lomba paduan suara Asia Pacific Choir Games di Colombo, Sri Lanka, Festival folklore Nusantara, Jakarta dan Pesparawi Mahasiswa Nasional XIV, Medan. Selain itu, penulis juga menerima dan melaksanakan Program Kreativitas Mahasiswa dalam bidang Pengabdian diselenggarakan oleh Kemenristekdikti pada tahun 2017/2018. 32 Masyarakat yang

(49)

Dokumen baru

Download (48 Halaman)
Gratis

Tags

Dokumen yang terkait

Sitotoksisitas dan genotoksitas antibakteri dari ekstrak metanol Xylocarpus granatum
0
9
60
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
13
62
89
Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu
0
0
54
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
1
2
14
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
0
2
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
0
4
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
3
19
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
0
3
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
0
29
Uji antibakteri fraksi n-Heksan dan fraksi etanol sisa dari ekstrak etanol 80 daun kemuning {Murraya paniculata (L.)} terhadap pertumbuhan Staphylococcusaureus ATCC 25923 dan skrining fitokimia fraksi - Ubaya Repository
0
0
1
222626 aktivitas antibakteri dari ekstrak getah
0
1
3
Uji antimikroba fraksi ekstrak metanol e
0
0
8
Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanol daun sirih (Piper betle L.) - USD Repository
0
0
163
Uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak kloroform daun piper crocatum Ruiz - USD Repository
0
0
46
Uji efek kombinasi ekstrak metanol daun Piper betle L. dengan ekstrak metanol daun Piper crocatum Ruiz - USD Repository
0
0
62
Show more