AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK METANOL DAUN SENGGUGU (Clerodendrum serratum L.) TERHADAP CHORIOALLANTOIC MEMBRANE YANG DIINDUKSI bFGF SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Gratis

0
0
93
9 months ago
Preview
Full text
(1)PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK METANOL DAUN SENGGUGU (Clerodendrum serratum L.) TERHADAP CHORIOALLANTOIC MEMBRANE YANG DIINDUKSI bFGF SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Retno Pamungkas NIM : 108114135 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014

(2) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK METANOL DAUN SENGGUGU (Clerodendrum serratum L.) TERHADAP CHORIOALLANTOIC MEMBRANE YANG DIINDUKSI bFGF SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Retno Pamungkas NIM : 108114135 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014 i

(3) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ii

(4) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI iii

(5) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN Skripsi ini kupersembahkan untuk: Sang Triratna atas perlindungannya disetiap langkah hidupku. Ibu dan Ayahku tercinta yang telah merawat, mendidik dan menjadi panutan hidupku. Adikku dan keluarga besarku yang telah saling berbagi rasa dan selalu mendukungku. Skripsi ini kupersembahkan sebagai ungkapan baktiku. Terima kasih atas segalanya yang telah diberikan kepadaku. iv

(6) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI v

(7) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI vi

(8) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas semua berkat dan penyertaan-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK METANOL DAUN SENGGUGU (Clerodendrum serratum L.) TERHADAP CHORIOALLANTOIC MEMBRANE YANG DIINDUKSI bFGF” ini dengan baik. Laporan akhir ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Strata 1 Program Studi Ilmu Farmasi (S. Farm). Penulis banyak mengalami kesulitan dan masalah dalam menyelesaikan laporan ini. Tetapi dengan adanya bantuan dari berbagai pihak, akhirnya penulis dapat menyelesaikan laporan akhir ini. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis ingin mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada: 1. Aris Widayati M.Si, Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Drh. Sitarina Widyarini MP, Ph.D., selaku Dosen Pembimbing Utama yang telah memberikan bantuan dan bimbingan selama rancangan, pengusulan skripsi, saat dilakukan penelitian dan selama penulisan skripsi dengan kesabaran dan penuh perhatian. 3. Phebe Hendra, Ph.D., Apt., selaku Dosen Pembimbing Pendamping yang telah memberikan bantuan dan bimbingan selama rancangan, pengusulan vii

(9) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI skripsi, saat dilakukan penelitian dan selama penulisan skripsi dengan kesabaran dan penuh perhatian. 4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus memberi arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis. 5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus memberi arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis. 6. C.M. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm, Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah mendidik, memberi dukungan dan nasihat positif. 7. Segenap laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia (Pak Wagiran) dan Perbekalan Steril (Pak Agung) Universitas Sanata Dharma atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium FarmakognosiFitokimia dan Perbekalan Steril. 8. Segenap laboran Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan (Pak Iwan) Universitas Gadjah Mada atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium Mikrobiologi. 9. Ketut Noveryka Lendra, Stien Dwiny dan Pande Krisna Wedana, tim antiangiogenesis yang kompak, saling mengisi kekurangan, pantang menyerah dan saling menyemangati. Tanpa mereka skripsi ini tidak akan berjalan dengan baik dan selesai. 10. Kedua orang tuaku dan adikku, yang terus menyemangati dan mendorongku untuk menyelesaikan skripsiku dengan baik. 11. Desi Irwanta, Kristin Yunita dan Rosiana Cahyono, yang telah menyemangati dan saran yang membangun. viii

(10) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 12. Teman-teman farmasi FKK B 2010, yang telah memberikan perhatian, dukungan, doa, semangat, kritik dan masukan yang membangun. 13. Teman-teman farmasi angkatan 2010, yang telah memberikan perhatian, dukungan, doa, semangat, kritik dan masukan yang membangun. 14. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah memberikan dukungan dan bantuan. Penulis menyadari bahwa dalam penyususnan skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Oleh karena itu, dengan segenap kerendahan hati Penulis memohon maaf apabila terdapat hal-hal yang kurang berkenan serta Penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir kata Penulis berharap semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca. Yogyakarta, 11 Agustus 2014 Penulis ix

(11) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL .......................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................. ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................... iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ............ v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................... vi PRAKATA ......................................................................................... vii DAFTAR ISI ...................................................................................... x DAFTAR TABEL............................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR .......................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................... xv INTISARI ........................................................................................... xvi ABSTRACT ......................................................................................... xvii BAB I PENGANTAR ......................................................................... 1 A. Latar Belakang ............................................................................ 1 1. Permasalahan .......................................................................... 3 2. Keaslian Penelitian ................................................................. 4 3. Manfaat Penelitian .................................................................. 4 B. Tujuan Penelitian ........................................................................ 5 x

(12) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 1. Tujuan Umum ....................................................................... 5 2. Tujuan Khusus ...................................................................... 5 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................. 6 A. Senggugu ..................................................................................... 6 1. Nama Tumbuhan ................................................................... 6 2. Taksonomi Tumbuhan .......................................................... 7 3. Manfaat Tanaman ................................................................. 7 4. Kandungan Kimia ................................................................. 8 B. Senyawa Polifenol ....................................................................... 8 C. Kanker ......................................................................................... 9 1. Sifat Sel Kanker .................................................................... 10 2. Angiogenesis ......................................................................... 13 3. Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) .............................. 15 D. Inhibitor Angiogenesis ................................................................ 16 E. Inhibitor Angiogenesis dari Senyawa Alam ............................... 16 F. Chorioallantoic Membrane ......................................................... 18 G. Uji Angiogenesis Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) ..... 19 H. Landasan Teori ............................................................................ 20 I. Hipotesis ...................................................................................... 22 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................... 23 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................. 23 B. Variabel dan Definisi Operasional .............................................. 23 1. Variabel ................................................................................. xi 23

(13) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2. Definisi Operasional ............................................................. 24 C. Bahan Penelitian ......................................................................... 24 D. Alat Penelitian ............................................................................. 24 E. Tata Cara Penelitian .................................................................... 25 1. Determinasi Tanaman ........................................................... 25 2. Preparasi Ekstrak Metanol Daun Senggugu .......................... 25 3. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .................................... 26 4. Orientasi Kelarutan Ekstrak Metanol Daun Senggugu ......... 27 5. Sterilisasi Alat ....................................................................... 27 6. Pembuatan Larutan Uji dan Larutan bFGF ............................ 27 7. Uji Antiangiogenesis ............................................................. 28 F. Analisis Data ............................................................................... 30 BAB VI HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................ 31 A. Hasil Determinasi Tanaman ........................................................ 31 B. Hasil Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Senggugu ................... 31 C. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis ............................................ 33 D. Hasil Uji Antiangiogenesis ......................................................... 34 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................. 50 A. Kesimpulan ................................................................................. 50 B. Saran ............................................................................................ 50 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................... 51 LAMPIRAN ....................................................................................... 55 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................ 75 xii

(14) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel I. Jumlah Pembuluh Darah Baru Kelompok Kontrol dan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu ........................ Tabel II. Uji Tukey Kelompok Kontrol dan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu ...................................................... Tabel III 41 Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru dan Persentase Penghambatan Angiogenesis Kelompok Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu ........................ Tabel IV 39 42 Rerata dan Standar Deviasi Pembuluh Darah Baru Setiap Kelompok ............................................................................. xiii 69

(15) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Foto Tanaman Senggugu.................................................. 6 Gambar 2. Hasil Uji CAM pada Kelompok Kontrol dan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu ................................... Gambar 3. Grafik Persentase Penghambatan Angiogenesis Kelompok Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu Gambar 4. Kemungkinan Jalur Sinyal 39 Angiogenesis 43 yang Diregulasi oleh Hispidulin dalam Sel Endotelial ............. 46 Gambar 5. Tanaman Senggugu di Kebun Obat Universitas Sanata 56 Dharma ......................... Gambar 6. Foto Prosedur Kerja Uji CAM ......................................... 66 Gambar 7. Hasil uji CAM pada Kelompok Kontrol dan Perlakuan .. 67 xiv

(16) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman Senggugu ............................ Lampiran 2. Foto Tanaman Senggugu dari Kebun Obat Universitas Sanata Dharma ................................................................. Lampiran 3. 55 56 Data Perhitungan Rendemen Ekstrak Metanol Daun Senggugu ......................................................................... 57 Lampiran 4. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis ................................. 58 Lampiran 5. Data Perhitungan Kontrol bFGF ...................................... 61 Lampiran 6. Data Perhitungan Kontrol Pelarut .................................... 63 Lampiran 7. Data Perhitungan Kelompok Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Senggugu ................................................. 64 Lampiran 8. Foto Prosedur Kerja Uji CAM ......................................... 66 Lampiran 9. Hasil uji CAM .................................................................. 67 Lampiran 10. Persentase Penghambatan Angiogenesis ......................... 69 Lampiran 11. Uji statistik dengan SPSS 16.0 ........................................ 71 xv

(17) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI INTISARI Daun senggugu (Clerodendrum serratum L.) merupakan daun yang banyak mengandung senyawa polifenol seperti flavonoid. Beberapa senyawa flavonoid telah diuji dapat menghambat angiogenesis. Contoh senyawa flavonoid tersebut adalah hispidulin, apigenin dan luteolin, yang juga terkandung dalam daun senggugu. Berdasarkan hal tersebut daun senggugu berpotensi memiliki aktivitas antiangiogenesis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antiangiogenesis dari ekstrak metanol daun senggugu dengan metode Chick Chorioallantoic Membrane (CAM), dan mengetahui kekerabatan antara konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu dengan aktivitas antiangiogenesis. Chorioallantoic membrane yang digunakan berasal dari telur ayam yang berusia 9 hari. Konsentrasi ekstrak yang diuji terdiri dari 3 variasi kadar yaitu 0,175; 0,35 dan 0,7 mg/mL. Aktivitas antiangiogenesis dilihat melalui pengamatan makroskopis dengan menghitung pembuluh darah baru yang keluar dari pembuluh darah utama secara langsung dan tidak langsung. Data tersebut dianalisis persentase penghambatan angiogenesis dan diuji statistik dengan one way anova dan uji Tukey. Hasil penelitian ini menunjukan ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas antiangiogenesis pada konsentrasi 0,35 dan 0,7 mg/mL dengan persentase penghambatan angiogenesis 30,00 dan 37,12%, dan tidak ada kekerabatan antara konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu dengan aktivitas antiangiogenesis. Kata kunci : Clerodendrum serratum L., aktivitas antiangiogenesis, CAM., persentase penghambatan angiogenesis xvi

(18) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ABSTRACT The leaves of senggugu (Clerodendrum serratum L.) is a leaves that contains polyphenolic compounds such as flavonoids. Several compounds have been tested flavonoids can inhibit angiogenesis. Examples of these flavonoids is hispidulin, apigenin and luteolin, which contained in the senggugu leaves. Based on that statement, senggugu leaves potentially have antiangiogenesis activity. This study aims to determine antiangiogenesis activity of the metanol extract of senggugu leaves by Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) method, and find out the relationship between the concentration metanol extract of senggugu leaves with antiangiogenesis activity. Chorioallantoic membrane is derived from chicken’s egg was 9 days. The concentration extract metanol of senggugu leaves which tested consists of three variation concentrations is 0.175; 0.35 and 0.7 mg/mL. Antiangiogenesis activity can be seen through macroscopic observation by counting the newly formed blood vessels where out from main blood vessel directly and indirectly. The data were analyzed with the percentage of inhibition angiogenesis and statistically tested by one way anova and tukey test. The result showed that the methanol extract of senggugu leaves have antiangiogenesis activity at concentrations 0.35 and 0.7 mg/mL, which the percentage of inhibition angiogenesis are 30.00 and 37.12%, and there was no relationship between the concentration metanol extract of senggugu leaves with antiangiogenesis activity. Key words: Clerodendrum serratum L., antiangiogenesis activity, CAM, Persentage of inhibition angiogenesis xvii

(19) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker adalah penyakit yang ditandai oleh pertumbuhan sel yang tidak terkendali, bersifat parasit dengan mengambil makanan dari sel sehat terdekat. Kanker merupakan salah satu penyakit mematikan di dunia. Resiko individu untuk menderita kanker dipengaruhi oleh faktor genetik dan pemejanan terhadap agen yang mempredisposisi kanker (Brooker, 2005). Berdasarkan estimasi dari International Agency for Research on Cancer (IARC), pada tahun 2008 terjadi 12,7 juta kasus kanker di dunia, dan 7,6 juta kematian akibat kanker. Pada tahun 2030 diduga kasus kanker akan terus bertambah menjadi 21,4 juta dan 13,2 juta kematian akibat kanker (American Cancer Society, 2011). Tingginya kasus kematian akibat kanker membuat penelitian dan pengembangan pengobatan kanker menjadi perhatian besar bagi dunia. Sekarang ini sudah ada beberapa terapi pengobatan kanker secara medis antara lain terapi operatif, kemoterapi, radioterapi, hormonal, dan imunoterapi. Saat ini telah berkembang pula pengobatan kanker dengan menggunakan tanaman obat. Secara empiris tanaman telah lama digunakan oleh nenek moyang sebagai obat untuk beragam penyakit. Tanaman obat yang digunakan untuk mengobati kanker pada prinsipnya berfungsi menghambat pertumbuhan kanker, menghancurkan kanker, dan memperbaiki fungsi organ vital yang rusak oleh kanker. Penggunaan tanaman obat sebagai salah satu alternatif pencegah dan penyembuh kanker masih 1

(20) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2 membutuhkan penelitian lebih lanjut oleh para ahli untuk memastikan keefektifannya (Mardiana, 2007). Angiogenesis terdiri dari dua kata, yaitu angio (pembuluh darah) dan genesis (pertumbuhan), jadi angiogenesis adalah pertumbuhan pembuluh darah baru. Pertumbuhan pembuluh darah baru berperan penting agar tumor (terutama tumor padat atau solid) dapat hidup dan berkembang. Berdasarkan hal tersebut maka salah satu cara membunuh tumor adalah dengan menghambat pertumbuhan pembuluh darah tumor sehingga tumor tidak bisa berkembang dan kemudian mati pelan-pelan (Tapan, 2005). Hal tersebut membuat pencarian obat antiangiogenesis menjadi salah satu perhatian besar dalam penelitian pengobatan kanker, salah satunya pencarian senyawa antiangiogenesis yang berasal dari tanaman obat. Senyawa tersebut kemudian akan dikembangkan menjadi obat kanker. Salah satu metode uji angiogenesis, yaitu metode Chick Chorioallantoic Membrane (CAM). Metode CAM adalah organotypic model yang awalnya dirancang untuk menggantikan Draize-test untuk mengidentifikasi iritasi di mata, pendarahan, lisis dan koagulasi. Tes ini lambat laun memungkinkan untuk analisis angiogenesis tumor yang tumbuh di chorioallantoic membrane (Hock, Zheng, Buckfelder, Eyupoglu, and Savaskan, 2013). Indonesia memiliki kekayaan hayati yang melimpah. Salah satunya kekayaan hayati tumbuhan. Tumbuhan memiliki peranan penting dalam menghasilkan senyawa bioaktif untuk obat, termasuk obat kanker. Salah satu tanaman yang diduga kandungan senyawa bioaktifnya dapat menyembuhkan kanker adalah daun senggugu (Clerodendrum serratum L.). Berdasarkan hasil uji

(21) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3 in vivo dengan parameter seperti studi hematologi dan estimasi protein, Median Survival Time (MST), Life Span (%LS) dan studi in vitro dengan uji garam tetrazolium dan metode tryphan blue dry exclusion dapat disimpulkan bahwa ekstrak daun senggugu memiliki aktivitas antikanker (Thalla, Tanmu, Pentela, and Thalla, 2012). Berdasarkan hasil uji angiogenesis menggunakan metode rat aortic, ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas antiangiogenesis yang lebih besar dibandingkan dengan penyari petroleum eter, kloroform, dan air (Mohamed, Mohamed, Aisha, Ameer, Ismail, Ismail, et al., 2012). Kandungan polifenolik dari daun senggugu sebagai antioksidan diduga memiliki peranan penting dalam aktivitas antiangiogenesis yang dapat bermanfaat sebagai antikanker. Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan apakah ekstrak metanol daun senggugu (Clerodendrum serratum L.) mempunyai potensi sebagai antiangiogenesis dengan uji angiogenesis lain, yaitu metode CAM dengan chorioallantoic membrane embrio ayam yang telah diinduksi basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), sehingga dapat dijadikan bukti ilmiah untuk pengembangan penelitian pengobatan kanker pada manusia. 1. Permasalahan a. Apakah ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas antiangiogenesis pada chorioallantoic membrane embrio ayam yang diinduksi bFGF? b. Adakah kekerabatan antara konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu dengan aktivitas antiangiogenesis pada chorioallantoic membrane embrio ayam yang diinduksi bFGF?

(22) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 4 2. Keaslian Penelitian Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji angiogenesis daun senggugu pernah dilakukan oleh Mohamed, et al., 2012, yang melakukan penelitian uji angiogenesis menggunakan model rat aortic. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah simplisia yang digunakan didapat dari Kebun Obat Universitas Sanata Dharma, dan model uji angiogenesis yang digunakan adalah metode CAM dengan chorioallantoic membrane embrio ayam yang telah diinduksi bFGF. Sepanjang pengetahuan penulis, penelitian uji angiogenesis daun senggugu dengan metode CAM menggunakan chorioallantoic membrane embrio ayam yang diinduksi bFGF belum pernah dilaporkan. 3. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoritis. Dapat memperkaya ilmu pengetahuan mengenai adanya aktivitas antiangiogenesis pada daun senggugu. b. Manfaat metodologi. Dapat memberikan pengetahuan mengenai tata cara pengujian aktivitas antiangiogenesis ekstrak metanolik daun senggugu menggunakan metode CAM pada embrio ayam yang diinduksi bFGF. c. Manfaat praktis. Dapat memberikan informasi mengenai adanya aktivitas antiangiogenesis daun senggugu dalam pengobatan kanker.

(23) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5 B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan Umum Untuk memberikan informasi kepada masyarakat tentang ekstrak daun senggugu sebagai obat antikanker. 2. Tujuan Khusus a. Untuk mengetahui aktivitas antiangiogenesis dari ekstrak metanol daun senggugu. b. Untuk mengetahui kekerabatan antara konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu dengan aktivitas antiangiogenesis.

(24) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Senggugu 1. Nama Tumbuhan Nama Latin : Clerodendron serratum L. Nama Umum : Senggugu (Gambar 1) Nama Daerah : Simar buangkudu (Batak Toba); Tanjau handak (Lampung); Senggugu (Melayu dan Jawa Tengah); Singgugu (Sunda); Kertase (Madura) (Direktorat Obat Asli Indonesia, 2008). Gambar 1. Foto Tanaman Senggugu (Clerodendrum serratum L.) (Singh, Khare, Iyer, Sharwan, and Tripathi, 2012). 6

(25) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 7 2. Taksonomi Tumbuhan Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Super Divisi : Spermatophyta Divisi : Spermatophyta Subdivisi : Angiopermae Kelas : Dicotyledoneae Bangsa : Lamiales Suku : Verbenaceae Marga : Clerodendron Jenis : Clerodendron serratum Spreng. Sinonim tumbuhan : Clerodendrum serratum, Clerodendron serratum (L.) Moon dan Clerodendron javanicum Walp., Clerodendrum serratum Spreng. (Direktorat Obat Asli Indonesia, 2008; Singh, et al., 2012; Van Steenis, 1975; Heyne, 1950). 3. Manfaat Tanaman Secara tradisional tanaman senggugu sudah digunakan sebagai obat anti rematik, anti asma, penurun panas, sakit kepala, ophtalmia, memar, bronchitis, patah tulang, malaria, digigit ular, bisul dan perut busung. Berdasarkan hasil penelitian Singh, et al., (2012) senggugu dapat berguna sebagai anti inflamasi,

(26) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 8 anti kanker, hepatoprotektif, anti diare, dan anti mikroba (Singh, et al., 2012; Redaksi Agromedia, 2008). 4. Kandungan Kimia Kandungan kimia yang banyak terdapat di tanaman genus Clerodendrum adalah karbohidrat, fenolik, flavonoid, terpenoid dan steroid. Daun senggugu mengandung α-spinosterol, luteolin, luteolin-7-o-glucoronide, diterpin-clerodin, ethycholesta-5, 24 25 -trine 3β-o-hispidulin, 7-o- glukonoid hispidulin, cruteuarein, stigmasterol, apigenin, dan baicalin. Kandungan flavonoid dalam daun senggugu, yaitu hispidulin memiliki aktivitas antioksidan yang kuat, anti mikroba, anti asma, anti tumor, dan aktivitas Central Nervous System (CNS) binding. Kandungan polifenol yang besar dalam daun senggugu diduga kuat berperan penting dalam aktivitas ekstrak metanol daun senggugu sebagai antiangiogenesis, antioksidan, dan vasorelaktan (Kumar and Nishteswar, 2013; Mohamed, et al., 2012; Vidya, Krishna, Manjunatha, Mankani, Ahmed and Singh, 2006). B. Senyawa Polifenol Polifenol adalah kelompok zat kimia yang ditemukan pada tumbuhan. Zat ini memiliki tanda khas yaitu memiliki banyak gugus fenol dalam molekulnya. Polifenol berperan sebagai antioksidan, dengan cara melindungi sel melawan kerusakan oksidatif dan meminimalkan resiko dari berbagai macam penyakit degeneratif yang berhubungan dengan stress oksidatif. Studi

(27) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 9 eksperimental menunjukkan peran polifenol yang kuat dalan pencegahan penyakit kardiovaskular, kanker, osteoporosis, dan diabetes melitus. Polifenol dibagi menjadi beberapa kelas sesuai dengan jumlah cincin fenol yang dikandung dan elemen struktural yang mengikat cincin satu sama lain. Kelompok utama polifenol yaitu flavonoid, asam fenolik, alkohol fenolik, stilbene, dan lignin (Hattenschwiler and Vitousek, 2000; Archivio, Filesi, Benedetto, Gargiulo, Giovannini and Masella, 2007). C. Kanker Kanker merupakan penyakit yang berpotensi mematikan yang disebabkan mutasi gen yang mengkode protein sel regulasi yang penting. Akibat mutasi gen tersebut menyebabkan disregulasi dari program sel normal untuk pembelahan sel dan diferensiasi sel. Pembelahan sel tersebut menyebabkan ketidakseimbangan replikasi sel dan kematian sel tumor, sehingga pertumbuhan populasi sel tumor tak terkendali (Alison, 2001; Ruddon, 2007). Penyakit kanker ditandai oleh pertumbuhan sel yang tidak terkendali dan bersifat parasit. Karakteristik yang menunjukkan perbedaan kanker ganas dengan tumor jinak adalah kemampuan untuk menginvasi secara lokal, menyebar ke kelenjar getah bening regional, dan metastasis ke jaringan lain dalam tubuh. Secara morfologi sel kanker memiliki karakteristik nukleus yang besar, memiliki ukuran dan bentuk yang tidak biasa, nukleolus yang menonjol, sitoplasma yang jarang dan warnanya intens atau sebaliknya pucat. Resiko individu untuk mengalami kanker dipengaruhi faktor genetik dan pemejanan terhadap karsinoma

(28) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 10 lingkungan (agen yang mempredisposisi kanker). Gaya hidup yang tidak sehat, merokok, western diet (tinggi lemak, rendah serat) juga dapat meningkatkan resiko timbulnya kanker (Baba and Catoi, 2007; Brooker, 2005). 1. Sifat Sel Kanker Secara umum, sel kanker memiliki sifat-sifat sebagai berikut: a. Potensi replikasi sel yang tidak terkendali. Sel normal tumbuh dan bereplikasi ketika sel mendapat sinyal dari sel disekitar mereka untuk tumbuh. Sel dapat bereplikasi 60 sampai 80 lipat dari populasi, telomer Human Diploid Fibroblasts (HDFs) memendek dan memicu respon kerusakan, kemudian sel akan berhenti membelah diri dan berkembang menjadi fenotip senescence. Senescence adalah program growth-arrest yang membatasi usia sel dan mencegah proliferasi sel yang tidak terbatas. Proses senescence diatur oleh tumour suppressors p53 dan retinoblastoma (RB). Jika RB dan p53 dilumpuhkan maka memungkinkan pembelahan sel terus berlangsung sampai telomer memendek secara kritis dan memicu krisis. Beberapa sel muncul dari krisis dengan mengaktifkan mekanisme stabilisasi telomer. Ekspresi eksogen Telomerase Reverse Transcriptase (TERT) pada beberapa tahap replikasi memungkinkan sel-sel tersebut immortal. Proses stabilisasi telomer memiliki peranan penting pada perkembangan tumor. Hal tersebut menyebabkan sel kanker dapat meningkatkan dan mempercepat pertumbuhannya sendiri. Sel kanker kehilangan kontrol untuk terus membelah diri (Mathon and Lloyd, 2001).

(29) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 11 b. Kemampuan sel mencukupi sendiri kebutuhannya terhadap sinyal pertumbuhan. Apabila sel normal dikulturkan, proliferasi sel bergantung pada sinyal pertumbuhan yang dimasukkan kedalam kultur tersebut. Sedangkan pada sel kanker, onkoprotein dapat meniru sinyal pertumbuhan pada sel normal, sehingga pada kultur sel kanker menunjukkan berkurangnya ketergantung sel pada sinyal pertumbuhan dari luar, karena sel kanker sudah memproduksinya sendiri (Hanahan and Weinberg, 2000). c. Respon terhadap stop signal (sinyal anti pertumbuhan) lemah. Sel normal akan berhenti membelah diri ketika menerima stop signal dari sel di dekatnya bahwa jumlah sel di sekitarnya sudah penuh atau bagian dari sel rusak. Proses proliferasi dihentikan oleh stop signal. Stop signal dapat menghentikan proliferasi dengan 2 mekanisme tertentu. Mekanisme pertama yaitu sel dipaksa berhenti berproliferasi dan memasuki fase istirahat (G0) yang dapat aktif kembali bila terdapat sinyal ekstraseluler. Sedangkan mekanisme kedua adalah sel diinduksi untuk menghilangkan potensi proliferasi secara permanen dengan memasuki tahap post mitosis, yang dihubungkan dengan terjadinya diferensiasi spesifik. Untuk mulai tumbuh, sel kanker harus menghindari faktor anti pertumbuhan yang sebagian besar berperan pada fase G1 yang menyebabkan sel berhenti berproliferasi dengan memasuki fase istirahat atau post mitosis. Sinyal antiproliferatif tersebut diperankan melalui retinoblastoma protein (pRB). pRB dapat mengeblok proliferasi dengan mengasingkan dan mengubah fungsi faktor transkripsi E2F yang mengontrol ekspresi simpanan gen esensial untuk memacu fase G1 memasuki fase S pada tingkat hipofosforilasi.

(30) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 12 Gangguan pada jalur pRB akan membebaskan E2F yang dapat menjadikan sel terus berproliferasi, dan juga membuat sel tidak sensitif terhadap faktor anti pertumbuhan yang beroperasi selama jalur ini, dengan cara mengeblok kemajuan fase G1 dari siklus sel (Hanahan and Weinberg, 2000; Weinberg, 1996). d. Mampu menghindari terjadinya apoptosis. Sel normal dapat mengalami kematian sel yang terdiri dari nekrosis, onkosis dan apoptosis. Apoptosis adalah kematian sel melalui mekanisme genetik yaitu kerusakan atau fragmentasi kromosom atau DNA. Apoptosis dibedakan menjadi dua yaitu apoptosis fisiologis dan apoptosis patologis. Sel kanker dapat menghindari dari proses apoptosis fisiologis karena aktivitas enzim ribonukleoprotein atau telomerase yang berperan dalam sintesis telomerik DNA aktif secara terus menerus sehingga ukuran telomer ujung kromosom dapat dipertahankan terus menerus. Akibatnya sel kanker tidak mengalami kematian sel (Sudiana, 2008). e. Merekrut suplai makanan. Semua sel untuk dapat tumbuh membutuhkan oksigen dan nutrisi yang dihantarkan dalam darah, salah satunya darah yang ada di pembuluh darah sekitarnya. Umumnya, sistem tubuh berhati-hati dalam meregulasi pertumbuhan pembuluh darah baru (angiogenesis). Namun tumor dapat mengaktifkan pemicu angiogenesis dengan merubah keseimbangan antara induktor dan inhibitor angiogenesis. Salah satu strategi untuk merubah keseimbangan melibatkan perubahan transkripsi gen. Pada sel tumor ekspresi VEGF dan FGF lebih banyak dibandingkan jaringan normal, sedangkan

(31) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 13 produksi inhibitor endogen seperti thrombospondin-1 atau interferon-β lebih sedikit (Hanahan and Weinberg, 2000). f. Menginvasi jaringan dan metastasis. Dalam jaringan sehat, sel-sel melekat pada tempat sel berada, mengikuti satu sama lain dalam struktur yang mencirikan jaringan dan membantu dalam fungsinya. Sebaliknya pada sel kanker yang sudah matang dapat melepaskan pegangan molekular sehingga dapat berpindah melalui pembuluh darah dan bergerak sampai bagian lain dalam tubuh dan menginvasi jaringan dengan membentuk koloni baru. Kemampuan untuk membentuk koloni baru yang jauh dari tempat primernya dinamakan metastasis. Metastasis merupakan karakteristik yang paling menentukan keganasan sel kanker karena penyebaran metastasis sel kanker sangat sulit diobati. Beberapa protein yang terlibat pada proses perlekatan sel dalam jaringan dalam proses invasi dan metastasis, diantaranya Cell Adhesion Molecules (CAMs), E-cadherin dan integrin yang menghubungkan sel dengan matriks ekstraseluler. (Alison, 2001; Hanahan and Weinberg, 2000). 2. Angiogenesis Angiogenesis adalah pertumbuhan pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang sudah ada. Angiogenesis terjadi pada tubuh manusia, mulai dari janin dan terus berlanjut sampai tua, baik saat sehat maupun sakit. Angiogenesis patologis terjadi pada penyakit seperti kanker, rheumatoid arthritis (RA), endometriosis, psoriasis, stroke, luka kronik, coronary artery disease, komplikasi Acquired Immune Defiency Syndrome (AIDS), alzheimer dan retinopati diabetes.

(32) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 14 Angiogenesis berperan penting dalam perkembangan kanker. Kanker untuk menyebar membutuhkan suplai pembuluh darah yang membawa oksigen dan nutrisi dan membuang sampah metabolit (Adair and Montani, 2011; Jeong, Koh, Lee, Lee, Lee, Bae, et al., 2010; Bisht, Dhasmana and Bist, 2010). Proses angiogenesis berawal dari jaringan yang sakit, luka, mengalami hipoksia, atau tumor yang akan memproduksi dan melepaskan faktor pertumbuhan angiogenesis yang berupa protein, faktor pertumbuhan angiogenesis tersebut berdifusi ke jaringan di sekitarnya. Contoh faktor pertumbuhan angiogenesis yaitu angiopoietin-1, Fibroblast Growth Factors: acidic (aFGF) dan basic (bFGF), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Transforming Growth Factor (TGF) dan lain-lain. Faktor pertumbuhan angiogenesis tersebut berikatan dengan reseptor spesifik dari sel endotelial pembuluh darah sekitarnya sehingga sel endotelial teraktivasi. Sel endotelial yang teraktivasi menghasilkan sinyal dari permukaan sel kemudian dikirim ke nukleus. Organel-organel sel endotelial kemudian memproduksi molekul baru termasuk enzim protease. Enzim protease mendegradasi matriks ekstraseluler. Sel endotelial kemudian mulai membelah diri dan migrasi keluar melalui lubang hasil degradasi matriks ekstraseluler menuju jaringan yang sakit, luka, hipoksia atau tumor tersebut. Sel endotelial mengalami elongasi dan saling menyejajarkan diri dengan sel endotelial lain untuk membentuk struktur percabangan pembuluh darah yang kuat. Struktur pembuluh darah akan distabilkan oleh sel mural (sel otot polos dan pericytes) sebagai jaringan penyangga dari pembuluh darah yang baru. Kemudian

(33) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 15 pembentukan anastomosis dan akhirnya aliran darah (Frisca, Sardjono, dan Sandra, 2009; Gupta and Qin, 2003). 3. Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Basic Fibroblast Growth Factor disebut juga Fibroblast Growth Factor2 (FGF2 /FGF-2). bFGF menginduksi migrasi, proliferasi dan diferensiasi sel endotelial secara in vitro, oleh karena itu bFGF memiliki peranan penting dalam angiogenesis. bFGF berperan pada proses regulasi ekspresi beberapa protein termasuk intestinal collagenase, urokinase type plasminogen activator (uPa) dan integrin β1, yang semuanya berperan penting untuk invasi sel endotelial ke dalam matriks selama angiogenesis. Selain itu bFGF juga dapat menginduksi proliferasi sel otot polos (Wingerter, Elliot, Clark, and Farr, 2000; Mogensen, 2005). Faktor pertumbuhan termasuk bFGF dapat berikatan dengan reseptornya pada permukaan sel endotelial dari pembuluh darah jaringan sekitar yang telah ada sebelumnya. bFGF mampu berinteraksi dengan sel endotelial melalui ikatannya dengan reseptor Fibroblast Growth Factor (FGF) tirosin kinase dan reseptor Heparan Sulphate Proteoglycans (HSPGs) di permukaan sel dan di matriks ekstraseluler. Ikatan tersebut menyebabkan sel endotelial teraktivasi dan menghasilkan enzim degradatif matrix metalloproteinases (MMPs). Enzim ini dilepaskan dari endotelial dan menyebar disekitar sel. MMPs mendegradasi matriks ekstraseluler dan menyebar ke jaringan sekitarnya. Kemudian sel endotelial mulai membelah diri dan migrasi keluar ke ruang intestinal, kemudian tumbuh dan berproliferasi melalui lubang hasil degradasi. Selanjutnya

(34) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 16 pembentukan lumen, generasi membran basement baru dengan perekrutan dari pericyte, kemudian pembentukan anastomosis dan akhirnya aliran darah (Chrisnanto, 2014; Gupta and Qin, 2003; Kleinsmith, Kerrigan, Kelly and Hollan, 2006; Ribbati, Leali, Gualandris, Bastaki, Vacca, Roncali, et al., 1999). D. Inhibitor Angiogenesis Inhibitor angiogenesis dibedakan menjadi 2 tipe yaitu inhibitor angiogenesis langsung dan tidak langsung. Inhibitor angiogenesis tipe tidak langsung bekerja dengan memblok sel onkogen tumor atau produknya atau reseptor dari produknya. Contoh dari inhibitor angiogenesis tipe tidak langsung adalah iressa. Iressa menghambat sintesis protein angiogenik bFGF, Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Transforming Growth Factor- Alpha (TGFα) dari sel tumor (Folkman, 2003). Inhibitor angiogenesis tipe langsung bekerja dengan memblok sel endotelial dari respon protein pro angiogenik. Contoh inhibitor angiogenesis tipe langsung adalah endostatin. Endostatin menghambat sel endotelial merespon beberapa protein angiogenik seperti bFGF, VEGF, IL-8 dan Platelet Derived Growth Factor (PDGF) (Folkman, 2003). E. Inhibitor Angiogenesis dari Senyawa Alam Berbagai penelitian telah membuktikan beberapa senyawa dari produk alam memiliki aktivitas antiangiogenesis Hispidulin yang merupakan senyawa bioaktif golongan flavonoid juga memiliki aktivitas antiangiogenesis. Menurut

(35) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 17 penelitian He Lijun dan kawan-kawan (2010) menunjukkan hispidulin dari ekstrak Artemisia vestita menghambat angiogenesis tumor pankreas manusia dan pertumbuhan tumor dengan cara mentarget jalur sinyal VEGFR2 yang dimediasi P13K/Akt/mTOR (He, Wu, Lin, Wang, Wu, Chen, et al, 2010). Selain hispidulin, apigenin juga merupakan senyawa bioaktif golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antiangiogenesis. Menurut penelitian Jing Fang dan kawan kawan (2004) apigenin memiliki aktivitas antiangiogenesis dengan cara menghambat tube formation melalui uji Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). Apigenin menghambat tube formation dengan cara menurunkan ekspresi VEGF. Apigenin menghambat ekspresi VEGF pada level transkripsi melalui ekspresi hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α). Apigenin menghambat HIF-1α dan ekspresi VEGF melalui 2 jalur sinyal P13K/AKT/p70S6K1 dan HDM2/p53. (Fang, Xia, Cao, Zheng, Reed, and Jiang, 2004). Luteolin menghambat proliferasi sel dengan cara menghambat reseptor tirosin kinase. Ekstrak luteolin dari Platycodon grandiflorum juga terbukti memiliki aktivitas antiangiogenesis yang diduga aktivitasnya berkaitan dengan aktivitas antioksidan dari luteolin dengan cara memblok produksi Reactive Oxygen Species (ROS) sehingga menekan ekspresi VEGF dan efek proangiogenik dari VEGF. Senyawa flavonoid lainnya yang sudah terbukti memiliki aktivitas penghambatan angiogenesis adalah 3-hydroxyflavone, 3’,4’-dihydroxyflavone, 2’3’-dihydroxyflavone, fisetin dan morin. Senyawa golongan alkaloid seperti pterogynidine yang diisolasi dari Alchornea glandulosa juga memiliki aktivitas antiangiogenesis. Pterogynidine bekerja dengan menghambat aktivitas endotelial

(36) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 18 NFκB (Park, Cho, Jun, Ryu, Kim, Yu et al, 2010; Lopes, Rocha, Pirraco, Regasini, Silva, Bolzani, et al., 2009). F. Chorioallantoic Membrane Chorioallantoic membrane adalah membran ekstraembrionik yang berasal dari perpaduan lapisan mesodermal alantois dengan lapisan mesodermal korio yang berdampingan. Chorioallantoic membrane dari embrio ayam kaya akan pembuluh darah, yang menyerupai jaringan endometrium pada uterus. Ketika chorioallantoic membrane tervaskularisasi dengan tinggi, chorioallantoic membrane menjadi media yang cocok / baik untuk propagansi virus dan mikroorganisme yang lain (Gajovic and Gruss, 1988; Ribbati, Bertossi, Nico, Vacca, Ria, Riva et al., 1998). Chorioallantoic membrane muncul pada hari ke-4 atau ke-5 diikuti pertumbuhan pembuluh darah yang meluas diatas permukaan kuning telur dan segera menutup seluruh daerah tersebut. Membran yang sangat kaya dengan pembuluh darah ini berhubungan dengan sirkulasi embrionik melalui arteri dan vena allantoic. Melalui sirkulasi ini berlangsung pertukaran oksigen dan karbondioksida yang dibutuhkan oleh embrio. Selain berfungsi sebagai sistem sirkulasi, membran ini juga berfungsi sebagai tempat pembuangan dan pencernaan dan juga bertanggung jawab terhadap perkembangan embrio. Chorioallantoic membrane adalah tempat yang cocok untuk transplantasi jaringan karena sistem imun embrio ayam belum sepenuhnya berkembang dan reaksi penolakan benda asing embrio ayam belum sempurna. Menurut Folkman (1971), chorioallantoic

(37) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 19 membrane embrio ayam dapat digunakan sebagai metode untuk mempelajari respon angiogenesis terhadap implan jaringan tumor (Folkman, 1971; Knighton, Ausprunk, Folkman, and Tapper, 1977; Patten, 1978; Shepro, 2006; Storer, Stebins, Usinger, and Nybakker, 1979). Uji angiogenesis dengan menggunakan chorioallantoic membrane dapat dilakukan secara in vivo maupun in vitro. Metode lain yang dapat digunakan sebagai uji angiogenesis dikelompokkan menjadi 3 jenis uji yaitu uji in vivo, uji in vitro sel dan uji organotropik. Selain uji angiogenesis CAM, uji in vivo angiogenesis yang lain yaitu Matrigel plug dan neovaskularisasi kornea. Uji in vitro sel dilakukan untuk mengukur proliferatif sel, migrasi sel, dan pembentukan tube. Uji in vitro menghasilkan informasi kritikal dan merupakan langkah awal esensial untuk validasi. Uji organotropik yang digunakan untuk uji angiogenesis yaitu dengan menggunakan cincin aorta dari tikus atau anak ayam (Auerbach, Lewis, Shinners, Kubai and Akhtar, 2003). G. Uji Angiogenesis Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Uji Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) merupakan metode dengan sistem yang sederhana untuk mempelajari angiogenesis in vivo. Uji CAM sudah banyak digunakan untuk studi angiogenesis dan invasi tumor dari kanker kolorektal, prostat, otak dan rahim. Pembuluh darah pada chorioallantoic membrane ayam berbeda dengan pembuluh darah pada kanker. Pada kanker struktur anatomi mikroskopik pembuluh darahnya mudah rapuh sedangkan pada chorioallantoic membrane embrio ayam pembuluh darahnya kuat dan

(38) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 20 permeabilitasnya normal. Model angiogenesis pada chorioallantoic membrane embrio ayam secara teknik lebih mudah dan murah untuk sampel dalam jumlah besar pada screening bahan alam yang berpotensi sebagai antiangiogenik. Aplikasi CAM hanya membutuhkan alat-alat yang murah, dan memungkinkan uji dapat dilakukan di laboratorium manapun. Selain itu, sistem yang sangat fleksibel, mengakomodasi sistem kompleks seperti sel dan jaringan. Kelemahan dari CAM yaitu tidak memungkinkan untuk manipulasi genetik, serial imaging dan intervensi sistemik yang memungkinkan studi terkontrol neovaskularisasi dalam pengaturan fisiologis yang kompleks (Mustafida, Munawir dan Dewi, 2014; Staton, Lewis and Bicknell, 2006; Lokman, Elder, Ricciardelli, and Oehler, 2012). H. Landasan Teori Angiogenesis adalah proses pertumbuhan pembuluh darah baru dari pembuluh yang sudah ada. Angiogenesis berperan penting dalam proses pertumbuhan sel kanker. Berdasarkan pernyataan tersebut bila proses angiogenesis sel kanker dihambat kemungkinan sel kanker lambat laun akan mati, sehingga inhibitor angiogenesis dapat digunakan sebagai obat untuk pengobatan kanker. Beberapa senyawa inhibitor angiogenesis berasal dari senyawa bioaktif tumbuhan. Berdasarkan hasil uji angiogenesis dengan metode rat aortic yang dilakukan Ali Jimale Mohammed dan kawan-kawan (2012), ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas antiangiogenesis yang lebih besar dibandingkan

(39) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 21 penyari petroleum eter, kloroform, dan air. Dalam penelitian tersebut juga diketahui bahwa senyawa polifenol merupakan senyawa yang dominan terdapat dalam ekstrak metanol daun senggugu. Kemungkinan senyawa polifenol yang berperan dalam aktivitas antiangiogenesis dari ekstrak metanol daun senggugu. Banyak senyawa dari produk alam sudah terbukti memiliki aktivitas antiangiogenesis melalui berbagai penelitian salah satunya senyawa golongan flavonoid. Flavonoid merupakan salah satu jenis dari polifenol. Senyawa golongan flavonoid yang terkandung pada daun senggugu, beberapa diantaranya adalah hispidulin, luteolin, dan apigenin. Menurut penelitian He Lijun dan kawankawan pada tahun 2010 menunjukkan hispidulin yang dapat ditemukan pada ekstrak Artemisia vestita memiliki aktivitas antiangiogenesis tumor pankreas manusia dan pertumbuhan tumor. Hispidulin dapat menghambat angiogensis dengan cara mentarget jalur sinyal VEGFR2 yang dimediasi P13K/Akt/mTOR. Ekstrak luteolin dari Platycodon grandiflorum terbukti memiliki aktivitas antiangiogenesis. Aktivitas antiangiogenesis dari luteolin diduga berkaitan dengan aktivitas antioksidannya. Luteolin bekerja dengan cara memblok produksi Reactive Oxygen Species (ROS) sehingga menekan ekspresi VEGF dan efek proangiogenik dari VEGF. Seperti hispidulin dan luteolin, apigenin juga memiliki aktivitas antiangiogenesis. Menurut penelitian Jing Fang dan kawan-kawan pada tahun 2004, apigenin memiliki aktivitas antiangiogenesis dengan cara menghambat tube formation yang dibuktikan melalui uji Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). Berdasarkan hal tersebut, diduga senyawa hispidulin, luteolin,

(40) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 22 apigenin atau senyawa polifenol lainnya dalam ekstrak metanol daun senggugu juga memiliki aktivitas antiangiogenesis. Aktivitas antiangiogenesis ini dapat diuji dengan metode CAM. Metode CAM adalah metode untuk uji angiogenesis dengan sistem yang sederhana. (Fang, et al., 2004; He et al, 2010; Mohamed et al., 2012; Park, et al, 2010). I. Hipotesis 1. Ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas antiangiogenesis pada chorioallantoic membrane embrio ayam yang diinduksi bFGF. 2. Terdapat kekerabatan antara konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu dengan aktivitas antiangiogenesis pada chorioallantoic membrane embrio ayam yang diinduksi bFGF.

(41) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola searah. Jenis penelitian yang dilakukan termasuk jenis penelitian eksperimental murni yaitu dengan melakukan percobaan pada kelompok perlakuan dan dibandingkan dengan kelompok kontrol. Rancangan penelitian ini menggunakan rancangan lengkap pola searah. Penelitian ini dilakukan secara lengkap yaitu terdapat kontrol negatif, kontrol positif dan kelompok perlakuan. Pola searah yaitu dengan memberikan perlakuan yang sama dengan kelompok perlakuan. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan Laboratorium Teknologi dan Formulasi Steril Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma serta Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada. B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel a. Variabel bebas berupa konsentrasi ekstrak daun senggugu. b. Variabel tergantung berupa banyaknya pembuluh darah baru. 23

(42) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 24 c. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, cara panen, cara pengeringan dan pembuatan simplisia, dan jumlah (gram) daun segar yang digunakan. d. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca, musim, dan kelembaban ruangan. 2. Definisi Operasional a. Pembuluh darah baru adalah pembuluh darah yang tipis yang keluar dari pembuluh darah utama. C. Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan antara lain : daun senggugu, Chorioallantoic Membrane (CAM) yang berasal dari telur ayam berembrio dalam kondisi terinkubasi, larutan basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), Phosphate Buffered Saline (PBS), Dimethyl Sulfoxide (DMSO), aquadest steril, aquabidest steril, etanol 70%, iodin povidon, kertas payung, kapas, cotton buds, paper disc berisi ampisilin, metanol, kertas Whatman filter, plat KLT silika gel 60 F 254, butanol, asam asetat, air, standar rutin, asam klorida 4 N, dietileter, gas nitrogen, dan uap amoniak. D. Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain : oven, ayakan, bejana maserasi, shaker, corong Buchner, bejana KLT, labu alas bulat,

(43) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 25 spektrofotometer Ultra Violet (UV), bejana, Laminar Air Flow (LAF), autoklaf, mikropipet, inkubator, lampu spiritus, korek api, teropong telur, mini drill, gunting bengkok, gunting bedah, penyedot udara, pinset, scalpel, kamera, kaca pembesar dan alat-alat gelas. E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada (UGM). Untuk membuktikan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah tanaman senggugu (Clerodendrum serratum L.). 2. Preparasi Ekstrak Metanol Daun Senggugu Daun senggugu diperoleh dari Kebun Obat Universitas Sanata Dharma. Daun senggugu dipanen pada bulan Januari 2014. Daun senggugu yang telah dikumpulkan, kemudian dibersihkan dengan air mengalir. Setelah itu daun senggugu dikeringkan dengan cara dijemur di bawah sinar matahari dengan ditutup kain hitam untuk menghindari sinar matahari secara langsung. Pengeringan daun senggugu dioptimalkan dengan dikeringkan dalam oven dengan suhu terkontrol hingga daun sudah benar-benar kering (kadar air < 10%) dengan ciri bila diremas bergemirisik dan berubah menjadi serpihan. Simplisia yang kering kemudian digiling hingga menjadi serbuk halus dengan blender, kemudian diayak dengan ayakan tepung. Simplisisa serbuk ditimbang sebanyak 50 gram dan

(44) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 26 dituang dalam bejana maserasi. Kemudian ditambah metanol p.a. sebanyak 200 mL dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama 1 hari. Kemudian disaring dengan kertas Whatman filter dengan corong Buchner. Hasil penyarian diuapkan pelarutnya menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 400C-500C. Hasil penyaringan filtrat diuapkan lagi dengan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental. 3. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada (LPPT UGM). Ekstrak kental ditimbang sebanyak 50 mg, kemudian dimasukkan ke dalam labu dan ditambahkan 10 mL asam klorida 4 N. Larutan kemudian dihidrolisis atau refluk dengan pendingin balik selama 30 menit, lalu didinginkan dan ekstraksi dengan 5 mL dietileter. Fase dietileter diambil, lalu diuapkan dengan gas nitrogen. Sampel dan pembanding rutin ditotolkan sebanyak 10 µL pada plat KLT silika gel 60 F 254 sebagai fase diam. Plat KLT kemudian dimasukkan ke dalam bejana jenuh fase gerak butanol : asam asetat : air (3:1:1), dan dieluasikan hingga batas. Setelah terelusi hingga batas plat dikeringkan. Hasil plat KLT yang diperoleh diidentifikasi di bawah lampu UV (254 nm dan 366 nm) dan dideteksi dengan disemprot pereaksi amoniak.

(45) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 27 4. Orientasi Kelarutan Ekstrak Metanol Daun Senggugu Orientasi kelarutan ekstrak metanol daun senggugu dilakukan dengan menggunakan pelarut DMSO. DMSO ditambahkan pada beberapa mg ekstrak sampai ekstrak larut, kemudian diencerkan dengan aquabidest steril. Konsentrasi DMSO yang digunakan adalah 0,2%. 5. Sterilisasi Alat Alat-alat yang digunakan untuk uji antiangiogenesis dicuci bersih dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilkan dengan pemanasan basah dalam autoklaf, suhu 121oC selama 15-30 menit. 6. Pembuatan Larutan Uji dan Larutan bFGF a. Preparasi bFGF Sebagai Induktor Angiogenesis. bFGF yang digunakan sebanyak 25 ng/µL menggunakan larutan PBS pH 7,4 kemudian diencerkan sehingga didapat kadar 1 ng/µL. Preparasi bFGF ini dilakukan secara aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF). Kadar bFGF yang diberikan untuk setiap telur perlakuan terinduksi adalah 10 ng. b. Preparasi Sediaan Larutan Uji. Ekstrak metanol daun senggugu dilarutkan dengan DMSO – aquabidest steril kemudian dibuat seri konsentrasi (0,175, 0,35 dan 0,7 mg/mL). Konsentrasi pelarut (DMSO– aquabidest steril) disesuaikan dengan hasil orientasi kelarutan ekstrak metanol daun senggugu. Preparasi dilakukan secara aseptis dalam Laminar Air Flow.

(46) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 28 7. Uji Antiangiogenesis Satu atau beberapa hari sebelum diberi perlakuan, telur diinkubasi dalam inkubator laboratorium pada suhu 37oC agar dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan barunya. Telur ayam usia 9 hari diberikan diperlakuan. Tahap awal perlakuan yaitu dengan membersihkan telur dari kotoran yang menempel di cangkang telur menggunakan alkohol 70%. Telur diberi tanda pada kerabang telur yang meliputi batas ruang udara, lokasi embrio dan daerah yang akan dibuat segi empat (jendela) berukuran 1x1 cm di atas embrio menggunakan pensil. Lokasi embrio diketahui melalui candling menggunakan cahaya lampu pada telur. Kerabang telur pada bagian kutub yang mengandung ruang udara dan kerabang di atas embrio dibersihkan dengan iodin povidon. Selanjutnya pada ruang udara tersebut dibuat lubang kecil dan pada daerah yang dibuat segiempat (jendela) dibuat luka dengan menggunakan mini drill dan scalpel. Udara dari ruang udara disedot dengan penyedot udara sampai berpindah dari kutub kerabang bagian atas telur. Perlakuan ini dilakukan dengan posisi telur horizontal, di ruang gelap, dan melalui candling, sehingga ruang udara buatan yang terbentuk di atas embrio dapat terlihat. Kerabang telur di atas embrio dipotong dengan mini drill untuk membuat lubang segiempat dengan luas 1x1 cm. Melalui lubang ini, paper disc untuk setiap perlakuan diimplantasikan ke dalam telur. Subyek uji berupa telur dibagi secara acak dalam 6 kelompok (masing-masing perlakuan terdiri dari 3 telur), sebagai berikut : a. Kelompok I adalah kelompok blank dengan implantasi paper disc.

(47) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 29 b. Kelompok II adalah kelompok pelarut dengan implantasi paper disc + pelarut (DMSO – aquabidest steril). c. Kelompok III kelompok kontrol bFGF + pelarut adalah kelompok telur dengan implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + pelarut (DMSO – aquabidest steril) sebanyak 10µL. d. Kelompok IV, V dan VI merupakan kelompok perlakuan yang digunakan untuk melihat efek penghambatan ekstrak metanol daun senggugu dengan 3 variasi konsentrasi (0,175 ; 0,35 dan 0,7 mg/mL). Kelompok ini adalah kelompok telur implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + larutan ekstrak metanol daun senggugu dengan masing-masing konsentrasi sebanyak 10 µL. Setelah diberi perlakuan implantasi paper disc sesuai kelompok perlakuan, lubang kecil pada daerah kutub dan lubang segiempat ditutup dengan parafin solidum yang dicairkan. Telur kemudian diinkubasi pada suhu 37oC dengan kelembaban relatif 60% selama 3 hari atau 72 jam dengan inkubator, kemudian telur dimasukkan ke dalam kulkas selama 24 jam. Telur dibuka (umur 13 hari) dengan cara menggunting cangkang telur menjadi dua bagian dimulai dari cangkang yang dekat dengan rongga udara menggunakan gunting bedah secara hati-hati agar tidak merusak chorioallantoic membrane telur, setelah itu chorioallantoic membrane dibersihkan secara hati-hati dengan aquabidest steril. Chorioallantoic membrane yang melekat pada bagian cangkang yang terdapat paper disc diamati secara makroskopis. Pengamatan makroskopis dilakukan secara langsung dan tidak langsung. Pengamatan makroskopis secara langsung dilakukan dengan bantuan kaca pembesar dan dikuantifikasi dengan menghitung

(48) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 30 jumlah pembuluh darah baru yang terbentuk pada paper disc dan di sekitar paper disc dan secara tidak langsung dengan foto kamera hasil CAM. Pembuluh darah baru yang dihitung yaitu pembuluh darah tipis yang keluar dari pembuluh darah utama. Pembuluh darah utama adalah pembuluh darah besar yang berada disekitar paper disk. Pengamatan makroskopis ini dilakukan oleh empat orang pengamat. F. Analisis Data Data penelitian uji antiangiogenesis berupa banyaknya pembuluh darah baru pada dan sekitar paper disc dianalisis dengan menghitung persentase pertumbuhan pembuluh darah baru pada masing-masing konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu, rumusnya sebagai berikut: a = jumlah pembuluh darah baru rata-rata konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu b = jumlah pembuluh darah baru rata-rata kontrol bFGF Data uji antiangiogenesis juga dianalisis secara statistik dengan uji one way anova dan dengan uji Tukey.

(49) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Determinasi Tanaman Determinasi dilakukan dengan tujuan memastikan kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian sehingga menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan sampel. Berdasarkan hasil determinasi yang dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada pada tanggal 6 Juni 2014 (Lampiran 1), telah dibuktikan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah tanaman senggugu (Clerodendrum serratum L.). B. Hasil Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Senggugu Ekstrak dibuat dari daun senggugu yang dikeringkan kemudian diserbuk. Daun senggugu dikeringkan dengan sinar matahari dan kemudian dioptimalkan menggunakan oven dengan suhu terkontrol hingga daun sudah benar-benar kering. Pengeringan tersebut bertujuan untuk mengurangi kandungan air yang dapat menjadi media pertumbuhan yang baik untuk jamur dan mikroorganisme lainnya. Selain itu tujuan dari pengeringan yaitu untuk menghentikan aktivitas enzim yang bisa menguraikan kandungan zat aktif sehingga mutu dari simplisia dapat dipertahankan, terjamin keawetannya, mudah disimpan dan juga untuk memudahkan dalam pembuatan serbuk. Syarat pengeringan simplisia yaitu kadar airnya kurang dari 10%, dengan ciri-ciri bila diremas bergemirisik dan berubah 31

(50) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 32 menjadi serpihan, tidak berjamur, berbau dan berasa khas menyerupai bahan segarnya. Proses penyerbukan simplisia daun senggugu bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel sehingga luas permukaannya semakin besar. Luas permukaan yang semakin besar akan mengoptimalkan kontak serbuk dengan penyari sehingga proses penyarian lebih optimal (Endrasari, Qanytah dan Prayudi, 2011; Herawati, Nuraida, Sumarto, 2012). Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi dan dengan penyari metanol. Metode maserasi dipilih karena merupakan metode ekstraksi dingin sehingga perubahan atau kerusakan senyawa dapat dihindari. Alasan pemilihan penyari metanol, sebagai berikut: 1. Metanol merupakan pelarut universal dan viskositas metanol yang lebih rendah dibanding etanol walupun memiliki polaritas yang hampir sama, sehingga metanol dapat berpenetrasi ke dalam sel-sel tanaman dengan kuat. 2. Metanol memiliki konsistensi yang lebih encer menyebabkan metanol lebih mudah berdifusi menembus sel-sel tanaman. 3. Metanol memiliki persentase OH yang lebih besar dibandingkan dengan etanol sehingga daya penetrasinya kuat dan ekstraksinya lebih efektif. 4. Berdasarkan hasil uji angiogenesis dengan metode rat aortic dengan, ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas anti-angiogenesis yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak petroleum eter, kloroform, dan air daun senggugu (Departemen Kesehatan RI, 2000; Mohamed et al., 2012; Pedricilli, 2001). Saat proses maserasi berlangsung terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat adanya perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel,

(51) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 33 sehingga metabolit sekunder yang berada dalam sitoplasma akan terlarut didalam cairan penyari. Proses maserasi dibantu pengadukan dengan menggunakan alat shaker selama 24 jam agar proses maserasi lebih efektif karena penyari lebih banyak kontak langsung dengan sel-sel dalam daun senggugu dibandingkan jika hanya didiamkan saja. Hasil penyarian diuapkan pelarutnya menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 400C-500C. Tujuan penggunaan vaccum rotary evaporator pada suhu tersebut agar filtrat metanol yang akan diuapkan pelarutnya tidak mengalami kontak dengan panas yang berlebihan sehingga kerusakan senyawa-senyawa kimia yang terkandung dalam filtrat metanol dapat dihindari. Sari yang didapat kemudian diuapkan lagi dengan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental. Bobot ekstrak kental daun senggugu yang didapat adalah 4,36 gram dan rendeman yang didapat adalah 8,72 %. C. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Tujuan dilakukannya uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah untuk membuktikan adanya senyawa flavonoid dalam ekstrak metanol daun senggugu. Uji KLT dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada (LPPT UGM). Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 F 254 dan fase gerak yang digunakan adalah butanol : asam asetat : air (3:1:1). Pembanding flavonoid yang digunakan adalah standar rutin. Hasil yang diperoleh diidentifikasi di bawah lampu UV (254 nm dan 366 nm) dan dideteksi dengan pereaksi amoniak. Flavonoid akan menunjukkan pemadaman bercak pada UV 254 sedangkan pada UV 366 bercak akan berflouresensi kuning gelap, hijau atau biru.

(52) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 34 Setelah diuapi dengan uap amoniak akan memberikan warna kuning (Wagner and Bladt, 1996; Harborne, 1987). Pada lampiran 4 terlihat saat diamati pada sinar UV 254 terjadi pemadaman pada standar rutin dan sampel ekstrak metanol daun senggugu. Saat diamati pada sinar UV 366 bercak standar rutin dan sampel berfluoresensi berwarna biru. Secara visibel terlihat adanya noda flavonoid berwarna kuning pada bercak rutin dan sampel ekstrak metanol daun senggugu, dengan Rf. flavonoid terdeteksi 0,81. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat kandungan flavonoid dalam ekstrak metanol daun senggugu. D. Hasil Uji Antiangiogenesis Penelitian ini menggunakan metode Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) untuk mengetahui aktivitas antiangiogenesis dari ekstrak metanol daun senggugu. Penelitian ini merupakan penelitian in vivo, dengan media yang digunakan yaitu chorioallatoic membrane telur ayam berembrio. Chorioallatoic membrane telur ayam akan terbentuk banyak pembuluh darah baru, perubahan pembuluh darah baru digunakan sebagai indikator angiogenesis baik berupa pengurangan atau penambahan pembuluh darah baru. Induktor angiogenesis yang digunakan adalah basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) yang merupakan salah satu faktor pro angiogenik. bFGF tersebut diinduksikan pada chorioallatoic membrane telur ayam dengan tujuan memperjelas pengamatan efek angiogenesis ekstrak pada chorioallantoic membrane. Mekanisme bFGF sebagai protein faktor pertumbuhan adalah bFGF tersebut berinteraksi dengan sel endotelial dari

(53) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 35 pembuluh darah jaringan sekitar yang telah ada sebelumnya melalui ikatannya dengan reseptor FGF tirosin kinase atau reseptor Heparan Sulphate Proteoglycans (HSPGs) di permukaan sel endotelial. Ikatan tersebut menyebabkan sel endotelial teraktivasi dan menghasilkan enzim degradatif matrix metalloproteinases (MMPs). Enzim ini dilepaskan dari endotelial dan menyebar disekitar sel. MMPs mendegradasi matriks ekstraseluler dan menyebar ke jaringan sekitarnya. Sel endotelial mulai membelah diri dan migrasi keluar ke ruang intestinal, kemudian tumbuh dan berproliferasi melalui lubang hasil degradasi. Selanjutnya pembentukan lumen, generasi membran basement baru dengan perekrutan dari pericyte, kemudian pembentukan anastomosis dan akhirnya aliran darah (Chrisnanto, 2014; Gupta and Qin, 2003; Kleinsmith, et al., 1999; Ribbati et al., 1999). Menurut penelitian Puspita dkk. (2008) dan penelitian Hamid dkk. (2013) menunjukkan bahwa terjadi ekspresi VEGF pada sitoplasma sel yang diberi induktor bFGF. Penghambatan proses angiogenesis dapat dilakukan dengan penetralan salah satu faktor proangiogenik contohnya bFGF. Penetralan faktor proangiogenik sudah cukup dapat mengganggu proses keseimbangan angiogenesis (Hamid, Nazar dan Ratnani, 2013; Puspita, Ardiani, Fina, Septisetyani dan Meiyanto, 2008; Ribbati, Vacca, Roncalli and Dammacco, 2000). Telur ayam berembrio yang dipergunakan untuk uji respon angiogenesis dapat dilakukan setelah terbentuknya chorioallatoic membrane pada hari ke-4 dan implantasi ke dalam chorioallatoic membrane dapat dilakukan pada telur

(54) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 36 berembrio umur 5-16 hari. Penelitian ini menggunakan telur berembrio yang berumur 9 hari. Hal ini karena pada umur tersebut letak rongga udara lebih mudah diamati dan pembuluh darahnya pun sudah lebih banyak dan lebih jelas. Selain itu chorioallatoic membrane lebih mudah menempel pada cangkang telur (Knighton, et al., 1977; Patten, 1978). Penelitian ini menggunakan 6 kelompok perlakuan yaitu 3 kelompok kontrol dan 3 kelompok perlakuan. Kelompok kontrol tersebut terdiri dari kontrol blank, kontrol pelarut, kontrol bFGF + pelarut. Kelompok perlakuan terdiri dari kelompok ekstrak metanol daun senggugu konsentrasi I (0,175 mg/mL), konsentrasi II (0,35 mg/mL), dan konsentrasi III (0,7 mg/mL). Penentuan konsentrasi larutan uji didasarkan IC50 ekstrak metanol daun senggugu dari penelitian Thalla dkk. (2012) sebesar 0,35 mg/mL. IC50 ini dijadikan konsentrasi tengah (0,35 mg/mL). Konsentrasi terbawah yang digunakan sebesar setengah dari IC50 (0,175 mg/mL), sedangkan konsentrasi tertinggi yang digunakan sebesar dua kali dari IC50 (0,7 mg/mL). Larutan uji (larutan ekstrak, bFGF dan pelarut) untuk masing-masing kelompok dimasukkan dalam media berupa paper disc, dan kemudian paper disc diimplantasikan ke dalam chorioallatoic membrane telur ayam berembrio. Larutan ekstrak, bFGF dan pelarut tidak diinjeksikan langsung ke telur, melainkan diimplantasikan pada paper disc. Tujuannya agar dapat mengamati proses angiogenesis dengan mudah melalui pengamatan banyaknya pembuluh darah baru yang keluar dari pembuluh darah utama yang berada di chorioallantoic membrane telur ayam berembrio (Thalla, et al., 2012)

(55) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 37 Kontrol blank berfungsi untuk mengetahui jumlah pembuluh darah baru normal yang ada pada chorioallantoic membrane embrio ayam. Kontrol blank hanya berisikan paper disc saja. Kontrol pelarut berfungsi sebagai pembanding untuk menentukan apakah pelarut ekstrak memiliki aktivitas antiangiogenesis. Pelarut ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini adalah dimethylsulfoxide (DMSO) dan aquabidest. DMSO berfungsi sebagai co-solvent untuk membantu aquabidest melarutkan ekstrak metanol daun senggugu. Menurut penelitian Koizumi dkk. (2003) DMSO memiliki aktivitas antiinflamasi kemungkinan dengan cara menghambat pembentukan pembuluh darah (antiangiogenesis) pada jaringan inflamasi. Aktivitas antiangiogenesis DMSO melalui penghambatan produksi MMP-2. DMSO juga bersifat toksik akut atau kronik yang rendah pada hewan, maka DMSO yang digunakan harus seminimal mungkin namun juga harus efektif melarutkan ekstrak metanol daun senggugu. Konsentrasi DMSO yang digunakan untuk melarutkan ekstrak metanol daun senggugu sebesar 0,2 %. Kontrol bFGF + pelarut berfungsi sebagai pembanding untuk menentukan apakah ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas antiangiogenesis terhadap chorioallantoic membrane yang diinduksi bFGF. (Gaylord Chemical Company, 2007; Koizumi, Tsutsumi, Yoshioka, Watanabe, Okamoto, Mukai, et al., 2003). Telur diinkubasi dalam inkubator agar embrio dalam telur dapat tetap hidup. Inkubator diatur pada suhu terkontrol 380C - 400C karena pada suhu tersebut embrio telur ayam dapat tumbuh secara optimal. Setelah tiga hari telur tersebut dimasukkan ke dalam kulkas selama 24 jam. Tujuan telur dimasukkan ke dalam kulkas adalah untuk mematikan embrio telur ayam. Telur tersebut

(56) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 38 kemudian dibuka dan pembuluh darah baru pada chorioallatoic membrane yang melekat pada bagian cangkang yang terdapat paper disc diamati secara makroskopis. Hasil dari uji antiangiogenesis ini adalah jumlah pembuluh darah baru. Pembuluh darah baru yang dihitung berupa percabangan pembuluh darah tipis yang keluar dari pembuluh darah utama. Pembuluh darah utama adalah pembuluh darah besar yang berada disekitar paper disc. Pengamatan makroskopis ini dilakukan oleh empat orang pengamat untuk mengurangi subjektivitas (Hamid, Bijanti, Wahyuni, Maslachah dan Yuliani, 2011). Hasil pengamatan makroskopis tercantum pada gambar 2 dan data hasil uji angiogenesis masing-masing perlakuan tercantum pada tabel 1.

(57) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 39 Kontrol bFGF + Pelarut Kontrol Pelarut EMDS Konsentrasi II (0,35 mg/mL) Kontrol Blank EMDS Konsentrasi I (0,175 mg/mL) EMDS Konsentrasi III (0,7 mg/mL) Gambar 2. Hasil Uji CAM pada Kelompok Kontrol dan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu (Clerodendrum serratum L.) Keterangan : EMDS = Ekstrak Metanol Daun Senggugu Tabel I. Jumlah Pembuluh Darah Baru Kelompok Kontrol dan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu (Clerodendrum serratum L.) Kelompok Jumlah Pembuluh Darah Baru (X ± SD) Kontrol Blank 14,33 ± 1,15 Kontrol Pelarut 13 ± 2 Kontrol bFGF + Pelarut 23,33 ± 0,58 EMDS Konsentrasi I (0,175 mg/ml) 21 ± 2 EMDS Konsentrasi II (0,35 mg/ml) 16,33 ± 1,15 EMDS Konsentrasi III (0,7 mg/ml) 14,67 ± 1,15 Keterangan : EMDS = Ekstrak Metanol Daun Senggugu

(58) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 40 Data pengamatan makroskopis masing-masing perlakuan tersebut kemudian diuji statistik menggunakan SPSS 16.0. Pertama dilakukan uji normalitas dengan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test. Data uji dikatakan terdistribusi normal bila memiliki signifikansi lebih dari 0,05. Hasil data uji normalitas didapatkan signifikansi masing-masing perlakuan 0,766 dan 1, hal ini menunjukkan data terdistribusi normal (Lampiran 11). Setelah didapatkan data normal, maka dilanjutkan dengan uji homogenitas. Data uji dikatakan homogen bila memiliki signifikansi lebih dari 0,05. Hasil data uji homogenitas didapatkan signifikansi 0,674 , hal ini menunjukkan data mempunyai varian homogen (Lampiran 11). Setelah diketahui data homogen, maka dapat dilanjutkan dengan uji lanjut menggunakan Tukey Test. Uji lanjut digunakan untuk melihat kelompok perlakuan mana yang memiliki perbedaan signifikan. Hasil uji Tukey ditunjukkan pada tabel II.

(59) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 41 Tabel II. Uji Tukey Kelompok Kontrol dan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu (Clerodendrum serratum L.) Kontrol Blank Kontrol Pelarut Kontrol bFGF + Pelarut EMDS EMDS EMDS Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi I (0,175 II (0,35 III (0,7 mg/mL) mg/mL) mg/mL) Kontrol BTB BB BB BTB BTB Blank Kontrol BTB BB BB BTB BTB Pelarut Kontrol BB BB BTB BB BB bFGF + Pelarut EMDS Konsentrasi BB BB BTB BB BB I (0,175 mg/mL) EMDS Konsentrasi BTB BTB BB BB BTB II (0,35 mg/mL) EMDS Konsentrasi BTB BTB BB BB BTB III (0,7 mg/mL) Keterangan : EMDS = Ekstrak Metanol Daun Senggugu ; BB = Berbeda Bermakna ; dan BTB = Berbeda Tidak Bermakna Parameter untuk mengetahui apakah pelarut ekstrak yaitu DMSO dan aquabidest memiliki aktivitas antiangiogenesis adalah dengan membandingkan jumlah pembuluh darah baru antara kontrol pelarut dengan kontrol blank. Jumlah pembuluh darah baru rata-rata kontrol pelarut (13 ± 2) dengan kontrol blank (14,33 ± 1,15) memiliki jumlah yang hampir sama (Tabel I). Berdasarkan hasil statistik antara kontrol pelarut dengan kontrol blank menunjukkan perbedaan tidak bermakna (Tabel II). Jadi dapat disimpulkan pelarut tidak memiliki aktivitas antiangiogenesis. Parameter untuk mengetahui terjadinya angiogenesis baru akibat induksi bFGF adalah dengan membandingkan jumlah pembuluh darah baru antara kontrol

(60) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 42 bFGF + pelarut dengan kontrol blank / paper disc dan kontrol bFGF + pelarut dengan kontrol pelarut. Dari hasil penelitian diketahui rata-rata jumlah pembuluh darah baru dari kontrol bFGF + pelarut adalah 23,33 ± 0,58 lebih besar dibandingkan dengan kontrol blank (14,33 ± 1,15) dan kontrol pelarut dan (13 ± 2) (Tabel I). Berdasarkan hasil statistik menunjukkan perbedaan bermakna antara kontrol bFGF + pelarut dengan kontrol blank dan antara kontrol bFGF + pelarut dengan kontrol pelarut (Tabel II). Hal tersebut menunjukkan induksi bFGF 10 ng efektif meningkatkan jumlah pembuluh darah baru pada chorioallantoic membrane telur ayam. Aktivitas antiangiogenesis ekstrak metanol daun senggugu dapat diketahui dengan melihat persentase penghambatan angiogenesis dari masing-masing konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu dan melihat hasil uji Tukey. Tabel III. Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru dan Persentase Penghambatan Angiogenesis Kelompok Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu Persentase Persentase Pertumbuhan Penghambatan Kelompok Pembuluh Darah Baru Angiogenesis (%) (%) EMDS Konsentrasi I (0,175 mg/ml) 90,01 9,99 EMDS Konsentrasi II (0,35 mg/ml) 70,00 30,00 EMDS Konsentrasi III (0,7 mg/ml) 62,88 37,12 Keterangan : EMDS = Ekstrak Metanol Daun Senggugu

(61) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 43 Gambar 3. Grafik Persentase Penghambatan Angiogenesis Kelompok Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Senggugu. Kelemahan dalam pengamatan pembuluh darah baru ini adalah tidak dapat dibedakan pembuluh darah tipis asal dimana paper disc diimplankan dengan pembuluh darah baru yang terbentuk. Kelemahan tersebut membuat dalam analisis penelitian ini tidak dapat dihasilkan persentase penghambatan pembuluh darah baru 100%. Jumlah pembuluh darah baru kelompok perlakuan yang sama atau mendekati dengan jumlah pembuluh darah baru kontrol pelarut sebesar 13 ± 2 (Tabel I) atau berdasarkan uji statistik Tukey menunjukkan berbeda tidak bermakna dengan kontrol pelarut dapat dinyatakan memiliki aktivitas antiangiogenesis yang baik karena mengembalikan keadaan seperti keadaan normal tanpa induksi bFGF. Berdasarkan data tabel III dan gambar 3 menunjukkan pemberian ekstrak metanol daun senggugu dengan konsentrasi 0,175 mg/mL, 0,35 mg/mL dan 0,7 mg/mL memiliki kemampuan menghambat angiogenesis sebesar 9,99;

(62) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 44 30,00 dan 37,12 %. Sesuai dengan uji statistik Tukey ekstrak metanol daun senggugu konsentrasi 0,175 mg/mL menunjukan perbedaan tidak bermakna dengan kontrol bFGF + pelarut. Ekstrak metanol daun senggugu konsentrasi 0,175 mg/mL menunjukkan perbedaan bermakna dengan kontrol pelarut (Tabel II). Hal ini berarti pada ekstrak metanol daun senggugu konsentrasi 0,175 mg/mL tidak memiliki aktivitas antiangiogenesis, sehingga tidak dapat mengembalikan keadaannya seperti keadaan normal (tanpa induksi bFGF). Berdasarkan hasil uji Tukey ekstrak metanol daun senggugu konsentrasi 0,35 mg/mL menunjukkan perbedaan bermakna dengan kontrol bFGF + pelarut, dan perbedaan tidak bermakna dengan kontrol pelarut (Tabel II). Ekstrak metanol daun senggugu konsentrasi 0,7 mg/mL menunjukkan perbedaan bermakna dengan kontrol bFGF + pelarut, dan perbedaan tidak bermakna dengan kontrol pelarut (Tabel II). Hal tersebut menunjukkan ekstrak metanol daun senggugu konsentrasi 0,35 dan 0,7 mg/mL memiliki aktivitas antiangiogenesis yang baik, yang mampu mengembalikan keadaannya seperti keadaan normal (tanpa induksi bFGF). Jadi dalam penelitian ini, ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas antiangiogenesis pada chorioallatoic membrane embrio ayam yang diinduksi bFGF hanya pada konsentrasi 0,35 dan 0,7 mg/mL. Semakin kecil persentase pertumbuhan pembuluh darah baru maka semakin besar aktivitas antiangiogenesisnya, atau semakin besar persentase penghambatan angiogenesis maka semakin besar aktivitas antiangiogensisnya. Berdasarkan data tabel III menunjukkan penurunan persentase pembuluh darah baru sebanding dengan peningkatan konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu.

(63) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 45 Data tabel III dan gambar 3 juga menunjukkan peningkatan persentase penghambatan angiogenesis sebanding dengan peningkatan konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu. Jumlah pembuluh darah baru ekstrak metanol daun senggugu konsentrasi 0,35 mg/mL > konsentrasi III 0,7 mg/mL > kontrol pelarut (16,33 ± 1,15 > 14,67 ± 1,15 > 13 ± 2) (Tabel I). Hal tersebut menunjukkan bahwa konsentrasi 0,7 mg/mL memiliki aktivitas antiangiogenesis yang lebih baik dibandingkan konsentrasi II 0,35 mg/mL, namun berdasarkan hasil uji statistik Tukey menunjukkan perbedaan tidak bermakna antara konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu II (0,35 mg/mL) dengan konsentrasi III (0,7 mg/mL) (Tabel II). Berdasarkan hasil uji statistik Tukey menunjukkan konsentrasi II dan III memiliki kekuatan aktivitas antiangiogenesis yang sama. Hal ini berarti meningkatnya konsentrasi ekstrak daun senggugu tidak meningkatkan aktivitas antiangiogenesisnya. Jadi tidak ada kekerabatan antara konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu dengan aktivitas antiangiogenesis. Penelitian ini memiliki kelemahaan yaitu belum diketahui secara pasti senyawa yang memiliki aktivitas antiangiogenesis dalam ekstrak metanol daun senggugu dan mekanisme penghambatan angiogenesisnya. Menurut Kumar dan Nishteswar (2013) senyawa yang diduga memiliki aktivitas antiangiogenesis dari ekstrak metanol daun senggugu adalah polifenol atau senyawa dari kelompok lain yang bekerja secara sinergi bersama dengan polifenol. Hal tersebut didasarkan dari penelitian Kumar dan Nishteswar yang menunjukan polifenol merupakan senyawa yang dominan pada ekstrak metanol daun senggugu. Polifenol yang terkandung pada ekstrak daun senggugu adalah flavonoid dan tanin terhidrolisis

(64) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 46 (Kumar and Nishteswar, 2013). Kandungan flavonoid dalam ekstrak metanol daun senggugu dalam penelitian ini dipertegas dengan hasil uji KLT flavonoid yang menunjukkan hasil positif (Lampiran 4). Banyak senyawa dari produk alam sudah terbukti memiliki aktivitas antiangiogenesis melalui berbagai penelitian seperti senyawa golongan flavonoid. Senyawa golongan flavonoid yang terkandung pada daun senggugu salah satu diantaranya yaitu hispidulin. Menurut penelitian He Lijun dkk. (2010) menunjukkan hispidulin yang dapat ditemukan dalam ekstrak Artemisia vestita mampu menghambat angiogenesis tumor pankreas manusia dengan cara menghambat VEGFR2 dimediasi P13K/Akt/mTOR (He, et al, 2010). Gambar 4. Kemungkinan Jalur Sinyal Angiogenesis yang Diregulasi oleh Hispidulin dalam Sel Endotelial (He, et al., 2010). Pada gambar 4 menunjukkan hispidulin menghambat VEGFR2 sehingga menyebabkan jalur sinyal P13K tidak dapat teraktivasi. P13K yang tidak teraktivasi tidak dapat meregulasi beberapa langkah kritis oleh fosforilasi

(65) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 47 substansi downstream yang berbeda, seperti mTOR. mTOR merupakan regulator sentral dari metabolisme, pertumbuhan, proliferasi, dan survival sel yang diaktivasi selama beberapa proses sel seperti angiogenesis (He, et al, 2010). Penghambatan fosforilasi mTOR menyebabkan proses angiogenesis terhambat. Berdasarkan penelitian diatas, diduga hispidulin yang juga terdapat dalam ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas yang sama (Kumar and Nishteswar, 2013). Sehingga hispidulin diduga sebagai senyawa aktif yang berperan dalam aktivitas antiangiogenesis ekstrak metanol daun senggugu pada penelitian ini. Selain hispidulin, senyawa flavonoid lainnya yang diduga sebagai senyawa aktif yang berperan dalam aktivitas antiangiogenesis ekstrak metanol daun senggugu penelitian ini adalah luteolin (Kumar and Nishteswar, 2013) dan apigenin (Vidya, et al., 2006). Luteolin merupakan flavonoid alam yang dapat memberikan efek anti-oksidatif jangka pendek maupun jangka panjang dengan cara secara langsung menghambat Reactive Oxygen Species (ROS) dengan mendonorkan ion hidrogen dan juga memodulasi jalur sinyal sel. Menurut penelitian Park Sung Wook dan kawan-kawan (2010) ekstrak luteolin dari Platycodon grandiflorum terbukti memiliki aktivitas antiangiogenesis. Aktivitas antiangiogenesis dari luteolin diduga berkaitan dengan aktivitas antioksidan. Mekanisme antiangiogenesis luteolin yaitu dengan cara memblok produksi ROS. Produksi ROS yang diblok mengakibatkan ekspresi VEGF dan efek proangiogenik dari VEGF ditekan sehingga angiogenesis dapat dihambat (Park et al., 2010). Berdasarkan hal tersebut, luteolin dalam ekstrak metanol daun senggugu diduga juga memiliki aktivitas yang sama dengan luteolin dalam ekstrak

(66) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 48 Platycodon grandiflorum. Sehingga kemungkinan luteolin dalam ekstrak metanol daun senggugu juga berperan dalam aktivitas antiangiogenesis penelitian ini atau zat aktif lainnya yang terdapat dalam ekstrak metanol daun senggugu yang juga memiliki aktivitas antioksidan seperti tanin terhidrolisis (Kumar A. and Nishteswar, 2013). Menurut penelitian Jing Fang dan kawan-kawan (2004) apigenin memiliki aktivitas antiangiogenesis dengan cara menghambat tube formation melalui uji Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). Apigenin menghambat tube formation dengan cara menurunkan ekspresi VEGF. Apigenin menghambat ekspresi VEGF pada level transkripsi melalui ekspresi hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α). Apigenin menghambat HIF-1α dan ekspresi VEGF melalui 2 jalur sinyal P13K/AKT/p70S6K1 dan HDM2/p53 (Fang et al. 2004). Berdasarkan hal tersebut, terdapat kemungkinan bahwa apigenin (Vidya, et al., 2006) dalam ekstrak metanol daun senggugu juga berperan dalam aktivitas antiangiogenesis dalam penelitian ini. Menurut penelitian Malik Tafazul Rashid dan kawan-kawan (2013) dalam ekstrak air daun senggugu juga mengandung alkaloid, glikosida, protein, karbonat, dan steroid (Rashid, Yadav, Bajaj, and Lane, 2013). Senyawa golongan alkaloid juga memiliki aktivitas antiangiogenesis pterogynidine yang diisolasi dari Alchornea glandulosa berdasarkan penelitian Flavia C.M. Lopes dan kawankawan pada tahun 2009. Pterogynidine bekerja dengan menghambat aktivitas endotelial NFκB (Lopes, et al.,2009). Sehingga terdapat juga kemungkinan

(67) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 49 senyawa alkaloid yang ikut terekstraksi dalam ekstrak metanol daun senggugu juga berperan terhadap aktivitas antiangiogenesis dalam penelitian ini. Untuk memastikan kebenaran zat aktif manakah yang berperan dalam aktivitas antiangiogenesis ekstrak metanol daun senggugu, maka perlu dilakukan studi lebih lanjut dengan mengisolasi zat aktif yang diduga memiliki aktivitas antiangiogenesis dalam ekstrak metanol daun senggugu terlebih dahulu. Zat aktif yang sudah terisolasi diuji aktivitas antiangiogenesis, kemudian dilakuan uji lebih lanjut untuk mengetahui mekanisme penghambatan angiogenesis zat aktif tersebut.

(68) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Ekstrak metanol daun senggugu memiliki aktivitas antiangiogenesis pada chorioallantoic membrane (CAM) embrio ayam yang diinduksi bFGF pada konsentrasi 0,35 dan 0,7 mg/mL. 2. Tidak ada kekerabatan antara konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu dengan aktivitas antiangiogenesis. B. Saran 1. Perlu dilakukan isolasi lebih lanjut untuk mengetahui senyawa spesifik yang memiliki aktivitas antiangiogenesis dalam daun senggugu. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui mekanisme aktivitas antiangiogenesis dari senyawa spesifik antiangiogenesis dalam daun senggugu. 50 yang memiliki aktivitas

(69) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Adair, T.H., and Montani, J.P., 2011, Angiogenesis, Morgan & Claypool Life Sciences, New Jersey, pp. 1-5. Alison, M.R., 2001, Cancer, Encyclopedia of Life Sciences, pp. 1-8. American Cancer Society, 2011, Global Cancer Facts and Figures, 2nd edition, American Cancer Society, Atlanta, pp. 1. Archivio, M.D., Filesi, C., Benedetto, R.D., Gargiulo, R., Giovannini, C., and Masella, R., 2007, Polyphenols, Dietary Sources and Bioavailability, Ann 1st Super Santa, 43(3), 348-361. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L. and Akhtar, N., 2003, Angiogenesis Assays: A Critical Overview, Clinical Chemistry, 49(1), 32. Baba, A.I., and Catoi, C., 2007, Comparative Oncology, The Publishing House of The Romanian Academy, pp. 18. Bisht, M., Dhasmana, D.C., and Bist, S.S., 2010, Angiogenesis: Future of Pharmacological Modulation, Indian Journal of Pharmacology, 42(1), 2. Brooker, C., 2005, Ensiklopedia Keperawatan, EGC, Jakarta, hal. 253. Chrisnanto, E., 2010, Prosedur Tetap Uji Antiangiogenesis In Situ, Cancer Chemoprevention Research Center, 1-8. Departemen Kesehatan RI, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Direktorat Obat Asli Indonesia, 2008, Taksonomi Koleksi Tanaman Obat Kebun Tanaman Obat Citeureup, Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, Jakarta. Endrasari, R., Qanytah dan Prayudi, B., 2011, Pengaruh Pengeringan Terhadap Mutu Simplisia Temulawak Di Kecamatan Tembalang Kota Semarang, Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Jawa Tengah, 435-442. Fang, J., Xia, C., Cao, Z., Zheng, J.Z., Reed, E., and Jiang, B.H., 2004, Apigenin inhibits VEGF and HIF-1 Expression Via P13K/AKT/p70S6K1 and HDM2/p53 Pathways, The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 19, 342-351. Folkman, J., 1971, Tumour Angiogenesis: Therapeutic Implication, New England Journal of Medicine, 285 (21), 1182-1186. Folkman, J., 2003, Models of Anti-Cancer Theraphy: Angiogenesis Inhibitor: A New Class of Drugs, Landes Bioscience, 2(4), 127-133. Frisca, Sardjono, C.T., dan Sandra, F., 2009, Angiogenesis: Patofisiologi dan Aplikasi Klinis, Jurnal Kedokteran Maranatha, 8(2), 174-187. Gajovic, S., and Gruss, P., 1998, Differentiation of The Mouse Embryoid Bodies Grafted on The Chorioallantoic Membrane of The Chick Embryo, The International Journal of Developmental Biology, 42, 225-228. Gaylord Chemical Company, 2007, Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Health and Safety Information, Gaylord Chemical Company, 106, 3. Gupta, M.K., and Qin, R.Y., 2003, Mechanism and It’s Regulation of TumorInduced Angiogenesis, World Journal of Gastroenterology, 9(6), 11441155. 51

(70) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 52 Hamid, I.S., Bijanti, R., Wahyuni, R.S., Maslachah, L. dan Yuliani, M.G.A., 2011, Uji Aktivitas Ekstrak Daun Gynura procumbens Sebagai Antiangiogenesis pada Membran Korio Alantois Telur Ayam Berembrio yang Diinduksi basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), Veterinaria Medika, 4(2), 105-109. Hamid, I.S., Nazar, D.S. dan Ratnani, H., 2013, Hambatan Ekspresi Vascular Endothelial Growth Factor oleh Ekstrak Daun Sambung Nyawa pada Endotel Membran Korioalantois, Jurnal Veteriner, 14(1), 85-90. Hanahan, D., and Weinberg, R.A., 2000, Drug Inhibition of Angiogenesis, Current Opinion in Pharmacology, 2(4), 403-414. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, hal 256, Institut Teknologi Bandung, Bandung. Hattenschwiler, S., and Vitousek, P.M., 2000, The Role of Polyphenols In Terrestrial Ecosystem Nutrient Cycling, Trends in Ecology and Evolution, 15 (6), 238. Herawati, D., Nuraida, L., dan Sumarto, 2012, Cara Produksi Simplisia yang Baik, Institute Pertanian Bogor, Bogor, hal.11. Heyne, K.V., 1950, De Nuttige Planten Van Indonesie, Deel I, Uitgeverijm Van Hoeve’s, Bandung, hal. 1323-1324. He, L., Wu, Y., Lin, L., Wang, J., Wu, Y., Chen, Y., et al., 2010, Hispidulin, A Small Flavonoid Molecule, Suppresses The Angiogenesis and Growth of Human Pancreatic Cancer by Targeting Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2-Mediated P13K/Akt/mTOR Signaling Pathway, Japanese Cancer Association, 102(1), 221-225. Hock, S.W., Zheng, F., Buckfelder, M., Eyupoglu, I.Y., and Savaskan, N.E., 2013, Evolution of The Molecular Biology of Brain Tumors and The Therapeutic Implications: Brain Tumor – Induced Angiogenesis: Approach and Bioassays, http://www.intechopen.com/books/evolutionof-the-molecular-biology-of-brain-tumors-and-the-therapeuticimplications/brain-tumor-induced-angiogenesis-approaches-andbioassays, diakses tanggal 26 Februari 2013. Jeong, S.J., Koh, W., Lee, E.O., Lee, H.J., Lee, H.J., Bae, H., et al., 2010, Antiangiogenic Phytochemical and Medicinal Herbs, Wiley InterScience, pp.1. Kleinsmith, J.L., Kerrigan, D., Kelly, J., and Hollen, B., 2006, Understanding Angiogenesis, National Cancer Institute, 15. Knighton, D., Ausprunk, D., Folkman, J., and Tapper, D., 1977, Avascular and Vascular Phases of Tumour Growth In The Chick Embryo, British Journal of Cancer, 35, 147-356. Koizumi, K., Tsutsumi, Y., Yoshioka, Y., Watanabe, M., Okamoto, T., Mukai, Y., et al., 2003, Anti-angiogenic Effects of Dimethyl Sulfoxide on Endothelial Cells, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 26(9), 12951298. Kumar A., P., and Nishteswar, K., 2013, Phyto-Chemical and Pharmacological Profiles of Clerodendrum serratum Linn. (Bharangi): A Review,

(71) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 53 Ayurveda Pharma, 4 (2), 276-278. Lokman, N.A., Elder, A.S.F., Ricciardelli, C., and Oehler, M.K., 2012, Chick Chorioallatoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis, International Journal of Molecular Sciences, 13 (8), 9959-9970. Lopes, F.C.M., Rocha, A., Pirraco, A., Regasini, L.O., Silva, D.H.S., Bolzani, V.S., et al., 2009, Anti-angiogenic Effects of Pterogynidine Alkaloid Isolated from Alchornea glandulosa, Biomedical Central. 9(15), 1-9. Mardiana, L., 2007, Kanker pada Wanita, Penebar Swadaya, Jakarta, hal 9-10. Mathon, N.F., and Lloyd, A.C., 2001, Cell Senescence and Cancer, Macmilan Magazines Limited, 1, 203-207. Mogensen, C.K., 2005, Release of bFGF from Endothelial Cells is Mediated by Protease Induced HSP27 Phosphorylation Via p38-MAPK Pathway, Dissertation, 14-20. Mohamed, A.J., Mohamed, E.A.H., Aisha, A.F.A., Ameer, O.Z., Ismail, Z., Ismail, N., et al., 2012, Antioxidant, Antiangiogenic, and Vasorelaxant Activities of Metanolic Extract of Clerodendrum serratum (Spreng) Leaves, Journal of Medicinal Plants Research, 6(3), 349-359. Mustafida, R.Y., Munawir, A., Dewi, R., 2014, Efek Antiangiogenik Ekstrak Etanol Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) pada Membran Korio Alantois (CAM) Embrio Ayam, e-Jurnal Pustaka Kesehatan, 2(1), 4-7. Park, S.W., Cho, C.S., Jun, H.O., Ryu, N.H., Kim, J.H., Yu, Y.S., et al., 2012, Anti-Angiogenic Effect of Luteolin on Retinal Neovascularization via Blockade of Reactive Oxygen Species Production, Investigative Ophthalmology and Visual Science, 53(12), 7718-7725. Patten, B.M., 1978, Early Embriology of The Chick, Graw-Hill Publishing Company Limited, New Delhi, pp. 147-151. Pedricilli, P., 2001, Antioxidant Mechanism of Flavonoid, Solvent Effect on Rate Constant for Chain Breaking Reaction of Quersetin and Epicathecinin Autoxidation of Metyl Linoleat, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49. Puspita, N., Ardiani, M., Fina, A.G., Septisetyani, E.P. dan Meiyanto, E., 2008, Ekstrak Etanolik Kulit Jeruk Mandarin (Citrus reticulata) Meningkatkan Ekspresi Faktor Angiogenik VEGF pada Sel Kanker Kolon WiDr, Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia, 50 – 54. Rashid, M.T., Yadav, A.S., Bajaj, A., and Lane, S.A., 2013, An Assesment of Antibacterial Potency of Aqueous Leaf Extract of Clerodendrum serratum Linn. Against Pathogenic Bacterial Strains, Indo American Journal of Pharmaceutical Research, 3(2), 1637-1644. Redaksi Agromedia, 2008, Buku Pintar Tanaman Obat, Agromedia Pustaka, Jakarta Selatan, hal. 223. Ribbati, D., Bertossi, M., Nico, B., Vacca, A., Ria, R., Riva, A., et al., 1998, Role of The Basic Fibroblast Growth Factor in The Formulation of The Capilary Plexus in The Embryo Chorioallantoic Membrane, An In Situ

(72) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 54 Hybridization, Immunohistochemical and Ultrastructural Study, Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, 30, 127-136. Ribbati, D., Leali, D., Gualandris, A., Bastaki, M., Vacca, A., Roncali, L., et al., 1999, In Vivo Angiogenic Activity of Urokinase: Role of Endogenous Fibroblast Growth Factor-2, Jounal of Cell Science, 112, 4213-4221. Ribbati, D., Vacca, A., Roncalli, L. and Dammacco, F., 2000, The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as a model for in vivo Research on AntiAngiogenesis, Current Pharmaceutical Biotechnology, 1, 73-82 Ruddon, R.W., 2007, Cancer Biology, 4th ed., Oxford University Press, New York, pp.4. Shepro, D., 2006, Microvascular Research: Biology and Pathology, Elsevier, Oxford, pp.183 Singh, M.K., Khare,G., Iyer, S.K., Sharwan, G. and Tripathi, D.K., 2012, Clerodandrum serratum: A Clinical Approach, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2 (2), 11-15. Staton, C., Lewis, C. and Bicknell, R., 2006, Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Technique, John Wiley & Sons Limited, London, pp. 183-186. Storer, T.J., Stebins, R.C., Usinger, R.L., and Nybakker, J.W., 1979, General Zoology, MC Graw-Hill Book Company, New York, pp. 191-194. Sudiana, I.K., 2008, Patobiologi Molekuler Kanker, Salemba Medika, Jakarta, hal. 46-48. Tapan, E., 2005, Kanker, Antioksidan, dan Terapi Komplementer, Gramedia, Jakarta, hal. 119-122. Thalla, S., Tanmu, J., Pentela, B., and Thalla, S.R., 2012, Evolution of Anticancer Activity of Clerodendrum serratum, International Journal of Chemical and Pharmaceutical Science, 3(1), 56. Van Steenis, C.G.G.J., 1975, Flora untuk Sekolah di Indonesia, diterjemahkan oleh Surjowinoto, hal. 352, 364, Pradma Paramita, Jakarta. Vidya, S.M., Krishna, V., Manjunatha, B.K., Mankani, K.L., Ahmed, M., and Singh, S.D.J., 2006, Evaluation of Hepatoprotective Activity of Clerodendrum serratum L., Indian Journal of Experimental Biology, 45, 538-542. Wagner, H., and Bladt, S., 1996, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, 2nd Edition, Springer, New York, pp. 196. Weinberg, R.A., 1996, How Cancer Arises, Scientific American, 275 (3), 62. Wingerter, P.P., Elliot, K.E., Clark, J.I., and Farr, A.G., 2000, Fibroblast Growth Factor-2 Selectively Stimulates Angiogenesis of Small Vessels in Arterial Tree, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 20, 1250.

(73) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI LAMPIRAN Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman Senggugu 55

(74) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 56 Lampiran 2. Foto Tanaman Senggugu dari Kebun Obat Universitas Sanata Dharma Gambar 5. Tanaman Senggugu di Kebun Obat Universitas Sanata Dharma

(75) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 57 Lampiran 3. Data Perhitungan Rendemen Ekstrak Metanol Daun Senggugu A. Penimbangan Bobot cawan = 61,17 gram Bobot cawan + ekstrak = 65,53 gram Bobot ekstrak = 4,36 gram Bobot daun senggugu yang digunakan = 50 gram B. Rendemen Ekstrak Metanol Daun Senggugu Rendemen ekstrak metanol daun senggugu = = = 8,72 %

(76) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 58 Lampiran 4. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis

(77) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 59

(78) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 60

(79) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 61 Lampiran 5. Data Perhitungan Kontrol bFGF Kontrol bFGF termuati bFGF 10 ng + pelarut (DMSO – aquabidest steril) sebanyak 10µL. 1. Larutan bFGF Konsentrasi awal bFGF (C1) adalah 25 ng/µL. Konsentrasi bFGF yang diinginkan (C2) adalah 1 ng/µL. Dosis setiap telur adalah 10 ng. = = 10 µL Setiap telur diinduksi dengan volume induksi bFGF sebesar 10 µL. Telur yang digunakan untuk masing-masing perlakuan adalah 10 telur. Total telur = 10 telur Volume bFGF yang dibutuhkan = = Larutan bFGF (25 ng /µl) diambil 4 µL kemudian ditambah dengan pelarut bFGF yaitu PBS. Volume PBS yang ditambahkan = 100µL – 4 µL = 96 µL.

(80) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 62 2. Larutan Pelarut (DMSO – aquabidest steril) Konsentrasi awal DMSO (C1) adalah 99,5%. Konsentrasi yang diinginan (C2) adalah 0,2%. dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, kemudian di add dengan aquabidest steril

(81) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 63 Lampiran 6. Data Perhitungan Kontrol Pelarut 1. Larutan Pelarut (DMSO – aquabidest steril) Konsentrasi awal DMSO (C1) adalah 99,5%. Konsentrasi yang diinginan (C2) adalah 0,2%. dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, kemudian di add dengan aquabidest steril

(82) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 64 Lampiran 7. Data Perhitungan Kelompok Konsentrasi Ekstrak Metanol Daun Senggugu 1. Volume DMSO Konsentrasi awal DMSO (C1) adalah 99,5%. Konsentrasi yang diinginkan (C2) adalah 0,2%. Untuk membantu melarutkan ekstrak, setiap konsentrasi ekstrak ditambahkan 0,2 mL DMSO. 2. Larutan Uji Konsentrasi 0,175 mg/mL ditambah 0,2 mL DMSO add sampai 100 mL Konsentrasi 0,35 mg/mL ditambah 0,2 mL DMSO add sampai 100 mL

(83) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 65 Konsentrasi 0,7 mg/mL ditambah 0,2 mL DMSO add sampai 100 mL 3. Larutan bFGF Terdapat 3 macam konsentrasi ekstrak (0,175; 0,35 dan 0,7 mg/mL). Total telur = 3 x 10 telur = 30 telur Volume bFGF yang dibutuhkan = = Larutan bFGF (25 ng/µL) diambil 12 µL kemudian ditambah dengan pelarut bFGF yaitu PBS. Volume PBS yang ditambahkan = 100µL – 12 µL = 88 µL.

(84) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 66 Lampiran 8. Foto Prosedur Kerja Uji CAM Gambar 6. Foto Prosedur Kerja Uji CAM (Chrisnanto, 2010)

(85) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 67 Lampiran 9. Hasil Uji CAM Kontrol Blank Kontrol Blank Kontrol Blank Kontrol Pelarut Kontrol Pelarut Kontrol Pelarut Kontrol bFGF + Pelarut Kontrol bFGF + Pelarut Kontrol bFGF + Pelarut

(86) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 68 EMDS Konsentrasi 0,175 mg/mL EMDS Konsentrasi 0,175 mg/mL EMDS Konsentrasi 0,175 mg/mL EMDS Konsentrasi 0,35 mg/mL EMDS Konsentrasi 0,35 mg/mL EMDS Konsentrasi 0,35 mg/mL EMDS Konsentrasi 0,7 mg/mL EMDS Konsentrasi 0,7 mg/mL EMDS Konsentrasi 0,7 mg/mL Gambar 7. Hasil Uji CAM Kelompok Kontrol dan Perlakuan Keterangan: EMDS = Ekstrak Metanol Daun Senggugu

(87) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 69 Lampiran 10. Persentase Penghambatan Angiogenesis Tabel IV. Rerata, Standar Deviasi dan Koefisien Variasi Pembuluh Darah Baru Setiap Kelompok Jumlah Jumlah Pengamatan Pembuluh Darah 15 Kontrol Blank 3 15 13 13 Kontrol Pelarut 3 11 15 24 Kontrol bFGF 3 23 23 21 EMDS Konsentrasi I 3 23 (0,175 mg/ml) 19 17 EMDS Konsentrasi II 3 17 (0,35 mg/ml) 15 14 EMDS Konsentrasi III 3 16 (0,7 mg/ml) 14 Keterangan: EMDS = Ekstrak Metanol Daun Senggugu Kelompok Rerata Standar Deviasi CV (%) 14,33 1,15 8,02 13 2 15,38 23,33 0,58 2,49 21 2 9.52 16,33 1,15 7,04 14,67 1,15 7,84 A. Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru a = jumlah pembuluh darah baru rata-rata konsentrasi ekstrak metanol daun senggugu b = jumlah pembuluh darah baru rata-rata kontrol bFGF

(88) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 70 Konsentrasi I (0,175 mg/ml) Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = 90,01% Persentase Penghambatan Angiogenesis = 100% - 90,01% = 9,99% Konsentrasi II (0,35 mg/ml) Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = 70% Persentase Penghambatan Angiogenesis = 100% - 70% = 30% Konsentrasi III (0,7 mg/ml) Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = 62,88% Persentase Penghambatan Angiogenesis = 100% - 62,88% = 37,12%

(89) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 71 Lampiran 11. Uji Statistik dengan SPSS 16.0 A. Uji Normalitas One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test Kontrol Kontrol_ Kontrol_bFGF Konsentras Konsentras Konsentr _Blank N Pelarut _dan_Pelarut i_I i_II asi_III 3 3 3 3 3 3 14.3333 13.0000 23.3333 21.0000 16.3333 14.6667 1.15470 2.00000 .57735 2.00000 1.15470 1.15470 Most Extreme Absolute .385 .175 .385 .175 .385 .385 Differences Positive .282 .175 .385 .175 .282 .385 Negative -.385 -.175 -.282 -.175 -.385 -.282 Kolmogorov-Smirnov Z .667 .303 .667 .303 .667 .667 Asymp. Sig. (2-tailed) .766 1.000 .766 1.000 .766 .766 Normal Mean a Parameters Std. Deviation a. Test distribution is Normal. B. Uji Homogenitas Descriptives jumlah_pembuluh_d arah_baru 95% Confidence Interval for Mean N Kontrol Blank Kontrol Pelarut Kontrol bFGF + Pelarut Konsentrasi I (0,175 mg/ml) Konsentrasi II (0,35 mg/ml) Mean Std. Std. Lower Upper Deviation Error Bound Bound 11.4649 17.2018 13.00 15.00 8.0317 17.9683 11.00 15.00 21.8991 24.7676 23.00 24.00 16.0317 25.9683 19.00 23.00 13.4649 19.2018 15.00 17.00 3 14.3333 1.15470 .66667 3 13.0000 2.00000 3 23.3333 3 21.0000 2.00000 3 16.3333 1.15470 .66667 1.1547 0 .57735 .33333 1.1547 0 Minimum Maximum

(90) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 72 Konsentrasi III 3 14.6667 1.15470 .66667 11.7982 17.5351 14.00 16.00 18 17.1111 4.05679 .95619 15.0937 19.1285 11.00 24.00 (0,7 mg/ml) Total Test of Homogeneity of Variances jumlah_pembuluh_darah_baru Levene Statistic df1 .640 df2 5 Sig. 12 .674 ANOVA jumlah_pembuluh_darah_baru Sum of Squares Between Groups Mean Square F 255.111 5 51.022 24.667 12 2.056 279.778 17 Within Groups Total df Sig. 24.822 .000 C. Uji Tukey Multiple Comparisons jumlah_pembuluh_darah_baru Tukey HSD 95% Confidence Interval Mean Difference Bound Bound (J) perlakuan (I-J) Kontrol Blank Kontrol Pelarut 1.33333 1.17063 .856 -2.5987 5.2654 -9.00000 * 1.17063 .000 -12.9320 -5.0680 -6.66667 * 1.17063 .001 -10.5987 -2.7346 -2.00000 1.17063 .551 -5.9320 1.9320 -.33333 1.17063 1.000 -4.2654 3.5987 -1.33333 1.17063 .856 -5.2654 2.5987 Konsentrasi I (0,175 mg/ml) Konsentrasi II (0,35 mg/ml) Konsentrasi III (0,7 mg/ml) Kontrol Pelarut Kontrol Blank Sig. Upper (I) perlakuan Kontrol bFGF + Pelarut Std. Error Lower

(91) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 73 Kontrol bFGF + Pelarut Konsentrasi I (0,175 mg/ml) Konsentrasi II (0,35 mg/ml) Konsentrasi III (0,7 mg/ml) Kontrol bFGF + Kontrol Blank Pelarut Kontrol Pelarut Konsentrasi I (0,175 mg/ml) Konsentrasi II (0,35 mg/ml) Konsentrasi III (0,7 mg/ml) * 1.17063 .000 -14.2654 -6.4013 * 1.17063 .000 -11.9320 -4.0680 -3.33333 1.17063 .116 -7.2654 .5987 -1.66667 1.17063 .714 -5.5987 2.2654 * 1.17063 .000 5.0680 12.9320 * 1.17063 .000 6.4013 14.2654 2.33333 1.17063 .399 -1.5987 6.2654 7.00000 * 1.17063 .001 3.0680 10.9320 8.66667 * 1.17063 .000 4.7346 12.5987 -10.33333 -8.00000 9.00000 10.33333 Konsentrasi I Kontrol Blank 6.66667 * 1.17063 .001 2.7346 10.5987 (0,175 mg/ml) Kontrol Pelarut 8.00000 * 1.17063 .000 4.0680 11.9320 Kontrol bFGF + Pelarut -2.33333 1.17063 .399 -6.2654 1.5987 4.66667 * 1.17063 .017 .7346 8.5987 6.33333 * 1.17063 .002 2.4013 10.2654 Konsentrasi II (0,35 mg/ml) Konsentrasi III (0,7 mg/ml) Konsentrasi II Kontrol Blank 2.00000 1.17063 .551 -1.9320 5.9320 (0,35 mg/ml) Kontrol Pelarut 3.33333 1.17063 .116 -.5987 7.2654 -7.00000 * 1.17063 .001 -10.9320 -3.0680 -4.66667 * 1.17063 .017 -8.5987 -.7346 1.66667 1.17063 .714 -2.2654 5.5987 .33333 1.17063 1.000 -3.5987 4.2654 1.66667 1.17063 .714 -2.2654 5.5987 -8.66667 * 1.17063 .000 -12.5987 -4.7346 -6.33333 * 1.17063 .002 -10.2654 -2.4013 Kontrol bFGF + Pelarut Konsentrasi I (0,175 mg/ml) Konsentrasi III (0,7 mg/ml) Konsentrasi III Kontrol Blank (0,7 mg/ml) Kontrol Pelarut Kontrol bFGF + Pelarut Konsentrasi I (0,175 mg/ml)

(92) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 74 Konsentrasi II (0,35 -1.66667 mg/ml) 1.17063 .714 *. The mean difference is significant at the 0.05 level. jumlah_pembuluh_darah_baru Tukey HSD Subset for alpha = 0.05 perlakuan N 1 2 Kontrol Pelarut 3 13.0000 Kontrol Blank 3 14.3333 Konsentrasi III (0,7 mg/ml) 3 14.6667 Konsentrasi II (0,35 mg/ml) 3 16.3333 Konsentrasi I (0,175 mg/ml) 3 21.0000 Kontrol bFGF + Pelarut 3 23.3333 Sig. .116 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. .399 -5.5987 2.2654

(93) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul “Aktivitas Antiangiogenesis Ekstrak Metanol Daun Senggugu (Clerodendrum Serratum L.) Terhadap Chorioallantoic Membrane Yang Diinduksi bFGF” memiliki nama lengkap Retno Pamungkas. Penulis dilahirkan di Tangerang pada tanggal 2 Juni 1992. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara pasangan Bapak Sunarto, S.Ag dan Ibu Dariyah, S.Ag. Pendidikan formal yang telah ditempuh penulis: TK Dharma Widya (19971998), SD Dharma Widya (1998-2003), SDN Kedaung Wetan 4 (2003-2004), SMP Dharma Putra (2004-2007) dan SMAN 15 Tangerang (2007-2010). Tahun 2010 penulis melanjutkan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Selama menjalani perkuliahan, penulis mengikuti beberapa kegiatan antara lain: Sie. Publikasi Dekorasi dan Dokumentasi Pelepasan Wisuda 2011 dan Koordinator Sie. Dekorasi dan Dokumentasi Pharmacy Days 2012, serta menjadi peserta beberapa seminar seperti seminar Deteksi Dini Kanker Payudara Dengan Sadari (2011), seminar nasional Pemberdayaan Pasien Dalam Self Management Diabetes Melitus untuk Meningkatkan Kualitas Hidup (2011), seminar Kanker Serviks dan Kanker Paru-paru (2011) dan seminar Kanker 2013 “Cancer Live It Or Leave It”. 75

(94)

Dokumen baru

Tags

Dokumen yang terkait

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
0
165
ANTARAKSI BAWANG PUTIH (Allium sativum L.) DAN ASETOSAL DITINJAU DARI EFEK ANTITROMBOTIK PADA TIKUS PUTIH BETINA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi
0
0
80
SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi
0
0
105
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi
0
0
83
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Ekonomi Program Studi Akuntansi
1
1
100
SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi
0
0
115
KARAKTERISASI EKSTRAK ETANOLIK DAUN TEH HIJAU (Camellia sinensis L.) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi
0
0
106
KARAKTERISASI EKSTRAK ETANOLIK DAUN JATI BELANDA (Guazuma ulmifolia Lamk.) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi
0
0
112
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
0
92
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
0
148
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi
0
0
105
EFEK HEPATOPROTEKTIF EKSTRAK METANOL : AIR DAUN Macaranga tanarius (L.) PADA TIKUS JANTAN TERINDUKSI PARASETAMOL Skripsi Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi
0
0
127
PENETAPAN KADAR ASIKLOVIR PADA SEDIAAN TABLET MENGGUNAKAN PELARUT HCl SECARA SPEKTROFOTOMETRI ULTRAVIOLET Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi
0
0
85
SEBAGAI SUPERDISINTEGRANT DAN MAGNESIUM STEARAT SEBAGAI LUBRICANT SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi
0
0
97
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
0
159
Show more