Uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak kloroform daun piper crocatum Ruiz - USD Repository

Gratis

0
1
46
2 months ago
Preview
Full text
(1)PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK KLOROFORM DAUN Piper crocatum Ruiz & Pav. TERHADAP Staphylococcus aureus RESISTEN AMPICILLIN SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Diajukan oleh: Nadia Chandra Prasdiyanti NIM : 158114025 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2018

(2) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK KLOROFORM DAUN Piper crocatum Ruiz & Pav. TERHADAP Staphylococcus aureus RESISTEN AMPICILLIN SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Diajukan oleh: Nadia Chandra Prasdiyanti NIM : 158114025 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2018 i

(3) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ii

(4) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 9 iii

(5) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN Kupersembahkan untuk: Tuhan Yesus Kristus sebagai sumber berkat dan pengharapanku Bapak, Ibu, dan Adik serta keluarga tercinta yang selalu mendukungku Arsa, sahabat dan teman-teman tercinta Serta almameterku Universitas Sanata Dharma iv

(6) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI v

(7) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI vi

(8) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala rahmat dan berkat kasih-Nya yang melimpah sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian skripsi yang berjudul “UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI DARI EKSTRAK KLOROFORM DAUN Piper crocatum Ruiz & Pav. TERHADAP Staphylococcus aureus RESISTEN AMPICILLIN” dengan baik. Penulis menyadari dalam penyusunan skripsi ini mendapatkan banyak bantuan, dukungan, bimbingan, dan doa dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria karena atas berkat-Nya yang luar biasa sehingga penulis diberikan kelancaran untuk menyelesaikan skripsi ini. 2. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, Dosen Pembimbing Akademik, sekaligus Dosen Pembimbing skripsi yang dengan sabar telah memberikan dukungan, bimbingan, saran dan doa selama proses penyusunan skripsi ini sehingga dapat terselesaikan dengan baik. 3. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma sekaligus dosen penguji skripsi atas kritik dan saran yang diberikan selama penyusunan skripsi. 4. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt. selaku dosen penguji skripsi atas kritik dan saran yang diberikan selama penyusunan skripsi. 5. Mas Antonius Dwi Priyana dan Mas Sarwanto selaku Sekretariat S1 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang memberikan informasi mengenai perkuliahan dan proses pengerjaan skripsi. 6. Pak Wagiran dan Mbak Intan yang telah membantu proses pengerjaan skripsi ini di laboratorium. vii

(9) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI viii

(10) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRAK Latar belakang : Penyakit infeksi masih merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat yang penting dan biasa diobati dengan antibiotik. Penggunaan antibiotik yang tidak rasional menyebabkan terjadinya resistensi antibiotik. Salah satu bakteri yang mengalami resistensi adalah Staphylococcus aureus. Adanya resistensi bakteri mendorong penggalian obat dari bahan alam. Piper crocatum Ruiz & Pav. adalah salah satu bahan alam yang memiliki aktivitas antibakteri. Dalam penelitian ini, fraksi hasil VLC dari ekstrak kloroform daun Piper crocatum Ruiz & Pav. diuji untuk melihat aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus resisten ampicillin. Metode : Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumuran, dilanjutkan dengan uji KHM dan KBM secara dilusi cair, serta metode bioautografi terhadap bakteri Staphylococcus aureus resisten ampicillin. Uji statistic dilakukan menggunakan Kruskal-Wallis dilanjutkan dengan MannWhitney. Hasil : Hasil uji aktivitas antibakteri fraksi dari ekstrak kloroform daun Piper crocatum Ruiz & Pav. menunjukkan zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 2 adalah 10,3333±0,7638 mm dan zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 3 adalah 7,8333±0,5774 mm, dengan nilai KBM 125 mg/ml. Analisis statistik dengan post hoc Mann-Whitney menunjukkan adanya perbedaan bermakna dari tiap perlakuan dengan nilai signifikansi <0,05. Kesimpulan : fraksi 2 dari ekstrak kloroform daun Piper crocatum Ruiz & Pav. memiliki aktivitas antibakteri dengan diameter zona hambat 10,3333±0,7638 mm dan nilai KBM 125 mg/ml. Kata kunci : Staphylococcus aureus, resistensi, daun Piper crocatum Ruiz & Pav., antibakteri, bioautografi. ix

(11) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT Background : Infection is one of the most important public health problems and is usually avoided by antibiotics. Irrational use of antibiotics causes antibiotic resistance, such as in the bacteria Staphylococcus aureus. Therefore, it is necessary to explore antibacterial drugs from natural ingredients. Piper crocatum Ruiz & Pav. Is a plant species that contain natural ingredient with antibacterial activity. In this study, the chloroform extract fraction of the Piper crocatum Ruiz & Pav. leaf was tested to determine its antibacterial activity against ampicillinresistant Staphylococcus aureus. Metode : Diffusion method was used to test the antibacterial activity, liquid dilution method used to determine MIC and MBC, bioautography was apply on ampicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteria. Data of inhibition zone was statistically tested with Kruskal-Wallis followed by Mann-Whitney. Result : The results of the antibacterial activity test of the Piper crocatum Ruiz & Pav. leaf chloroform extract showed that the inhibition zone produced by fraction 2 was 10.3333 ± 0.7638 mm and the inhibition zone produced by fraction 3 was 7.8333 ± 0.5774 mm, with a KBM value of 125 mg / ml. The post hoc MannWhitney statistical analysis showed a significant difference of each treatment with the significance value <0.05. Conclusion : fraction 2 of Piper crocatum Ruiz & Pav. leaf chloroform extract has antibacterial activity with inhibitory zone diameter of 10.3333 ± 0.7638 mm and KBM value of 125 mg / ml. Keyword : Staphylococcus aureus, resistance, Piper crocatum Ruiz & Pav. leaf, antibacterial, bioautography x

(12) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL........................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iii HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.............................. vi PRAKATA .......................................................................................................... vii ABSTRAK .......................................................................................................... ix ABSTRACT .......................................................................................................... x DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi DAFTAR TABEL ............................................................................................... xii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiv PENDAHULUAN .............................................................................................. 1 METODE PENELITIAN .................................................................................... 2 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................... 8 KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 20 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 21 LAMPIRAN ........................................................................................................ 24 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 31 xi

(13) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel 1. Hasil uji aktivitas antibakteri ................................................................ 13 Tabel 2. Nilai Rf dan warna hasil uji KLT ......................................................... 18 xii

(14) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Profil KLT fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah ... 11 Gambar 2. Uji resistensi bakteri Staphyloccous aureus .................................... 12 Gambar 3. Kontrol media dan kontrol pertumbuhan ......................................... 12 Gambar 4. Zona hambat fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah 13 Gambar 5. Uji KHM fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah ...... 14 Gambar 6. Uji KBM fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah ...... 15 Gambar 7. Fraksi pada plat KLT untuk uji bioautografi kontak ....................... 15 Gambar 8. Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi kontak .......... 16 Gambar 9. Uji kualitatif senyawa flavonoid dengan uji tabung ........................ 17 Gambar 10. Uji kualitatif senyawa flavonoid dengan KLT ............................. 18 xiii

(15) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat determinasi tanaman Piper crocatum Ruiz & Pav. ............... 24 Lampiran 2. Surat identifikasi bakteri Staphyloccous aureus ............................. 25 Lampiran 3. Sertifikat pengujian statistik dengan SPSS ..................................... 26 Lampiran 4. Hasil perhitungan statistic .............................................................. 27 xiv

(16) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PENDAHULUAN Penyakit infeksi masih merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat yang penting, khususnya di negara berkembang. Salah satu obat andalan untuk mengatasi masalah tersebut adalah antimikroba antara lain antibakteri/antibiotik, antijamur, antivirus, antiprotozoa (Kemenkes RI, 2011). Berbagai jenis antibiotik digunakan untuk menanggulangi penyakit infeksi. Penggunaan antibiotik yang tidak rasional sebagai terapi terutama pada pasien kelompok usia 0-14 tahun dapat berisiko resistensi antibiotik dini. Penggunaan obat dikatakan rasional apabila memenuhi syarat yaitu tepat indikasi pasien, tepat pemilihan obat, tepat penilaian kondisi pasien, tepat dosis, tepat lama pemberian, dan tepat interval waktu pemberian (Kemenkes RI, 2011). Salah satu permasalahan yang cukup meresahkan adalah munculnya resistensi bakteri Staphylococcus aureus terhadap antibiotik golongan penisilin atau biasa disebut dengan bakteri Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA). MRSA menyebabkan berbagai penyakit, dari infeksi kulit dan luka hingga pneumonia dan infeksi aliran darah yang dapat menyebabkan sepsis dan kematian (CDC, 2013). Menurut data Centers for Disease Control and Prevention (2013), terdapat 80.461 kasus infeksi MRSA dan sebanyak 11.285 kasus kematian terjadi pada tahun 2013. Adanya bakteri yang resisten terhadap antibakteri mendorong pentingnya penggalian sumber obat-obatan antimikroba dari bahan alam (Hertiani, 2003). Penggunaan obat herbal meningkat di masyarakat khususnya di negara berkembang dan dipercaya dapat mengobati berbagai penyakit, salah satunya adalah penyakit infeksi (Wendakoon, Calderon, dan Gagnon, 2012). Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) adalah salah satu tumbuhan yang digunakan sebagai obat alternatif oleh masyarakat. Daun sirih merah mengandung senyawa golongan flavonoid, alkaloid, tanin-polifenol, steroiterpenoid, dan saponin (Parfati dan Windono, 2016). Senyawa-senyawa yang terdapat pada daun sirih merah memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif (Reveny, 2011). Daun sirih merah berpotensi 1

(17) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI sebagai antibakteri untuk mengatasi infeksi (Wardani dkk, 2012). Hasil penelitian yang dilakukan oleh Soleha, dkk. (2015) menunjukkan bahwa ekstrak daun sirih merah lebih kuat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif yaitu Staphylococcus aureus dibandingkan dengan bakteri gram negatif yaitu Salmonella typhi. Juliantina, dkk. (2010), melaporkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah dengan kuat dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherchia coli dengan menggunakan metode dilusi. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Thie (2018) menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun sirih merah memiliki zona hambat terhadap bakteri Staphylococcus aureus resisten ampicillin, dengan nilai KHM 12,5 mg/ml dan nilai KBM 50 mg/ml. Berdasarkan uraian diatas, peneliti ingin mengetahui potensi fraksi hasil VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah dalam penghambatan pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus resisten antibiotik dengan metode difusi sumuran. Dilakukan juga uji KHM dan KBM terhadap fraksi teraktif hasil VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah. Selain itu dalam penelitian ini dilakukan uji bioautografi kontak terhadap fraksi teraktif hasil VLC ekstrak kloroform daun sirih merah untuk melihat aktivitas antibakteri yang terdapat didalamnya serta dilakukan uji kualitatif senyawa flavonoid untuk melihat ada tidaknya senyawa flavonoid pada fraksi tersebut. METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih merah, bakteri Staphylococcus aureus, media Nutrient Agar, Nutrient Broth, DMSO 100%, Buffer Pepton Water, etil asetat, n-heksana, kloroform, metanol, aquadest steril, antibiotik ciprofloxacin, cakram ampisilin 10µg, standar kuarsetin, dan alkohol 70%. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer, tabung reaksi, corong, labu ukur, pipet tetes, glasfirn, pipet volume, cawan petri, batang pengaduk, gelas ukur, sendok, pelubang sumuran, platform shaker (Innova 2100), 2

(18) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI autoclave (Model KT-40, ALP Co. Ltd Hamurasi Tokyo Japan, oven (Memmert), rotary evaporator, incubator, microbiology safety cabinet, bunsen, jarum ose, spreader, flakon, chamber, mikrokapiler, kertas saring, lempeng KLT, timbangan analitik, mistar, ayakan no 50, vortex. Penyiapan Bahan Uji dan Determinasi Tanaman Sirih Tanaman sirih merah didapatkan dari Kabupaten Sleman, Yogyakarta. Bagian yang diambil adalah bagian daun. Daun sirih merah yang dipilih adalah daun sirih dengan permukaan halus, tidak berlubang, berwarna merah keperakan, dan berdiameter 5-8cm. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Pembuatan Simplisia Daun Sirih Daun sirih merah yang telah dikumpulkan dipisahkan dari pengotor, dicuci dengan air mengalir sebanyak 3 kali, kemudian dikeringkankan dengan oven dengan suhu 40°C. Daun yang telah kering kemudian dipisahkan dari bahan pengganggu, lalu diserbuk dengan blender dan di ayak dengan pengayak nomor 50, dan kemudian disimpan (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011). Penetapan Kadar Air Penetapan kadar air dilakukan dengan metode destilasi toluena (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011). Pereaksi toluena jenuh air disiapkan dengan cara mengocok toluene P dengan sedikit air kemudian air dipisahkan menggunakan corong pisah. Simplisia kering sebanyak 10 gram dan 200 ml dimasukkan toluena jenuh air ke dalam labu. Toluena jenuh air dimasukkan ke tabung penerima melalui pendingin sampai leher alat penampung dan labu dipanaskan selama 15 menit. Setelah toluena mulai mendidih, penyulingan diatur dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian besar air tersuling, kemudian kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik selama 5 menit. Setelah selesai, tabung penerima 3

(19) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI didinginkan hingga suhu ruang dan kemudian volume air dibaca setelah air dan toluena terpisah. Kadar air dihitung dengan rumus: Pembuatan Ekstrak Kloroform Daun Sirih Merah Pembuatan ekstrak kloroform daun sirih merah dilakukan dengan maserasi menurut Badan Pengawas Obat dan Makanan RI (2010) dengan jumlah serbuk yang dimaserasi adalah 10 gram dan pelarut kloroform sebanyak 100 ml. Serbuk daun sirih merah sebanyak 10 gram (10 bagian serbuk) dimasukkan ke dalam Erlenmeyer kemudian dilarutkan dalam 100 ml pelarut kloroform. Maserasi dilakukan selama 1x24 jam dengan bantuan shaker. Hasil maserat yang diperoleh disaring dengan corong Buchner yang dilapisi kertas saring Whatman No. 1 dengan menggunakan bantuan pompa vakum. Serbuk hasil penyaringan dimaserasi dengan pelarut baru sebanyak 75 ml selama 1x24 jam. Kemudian diremaserasi sekali lagi menggunakan 25 ml pelarut baru selama 1x24 jam. Maserat pertama, kedua, dan ketiga kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 60°C untuk menghilangkan pelarut pada ekstrak. Selanjutnya ekstrak diletakkan pada cawan porselen dan diuapkan kembali dengan menggunakan waterbath pada suhu 60°C untuk menghilangkan sisa pelarut yang mungkin masih ada dalam ekstrak. Ekstrak yang didapat merupakan ekstrak kental dengan bobot tetap sesuai yang dipersyaratkan. Rendemen dihitung dengan rumus: Pembuatan Fraksi dari Ekstrak Kloroform Daun Sirih Merah Ekstrak klorofom daun sirih merah difraksinasi lebih lanjut dengan metode Vacuum Liquid Chromatography (VLC). Sintered Glass Buchner dan Erlenmeyer serta vakum yang digunakan untuk fraksinasi disiapkan dan dipasang. 4

(20) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Kertas saring dimasukkan ke dalam kolom sesuai diameter kolom. Sillica Gel GF254 dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit sambil di vakum sebagai fase diam. Bobot Silica Gel GF254 yang digunakan sebagai fase diam adalah sebanyak ± 4 kali bobot esktrak yang didapat. Kemudian Sillica Gel GF254 disiapkan lagi sebanyak ± 2 kali bobot esktrak dan dicampurkan dengan ekstrak kering menggunakan mortir dan stamper sambil diaduk perlahan hingga didapatkan campuran homogen dan kering (free flowing). Serbuk ekstrak free flowing dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam sintered glass Buchner diatas fase diam sambil divakum. Dua lembar kertas saring sebesar diameter kolom dimasukkan diatas serbuk ekstrak free flowing. Sebanyak 200ml pelarut dituangkan secara perlahan-lahan pada permukaan kertas saring melalui dinding sambil divakum. Pelarut yang digunakan berturut-turut metanol, metanol kloroform (7:3 v/v), metanol - kloroform (5:5 v/v), metanol - kloroform (3:7 v/v), dan kloroform. Hasil fraksinasi ditampung dalam cawan porselen. Fraksi yang didapat kemudian dianalisis menggunakan KLT dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak metanol : klorofom dengan perbandingan 9:1, dan deteksi UV dengan panjang gelombang 365 nm. Fraksi dengan profil KLT yang mirip akan digabungkan menjadi satu fraksi. Preparasi Bakteri Uji Bakteri Staphylococcus aureus disiapkan dengan cara kultur bakteri diambil dengan jarum ose dan diinokulasikan ke dalam media Nutrient Broth (NB) steril, setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 jam untuk mendapatkan stok bakteri uji (CLSI, 2017). Berikutnya dilakukan pengujian sebagai penegasan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri yang resisten terhadap ampicillin. Sebanyak 5 ml Nutrient Agar (NA) steril dituangkan ke dalam cawan petri steril, dibiarkan memadat sebagai base layer agar. Sebanyak 1 ml bakteri uji diinokulasikan ke dalam 15 ml media NA secara pour plate, kemudian dituangkan secara merata sebagai seed layer agar di atas base layer agar, dan dibiarkan memadat. Paper disk berisi antibiotik ampicillin 10µg diletakkan di bagian tengah pada seed layer dan 5

(21) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI diinkubasi selama 24 jam kemudian diamati zona jernih yang terbentuk. Bakteri dikatakan z h z h h ≥29 h ≤28 , CLSI, 2017). Apabila sudah dipastikan bahwa bakteri yang didapatkan adalah bakteri resisten, stok bakteri diambil dan diencerkan dengan Bufferd Pepton Water (BPW) kemudian disetarakan kekeruhnnya dengan larutan Mac Farland 0,5 menggunakan alat nephelometer. Pembuatan Kontrol Pertumbuhan Bakteri Sebanyak 5 ml Nutrient Agar (NA) steril dituangkan ke dalam cawan petri steril, dibiarkan memadat sebagai base layer agar. Kemudian diambil 1 ml suspensi bakteri uji, diinokulasikan ke dalam 15 ml media NA secara pour plate, kemudian dituangkan secara merata sebagai seed layer agar di atas base layer agar, dan dibiarkan memadat. Pembuatan Kontrol Kontaminasi Media Sebanyak 20 ml media Nutrient Agar (NA) dituangkan ke dalam petri steril dan ditunggu hingga memadat. Pembuatan Larutan Stok Antibiotik Tablet ciprofloxacin 500 mg digerus dan dilarutkan dalam 100 ml aquadest sehingga didapatkan konsentrasi 5mg/ml. Kemudian diambil 1 ml dan ditambahkan 100 ml aquadest steril sehingga didapatkan konsentrasi 50 µm/ml. Uji Daya Antibakteri Fraksi dari Ekstrak Kloroform Daun Sirih Merah Sebanyak 5 ml Nutrient Agar (NA) steril dituangkan ke dalam cawan petri steril, dibiarkan memadat sebagai base layer agar. Kemudian diambil 1 ml suspensi bakteri uji, diinokulasikan ke dalam 15 ml media Nutrient Agar (NA) dalam tabung reaksi dan divortex. NA yang telah dicampur dengan suspensi bakteri tersebut kemudian dituang ke dalam petri steril sebagai seed layer agar di atas base layer agar kemudian digoyang-goyangkan hingga merata dan dibiarkan memadat. Selanjutnya dibuat 4 sumuran menggunakan pelubang sumuran no. 4 6

(22) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI berdiameter 6 mm pada NA yang sudah disiapkan. Setiap sumuran diberikan masing-masing 50 µl larutan kontrol positif (antibiotik), larutan kontrol negatif (pelarut), dan dua fraksi uji dengan konsentrasi yang sama yaitu 250 mg/ml. Kemudian dilihat fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri paling baik. Aktivitas antibakteri yang dihasilkan dilihat dari zona hambat yang dihasilkan. Zona hambat yang diukur adalah zona disekitar sumuran yang keruh tetapi sudah berkurang kekeruhannya dibandingkan dengan daerah sekitarnya. Preparasi Fraksi Teraktif Fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri paling baik dibuat variasi konsetrasi 250 mg/ml; 125 mg/ml; 62,5 mg/ml; 31,3 mg/ml; 15,6 mg/ml; 7,8 mg/ml; 3,9 mg/ml; dan 1,9 mg/ml. Pembuatan variasi konsentrasi ini dilakukan dengan cara pengenceran terhadap fraksi menggunakan pelarut DMSO 100%. Penentuan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) Sebanyak 8 tabung reaksi steril disiapkan kemudian 1 ml suspensi bakteri diinokulasikan ke dalam 20 ml Nutrient Broth (NB) dan ditambahkan 8 variasi konsentrasi ekstrak kemudian divortex kemudian diinkubasi selama 24 jam. Setelah itu kekeruhannya dibandingkan menggunakan kontrol media dan kontrol bakteri uji untuk menentukan KHM. Sebanyak 20 ml Nutrient Agar (NA) dituangkan ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan memadat. Dibuat masing-masing 4 kuadran. Masing-masing tabung reaksi yang berisi bakteri dan variasi konsentrasi fraksi kemudian di streak plate pada masing-masing kuadran. Variasi konsentrasi terendah dari fraksi yang tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri ditentukan sebagai KBM. Identifikasi Kualitatif Senyawa Flavonoid Fraksi dilarutkan dalam metanol 50% (1-2 mL), dengan pemanasan kemudian ditambahkan logam Mg dan 5-6 tetes asam hidroklorida, larutan akan menjadi merah apabila mengandung flavonol dan berwarna oranye untuk flavanon. Uji KLT dengan silica gel sebagai fase diam dan etil asetat : toluena 7

(23) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI (9:1 v/v) sebagai fase gerak, adanya flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning pada sinar tampak, pemadaman pada sinar UV 254 nm, dan warna hitam, kuning, biru atau hijau pada sinar UV 365 nm (Hartini, 2013). Kemudian kromatogram disemprot dengan FeCl3. Uji Bioautografi Senyawa antibakteri pada fraksi teraktif hasil VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah dideteksi dengan metode bioautografi kontak, dengan KLT fase diam Silica Gel GF254 dan fase gerak etil asetat : toluen (9:1 v/v). Fraksi yang memiliki daya antibakteri paling tinggi kemudian ditotolkan pada plat KLT dan dielusi dalam chamber yang berisi fase gerak yang sudah dibuat. Plat KLT kemudian ditempelkan pada media NA yang sudah diinokulasikan bakteri dan sudah memadat. Ditunggu 45 menit kemudian plat diangkat. Media NA kemudian diinkubasi selama 24 jam untuk melihat daya hambatnya. Teknik Analisis Data Penelitian Data analisis seecara statistik diawali dengan menguji distribusi normalitas dengan uji Shapiro-Wilk. Uji homogenitas dilakukan dengan uji Levene. Apabila data yang didapatkan terdistribusi normal (nilai P > 0,05), maka dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA, dan apabila ditemukan perbedaan maka dilanjutkan dengan Post-Hoc Tukey pada taraf kepercayaan 95%. Sedangkan apabila didapakan data yang tidak terdistribusi normal (nilai P < 0,05), maka dilanjutkan dengan uji Kurskal-Wallis, dan apabila ditemukan perbedaan maka dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney pada taraf kepercayaan 95%. HASIL DAN PEMBAHASAN Determinasi tanaman bertujuan untuk menghindari kesalahan dalam penelitian dan memastikan bahwa tanaman yang digunakan adalah sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.). Determinasi dilakukan dengan melihat ciri-ciri tanaman yang digunakan dalam penelitian ini. Determinasi ini dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan 8

(24) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI dalam penelitian ini merupakan tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) seperti yang tercantum dalam surat keterangan (Lampiran 1). Sirih merah yang dipanen dipisahkan antara salur dan daunnya, ditimbang, lalu dilakukan sortasi basah untuk memisahkan dari kotoran dan bahan asing, selanjutnya ditimbang kembali. Daun sirih merah kemudian dicuci dengan air mengalir lalu dipotong-potong dan dikeringkan. Pengeringan bertujuan untuk mengurangi kadar air pada daun sirih merah dan dilakukan hingga daun sirih merah mudah hancur saat diremas. Selanjutnya simplisia kering diserbuk dan diayak. Hasil penyerbukan simplisia yang didapatkan adalah 236 gram. Penetapan kadar air yang dilakukan mengacu pada Farmakope Herbal (2011) yaitu dengan destilasi toluena. Serbuk simplisia daun sirih merah yang ditimbang adalah 10,2294 gram dan volume air yang didapatkan adalah 0,5 ml sehingga kadar air serbuk simplisia daun sirih merah yang didapatkan yaitu 4,8879%. Hal ini berarti bahwa serbuk simplisia yang digunakan sudah memenuhi h ≤ . Metode yang dilakukan untuk pembuatan ekstrak kloroform daun sirih merah adalah maserasi. Pada metode maserasi, serbuk simplisia akan kontak dengan pelarut, dan dengan bantuan pengadukan maka senyawa aktif simplisia akan larut dan berpindah ke pelarut. Daun sirih merah mengandung senyawa thermolabile seperti flavonoid dan minyak atsiri sehingga metode maserasi dipilih untuk porses ekstraksi karena metode ini sederhana dan tidak membutuhkan pemanasan sehingga cocok untuk senyawa thermolabile (Pandey, 2014). Hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong buchner dan dengan bantuan vakum. Hasil penyaringan kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 60°C untuk menguapkan pelarut pada ekstrak. Setelah didapatkan ekstrak kental kemudian dilakukan bobot tetap untuk memastikan bahwa pelarut yang digunakan sudah tidak ada lagi didalam ekstrak. Bobot tetap diperoleh apabila perbedaan dua kali penimbangan selama 1jam berturut-turut tidak melebihi 0,5mg (Direktorat Jendral Bina Kefarmasian dan Alat Kesehatan, 2011). Bobot ekstrak 9

(25) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI kloroform yang didapatkan adalah 19,3952 gram dan rendemen yang didapatkan adalah 9,6902 %. Ekstrak klorofom daun sirih merah difraksinasi lebih lanjut dengan metode Vacuum Liquid Chromatography (VLC). Fraksinasi dilakukan dengan metode VLC karena metode ini dapat digunakan untuk fraksinasi dengan jumlah ekstrak dalam skala besar dan dalam waktu yang singkat. Pertama-tama Sintered Glass Buchner dan Erlenmeyer serta vakum yang digunakan untuk fraksinasi disiapkan dan dipasang. Kertas saring dimasukkan ke dalam kolom sesuai diameter kolom. Sillica Gel GF254 dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit sambil di vakum sebagai fase diam. Bobot Silica Gel GF254 yang digunakan sebagai fase diam adalah sebanyak ± 4 kali bobot esktrak yang didapat. Kemudian Sillica Gel GF254 disiapkan lagi sebanyak ± 2 kali bobot esktrak dan dicampurkan dengan ekstrak kering menggunakan mortir dan stamper sambil diaduk perlahan hingga didapatkan campuran homogen dan kering (free flowing). Serbuk ekstrak free flowing dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam sintered glass Buchner diatas fase diam sambil divakum. Dua lembar kertas saring sebesar diameter kolom dimasukkan diatas serbuk ekstrak free flowing. Sebanyak 200ml pelarut dituangkan secara perlahan-lahan pada permukaan kertas saring melalui dinding sambil divakum. Pelarut yang digunakan berturut-turut metanol (fraksi a), metanol - kloroform (7:3) (fraksi b), metanol - kloroform (5:5) (fraksi c), metanol - kloroform (3:7) (fraksi d), dan kloroform (fraksi e). Hasil fraksinasi ditampung dalam cawan porselen. Fraksi yang didapat kemudian dianalisis menggunakan KLT dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak metanol : kloroform dengan perbandingan 9:1, dan deteksi UV 365 nm. Fase gerak metanol : kloroform dengan perbandingan 9:1 yang digunakan untuk metode KLT ini dipilih setelah sebelumnya dilakukan optimasi fase gerak. Fraksi yang memiliki profil KLT yang mirip akan digabungkan menjadi satu fraksi. Berdasarkan kemiripan profil KLT, dilihat dari warna, bercak, posisi, dan bentuknya, fraksi tersebut digabungkan menjadi tiga fraksi yaitu fraksi 1 yang terdiri dari fraksi a; fraksi 2 yang terdiri dari fraksi b, fraksi c, dan fraksi d; serta fraksi 3 yang terdiri dari fraksi e. Fraksi 10

(26) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI tersebut kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 60°C untuk menguapkan pelarut pada fraksi. (a) UV 254 nm (b) UV 365 nm Gambar 1. Profil KLT fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah Keterangan: a. fraksi dengan fase gerak metanol; b. fraksi dengan fase gerak metanol - kloroform (7:3); c. fraksi dengan fase gerak metanol kloroform (5:5); d. fraksi dengan fase gerak metanol - kloroform (3:7); e. fraksi dengan fase gerak kloroform Selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri untuk melihat fraksi teraktif dari tiga fraksi yang didapatkan. Fraksi 1 tidak dilanjutkan untuk penelitian ini karena jumlahnya tidak memenuhi untuk pengujian. Masing-masing fraksi diencerkan menggunakan DMSO 100% hingga konsentrasi 250 mg/ml. Pengujian fraksi teraktif dilakukan dengan difusi sumuran. Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah Staphylococcus aureus resisten ampicillin. Bakteri Staphylococcus aureus dikatakan resisten terhadap ampicillin apabila z h z h ≤ 28 ≥29 dan dikatakan intermediet dan sensitive bila (CLSI, 2017). Zona hambat yang didapatkan adalah 1 mm sehingga disimpulkan bahwa bakteri uji telah resisten terhadap ampicillin (Gambar 2). 11

(27) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Gambar 2. Uji resistensi bakteri Staphyloccous aureus Kontrol media (Gambar 3a) yang dibuat tampak bening yang menunjukkan bahwa tidak terdapat kontaminasi. Pada kontrol pertumbuhan (Gambar 3b) bakteri tampak keruh merata yang berarti bahwa bakteri Staphylococcus aureus resisten ampicillin dapat tumbuh pada media Nutrient Agar (NA). (a) (b) Gambar 3. Kontrol media (a) dan kontrol pertumbuhan (b) Pada setiap petri dibuat 4 sumuran yang masing-masing berisi kontrol positif yaitu ciprofloxacin 50µg/ml, kontrol negatif yaitu DMSO 100%, fraksi 2, dan fraksi 3 dengan konsentrasi masing-masing 250mg/ml. Potensi antibakteri pada metode difusi dilihat berdasarkan pengamatan zona jernih yang terbentuk di sekitar tempat penginokulasian senyawa karena terdifusinya senyawa tersebut (Jawetz, dkk., 2005). Dari hasil pengamatan diketahui bahwa fraksi 2 memiliki aktivitas antibakteri yang lebih besar daripada fraksi 3. Hasil pengamatan menunjukkan juga menunjukkan bahwa DMSO 100% tidak menghambat pertumbuhan bakteri dilihat dari tidak adanya zona hambat yang terbentuk 12

(28) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI sehingga dapat digunakan sebagai pelarut. Hal ini serupa dengan penelitian yang dilakukan oleh Cahyono (2013) dan Yulianingsih (2012), pelarut DMSO 100% tidak memiliki daya hambat terhadap bakteri, dilihat dari tidak terbentuknya zona hambat disekitar sumuran yang berisi DMSO 100%. Gambar 4. Zona hambat fraksi dari ekstrak kloroform daun sirih merah Keterangan gambar: 1. DMSO 100% ; 2. Ciprofloxacin 50µm/ml ; 3. Fraksi 2 konsentrasi 250mg/ml ; 4. Fraksi 3 konsentrasi 250mg/ml Dilakukan 3 kali replikasi pada uji aktivitas antibakteri dengan data sebagai berikut: Tabel 1. Hasil uji aktivitas antibakteri Replikasi Kontrol Positif Kontrol Fraksi 2 Fraksi 3 Negatif ( 250 mg/ml) (250 mg/ml) I 18,5 mm 0 mm 10,5 mm 7,5 mm II 18,5 mm 0 mm 9,5 mm 7,5 mm III 16 mm 0 mm 11 mm 8,5 mm Mean±SD 17, 6667±1, 4434 0±0 10,3333±0,7638 7,8333±0,5774 Setelah diketahui bahwa fraksi 2 adalah fraksi teraktif maka dilanjutkan pengujian selanjutnya. Dilakukan pengujian KHM dan KBM pada fraksi 2 hasil VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah. Penentuan KHM dilakukan menggunakan dilusi cair. Penentuan KHM dilihat berdasarkan pertumbuhan bakteri pada media NB dengan cara membandingkan dengan kontrol media dan kontrol pertumbuhan. Dari hasil pengamatan tidak bisa ditentukan KHM karena 13

(29) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI masing-masing tabung terlihat keruh akibat penambahan masing-masing variasi konsentrasi fraksi sehingga pengamatan tidak bisa terlihat jelas (Gambar 5). Gambar 5. Uji KHM fraksi 2 VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah Keterangan: 1. Kontrol media ; 2. Kontrol pertumbuhan ; 3. Fraksi 2 konsentrasi 250mg/ml ; 4. Fraksi 2 konsentrasi 125mg/ml ; 5. Fraksi 2 konsentrasi 62,5mg/ml ; 6. Fraksi 2 konsentrasi 31,25mg/ml ; 7. Fraksi 2 konsentrasi 15,625mg/ml ; 8. Fraksi 2 konsentrasi 7,8125mg/ml ; 9. Fraksi 2 konsentrasi 3,90625mg/ml ; 10. Fraksi 2 konsentrasi 1,953125mg/ml Kemudian dilanjutkan penentuan nilai KBM dengan cara sub kultur dari media NB ke dalam media NA steril secara streak plate lalu diinkubasi selama 24 jam. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pada konsentrasi 250mg/ml dan 125mg/ml tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri sehingga nilai KBM dari fraksi 2 ekstrak kloroform daun sirih merah adalah pada konsenstrasi 125mg/ml (Gambar 6). Menurut penelitian yang dilakukan oleh Thie (2018), ekstrak kloroform daun sirih merah memiliki nilai KBM 50mg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa daya antibakteri pada ekstrak kloroform daun sirih merah lebih baik daripada fraksi dari ekstrak kloroform daun sirih merah. Hal ini bisa dikarenakan adanya aktivitas antibakteri yang sinergi dari beberapa senyawa yang terdapat pada ekstrak. 14

(30) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Gambar 6. Uji KBM fraksi 2 VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah Keterangan: 1. Fraksi 2 konsentrasi 250mg/ml ; 2. Fraksi 2 konsentrasi 125mg/ml ; 3. Fraksi 2 konsentrasi 62,5mg/ml ; 4. Fraksi 2 konsentrasi 31,25mg/ml Metode bioautografi merupakan metode kombinasi KLT dengan deteksi biologi (Marston, 2011). Metode bioautografi dapat digunakan untuk mendeteksi komponen senyawa aktif pada suatu sampel (Chomnawang, et al, 2009). Pada metode bioautografi kontak, adalah dengan memindahkan senyawa antibakteri melalui proses difusi dari plat KLT ke media agar yang sudah diinokulasikan bakteri (Hamburger and Cordell, 1987). Fraksi yang akan diuji dengan bioautografi kontak ditotolkan pada plat KLT (Gambar 7) kemudian ditempelkan pada permukaan agar yang sudah diinokulasikan bakteri Staphylococcus aureus resisten ampicillin (Gambar 8a). (a) UV 254 nm (b) UV 365 nm Gambar 7. Fraksi pada plat KLT untuk uji bioautografi kontak Hasil bioautografi menunjukkan adanya aktivitas antibakteri pada fraksi 2 dari ekstrak kloroform daun sirih merah (Gambar 8b). Aktivitas antibakteri 15

(31) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI dapat dilihat dari adanya zona jernih yang terbentuk. Pada penelitian yang dilakukan oleh Sudirman (2005), didapatkan 3 spot zona jernih yang menandakan adanya aktivitas antibakteri. Tiga spot zona jernih ini dapat dihitung nilai Rf dari masing-masing spot dan dapat dideteksi kemungkinan senyawa yang berperan dalam pembentukan zona hambat ini. Hal ini karena adanya pemisahan antara spot zona jernih yang dihasilkan sehingga dapat dihitung Rf dari spot-spot tersebut lalu dibandingkan dengan kromatogram yang digunakan untuk menentukan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri melalui Rf yang didapatkan. Hasil penelitian ini berbeda dengan yang dilakukan oleh Sudirman (2005), yaitu belum dapat ditentukan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri karena zona jernih yang terbentuk tidak berbentuk spot sehingga tidak bisa dihitung Rf dari senyawa tunggal yang memiliki aktivitas antibakteri. Hal ini dikarenakan fraksi belum mengalami pemisahan dengan baik sehingga belum bisa dideteksi senyawa antibakteri teraktif pada fraksi 2 ekstrak kloroform daun sirih merah. Pada penelitian ini, fraksi yang digunakan untuk uji bioautografi kontak adalah 10 totol fraksi. Salah satu penyebab pemisahan yang kurang baik ini bisa dikarenakan totolan fraksi pada plat KLT yang belum kering sempurna. Hal ini bisa diatasi dengan penggunaan hairdryer untuk pengeringan fraksi pada plat KLT. Untuk menghindari kerusakan senyawa pada fraksi maka penggunaan hairdryer diberi jarak sedikit jauh dari plat KLT. Hal-hal lain yang dapat berpengaruh pada hasil bioautografi kontak adalah loading mass fraksi pada plat KLT dan juga lamanya kontak plat KLT dengan agar. (a) Penempelan plat KLT pada agar (b) Hasil uji bioautografi kontak Gambar 8. Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi kontak 16

(32) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Selanjutnya dilakukan uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid pada fraksi 2 hasil VLC dari ekstrak klorofrom daun sirih merah, dilakukan 2 uji kualitatif yaitu dengan uji tabung dan uji KLT. Pada penelitian yang dilakukan oleh Thie (2018), pada ekstrak kloroform daun sirih merah tidak terdeteksi adanya senyawa flavonoid. Pada penelitian ini tetap dilakukan uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid pada fraksi 2 hasil VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah untuk melihat apakah pada fraksi tersebut terdeteksi adanya senyawa flavonoid. Hal ini dikarenakan kandungan senyawa pada fraksi seharusnya lebih besar daripada yang terdapat pada ekstrak. (a) Sebelum penambahan reagen (b) sesudah penambahan reagen Gambar 9. Uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid dengan uji tabung Hasil pengamatan menunjukkan bahwa tidak terdapat perubahan warna menjadi warna merah setelah dilakukan uji tabung pada fraksi 2 hasil VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah. Hal ini menunjukkan bahwa pada fraksi tersebut tidak terdeteksi adanya senyawa flavonoid. Tidak terdeteksinya senyawa flavonoid ini bisa dikarenakan tidak adanya senyawa flavonoid dalam fraksi ataupun jumlah / kuantitas senyawa flavonoid yang rendah sehingga tidak dapat terdeteksi dengan uji tabung. Selanjutnya dilakukan uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid pada fraksi 2 hasil VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah, dan digunakan kuersetin sebagai marker. Kuersetin adalah aglikon yang sangat tidak larut dalam air dingin, tidak larut dalam air panas, tetapi cukup larut pada alkohol dan lipid 17

(33) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI (Kelly, 2011). Kloroform merupakan pelarut non polar sehigga kuersetin dipilih sebagai marker karena dapat larut dalam pelarut non polar. Jarak elusi pada KLT yang dilakukan adalah 10 cm. c b c c b a e d 1 1 2 (a) UV 254 nm 1 2 (b) UV 365 nm 2 (c) Penyemprotan FeCl3 Gambar 10. Uji kualitatif kandungan senyawa flavonoid dengan metode KLT Keterangan gambar : 1. Marker kuersetin; 2. Fraksi 2 hasil VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah; a. Senyawa dengan Rf 0,77; b. Senyawa dengan Rf 0,93; c. Senyawa dengan Rf 1; d. Senyawa dengan Rf 0,49; e. Senyawa dengan Rf 0,65 Tabel 2. Nilai Rf dan warna hasil uji KLT Deteksi Bercak yang Nilai Rf Senyawa Warna didapatkan UV 254 nm UV 365 nm Marker kuersetin 0,88 hijau kehitaman Bercak a 0,77 Biru Bercak b 0,93 Biru Bercak c 1 Hijau kehitaman Marker kuersetin 0,88 Biru Bercak c 1 Ungu kemerahan 18

(34) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Bercak d 0,49 Ungu kemerahan Bercak e 0,65 Ungu kemerahan Penyemprotan Marker kuersetin 0,88 Hitam FeCl3 Bercak b 0,93 Putih Bercak c 1 Coklat kehitaman Fase diam yang digunakan pada KLT ini adalah plat Silica Gel GF254. Plat ini akan menampakkan bercak pada saat disinari UV 254 nm serta plat dan bercak akan tampak gelap saat disinari UV 365 nm. Pada uji KLT didapatkan hasil bahwa fraksi tersebut tidak terdeteksi adanya kuersetin yang merupakan senyawa golongan flavonoid. Hal ini bisa dilihat dari hasil KLT yang menunjukkan bahwa sampel menghasilkan warna bercak serta Rf senyawa yang berbeda dengan marker. Fraksi 2 hasil VLC dari esktrak kloroform daun sirih merah kemungkinan mengandung flavonoid lain selain kuersetin. Hal ini dapat dilihat dari adanya fluorosensi pada UV 254 nm pada kromatogram yang menandakan adanya flavonoid (Wagner and Bladt, 1996) dan berwarna kuning (Skorek et al., 2016). Selain itu, adanya bercak ungu kemerahan pada kromatogram dibawah UV 365 nm menunjukkan adanya klorofil ataupun senyawa lain yang tertutupi oleh klorofil (Wagner and Bladt, 1996). Menurut Harborne (1987), deteksi senyawa fenol dengan penambahan FeCl3 akan menghasilkan warna hijau, merah, coklat, ungu, biru, atau hitam yang kuat. Kromatogram setelah disemprot dengan FeCl3 coklat kehitaman menunjukkan adanya senyawa fenol pada fraksi. Aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh fraksi VLC dari ekstrak kloroform daun sirih merah selain karena aktivitas antibakteri dari flavonoid diduga juga karena adanya daya antibakteri dari minyak atsiri. Menurut Tiwari (2011), pelarut kloroform dapat digunakan untuk mengekstraksi senyawa flavonoid dan terpenoid. Minyak atsiri merupakah salah satu senyawa golongan terpenoid yang memiliki aktivitas antibakteri. 19

(35) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Berdasarkan analisis statistik (lampiran 4), uji Shapiro-Wilk untuk melihat mormalitas data dengan nilai signifikansi <0,05 menunjukkan data tidak terdistribusi secara normal. Uji Levene untuk melihat homogenitas data dengan nilai signifikansi <0,05 menunjukkan distribusi data tidak homogen, sehingga dilanjutkan uji Kruskal-Wallis yang menunjukkan adanya perbedaan signifikan pada data dengan nilai signifikansi <0,05 selanjutnya dilanjutkan uji Post-Hoc Mann-Whitney. Diameter zona hambat fraksi 2 dan fraksi 3 berbeda bermakna secara statistik terhadap kontrol negatif dan kontrol positif. Adanya perbedaan bermakna dengan kontrol positif dikarenakan diameter zona hambat yang dihasilkan oleh kontrol positif jauh lebih besar daripada zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 2 dan fraksi 3 yaitu 17,6667±1,4434 mm untuk kontrol positif, 10,3333±0,7638 untuk fraksi 2, dan 7,8333±0,5774 untuk fraksi 3. Sedangkan perbedaan bermakna dengan kontrol negatif dikarenakan tidak dihasilkannya zona hambat oleh kontrol negatif. Hasil pengujian statistik juga menunjukkan bahwa ada perbedaan bermakna antara zona hambat yang dihasilkan fraksi 2 dan fraksi 3. Hal ini dikarenakan zona hambat yang dihasilkan oleh kedua fraksi memiliki selisih yang besar. Dari hasil penelitian didapatkan bahwa fraksi 2 memiliki daya antibakteri yang lebih besar daripada fraksi 3 dengan konsentrasi fraksi 250 mg/ml. KESIMPULAN DAN SARAN Fraksi dari ekstrak kloroform daun sirih merah memiliki daya antibakteri dengan diameter zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 2 adalah 10,3333±0,7638 mm dan zona hambat yang dihasilkan oleh fraksi 3 adalah 7,8333±0,5774 mm, dengan nilai KBM 125 mg/ml. Saran, pengujian dengan metode bioautografi kontak sebaiknya digunakan untuk senyawa yang memiliki daya antibakteri kuat dan juga dilakukan uji identifikasi senyawa minyak atsiri. 20

(36) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2010. Acuan Sediaan Herbal. Volume 5, Edisi 1, Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan, 6-8. Cahyono, W., 2013. Aktivitas Antibakteri Kombinasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz And Pav) dan Kloramfenikol terhadap Bakteri Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, dan Staphylococcus aureus beserta Bioautografinya. Skripsi. Surakarta: Universitas Muhammadiyah Surakarta. Centers for Disease Control and Prevention, 2013. Antibiotic Resistance Threats.United States: Department of Health and Human Service. Chomnawang, M. T., Surassmo, S., Wongsariya, K., and Bunyapraphatsara, N., 2009. Antibacterial Activity of Thai Medical Plants against Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Fitoterapia, 80, 102-104. Clinical and Laboratory Standards Institute, 2017. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 27 th Edition, 62. Davis, W. W., and Stout, T. R., 1971., Disc Plate Methode of Microbiological Antibiotic Assay. Journal of Microbiology. 22 (4), 666-670. Direktorat Jendral Bina Kefarmasian Kefarmasian dan Alat Kesehatan RI, 2011. Farmakope Herbal. Suplemen II. Edisi I, Jakarta: Kementerian Kesehatan RI, 101-102, 105-111. Hamburger, O. M., dan Cordell, G. A., 1987. A Direct Bioutographic TLC Assay for Compounds Possessing Antibacterial Activity. Journal of Natural Products. 50(1), 19-22. Harborne, J.B., 1987. Phytochemical Methods: A Guide to Modern Technique of Plant Analysis, New York: Champman and Hall, 34. Hartini, Y. S., Wahyuono, S., Widyarini, S., dan Yuswanto, A., 2013. Uji Aktivitas Fagositosis Makrofag Fraksi-fraksi dari Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Secara In Vitro. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 11 (2), 108-115. 21

(37) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Hertiani T., Palupi, I. S., Sanliferianti, & Nurwindasari, H. D., 2003. Uji Potensi Antimikroba terhadap S. aureus, E. coli, Shigella dysentriae, dan Candida albicans dari Beberapa Tanaman Obat Tradisional untuk penyakit Infeksi, Jurnal Farmasi Indonesia Pharmacon, 4 (2), 89-95. Jawetz, Melnick, Adelberg, Brooks, Butel, dan Ornston, 2005. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 20, Jakarta: EGC. Juliantina R., Farida, dkk., 2009. Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum) Sebagai Agen Antibakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia. Kelly, G. S., 2011. Quercetin. Alternative Medicine Review. 16 (2), 172-194. Kementrian Kesehatan RI, 2011. Modul Penggunaan Obat Rasional. Jakarta: Kementrian Kesesehatan RI. Kementrian Kesehatan RI., 2011, Pedoman Umum Penggunaan Antibiotik. Jakarta: Kementrian Kesehatan RI. Marston, A., 2011. Thin-Layer Chromatography with Biological Detection in Phytochemistry, Journal of Chromatography A. 1281, 2676-2683. Pandey, A., and Tripathi, S., 2014. Concept of Standardization, Extraction and Pre Phytochemical Screening Strategies for Herbal Drug. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2(5), 115-119. Parfati, N., dan Windono, T., 2016. Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Kajian Pustaka Aspek Botani, Kandungan Kimia, dan Aktivitas Farmakologi. Media Pharmaceutica Indonesiana. 1(2), 106-115. Reveny, J., 2011, Daya Antimikroba Ekstrak dan Fraksi Daun Sirih Merah (Piper betle Linn.), Daya Antimikroba, 12 (1), 6-12. Skorek, M., JurcZYK, k., Sajewicz, M., abd Kowalska, T., 2016. Thin-Layer Chromatographic Identification of Flavonoids and Phenolic Acids Contained in Cosmetic Raw Material. Journal of Liquid Chromatograohy & Related Technologires. 39(5-6), 286-291. Soleha, T. U., Corolia, N., and Kurniawan, S. W., 2015. The Inhibition Of Red Betel Leaves (Piper crocatum) Towards Staphylococcus aureus and Salmonella typhi. J Majority. 5 (5), 117-122. 22

(38) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Sudirman, L. L., 2005., Deteksi Senyawa Antimikroba yang Diisolasi dari Beberapa Lentinus Tropis dengan Metode Bioautografi, Hayati. 12(2), 67-72. Thie, A. S., 2018. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kloroform Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) terhadap Staphylococcus aureus Resisten Ampicillin. Skripsi. Yogyakarta: Universitas Sanata Dharma. Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., and Kaur, H., 2011. Phytochemical screening and Extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia. 1(1), 98-106. Wagner, H., and Bladt, S. 1996. Plant Drug Analysis, A Thin Layer Chromatography Atlas, 2nd Ed., Berlin: Springer Verlag, 195-197. Wardani, R, K., Tjahjaningsih, W., & Rahardja, B, S., 2012. Uji Eefektifitas Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper rocatum) terhadap Bakteri Aeromonas hydrophila Secara In Vitro, Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 4 (1), 59-64. Wendakoon, C., Calderon, P., and Gagnon, D., 2012. Evaluation of Selected Medicinal Plants Extracted in Different Ethanol Concentrations for Antibacterial Activity against Human Pathogens, Journal of Medicinally Active Plants. 1, 60-68. Yulianingsih, S.N., 2012, Aktivits Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L.) terhadap Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis. Muhammadiyah Surakarta. 23 Skripsi. Surakarta: Universitas

(39) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 1. Surat determinasi tanaman sirih merah 24

(40) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 2. Surat identifikasi bakteri Staphyloccous aureus 25

(41) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 3. Sertifikat pengujian statistik dengan SPSS 26

(42) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 4. Hasil perhitungan statistik Hasil Uji Levene Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic Zona Hambat Based on Mean df1 df2 Sig. 6.444 3 8 .016 Based on Median .542 3 8 .667 Based on Median and with adjusted df .542 3 3.151 .685 5.334 3 8 .026 Based on trimmed mean Hasil Uji Shapiro-Wilk Tests of Normality Perlakua n Zona Hambat Kolmogorov-Smirnova Statistic df Sig. Statistic df Sig. 1 .385 3 . .750 3 .000 2 . 3 . . 3 . 3 .253 3 . .964 3 .637 4 .385 3 . .750 3 .000 Hasil Uji Kruskal-Wallis Test Statisticsa,b Zona Hambat Kruskal-Wallis H df Shapiro-Wilk 10.607 3 27

(43) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Asymp. Sig. .014 Hasil Uji Mann-Whitney kontrol positif dan kontrol negative Test Statisticsa Zona Hambat Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 6.000 Z -2.121 Asymp. Sig. (2-tailed) .034 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .100b Hasil Uji Mann-Whitney kontrol positif dan fraksi 2 dari ekstrak kloroform daun sirih merah Test Statisticsa Zona Hambat Mann-Whitney U Wilcoxon W Z .000 6.000 -1.993 Asymp. Sig. (2-tailed) .046 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .100b 28

(44) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Hasil Uji Mann-Whitney kontrol positif dan fraksi 3 dari ekstrak kloroform daun sirih merah Test Statisticsa Zona Hambat Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 6.000 Z -2.023 Asymp. Sig. (2-tailed) .043 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .100b Hasil Uji Mann-Whitney kontrol negatif dan fraksi 2 dari ekstrak kloroform daun sirih merah Test Statisticsa Zona Hambat Mann-Whitney U Wilcoxon W Z .000 6.000 -2.087 Asymp. Sig. (2-tailed) .037 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .100b 29

(45) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Hasil Uji Mann-Whitney kontrol negatif dan fraksi 3 dari ekstrak kloroform daun sirih merah Test Statisticsa Zona Hambat Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 6.000 Z -2.121 Asymp. Sig. (2-tailed) .034 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .100b Hasil Uji Mann-Whitney fraksi 2 dan fraksi 3 dari ekstrak kloroform daun sirih merah Test Statisticsa Zona Hambat Mann-Whitney U Wilcoxon W Z .000 6.000 -1.993 Asymp. Sig. (2-tailed) .046 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .100b 30

(46) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis bernama lengkap Nadia Chandra Prasdiyanti lahir di Surakarta, 27 Mei 1996. Penulis merupakan anak pertama dari 3 bersaudara dari pasangan Bapak I Made Budiarsa dan Ibu Niken Satuti Nur Handayani. Penulis menempuh pendidikan di SD Percobaan 2 Yogyakarta, SMP Negeri 1 Depok Yogyakarta, SMA Stella Duce 1 Yogyakarta dan pada tahun 2015 melanjutkan pendidikan di Program Studi Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis aktif dalam kegiatan kepanitiaan antara lain sebagai anggota divisi Expo kegiatan INSADHA tahun 2016, kordinator divisi konsumsi kegiatan Desa Mitra 1, anggota divisi perlengkapan kegiatan Desa Mitra 2 serta menjadi volunteer kegiatan Faction #2. Penulis pernah menjadi asisten dosen praktikum Farmakognosi-Fitokimia (2018), Farmakokinetika-Biofarmasetika (2018), serta Formulasi dan Teknologi Sediaan Farmasi (2018). 31

(47)

Dokumen baru

Tags

Dokumen yang terkait

uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
13
63
89
Uji aktivitas fagositosis makrofag senyawa kode Pc-2 dari daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) secara in-vivo.
0
2
12
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
1
2
14
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
0
2
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
0
4
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
3
19
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
0
3
uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol, fraksi n-heksan, fraksi kloroform dan fraksi etilasetat daun jambu mete (aNACARDIUM oCCIDENTALE l.)
0
0
29
Potensi antibakteri fraksi kloroform etanol-asam asetat dari ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri [Aleurites moluccana L. WILLD] terhadap Staphylococcus aureus - USD Repository
0
0
88
Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz & Pav] terhadap kultur sel kanker payudara T47D - USD Repository
0
0
80
Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz & Pav] terhadap kultur sel raji - USD Repository
0
0
71
Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz & Pav] terhadap kultur sel HeLa - USD Repository
0
0
73
Uji potensi antifungsi infusa daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz - USD Repository
0
0
96
Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz & Pav] terhadap kultur sel mieloma - USD Repository
0
0
75
Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air [Impatiens balsamina L.] terhadap kultur sel SiHa - USD Repository
0
0
82
Show more