Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jinten Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paruparu Mencit (Mus musculus)

 1  66  162  2017-05-18 15:53:05 Report infringing document
2 ABSTRAK AGUNG SUDOMO Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus). Dibimbing oleh SRI ESTUNINGSIH dan DEWI RATIH AGUNGPRIYONO Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi mengenai efek pemberian ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa) terhadap gambaran histopatologi paru-paru mencit. Sebanyak 12 ekor mencit jantan usia 4 minggu dibagi menjadi empat kelompok, masing masing kelompok beranggotakan tiga ekor mencit. Kelompok K atau kontrol negatif menerima perlakuan aquades, kelompok HS 0.1 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml, kelompok HS 0.2 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml dan kelompok HS Madu menerima perlakuan kombinasi ekstrak minyak jintan hitam dengan madu (perbandingan 1:20) sebanyak 0.3 ml. Perlakuan dilakukan selama dua bulan. Kemudian mencit dieutanasi dengan cara dislokasi sendi atlanto-occipitalis kemudian mencit dinekropsi untuk mendapatkan sampel organ paru-paru. Paru-paru diproses menjadi sediaan histopatologi kemudian diwarnai dengan pewarnaan Hematoxyllin-Eosin dan Periodic Acid Schiff. Parameter yang diamati adalah persenatse bronkhus yang bereksudat, jumlah sel goblet pada saluran nafas, luas area dan kepadatan sel BALT, kongesti dan hemoragi, fokus-fokus radang, ketebalan otot polos di sekitar saluran nafas serta kejadian emfisema menggunakan perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows®. Analisis data dilakukan denganmenggunakan perangkat lunak SPSS® 16.0, uji statistik yang digunakan adalah ANOVA dan uji lanjut Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam tidak menyebabkan eksuddasi yang berlbihan, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan luas BALT dan meningkatkan kepadatan sel limfoid BALT, menurunkan kejadian kongesti dan heomragi, menurunkan peradangan dan tidak menyebabkan hipertrofi otot polos. Kandungan dari jintan hitam yaitu thymoquinone dan longifelone diduga memberikan efek yang baik untuk histomorfologi organ paruparu. Kata kunci: Mencit, Nigella sativa, paru-paru, mikroskopis sistem pernapasan 3 ABSTRACT AGUNG SUDOMO The Effect of Blackseed (Nigella sativa) Extract on Mice (Mus musculus) Lung Microscopy. Under direction of SRI ESTUNINGSIH and DEWI RATIH AGUNGPRIYONO This study was aimed to get information about the effect of blackseed (Nigella sativa) effect on the histopathology of mice lung. Twelve male mice of 4 weeks old were divided into four groups, each group consisted of three mice. Group K or negative control received aquadest, group HS 0.1 was received 0.1 ml blackseed oil, group HS 0.2 was received 0.2 blackseed oil and group HS Madu was received 0.3 ml mixed of blackseed oil and honey (1:20) for two months. At the end of the experiment, the mice were euthanized by atlanto occipital dislocation and necropsied to collect the lung sample. The lungs were processed to prepare the histopathology slides with Hematoxyllin-Eosin and Periodic Acid Schiff (PAS) stain. The parameters observed include counting percentage of bronchus and bronchial presenting exudates, counting the goblet cell between the respiratory epithelial cell, calculating the BALT area, counting the limfoid cell density of the BALT, counting the congestion, hemorrhage, inflammation and emphysema area on the certain fields of view, measuring the thickness of smooth muscle surround bronchial using Image J® for Microsoft® Windows®. Quantitative data were analyzed using SPSS® 16.0 software and ANOVA test followed Duncan test. The result showed that Nigella sativa treatment does not lead to increase exudation in the bronchus and bronchioles lumen,a decrease in the activity of goblet cells, a decrease the BALT area and an increase in the lymphoid cell density,a reduce the area of congestion and hemorrhage, inflammation and emphysema, reduction at the smooth muscle thickness. The blackseed content such thymoquinone and longifolene were thought to provide a favorable effect on lung histomorphology. Keyword: Mice, Nigella sativa, lung, microscopy of respiratory system 4 RINGKASAN AGUNG SUDOMO Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus). Dibimbing oleh SRI ESTUNINGSIH dan DEWI RATIH AGUNGPRIYONO Saluran pernafasan merupakan organ yang mudah terserang penyakit, hal ini disebabkan karena saluran pernafasan termasuk ke dalam kelompok saluran terbuka. Artinya saluran pernafasan berhubungan langsung dengan lingkungan luar (Aspinall dan O’Reilly 2004). Saluran pernafasan memiliki mekanisme pertahanan yang dapat mencegah masuknya kuman ke dalam tubuh melalui saluran pernafasan (Bals et al. 1999). Terkadang sistem pertahanan yang ada pada organ paru-paru tidak dapat menahan gempuran mikroorganisme patogen yang masuk. Salah satu cara untuk meningkatkan sistem imun pada paru-paru adalah dengan menggunakan obat-obatan herbal. Penggunaan tanaman herbal pada pengobatan sudah dikenal sejak ribuan tahun yang lalu. Hingga saat ini banyak obat-obatan modern yang masih diturunkan dari tanaman dan ±25% dari semua resep mengandung satu atau lebih bahan aktif dari tanaman (Saad et al. 2005). Delapan puluh persen penduduk Asia dan Afrika menggunakan pengobatan herbal untuk menangani masalah kesehatan (WHO 2008). Penggunaan tanaman herbal sebagai obat-obatan banyak disukai karena secara umum obat herbal lebih aman dibandingkan dengan obat modern (Sari 2006). Nigella sativa atau yang dikenal dengan nama jintan hitam adalah tanaman herbal yang berasal dari daerah di sekitar laut mediterania (Rouhou et al. 2007). Biji dan minyak dari jintan hitam memiliki khasiat sebagai antiinflamasi, analgesik, antipiretik, antimikroba dan antineoplasma. Beberapa laporan juga menyebutkan bahwa jintan hitam juga efektif untuk pencegahan penyakit asma (Salama dan Ragaa 2010). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak minyak jintan hitam dan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dan madu terhadap gambaran mikroskopis organ paru-paru. Perubahan yang terjadi pada gambaran mikroskopis organ paru dapat digunakan sebagai acuan untuk mempelajari efek jintan hitam lebih lanjut. Sebanyak 12 ekor mencit jantan usia 4 minggu dibagi menjadi empat kelompok, masing masing kelompok beranggotakan tiga ekor mencit. Kelompok K atau kontrol negatif menerima perlakuan aquades, kelompok HS 0.1 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml, kelompok HS 0.2 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml dan kelompok HS Madu menerima perlakuan kombinasi ekstrak minyak jintan hitam dengan madu (perbandingan 1:20) sebanyak 0.3 ml. Perlakuan dilakukan selama dua bulan. Kemudian mencit dieutanasi dengan cara dislokasi sendi atlanto-occipitalis kemudian mencit dinekropsi untuk mendapatkan sampel organ paru-paru. Paruparu diproses menjadi sediaan m kemudian diwarnai dengan pewarnaan Hematoxyllin-Eosin dan Periodic Acid Schiff. Parameter yang diamati adalah persenatse bronkhus yang bereksudat, jumlah sel goblet pada saluran nafas, luas area dan kepadatan sel BALT, kongesti dan hemoragi, fokus-fokus radang, ketebalan otot polos di sekitar saluran nafas serta kejadian emfisema menggunakan perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows®. Analisis data 5 dilakukan denganmenggunakan perangkat lunak SPSS® 16.0, uji statistik yang digunakan adalah ANOVA dan uji lanjut Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam tidak menyebabkan eksuddasi yang berlbihan, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan luas BALT dan meningkatkan kepadatan sel limfoid BALT, menurunkan kejadian kongesti dan heomragi, menurunkan peradangan dan tidak menyebabkan hipertrofi otot polos. Kandungan dari jintan hitam yaitu thymoquinone dan longifelone diduga memberikan efek yang baik untuk histomorfologi organ paru-paru. Kata kunci: Mencit, Nigella sativa, paru-paru, mikroskopis sistem pernapasan PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK MINYAK JINTAN HITAM (Nigella sativa) TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS PARU-PARU MENCIT (Mus musculus) AGUNG SUDOMO FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTUTUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 2 ABSTRAK AGUNG SUDOMO Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus). Dibimbing oleh SRI ESTUNINGSIH dan DEWI RATIH AGUNGPRIYONO Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi mengenai efek pemberian ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa) terhadap gambaran histopatologi paru-paru mencit. Sebanyak 12 ekor mencit jantan usia 4 minggu dibagi menjadi empat kelompok, masing masing kelompok beranggotakan tiga ekor mencit. Kelompok K atau kontrol negatif menerima perlakuan aquades, kelompok HS 0.1 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml, kelompok HS 0.2 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml dan kelompok HS Madu menerima perlakuan kombinasi ekstrak minyak jintan hitam dengan madu (perbandingan 1:20) sebanyak 0.3 ml. Perlakuan dilakukan selama dua bulan. Kemudian mencit dieutanasi dengan cara dislokasi sendi atlanto-occipitalis kemudian mencit dinekropsi untuk mendapatkan sampel organ paru-paru. Paru-paru diproses menjadi sediaan histopatologi kemudian diwarnai dengan pewarnaan Hematoxyllin-Eosin dan Periodic Acid Schiff. Parameter yang diamati adalah persenatse bronkhus yang bereksudat, jumlah sel goblet pada saluran nafas, luas area dan kepadatan sel BALT, kongesti dan hemoragi, fokus-fokus radang, ketebalan otot polos di sekitar saluran nafas serta kejadian emfisema menggunakan perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows®. Analisis data dilakukan denganmenggunakan perangkat lunak SPSS® 16.0, uji statistik yang digunakan adalah ANOVA dan uji lanjut Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam tidak menyebabkan eksuddasi yang berlbihan, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan luas BALT dan meningkatkan kepadatan sel limfoid BALT, menurunkan kejadian kongesti dan heomragi, menurunkan peradangan dan tidak menyebabkan hipertrofi otot polos. Kandungan dari jintan hitam yaitu thymoquinone dan longifelone diduga memberikan efek yang baik untuk histomorfologi organ paruparu. Kata kunci: Mencit, Nigella sativa, paru-paru, mikroskopis sistem pernapasan 3 ABSTRACT AGUNG SUDOMO The Effect of Blackseed (Nigella sativa) Extract on Mice (Mus musculus) Lung Microscopy. Under direction of SRI ESTUNINGSIH and DEWI RATIH AGUNGPRIYONO This study was aimed to get information about the effect of blackseed (Nigella sativa) effect on the histopathology of mice lung. Twelve male mice of 4 weeks old were divided into four groups, each group consisted of three mice. Group K or negative control received aquadest, group HS 0.1 was received 0.1 ml blackseed oil, group HS 0.2 was received 0.2 blackseed oil and group HS Madu was received 0.3 ml mixed of blackseed oil and honey (1:20) for two months. At the end of the experiment, the mice were euthanized by atlanto occipital dislocation and necropsied to collect the lung sample. The lungs were processed to prepare the histopathology slides with Hematoxyllin-Eosin and Periodic Acid Schiff (PAS) stain. The parameters observed include counting percentage of bronchus and bronchial presenting exudates, counting the goblet cell between the respiratory epithelial cell, calculating the BALT area, counting the limfoid cell density of the BALT, counting the congestion, hemorrhage, inflammation and emphysema area on the certain fields of view, measuring the thickness of smooth muscle surround bronchial using Image J® for Microsoft® Windows®. Quantitative data were analyzed using SPSS® 16.0 software and ANOVA test followed Duncan test. The result showed that Nigella sativa treatment does not lead to increase exudation in the bronchus and bronchioles lumen,a decrease in the activity of goblet cells, a decrease the BALT area and an increase in the lymphoid cell density,a reduce the area of congestion and hemorrhage, inflammation and emphysema, reduction at the smooth muscle thickness. The blackseed content such thymoquinone and longifolene were thought to provide a favorable effect on lung histomorphology. Keyword: Mice, Nigella sativa, lung, microscopy of respiratory system 4 RINGKASAN AGUNG SUDOMO Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus). Dibimbing oleh SRI ESTUNINGSIH dan DEWI RATIH AGUNGPRIYONO Saluran pernafasan merupakan organ yang mudah terserang penyakit, hal ini disebabkan karena saluran pernafasan termasuk ke dalam kelompok saluran terbuka. Artinya saluran pernafasan berhubungan langsung dengan lingkungan luar (Aspinall dan O’Reilly 2004). Saluran pernafasan memiliki mekanisme pertahanan yang dapat mencegah masuknya kuman ke dalam tubuh melalui saluran pernafasan (Bals et al. 1999). Terkadang sistem pertahanan yang ada pada organ paru-paru tidak dapat menahan gempuran mikroorganisme patogen yang masuk. Salah satu cara untuk meningkatkan sistem imun pada paru-paru adalah dengan menggunakan obat-obatan herbal. Penggunaan tanaman herbal pada pengobatan sudah dikenal sejak ribuan tahun yang lalu. Hingga saat ini banyak obat-obatan modern yang masih diturunkan dari tanaman dan ±25% dari semua resep mengandung satu atau lebih bahan aktif dari tanaman (Saad et al. 2005). Delapan puluh persen penduduk Asia dan Afrika menggunakan pengobatan herbal untuk menangani masalah kesehatan (WHO 2008). Penggunaan tanaman herbal sebagai obat-obatan banyak disukai karena secara umum obat herbal lebih aman dibandingkan dengan obat modern (Sari 2006). Nigella sativa atau yang dikenal dengan nama jintan hitam adalah tanaman herbal yang berasal dari daerah di sekitar laut mediterania (Rouhou et al. 2007). Biji dan minyak dari jintan hitam memiliki khasiat sebagai antiinflamasi, analgesik, antipiretik, antimikroba dan antineoplasma. Beberapa laporan juga menyebutkan bahwa jintan hitam juga efektif untuk pencegahan penyakit asma (Salama dan Ragaa 2010). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak minyak jintan hitam dan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dan madu terhadap gambaran mikroskopis organ paru-paru. Perubahan yang terjadi pada gambaran mikroskopis organ paru dapat digunakan sebagai acuan untuk mempelajari efek jintan hitam lebih lanjut. Sebanyak 12 ekor mencit jantan usia 4 minggu dibagi menjadi empat kelompok, masing masing kelompok beranggotakan tiga ekor mencit. Kelompok K atau kontrol negatif menerima perlakuan aquades, kelompok HS 0.1 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml, kelompok HS 0.2 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml dan kelompok HS Madu menerima perlakuan kombinasi ekstrak minyak jintan hitam dengan madu (perbandingan 1:20) sebanyak 0.3 ml. Perlakuan dilakukan selama dua bulan. Kemudian mencit dieutanasi dengan cara dislokasi sendi atlanto-occipitalis kemudian mencit dinekropsi untuk mendapatkan sampel organ paru-paru. Paruparu diproses menjadi sediaan m kemudian diwarnai dengan pewarnaan Hematoxyllin-Eosin dan Periodic Acid Schiff. Parameter yang diamati adalah persenatse bronkhus yang bereksudat, jumlah sel goblet pada saluran nafas, luas area dan kepadatan sel BALT, kongesti dan hemoragi, fokus-fokus radang, ketebalan otot polos di sekitar saluran nafas serta kejadian emfisema menggunakan perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows®. Analisis data 5 dilakukan denganmenggunakan perangkat lunak SPSS® 16.0, uji statistik yang digunakan adalah ANOVA dan uji lanjut Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam tidak menyebabkan eksuddasi yang berlbihan, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan luas BALT dan meningkatkan kepadatan sel limfoid BALT, menurunkan kejadian kongesti dan heomragi, menurunkan peradangan dan tidak menyebabkan hipertrofi otot polos. Kandungan dari jintan hitam yaitu thymoquinone dan longifelone diduga memberikan efek yang baik untuk histomorfologi organ paru-paru. Kata kunci: Mencit, Nigella sativa, paru-paru, mikroskopis sistem pernapasan 6 PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK MINYAK JINTAN HITAM (Nigella sativa) TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS PARU-PARU MENCIT (Mus musculus) AGUNG SUDOMO Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTUTUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 7 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi “Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jintan Hitam (Nigella sativa) terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus)” adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada Perguruan Tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Bogor, September 2012 Agung Sudomo NIM B04070007 8 © Hak Cipta milik IPB, tahun 2012 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyususnan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB 9 LEMBAR PENGESAHAN Judul Penelitian : Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jinten Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paruparu Mencit (Mus musculus) Nama Mahasiswa : Agung Sudomo NRP : B04070007 Program Studi : Kedokteran Hewan Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor Disetujui Komisi Pembimbing Pembimbing I Pembimbing II Dr.Drh. Sri Estuningsih, MSi, APVet NIP. 19600629 199002 2 001 Drh. Dewi Ratih Agungpriyono, PhD, APVet NIP. 19631201 198803 2 001 Mengetahui, A.n. Dekan Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor Drh. Agus Setiyono, MS. PhD, APVet NIP. 19630810 198803 1 004 Tanggal lulus: 10 PRAKATA Puji syukur ke hadirat Allah SWT atas berkat, rahmat, dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyususnan skripsi yang berjudul Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jintan Hitam (Nigella sativa) terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-paru Mencit (Mus musculus). Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Proses penulisan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan rasa tulus dan hormat, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Ayah (Sukemi) dan Ibu (Nurmarini) tercinta selaku orang tua penulis, atas kasih sayang, doa, motivasi, nasihat, dan dorongan yang luar biasa dan tak henti-hentinya kepada penulis. 2. Dr. Drh. Sri Estuningsih, MSi. APVet Drh. Dewi Ratih Agungpriyono, PhD. APVet selaku dosen pembimbing skripsi atas bimbingan, arahan, motivasi, waktu, dan pemikiran selama proses penelitian dan penyelesaian skripsi ini. 3. Drh. Isdoni, M.Biomed selaku dosen pembimbing akademik. 4. Saudara tercinta Awaluddin Nurmiyanto, Nurafni Aridhona atas dukungan dan inspirasi yang luar biasa. 5. Tim Habbatussauda (Dian Mayasafira, Niken Rostika, Cut Dara, Nova Febrina, Ornella Zynesha, dan Annisa Rahmi) dan teman-teman seperjuangan di Lab. Patologi Rahmah, Desray, Fatma, Mutia, Zaza, Juju, Tizzani dan Iren atas kebersamaannya. 6. Danang, Fakhri, Disa, Tami, dan Arni atas bantuan dan dukungan moril dan kebersamaan yang telah kita lalui. 7. Staf Bagian Patologi FKH IPB (Pak Kasnadi, Pak Endang, Pak Soleh, dan Mbak Kiki) atas segala bantuannya. 8. Keluarga Bapak Haryadi dan keluarga bapak Bambang HR atas dukungannya 9. Teman-teman yang tergabung dalam Gianuzzi FKH 44. 11 10. Teman-teman HIMPRO Satwaliar (Pandu, Yoha, Ines, Rere, Nindi dan Talitha) atas kebersamaan dan dukungan selama ini. 11. Teman-teman IMAKUSI dan Asrama Kuansing (Misep, Pras, Disfa, Abrar, Iqbar, Aji, Yufi) atas kebersamaan dan dukungannya. 12. Teman-teman Blogger IPB Yusuf, Elka, Miftah, Adietya, Sentani dan Momo atas kebersamaan dan dukungannya. Terakhir penulis mengucapkan terima kasih banyak kepada seluruh civitas akademik Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Segala sesuatu tidak ada yang sempurna, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Bogor, September 2012 Agung Sudomo NIM B04070007 i PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK MINYAK JINTAN HITAM (Nigella sativa) TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS PARU-PARU MENCIT (Mus musculus) AGUNG SUDOMO FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTUTUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 ii DAFTAR ISI Halaman Daftar Isi.....................................................................................................................i Daftar Gambar ............................................................................................................iii Daftar Tabel ...............................................................................................................iv Daftar Lampiran .........................................................................................................vii Bab I Pendahuluan .....................................................................................................1 1.1 Latar Belakang .........................................................................................1 1.2 Tujuan ......................................................................................................2 1.3 Manfaat ....................................................................................................3 1.4 Hipotesis ...................................................................................................3 Bab II Tinjauan Pustaka .............................................................................................4 2.1 Jintan Hitam ............................................................................................4 2.2 Madu.........................................................................................................9 2.3 Mencit.......................................................................................................10 2.4 Organ Sistem Pernafasan Mencit .............................................................12 2.4.1 Saluran Nafas.............................................................................12 2.4.1 Paru-paru ...................................................................................13 2.4.2 Histologi Paru-paru ...................................................................14 2.4.3 Sistem Pertahanan pada Paru-paru ............................................14 2.4.4 Perubahan Histopatologi Paru-Paru pada Penderita Asma .......16 Bab III Bahan dan Metode .........................................................................................19 3.1 Waktu dan Tempat ...................................................................................19 3.2 Bahan dan Alat .........................................................................................19 iii 3.3 Metode Penelitian .....................................................................................20 3.3.1 Persiapan Hewan Coba .............................................................20 3.3.2 Kandang Hewan Coba...............................................................21 3.3.3 Pakan dan Minum .....................................................................22 3.3.4 Kelompok Perlakuan Penelitian ................................................22 3.3.5 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ ...............................22 3.3.6 Pembuatan Sediaan Histologi ...................................................23 3.3.7 Pewarnaan Sediaan Histologi ....................................................24 3.3.8 Pengamatan Sediaan Histologi ..................................................24 3.3.9 Analisis Statistik .......................................................................27 BAB IV Hasil dan Pembahasan .................................................................................27 4.1 Eksudat pada bronkhus dan bronkhiolus..................................................27 4.2 Sel Goblet pada bronkhiolus ....................................................................29 4.3 Bronchial-Associated Lymphoid Tissue (BALT) .....................................32 4.4 Kongesti dan Hemoragi............................................................................34 4.5 Fokus Radang ...........................................................................................36 4.6 Ketebalan otot polos .................................................................................39 4.7 Emfisema..................................................................................................41 4.8 Pembahasan Umum ..................................................................................42 BAB V Penutup .........................................................................................................45 5.1 Kesimpulan ..............................................................................................45 5.2 Saran .........................................................................................................45 Daftar Pustaka ............................................................................................................46 Lampiran ....................................................................................................................52 iv DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1 Bunga dan Biji Jintan Hitam .....................................................................5 Gambar 2 Mencit (Mus musculus) ............................................................................11 Gambar 3 Histologi Normal Paru-paru .....................................................................14 Gambar 4 Mekanisme Sistem Pertahanan pada Paru-paru .......................................15 Gambar 5 Penebalan Epitel pada Paru-Paru Mencit Model Penyakit Asma ............17 Gambar 6 Peningkatan Jumlah Sel Goblet pada Mencit Model Penyakit Asma ......17 Gambar 7 Kandang Hewan coba ...............................................................................21 Gambar 8 Gambaran Histopatologi Bronkhus Yang Bereksudat Sedikit ..................29 Gambar 9 Gambaran Histopatologi Sel Goblet Dengan Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) .............................................................................................31 Gambar 10 Gambaran Histopatologi Keberadaan Fokus BALT di Sekitar Bronkhioli dengan Pewarnaan HE ..........................................................32 Gambar 11 Gambaran Mikroskopi Kepadatan Sel Limfoid pada BALT dengan Pewarnaan HE .........................................................................................33 Gambar 12 Gambaran Histopatologi Kongesti Pembuluh Darah Vena pada Organ Paru-paru .................................................................................................35 Gambar 13 Gambaran Histopatologi Hemoragi pada Organ Paru-paru ....................36 Gambar 14 Gambaran Histopatologi Fokus-Fokus Radang Pada Organ Paru-Paru .38 Gambar 15 Gambaran Histopatologi Otot Polos Di Sekitar Bronkhus Pada Organ Paru-Paru .................................................................................................40 Gambar 16 Gambaran Histopatologi Emfisema Pada Organ Paru-Paru ...................42 v DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Karakteristik Kimia Biji Jintan Hitam .........................................................5 Tabel 2. Komposisi Asam Lemak Minyak Jintan Hitam ..........................................6 Tabel 3. Aktivitas Antimikroba Thymoquinone dibandingkan Gentamycin dan Erythromycin terhadap Bakteri Patogen pada Manusia...............................7 Tabel 4. Komposisi kimia madu per 100 gr ...............................................................10 Tabel 5. Data Dasar Fisiologis Mencit .......................................................................11 Tabel 6. Jadwal Kegiatan Penelitian ..........................................................................19 Tabel 7 Persentase Bronkhus dan Bronkhiolus yang Bereksudat pada Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam .....................................................................27 Tabel 8 Jumlah Sel Goblet pada Bronkhiolus Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam............................................................................................................30 Tabel 9 Hasil Pengamatan BALT pada Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam............................................................................................................32 Tabel 10 Hasil Pengamatan Kongesti dan Hemoragi pada Paru-paru Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam .....................................................................34 Tabel 11 Rataan Jumlah Fokus Radang Pada Paru-Paru Mencit Yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam ................................................................................36 Tabel 12 Hasil Pengamatan Terhadap Otot Polos Pada Bronkhus Mencit Yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam .....................................................................39 Tabel 13 Persentase Daerah Emfisema pada Mencit yang diberi Perlakuan Jintan Hitam............................................................................................................41 Tabel 14 Dosis Efektif Jintan Hitam Berdasarkan Faktor yang Diamati ...................44 vi Daftar Lampiran Halaman Lampiran 1 Perhitungan Dosis ...................................................................................53 Lampiran 2 Jadwal Pelaksanaan Kegiatan .................................................................55 Lampiran 3 Hasil Analisis Data Eksudat pada Bronkhus ..........................................56 Lampiran 4 Hasil Analisis Data Jumlah Sel Goblet ..................................................58 Lampiran 5 Hasil Analisis Data Pengamatan BALT .................................................60 Lampiran 6 Hasil Analisis Data Pengamatan Kongesti dan Hemoragi .....................62 Lampiran 7 Hasil Analisis Data Pengamatan Fokus Radang.....................................64 Lampiran 8 Hasil Analisis Data Ketebalan Otot Polos ..............................................66 Lampiran 9 Hasil Analisis Data Emfisema ................................................................68 1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Saluran pernafasan merupakan organ yang mudah terserang penyakit, hal ini disebabkan karena saluran pernafasan termasuk ke dalam kelompok saluran terbuka. Artinya saluran pernafasan berhubungan langsung dengan lingkungan luar (Aspinall 2004). Salah satu permasalahan kesehatan paru-paru adalah penyakit asma. WHO (2011) menyebutkan bahwa saat ini sebanyak 235 juta penduduk dunia mengidap penyakit asma. Penyakit pernafasan kronik ini sudah menjadi masalah kesehatan masyarakat. Asma sudah masuk ke semua negara baik yang mempunyai pendapatan yang tinggi ataupun rendah. Saluran pernafasan memiliki mekanisme pertahanan yang dapat mencegah masuknya kuman kedalam tubuh melalui saluran pernafasan. Mekanisme ini berupa sistem kekebalan bawaan yang bersifat umum dan sistem kekebalan dapatan yang bersifat khusus (Robert 1999). Namun terkadang sistem pertahanan yang ada pada organ paru-paru tidak dapat menahan mikroorganisme patogen yang masuk. Agar tidak terjadi kerusakan pada paru-paru, diperlukan zat yang mampu meningkatkan sistem pertahanan pada organ paru-paru sehingga dapat mencegah masuknya mikroorganisme patogen maupun benda asing yang dapat menyebabkan kerusakan pada paru-paru. Salah satu cara untuk meningkatkan sistem imun pada paru-paru adalah dengan menggunakan obat-obatan herbal. Penggunaan tanaman herbal untuk pengobatan sudah dikenal sejak ribuan tahun yang lalu. Secara umum penggunaan herbal dalam dunia pengobatan dikelompokkan menjadi empat kelompok yaitu pengobatan tradisional herbal cina, ayuverda, pengobatan herbal barat dan pengobatan herbal dari arab. Saat ini banyak obat-obatan modern yang masih diturunkan dari tanaman dan ±25% dari semua resep mengandung satu atau lebih bahan aktif dari tanaman (Saad 2005). Di Asia dan Afrika 80% penduduknya menggunakan pengobatan herbal untuk menangani masalah kesehatan yang dialami (WHO 2008). Penggunaan tanaman 2 herbal sebagai obat-obatan banyak disukai karena secara umum obat herbal lebih aman dibandingkan dengan obat modern (Sari 2006). Peningkatan penggunaan obat herbal juga terjadi di Indonesia. Hal ini menandakan bahwa masyarakat di Indonesia semakin percaya terhadap efek obat herbal. Penggunaan obat herbal di Indonesia juga tidak terbatas pada strata masyarakat tertentu. Penggunaan obat herbal sudah menembus seluruh lapisan masyarakat. Meskipun demikian kajian dan pengembangan terhadap potensi obat herbal harus terus dilakukan agar masyarakat mendapatkan manfaat dari penggunaan obat herbal secara maksimal (Subarnas 2010). Pemerintah Indonesia juga sudah mendukung penggunaan obat herbal ini. Pada tahun 2004 BPOM mengeluarkan Keputusan Kepala BPOM No. HK.00.05.4.2411 tentang Ketentuan Pokok Pengelompokan dan Penandaan Obat. Nigella sativa atau yang dikenal dengan nama jintan hitam adalah tanaman herbal yang berasal dari daerah di sekitar laut mediterania (Rouhou et al. 2007). Biji dan minyak dari jintan hitam memiliki khasiat sebagai antiinflamasi, analgesik, antipiretik, antimikroba dan antineoplasma. Beberapa laporan juga menyebutkan bahwa jintan hitam juga efektif untuk pencegahan penyakit asma. Jintan hitam sudah digunakan sebagai obat herbal sejak ribuan tahun yang lalu. Masyarakat pada daerah timur tengah dan beberapa negara lain di Asia barat menggunakan jintan hitam sebagai obat untuk mengobati penyakit. Selain sebagai obat herbal, jintan hitam juga digunakan sebagai bahan tambahan makanan (Salama 2010). Saat ini jintan hitam sudah banyak ditemukan di pasaran baik dalam bentuk bubuk dalam kapsul dan minyak. Melihat potensi jintan hitam dan tren penggunaan obat herbal pada masyarakat maka perlu diadakan kajian untuk mendapatkan informasi ilmiah tentang manfaat jintan hitam terutama pada organ paru-paru. 3 1.2 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa) dan kombinasi ekstrak jintan hitam dengan madu terhadap gambaran mikroskopis organ paru-paru pada mencit (Mus musculus). 1.3 Manfaat Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah informasi tentang khasiat jintan Hitam khususnya pada paru-paru mencit (Mus musculus). Dengan informasi dari penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan penggunaan jintan hitam sebagai obat herbal yang dapat mengatasi permasalahan pada paru-paru baik pada hewan maupun pada manusia. 1.4 Hipotesis H0: Tidak terdapat perbedaan gambaran mikroskopis organ paru-paru mencit yang diberi perlakuan (ekstrak minyak jintan hitam) dengan kelompok kontrol negatif (tidak diberi ekstrak minyak jintan hitam). H1: Terdapat perbedaan gambaran mikroskopis organ paru-paru antara kelompok mencit yang diberi perlakuan (diberi ekstrak minyak jintan hitam) dengan kelompok kontrol negatif (tidak diberi ekstrak minyak jintan hitam). 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Jintan Hitam Nigella sativa merupakan tanaman herbal tahunan. Tanaman ini sudah digunakan sejak ribuan tahun yang lalu sebagai bumbu dan pengawet makanan. Tanaman ini biasanya tumbuh di Eropa, Timur Tengah dan Asia Barat. Jintan hitam tumbuh pada keadaan tanah semi arid. Bunga jintan hitam berwarna kebirubiruan dengan variasi jumlah kelopak (Gambar 5). Bunga jintan hitam juga ditandai dengan adanya nektar. Biji jintan hitam berukuran kecil dengan berat antara 1-5 mg berwarna abu-abu gelap atau hitam dengan permukaan kulit yang berkerut (Antuono et al. 2002). Jintan hitam dikenal sebagai obat-obatan herbal sejak ribuan tahun yang lalu. Jintan hitam sering digunakan sebagai obat-obatan tradisional untuk mengobati berbagai penyakit seperti demam, flu, sakit kepala, asma, rematik, infeksi oleh mikroba, untuk mengatasi cacing pada saluran pencernaan dan juga untuk meningkatkan status kesehatan (Salama 2010). Nigella sativa di Indonesia dikenal sebagai jintan hitam. Sedangkan di Arab Saudi N. Sativa dikenal dengan nama Al-Habbah Al Sawda, Habbet ElBaraka, Kamoun Aswad, Schuniz dan Khodria. Di Pakistan India, dan Sri Lanka dikenal sebagai Kalvanji, Kalunji, Azmut, Gurat, Aof dan Aosetta. Dalam bahasa Inggris tanaman ini dikenal dengan nama black seed, black cumin, black caraway, cinnamon flower, nutmeg flower dan love-in-a-mist (Salama 2010). Klasifikasi ilmiah jintan hitam (USDA 2011) adalah sebagai berikut: Kingdom : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Ranunculales 5 Famili : Ranunculaceae Genus : Nigella L. Spesies : Nigella sativa L. A B Gambar 1. Bunga dan Biji Jintan Hitam (Sumber: Gambar A: USDA 2011; Gambar B: Fatoni 2011) Biji jintan hitam diketahui mempunyai banyak manfaat bagi kesehatan. Karakteristik kimia biji jintan hitam menurut Rouhou et al. 2007 dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1.Karakteristik Kimia Biji Jintan Hitam Komposisi Dry matter (%) Oila Crude proteina Asha Potassiumb Magnesiumb Calciumb Phosphorusb Sodiumb Ironb Copperb Zincb Manganeseb Total carbohydratea a Dalam % basis bahan kering Dalam mg/kg dari bahan kering Sumber: Rouhou et al. (2007) b Jumlah 91.35 ± 0.26 28.48 ± 0.05 26.7 ± 0.35 4.86 ± 0.06 783 ± 6.61 235 ± 4.87 572 ± 21.5 48.9 ± 0.04 20.8 ± 2.21 8.65 ± 0.65 1.65 ± 0.03 8.04 ± 0.21 4.43 ± 0.11 40.0 ± 0.46 6 Kandungan asam lemak dari minyak jintan hitam didominasi oleh asam linoleat, asam oleat, dan asam palmitoleat. Perbandingan antara asam linoleat dan asam oleat lebih besar dari 2:1. Perbandingan antara asam linoleat dan asam oleat pada minyak jagung dan minyak kedelai dilaporkan juga memiliki perbandingan yang lebih besar dari 2:1 (Rouhou et al. 2007). Tabel 2. Komposisi Asam Lemak Minyak Jintan Hitam Asam Lemak Jumlah Myristic C14:0 0.35 ± 0.02 Myristoleic C14:1 Sedikit Palmitic C16:0 17.2 ± 0.15 Palmitoleic C16:1 1.15 ± 0.05 Margaric C17:0 Sedikit Margaroleic C17:1 Sedikit Stearic C18:0 2.84 ± 0.08 Oleic C18:1 25.0 ± 0.24 Linoleic C18:2 50.31 ± 0.25 Arachidic C20:0 0.14 ± 0.02 Eicosenoic C20:1 0.32 ± 0.04 Behenic C22:0 1.98 ± 0.08 Lignoceric C24:0 Sedikit Sumber: Rouhou et al. (2007) Jintan hitam diketahui memiliki berbagai macam khasiat antara lain anti bakteri, anti jamur, anti kanker, antioksidan, antiparasit, analgesik, anti koagulan dan juga agen hipoglikemik (Salama 2010). Aktivitas antimikroba jintan hitam berasal dari kandungan zat aktifnya yaitu thymoquinone dan longifolene. Dalam sebuah penelitian disebutkan bahwa thymoquinone dan longifolene mempunyai efek antibakteri terhadap S. aureus dengn nilai IC50 1,8µM (0,3µg/ml) dan 3,0 µM (0,6 µg/ml) (Bourgou et al. 2010). Thymoquinone mempunyai aktivitas antibakteri yang tinggi terhadap bakteri gram positif. Thymoquinone juga dilaporkan mempunyai efek sinergi dengan streptomycin dan gentamycin. Cahieb et al. (2011) menguji kemampuan thymoquinone secara in vitro dalam melawan bakteri dengan bakteri patogen yang ada pada manusia. Hasil dari percobaan tersebut dapat dilihat pada Tabel 3. 7 Tabel 3. Aktivitas Antimikroba Thymoquinone dibandingkan Gentamycin dan Erythromycin terhadap Bakteri Patogen pada Manusia Strain Bakteri batang gram negatif Escherichi coli ATCC 35218 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 Vibrio alginolyticus ATCC 33787 Vibrio paraheamolyticus ATCC 17802 Gram positive bacilli Bacillus cereus ATCC 14579 Listeria monocytogene ATCC 19115 Gram positive cocci Enterococcus faecalis ATCC 29212 Micrococcus luteus NCIMB 8166 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus epidermidis CIP 106510 a b Antimicrobial susceptibility Gentamycin Erythromycin Thymoquinone (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) a b MIC MBC aMIC bMBC aMIC bMBC 8 2 16 4 32 256 64 >256 >512 >512 >512 >512 2 32 8 8 64 16 >256 >256 128 >256 >256 256 >512 256 32 >512 >512 64 4 2 8 4 8 1 16 4 8 16 8 32 32 64 256 >256 32 64 2 16 4 8 32 8 4 16 16 16 32 32 8 8 8 64 16 8 Minimum Inhibitory Concentration Minimum Bactericidal Concentration Sumber: Chaieb et al (2011) Selain memiliki aktivitas antimikroba, jintan hitam juga diketahui memiliki aktivitas antifungi dan antihelmintika. Biji jintan hitam berkhasiat sebagai obat cacing (Hutapea 1994). Ela (2002) meneliti tentang efek ekstrak jintan hitam terhadap tikus yang mengalami schistosomiasis. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa thymoquinone yang merupakan kandungan dari jintan hitam memberikan efek mencegah aberasi kromosom pada mencit yang diinfeksi schistomiasis. Thymoquinone yang merupakan bahan yang terdapat pada jintan hitam juga dilaporkan memiliki efek protektif terhadap aberasi kromosom. Ekstrak jintan hitam juga mempunyai efek inhibisi terhadap khamir patogen Candida albican (Salama 2010). Jintan hitam di Arab Saudi biasanya digunakan sebagai obat untuk penyakit asma (Salama 2010). Penelitian yang dilakukan oleh Boskabady et al. (2007) menunjukkan bahwa jintan hitam memiliki efek pencegahan pada pasien penderita asma. Efek protektif dan kuratif terhadap penyakit asma diduga berasal dari efek anti histamin yang dimiliki oleh jintan hitam. Dalam penelitian yang lain Boskabady et al. (2008) menyatakan bahwa jintan hitam juga memberikan efek 8 protektif pada paru-paru marmut yang dipapar gas berbahaya yaitu sulfur mustard. Ramadhan (2011) menggunakan mencit untuk menguji efek analgesik jintan hitam. Mencit jantan yang terlebih dahulu diberi minyak jintan hitam lebih tahan terhadap rasa sakit yang disebabkan oleh asam asetat dibandingkan mencit jantan pada kelompok kontrol. Mencit betina mempunyai mekanisme yang berbeda dengan mencit jantan dalam merespon rasa sakit yang ditimbulkan oleh asam asetat. Namun demikian pemberian minyak jintan hitam juga menunjukkan efek yang sama dengan yang ditimbulkan pada mencit jantan. Efek analgesik jintan hitam berasal dari kandungan aktif jintan hitam yaitu thymoquinone. Efek antiinflamasi juga ditunjukkan oleh jintan hitam. Borgou et al. (2010) menguji efek antiinflamasi jintan hitam dengan mengukur kemampuan jintan hitam dalam menghambat pembentukan NO (nitrat oksida). NO merupakan radikal bebas yang dihasilkan oleh jaringan tubuh. NO bisa dijadikan indikator keadaan patologis beberapa jenis inflamasi. Thymoquinone terbukti sebagai bahan aktif jintan hitam yang mampu menghambat pembentukan NO. Seperti yang disebutkan di atas, jintan hitam juga memiliki efek antioksidan. Antioksidan berfungsi dalam menangkal radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan pada sel. Jintan hitam terbukti dapat menurunkan produksi ROS (reactive oxygen species) yang dapat merusak sel. Efek antioksidan dari jintan hitam berasal dari thymoquinone (Borgou et al. 2010). Boskabady et al. (2007) dalam penelitiannya mengamati efek jintan terhadap pasien penyakit asma. Dalam penelitian tersebut disimpulkan bahwa jintan hitam memiliki efek preventif terhadap asma. Terjadi peningkatan nilai PFT (Pulmonary Function Test) pada kelompok pasien asma yang diberi jintan hitam. Respon alergi merupakan salah satu penyebab penyakit asma. Jintan hitam dilaporkan dalam beberapa uji in vivo dilaporkan tidak memiliki efek samping. Hal ini tentu sangat membantu pengobatan asma tanpa menimbulkan alergi. Selain itu jintan hitam juga diketahui memiliki efek hepatoprotektif yang akan mendukung proses penyembuhan penyakit asma (Boskabady et al. 2007). 9 2.2 Madu Madu merupakan zat manis alami yang dihasilkan oleh lebah. Bahan baku madu adalah nektar. Nektar adalah senyawa kompleks yang dihasilkan oleh kelenjar tanaman dalam bentuk larutan gula. Perubahan nektar menjadi madu dimulai ketika lebah pekerja membawa nektar ke sarangnya. Untuk menghasilkan 1 kg madu, lebah harus mengumpulkan 120.000-150.000 tetes nektar atau 3-4 kg nektar dengan menempuh jarak 360.000-450.000 Km (Sarwono 2001). Berdasarkan asal nektarnya, madu dapat digolongkan menjadi tiga golongan yaitu madu flora, madu ekstra flora dan madu embun. Madu flora adalah madu yang bahan bakunya berasal dari bunga. Disebut madu monoflora jika hanya berasal dari satu jenis bunga dan poliflora jika berasal dari berbagai macam bunga. Madu ekstraflora adalah madu yang berasal dari luar daun, misalnya batang, cabang atau daun tanaman. Sedangkan madu embun adalah madu yang dihasilkan dari hasil suksesi serangga yang kemudian eksudatnya diambil oleh lebah madu (Sarwono 2001). Sejak zaman mesir kuno 2600 SM madu sudah dikenal sebagai obat. Diantaranya madu digunakan sebagai salep antiseptik untuk mengobati luka oleh bangsa Yunani, Romawi, Assyiria, dan Cina kuno. Madu juga dapat mencegah pertumbuhan mikroba seperti Salmonella, Shigella, E. Coli dan V. cholerae yang dapat menyebabkan diare. Apabila kandungan gula pada madu dihilangkan, maka madu mempunyai khasiat yang sama dengan streptomycin dalam membunuh bakteri (Sarwono 2001). Selain itu, madu juga mempunyai efek anti aritmia akibat keracunan katekolamin. Efek anti aritmia ini berasal dari aktivitas hiperadrenergik yang dimiliki oleh madu (Hussein 2003). Madu juga mempunyai efek protektif terhadap hati. Pada suatu penelitian dibuktikan bahwa madu mempunyai efek protektif terhadap kerusakan hati yang disebabkan oleh karbon tetraklorida (CCl4). Kerusakan hati akibat CCl4 dapat menyebabkan penurunan berat badan, penurunan asupan makanan serta penurunan bobot hati dan ginjal (El Denshary et al. 2011). 10 Tabel 4. Komposisi Kimia Madu per 100 gr Komposisi Kalori Kadar Air Protein Karbohidrat Jumlah 328 kal 17,2 g 0,5 g 82,4 g Sumber: Suranto (2004) Selain memiliki kandungan gula, madu juga memiliki kandungan nutrisi lain yang penting bagi tubuh. Madu mengandung garam mineral, protein, lemak, dan vitamin A, vitamin B dan vitamin C. Dalam 100 gr madu terkandung 294 kalori, 9,5 g karbohidrat, 24 g air, 16 mg fosfor, 5 mg kalsium dan 4 mg vitamin C (Sarwono 2001). 2.3 Mencit Klasifikasi mencit putih Arrington (1972): Kingdom : Animalia Filum : Chordata Kelas : Mamalia Ordo : Rodentia Family : Muridae Genus : Mus Species : Mus musculus Mencit merupakan hewan jinak, lemah, mudah ditangani, takut cahaya dan aktif pada malam hari. Mencit yang dipelihara sendiri makannya lebih sedikit dan bobot badan lebih ringan daripada yang dipelihara bersama-sama dalam satu kandang. Beberapa mencit mempunyai sifat kanibal (Penn 1999). Mencit bersifat sosial, aktif, dan cerdas. Memiliki kemampuan beradaptasi, ukuran yang kecil, reproduksi cepat dan karakteristik genetik yang luas juga menambah nilai tikus dan mencit sebagai hewan percobaan. 11 Gambar 2. Mencit (Mus musculus) Sumber: Sancheti 2011 Banyak strain berbeda dari mencit laboratorium yang telah dikembangkan oleh ahli genetik, beberapa strain seperti swiss webster dikembangkan secara outbreed, sementara beberapa strain lain seperti DDY, Balb/c, DBA, dan BC dikembangkan secara inbreed dengan gen-gen yang homozigot (Penn 1999). Tabel 5. Data Dasar Fisiologis Mencit Berat Dewasa Jantan Betina Berat Lahir Masa Kebuntingan Masa Hidup Suhu Tubuh Konsumsi Pakan Konsumsi Air Hemoglobin Rataan Kisaran Hematokrit Eritrosit Rataan Kisaran Limfosit Rataan Kisaran Sumber: Arrington (1972) 20-40 gr 18-35 gr 1,0-1,5 gr 18-21 hari 1-2 tahun 37,4 0C 4-5 gr/100 gr BB/ hari 4-7 gr/ 100 gr BB/ hari 14,8 gr% 10-19 gr% 41,5 % 9,3 x 106/µL 7,7-12,5 x 106/µL 8 x 103/ µL 4-12 x 103/ µL Mencit mempunyai lama hidup sekitar satu hingga dua tahun. Bahkan beberapa bisa mencapai usia tiga tahun dengan lama masa produktif selama sembilan bulan. Mencit mencapai dewasa kelamin pada usia 35 hari dan setalah usia delapan minggu, mencit sudah dapat dikawinkan. Pencapaian pubertas dan 12 siklus estrus dipengaruhi oleh paparan pheromon. Lama kebuntingan mencit adalah 18-21 hari dengan jumlah anak rata-rata enam ekor. Kebuntingan dapat diketahui pada hari ke 14 dengan cara palpasi, peningkatan bobot badan, dan perkembangan kelenjar mamae. Bobot badan mencit jantan dewasa adalah 20-40 gr dan bobot badan mencit betina dewasa adalah 18-35 gr. Mencit dapat dipelihara pada kotak dengan berbagai macam bahan seperti plastik (polipropilen atau polikarbonat), aluminium atau baja tahan karat (Smith & Mangkoewidjaja 1988). Biasanya mencit jantan mempunyai ukuran yang lebih besar dibandingkan dengan betina. Mencit memiliki kelenjar Harderian yang memproduksi pigmen porfirin yang dapat teramati di sekitar mata ketika hewan mengalami stress atau sedang sakit. Mencit tidak bisa muntah dan tidak memiliki kantung empedu. Mencit albino mengalami degenerasi retina dan memiliki kemampuan penglihatan yang lemah (Kahn 2010). 2.4 Organ sistem pernafasan mencit 2.4.1 Saluran nafas Secara sederhana fungsi utama sistem pernafasan adalah membawa oksigen (O2) masuk ke dalam tubuh dan membuang karbon dioksida (CO2) keluar dari tubuh. Semua organ yang terkait dengan pernafasan mempunyai tugas untuk mendukung fungsi tersebut. Oksigen dibutuhkan untuk proses metabolisme tubuh. Sedangkan karbon dioksida merupakan limbah dari proses metabolisme tubuh. Proses pertukaran oksigen dan karbonsioksida disebut pernafasan. Pernafasan dapat dibagi menjadi pernafasan internal dan pernafasan eksternal. Pernafasan internal adalah pernafasan yang terjadi pada tingkat sel, sedangkan pernafasan eksternal adalah pernafasan yang terjadi pada paru-paru. Selain fungsi utama sebagai penyalur udara dan pertukaran gas, sistem respirasi juga memiliki fungsi tambahan yaitu menghasilkan suara, penciuman, pengaturan suhu tubuh, ekskresi, keseimbangan asam basa dan tekanan darah (Coville 2002). Struktur dari sistem pernafasan berdasarkan fungsinya dapat dibedakan menjadi tiga bagian yaitu komponen konduktif, komponen transisi dan komponen 13 pertukaran gas. Komponen konduktif memanjang dari rongga hidung sampai bronkhiol. Komponen konduktif mempunyai fungsi sebagai penyalur udara. Komponen transisi yaitu komponen yang berfungsi sebagai penyalur (konduksi) sekaligus sebagai tempat pertukaran gas. Komponen pertukaran gas sesuai dengan namanya mempunyai fungsi sebagai tempat bertukarnya gas oksigen dan karbon dioksida. Bagian-bagian yang termasuk dalam komponen pertukaran gas yaitu ductus alveolar, alveolar sac dan alveoli (Banks 1993). 2.4.1 Paru-paru Paru-paru mempunyai bentuk yang menyerupai kerucut. Umumnya pada hewan paru-paru terbagi pada beberapa bagian yang yang disebut lobus. Lobus ditandai dengan adanya percabangan bronkhus yang besar. Paru-paru merupakan organ yang ringan dan berbentuk seperti spons. Paru-paru belum berfungsi pada saat hewan masih berada dalam kandungan. Paru-paru fetus mempunyai konsistensi yang padat dan lebih mirip hati. Pada saat hewan dilahirkan dan melakukan pernafasan untuk pertama kalinya maka paru-paru akan mengembang. Surfaktan merupakan substansi yang dihasilkan oleh sel alveolar tipe II yang menjaga agar paru-paru tetap mengembang (Coville 2002). Paru-paru dapat digolongkan menjadi dua bagian besar, yang pertama adalah susunan bronkhial sedangkan yang kedua adalah alveoli. Susunan bronkhus terbentuk dari pertumbuhan dan diferensiasi usus depan, sedangkan alveolar terbentuk dari jaringan mesenkhim. Jaringan-jaringan ini sudah terbentuk sejak masa embrional (Coville 2002; Aspinall 2004) Fungsi utama paru-paru adalah pertukaran gas. Paru-paru bisa dikatakan sebagai gabungan dari kelenjar tubuloalveolar yang mengekskresikan CO2 dan menukarnya dengan O2. Pertukaran oksigen dan karbon dioksida pada paru-paru terjadi di alveoli. Alveoli berbentuk kantung dengan dinding yang tipis. Alveoli dikelilingi oleh jaring-jaring pembuluh darah kapiler. Dinding alveoli yang tipis serta dinding pembuluh darah kapiler yang juga tipis memungkinkan terjadinya pertukaran gas pada alveoli (Coville 2002). 14 2.4.2 Histologi Paru-paru Sel penyusun utama paru-paru adalah sel alveolar tipe I. Pada sel inilah terjadi pertukaran antara oksigen dan karbon dioksida. Sel ini merupakan sel yang berbentuk pipih. Inti dari sel alveolar tipe I menonjol ke dalam kantung alveol. Sel alveolar tipe I mempunyai fungsi sebagai tempat pertukaran oksigen dan karbon dioksida. Selain sel alveolar tipe I pada paru-paru juga terdapat sel alveolar tipe II dan otot polos. Sel alveolar tipe II merupakan sel sekretori. Pada mikroskop cahaya sel ini terlihat berbentuk bulat atau kubus. Sel alveolar tipe II mempunyai fungsi mengeluarkan sekreta yang disebut surfaktan. Surfaktan mempunyai fungsi untuk menjaga tegangan permukaan untuk mencegah kolapsnya paru-paru (Akers 2008). Gambar 3. Histologi normal paru-paru. BV menandakan pembuluh darah, AV menandakan saluran nafas dan EP menandakan Epitel. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber: Olmez et al. 2009) 2.4.3 Sistem Pertahanan pada Paru-paru Sistem pertahan pada paru-paru secara umum dapat dibagi menjadi sistem pertahanan spesifik dan sistem pertahanan non spesifik. Sistem pertahanan non spesifik terdiri silia, mukus yang dihasilkan, dan refleks batuk. Apabila sistem pertahanan non spesifik tidak mampu menangkal antigen yang masuk maka antigen akan berhadapan dengan sistem pertahanan spesifik. 15 Antibodi spesifik terdiri dari immunoglobulin yang dihasilkan oleh sel limfoid yang banyak tersebar pada saluran pernafasan. Sel-sel limfoid ini berupa limfosit yang tersebar secara acak. Pada saluran pernafasan bagian atas limfosit banyak menghasilkan IgA. Sedangkan pada bronkhiol dan alveoli sekreta yang dihasilkan lebih banyak mengandung IgG. IgA bertugas untuk mencegah penempelan antigen pada dinding saluran pernafasan sehingga antigen tidak bisa menimbulkan kerusakan yang lebih parah. Sedangkan IgG yang banyak dihasilkan pada alveoli dan bronkhioli bertugas ketika terjadi peradangan yang akut transudasi serum protein (Tizard 2008). Gambar 4. Mekanisme Sistem Pertahanan pada Paru-paru (Sumber: Bals 1999) Pada dinding alveol banyak sekali terdapat makrofag. Dalam menjalankan tugasnya makrofag bisa bersifat tetap (tidak berpindah tempat) atau bergerak. Karena makrofag dapat bergerak bebas maka makrofag bisa bekerja secara maksimal dalam membuang sisa antigen pada paru-paru. Makrofag yang bergerak ini dapat meninggalkan paru-paru karena terbawa oleh mukus ke arah laring atau menembus sel alveolar dan masuk ke dalam pembuluh limfe paru-paru (Akers 2008). Conrod (1989) dalam penelitiannya juga menyebutkan bahwa alveolar 16 makrofag merupakan sel yang utama yang melindungi paru-paru dari mikroba yang masuk ke dalam paru-paru. Alveolar makrofag membunuh mikroba baik dengan mekanisme oksidatif maupun non-oksidatif. Selain itu, alveolar makrofag juga mensekresikan faktor anti mikrobial termasuk lisozim, peptida dan transferrin yang memungkinkan alveolar makrofag membunuh mikroba secara ekstraselular. Selain berfungsi untuk membunuh mikroba yang masuk atau terhirup ke paru-paru, sekresi yang dikeluarkan alveolar makrofag juga berfungsi sebagai inisiasi proses peradangan untuk membasmi mikroba secara tuntas. Heitmann (1999) menggunakan mencit unuk mengamati karakteristik immunohistologi dari paru-paru mencit sehat dan melihat jenis sel radang pada paru-paru mencit saat peradangan akut terjadi. Dalam penelitiannya tersebut Heitmann menggunakan Haemophilus influenza tipe b (Hib) yang diberikan secara intratrakhea. Pada paru-paru mencit yang sehat populasi sel radang didominasi oleh sel T, dan sel CD4+. Saat peradangan akut terjadi, jumlah neutrofil pada jaringan parenkhim dan BALT meningkat. Peningkatan neutrofil terjadi pada satu jam pertama setelah infeksi bakteri dan kembali ke jumlah minimum dalam waktu satu minggu. 2.4.5 Perubahan Histopatologi Paru-Paru Pada Penderita Asma Asma didefiniskan sebagai peradangan kronis pada saluran pernafasan yang biasanya dihubungkan dengan kejadian peningkatan sel radang. Gejala klinis yang timbul adalah memendeknya nafas, batuk, sesak nafas, dan mengeluarkan bunyi yang khas saat bernafas (mengi) (Barrios et al. 2006). Olmez et al. 2009 dalam penelitiannya menyebutkan bahwa terjadi beberapa perubahan pada struktur histopatologi pada mencit yang digunakan sebagai model penyakit asma. Dalam penelitiannya tersebut Olmez et al. (2009) mengamati perubahan ketebalan membran basal, ketebalan otot polos subepitelial, ketebalan jaringan epitel, jumlah sel mast, dan jumlah sel goblet. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa pada mencit yang menderita asma terjadiperubahan ketebalan membran basal, ketebalan otot polos subepitelial, ketebalan jaringan epitel, jumlah sel mast, dan jumlah sel goblet. 17 Gambar 5. Perubahan yang terjadi pada jaringan paru-paru mencit model penyakit asma. Bagian yang ditunjuk oleh tanda panah adalah bagian epitel yang menebal. Bagian yang ditunjuk dengan tanda GC adalah peningkatan jumlah sel Goblet. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber Olmez et al. 2009) Gambar 6. Perubahan yang terjadi pada jaringan paru-paru mencit model penyakit asma. Bagian yang ditunjuk dengan tanda GC adalah peningkatan jumlah sel Goblet. Bagian yang ditandai dengan tanda elips menunjukkan infiltrasi sel mononuklear. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber Olmez et al. 2009). 18 Perubahan yang dapat diamati pada preparat histopatologi organ paru-paru yang menderita asma menurut Yamauchi (2006) terdapat pada beberapa bagian. Bagian yang pertama adalah bagian lumen saluran pernafasan. Pada penderita asma, saluran pernafasan akan berisi eksudat. Bagian yang kedua yang dapat diamati pada penderita asma adalah lapisan mukus pada bronkhus. Pada mukosa bronkhus juga terdapat eksudat. Selain eksudat juga terlihat kelainan sel-sel epitel pada mukosa bronkhus. Bagian terakhir adalah dinding bronkhus. Pada penderita asma, dinding bronkhus akan mengalami kelainan berupa hipertrofi otot polos. Emfisema dan asma biasanya dikelompokkan dalam satu kelompok yaitu chronic obstructive pulmonary dissease (COPD). Emfisema adalah perluasan ruangan alveol yang terjadi akibat kerusakan dinding alveol tetapi tanpa diikuti fibrosis. Berdasarkan lokasinya emfisema dapat dibedakan menjadi emfisema sentrilobular, emfisema pan-asinar dan emfisema lokal. Emfisema sentrilobular biasanya disebabkan oleh asap rokok. Emfisema jenis ini banyak sekali ditemui pada paru-paru perokok. Emfisema sentrilobular ditandai dengan emfisema yang terjadi di bronkhus terminal hingga ujung bronkhus. Berbeda dengan emfisema sentrilobular, pada emfisema pan-asinar, kerusakan dinding alveol tidak hanya terjadi di dekat bronkhus terminal, tetapi terjadi di seluruh bagian alveolar. Emfisema lokal adalah emfisema yang hanya terjadi pada daerah-daerah tertentu pada paru-paru, misalnya pada apeks paru-paru (Rubin 2009). 19 BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan. Pemeliharaan hewan coba dan pemberian perlakuan pada hewan coba dilakukan di fasilitas kandang hewan percobaan Bagian Patologi, departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Sedangkan pembuatan preparat Histopatologi dilakukan di Laboratorium Histopatologi, Bagian Patologi, departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Dua belas ekor mencit jantan usia empat minggu 2. Obat-obatan untuk persiapan hewan percobaan sebelum dilakukan perlakuan seperti obat anthelmintik (Albendazole 5%), antibiotik (Clavamox®) dan anti protozoa (Flagyl®). 3. Minyak jintan hitam dan kombinasi minyak jintan hitam dengan madu (sediaan komersial). 4. Kebutuhan mencit seperti pakan dan air minum. 5. Bahan-bahan yang dperlukan untuk keperluan nekropsi dan pengambilan sampel organ seperti kertas tisu, ether, buffered neutral formaline (BNF) 10%, xylol, alkohol, alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, parafin, Mayer’s hematoksilin, lithium karbonat, eosin, larutan albumin, air hangat dengan suhu 45°C, larutan periodic acid 1%, schiff reagent, sodium bisulfit 10%, 1 N HCl dan aquadest. 20 Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1. Alat yang dibutuhkan dalam pemeliharaan mencit berupa boks yang dimodifikasi menjadi kandang, timbangan digital, sonde lambung, dan syringe 1 ml. 2. Alat-alat nekropsi berupa skalpel, gunting pinset dan pot plastik. 3. Alat pembuatan preparat histologi seperti tissue basket, gelas objek, cover glass, spidol, label, tissue cassette, Sakura® automatic tissue processor, Sakura® tissue embedding console, inkubator, dan mikrotom. 4. Mikroskop cahaya dan digital electronic eyepiece camera serta satu unit komputer untuk pengambilan foto preparat histologi. 5. Perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows® untuk penghitungan sel. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Persiapan Hewan Coba Penelitian ini menggunakan dua belas ekor mencit jantan berusia empat minggu. Mencit dipelihara dalam sebuah boks plastik dengan alas kain selama dua bulan. Penggunaan kain dimaksudkan untuk mengurangi resiko yang ditimbulkan akibat debu apabila menggunakan alas sekam atau serbuk gergaji. Sebelum diberikan perlakuan terlebih dahulu dilakukan adaptasi dengan mengistirahatkan mencit selama dua hari. Setelah dilakukan adaptasi mencit diberikan antibiotik, antijamur dan obat cacing untuk menetralkan infeksi. Antibiotik yang digunakan adalah Clavamox® yang berisi kombinasi amoxicillin dan asam clavulanat. Dosis antibiotik yang diberikan adalah 250 mg/ kg BB. Obat cacing yang diberikan adalah obat cacing jenis albendazole dengan konsentrasi 5% dengan dosis 10 mg/ kg BB. Selain itu juga diberikan obat anti protozoa yaitu Flagyl® 500mg yang memmiliki kandungan bahan aktif metronidazole. Pemberian dilakukan selama lima hari berturut-turut dengan dosis pemberian 30 mg/ kg BB. Setelah pemberian obat-obatan selesai dilanjutkan dengan perlakuan yang berlangsung selama dua bulan. 21 3.3.2 Kandang Hewan Coba Hewan coba dipelihara dalam sebuah boks plastik. Pada boks tersebut diletakkan wadah pakan dan wadah minum. Setiap hari dilakukan desinfeksi pada boks, wadah pakan, dan wadah minum menggunakan cairan desinfektan (Bayclin®). Agar hewan coba merasa nyaman maka pada boks diletakkan potongan kain kecil-kecil yang juga didesinfeksi menggunakan Bayclin® setiap hari. A B Gambar 7 Kandang Hewan coba. A Pengelompokan mencit berdasarkan perlakuan B Kandang mencit yang menggunakan alas kain 3.3.3 Pakan dan Minum Pemberian pakan dilakukan satu kali dalam satu hari dengan jumlah 5 gr/ekor/hari. Jumlah tersebut sudah melebihi jumlah kebutuhan pakan untuk satu ekor mencit per hari (Arrington 1972). Pemberian jumlah pakan yang berlebih bertujuan untuk mengantisipasi pakan yang terbuang ketika hewan coba berebut pakan. Pakan yang diberikan merupakan pakan khusus untuk mencit. Air minum diberikan secara ad libitum. Air yang digunakan merupakan air layak minum. 3.3.4 Kelompok Perlakuan Penelitian Penelitian ini menggunakan 12 ekor mencit jantan. Mencit tersebut dibagi menjadi empat kelompok. Masing masing kelompok terdiri dari 3 ekor mencit jantan. Kelompok yang pertama merupakan kelompok kontrol negatif (dicekok air 22 minum) selanjutnya disebut dengan kelompok kontrol, kelompok kedua diberi perlakuan dengan dicekok ekstrak minyak jintan hitam dengan dosis 0,1 ml/ekor/hari selanjutnya disebut dengan kelompok HS 0.1. Kelompok ketiga diberi perlakuan dengan dicekok ekstrak minyak jintan hitam dengan dosis 0,2 ml/ekor/hari selanjutnya disebut dengan kelompok HS 0.2. Kelompok keempat diberi perlakuan dengan dicekok sediaan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dengan madu dengan perbandingan 1:20, selanjutnya disebut dengan kelompok HS-Madu. Dosis sediaan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dengan madu yang diberikan adalah 0,3 ml/ekor/hari (jumlah madu = 0,285 ml, jumlah ekstrak minyak jintan hitam = 0,015 ml). Dosis yang digunakan merupakan konversi dari dosis yang biasa digunakan pada manusia. Pemberian perlakuan ini dilakukan setiap hari selama dua bulan. 3.3.5 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ Setelah masa perlakuan selesai hewan coba dimatikan dengan cara dislokasio atlanto-occipitalis. Hewan kemudian dinekropsi untuk diambil sampel organ paru-parunya. Organ ini kemudian akan diproses menjadi preparat histopatologi yang kemudian akan diamati perubahan histopatologinya. Dari perubahan histopatologi organ tersebut dapat diketahui efek yang ditimbulkan oleh ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa). Segera setelah dilakukan pengambilan, sampel organ langsung difiksasi ke dalam Buffer Neutral Formalin (BNF) 10%. Fiksasi ini dimaksudkan untuk mencegah kerusakan jaringan karena proses pembusukan. 3.3.6 Pembuatan Sediaan Histopatologi Sampel organ yang telah difiksasi dalam cairan BNF 10% kemudian ditrimming dan dimasukkan dalam tissue basket dan kembali difiksasi dalam cairan BNF 10%. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan cara merendam sampel organ secara berturut-turut dalam larutan alkohol konsentrasi bertingkat 70%, 80%, 90%, alkohol absolut dua kali ulangan, silol dua kali ulangan, dan parafin dua kali ulangan. Perendaman pada masing-masing larutan dilakukan selama dua 23 jam. Perendaman dilakukan secara otomatis dengan menggunakan alat Sakura® tissue processor selama satu malam. Setelah melalui serangkaian proses di atas, potongan organ dimasukkan kedalam alat pencetak yang berisi parafin cair (Sakura® tissue embedding console). Letak potongan ditahan agar posisi potongan organ tetap berada di tengah. Setelah mulai membeku, kembali ditambahkan parafin hingga alat pencetak penuh lalu parafin dibiarkan mengeras dan diberi label. Selanjutnya blok parafin yang berisi potongan organ dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5µm. Hasil potongan akan berbentuk pita (ribbon). Untuk menghilangkan lipatan akibat pemotongan pada pita, pita diletakkan di atas permukaan air hangat (450C). Sediaan diangkat dari permukaan air dengan menggunakan gelas objek yang sebelumnya telah dilapisi dengan larutan albumin sebagai perekat. Selanjutnya sediaan dikeringkan pada suhu 600C selama satu malam. Selanjutnya preparat dimasukkan ke dalam larutan silol untuk dideparafinasi sebanyak dua kali. Setelah proses deparafinasi dilakukan proses rehidrasi. Proses rehidrasi diawali dengan mencelupkan preparat ke dalam larutan alkohol absolut sampai larutan alkohol 80%. Pencelupan pada masing-masing larutan dilakukan selama dua menit. Setelah melalui proses rehidrasi preparat dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 3.3.7 Pewarnaan Sediaan Histopatologi Proses selanjutnya adalah proses pewarnaan sediaan histopatologi. Pada penelitian ini dilakukan dua pewarnaan yaitu pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE) dan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS). Pewarnaan HE dilakukan agar perubahan-perubahan umum yang terjadi pada jaringan dapat diamati. Pewarnaan PAS dilakukan agar perubahan pada sel goblet dapat terlihat. Pewarnaan hematoksilin dilakukan lebih dulu dan dilanjutkan dengan pewarnaan eosin. Pewarnaan hematoksilin dilakukan dengan menggunakan pewarna Mayer’s Hematoksilin selama delapan menit, kemudian dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan 24 air, dan diwarnai dengan pewarna eosin selama 2 menit. Selanjutnya sediaan dicuci dengan menggunakan air mengalir untuk menghilangkan pewarna eosin yang berlebih sebelum akhirnya diangkat dan dikeringkan. Setelah sediaan kering, sediaan dicelupkan ke dalam alkohol 90% sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut I sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, silol dua kali ulangan masing-masing selama dua menit. Setelah itu sediaan ditetesi perekat permount dan kemudian ditutup dengan gelas penutup (cover glass) dan dibiarkan kering. Setelah itu sediaan dapat diamati dengan mikroskop cahaya. Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) merupakan pewarnaan khusus. Sediaan yang sudah dideparafinasi digenangi dengan periodic acid 1% selama 10 menit. Periodic acid 1% yang digunakan harus dalam keadaan segar atau baru dibuat. Setelah digenangi dengan periodic acid 1% sediaan dicuci dengan akuades. Sediaan digenangi kembali dengan Schiff reagent selama 20 menit kemudian dibilas dengan air sulfit sebanyak tiga kali. Setelah itu sediaan dicuci dengan air mengalir dan bilas menggunakan akuades. Setelah sediaan dibilas dengan akuades dilakukan proses dehidrasi dan sediaan ditutup dengan menggunakan cover glass dan diamati menggunakan mikroskop cahaya. 3.3.7 Pengamatan Sediaan Histopatologi Pengamatan sediaan histopatologi dilakukan dengan mikroskop cahaya dan dibantu dengan menggunakan alat digital electronic eyepiece camera yang terhubung dengan komputer. Pengamatan ini bertujuan untuk melihat perubahan histopatologi yang terjadi pada organ paru-paru. Pengamatan dilakukan baik terhadap saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru maupun jaringan parenkhim paru-paru. Pembesaran yang digunakan disesuaikan dengan keadaan preparat agar pengamatan dapat dilakukan dengan optimal. Pengamatan terhadap saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru dilakukan dengan menghitung jumlah saluran pernafasan (bronkhus dan bronkhioli) yang dapat terlihat pada lapang pandang 6,32 mm2 semua preparat histopatologi serta mengamati perubahan-perubahan yang terjadi. Perubahan pada 25 saluran nafas yang diamati adalah perubahan epitel dan hadirnya cairan pada saluran nafas serta penghitungan jumlah sel goblet sepanjang 1000 µm, pada 5 lapang pandang. Khusus untuk penghitungan sel goblet digunakan pewarnaan khusus yaitu pewarnaan PAS. Pengamatan keadaan bronkhus associate lymphoid tissue (BALT) pada saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru. Pengamatan meliputi jumlah, diameter dan kepadatan sel limfoid. Selain itu juga diamati perubahan ketebalan yang terjadi pada jaringan otot polos di sekitar saluran nafas (Pembesaran mikroskop yang digunakan pada pengamatan perubahan epitel pada saluran nafas serta penghitungan jumlah saluran pernafasan maupun pengamatan BALT adalah 4 X 10. Sedangkan untuk penghitungan sel goblet digunakan pembesaran 40 X 10. Perubahan jaringan parenkhim paru-paru yang diamati adalah emfisema, fokus-fokus radang, serta keadaan kongesti maupun hemoragi. Pembesaran yang digunakan pada pengamatan emphisema organ paru-paru adalah 40 X 10. Pengamatan terhadap fokus-fokus radang dilakukan dengan mengukur luas wilayah radang dibandingkan dengan luas lapang pandang. Selain luas wilayah radang juga diamati jenis-jenis sel radang yang terdapat pada fokus-fokus radang. Pengamatan terhadap fokus-fokus radang menggunakan pembesaran 40 X 10. Pengamatan keadaan kongesti dan hemoragi dilakukan dengan pembesaran 20 X 10. Pengamatan jaringan otot polos pada saluran pernafasan menggunakan pewarnaan HE dan diamati pada pembesaran 4 X 10. Pengamatan perubahanperubahan histopatologi yaitu ketebalan otot polos yang terjadi dibantu perangkat lunak ImageJ. Penggunaan perangkat lunak ini bertujuan untuk memudahkan pengamatan dan pengukuran. Hasil dari pengamatan ini merupakan indikator yang bisa menggambarkan efek yang ditimbulkan oleh jintan hitam serta kombinasi jintan hitam dan madu. 3.3.8 Analisis Statistik Hasil pengamatan berupa peruahan-perubahan yang terjadi pada saluran nafas, jumlah sel goblet pada saluran nafas, perubahan yang terjadi pada BALT, 26 jenis sel radang pada fokus-fokus radang, perubahan pada jaringan otot, dan perubahan-perubahan lain berupa emfisema, kongesti dan hemoragi. Hasil pengamatan kemudian dianalisa secara statistik menggunakan metode One Way ANOVA dan uji lanjut Duncan untuk melihat perbedaan yang nyata antar kelompok perlakuan. 27 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh pemberian ekstrak jintan hitam terhadap fungsi pernafasan dapat dipelajari dari gambaran histopatologi organ paru-paru dengan adanya perubahanperubahan yang terjadi pada jaringan organ tersebut. Perubahan pada paru-paru dilihat dengan mengamati sistem saluran pernafasan, bronkhus, bronkhiolus dan jaringan parenkhim paru-paru yaitu alveol. Pada penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap bronkhus dan bronkhiolus meliputi adanya eksudat pada saluran nafas, dan jumlah sel goblet pada bronkhiolus. Selain itu juga dilakukan pengamatan terhadap ketebalan otot polos di sekitar bronkhus. Pengamatan terhadap Bronchial Associated Lymphoid Tissue (BALT) meliputi luas fokus BALT pada bronkhus serta kepadatan sel BALT tersebut. Pengamatan terhadap jaringan parenkhim paru-paru meliputi pengamatan terhadap keadaan kongesti dan hemoragi serta pengamatan terhadap fokus-fokus radang. Selain itu juga dilakukan pengamatan terhadap emfisema. 4.1 Eksudat pada bronkhus dan bronkhiolus Pengamatan terhadap adanya eksudat di saluran nafas yaitu bronkhus dan bronkhiolus dilakukan pada perbesaran 10x10. Pengamatan dilakukan pada semua bronkhus dan bronkhiolus pada jaringan paru di seluruh sediaan. Perhitungan dilakukan dengan membagi jumlah bronkhus dan bronkhiolus yang lumennya berisi eksudat dengan jumlah bronkhus dan bronkhiolus yang ditemukan secara keseluruhan pada semua bidang sayatan sediaan. Hasil pengamatan terhadap bronkhus dan bronkhiolus disajikan pada tabel 8. Tabel 8 Persentase bronkhus dan bronkhiolus yang bereksudat pada mencit yang diberi perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Persentase bronkhus yang Persentase bronkhiolus bereksudat (%) yang bereksudat (%) a Kontrol 4.77±0.29 4.68±0.00a HS 0.1 4.74±0.23a 4.60±0.10a a HS 0.2 4.93±0.07 4.67± 0.00a HS-Madu 4.74±0.14a 4.60±0.13a Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan pada taraf p<0.05 28 Pengamatan terhadap saluran nafas baik bronkhus dan bronkhiolus menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan tidak ditemukan adanya tanda-tanda udema pulmonum serta peradangan pada bronkhus maupun bronkhiolus. Adanya eksudat atau cairan dalam saluran pernafasan merupakan indikasi adanya udema pulmonum, aktivasi sel goblet pada epitel penutup saluran pernafasan akibat bronkhitis dan bronkhiolitis (Mc Gavin 2007). Secara umum eksudat yang ditemukan pada bronkhus dan bronkhiolus hanya dalam jumlah yang kecil (terlihat pada gambar 8). Eksudat dalam jumlah yang kecil bisa disebabkan karena proses fisiologis seperti adanya regenerasi epitel permukaan lumen saluran nafas atau mukus pada saluran nafas (Akers 2008). Permukaan saluran nafas adalah salah satu pintu masuk patogen ke dalam sistem pernafasan. Permukaan saluran pernafasan mempunyai sistem pertahanan yang terdiri dari mukus, lysozim, immunoglobulin dan mukosiliari. Mukus adalah campuran kompleks dari air, glikoprotein, imunoglobulin, lipid dan elektrolit. Mukus dihasilkan oleh sel goblet, sel serous, kelenjar submukosa dan cairan dari proses transport air dan ion. Mukus pada saluran nafas berfungsi sebagai pertahanan pada permukaan saluran nafas. Mukus akan mengikat partikel-partikel yang terbawa oleh udara pernafasan. Mukus juga mempunyai kemampuan untuk menetralkan gas-gas yang terdapat pada udara pernafasan (Mc Gavin 2007). Selain mukus, pada saluran nafas juga terdapat liozim dan antibodi. Lisozim merupakan bahan anti mikrobial yang berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang terbawa oleh udara pernafasan. Lisozim berupa enzim yang dapat membunuh mikroba. Immunoglobulin (Ig) merupakan protein yang mempunyai aktifitas sebagai antibodi. Immunoglobulin yang terdapat pada mukosa saluran nafas bagian atas adalah immunoglobulin A (IgA). IgA tidak bersifat bakterisidal walaupun IgA mempunyai kemampuan untuk menetralkan beberapa virus dan enzim bakteri tertentu. IgA diproduksi pada sel plasma pada saluran intestinal, kemudian didistribusikan ke saluran respirasi dan kelenjar mamae. IgA berperan untuk menghambat perlekatan pada mukosa (Tizard 1982). Mukosiliari berfungsi untuk membuang gas dan partikel yang menempel pada mukus saluran nafas. Mukosiliari berperan sebagai pertahanan utama pada 29 permukaan saluran nafas. Sistem pertahanan mukosiliari berupa selimut mukosiliari yang akan bergerak secara cepat dan bergelombang untuk mengeluarkan partikel keluar dari saluran pernafasan. Mukosiliari juga mencegah masuknya gas berbahaya kedalam paru-paru dengan cara mengencerkannya (McGavin 2007). Peningkatan produksi mukus pada saluran pernafasan dapat dipicu oleh adanya proses peradangan. Jintan hitam diketahui memiliki khasiat sebagai anti radang. Bahan aktif yang terkandung dalam jintan hitam yaitu thymoquinone dapat menghambat terbentuknya mediator inflamasi yaitu asam arachidonat. Thymoquinone terbukti dapat menghambat pembentukan cyclooxigenase dan 5cyclooxigenase dalam proses sintesa asam arachidonat (Houghton et al. 1995). Adanya aktivitas anti radang ini diduga berpengaruh terhadap eksudat yang terdapat pada saluran nafas mencit. Selain aktivitas anti radang, jintan hitam dan madu juga mempunyai aktivitas anti bakteri yang bisa menurunkan resiko terjadinya peradangan oleh bakteri (Estevinho 2008 dan Chaieb et al. 2011). Gambaran histopatologi eksudat pada saluran nafas dapat dilihat pada gambar 8. Gambar 8 Gambaran histopatologi bronkhus yang bereksudat sedikit (tanda panah). Pewarnaan HE perbesaran 4x10. Gambar histopatologi diambil dari kelompok mencit kelompok kontrol 30 4.2 Sel Goblet pada Bronkhiolus Sel goblet merupakan sel yang menghasilkan mukus pada saluran pernafasan. Sel goblet mempunyai inti yang terletak di bagian dasar sel. Tekanan dari mukus yang dihasilkan oleh sel goblet membuat inti sel ini terletak di bagian dasar sel. Organel sel pada sel goblet seperti organel sel pada umumnya, terdapat badan golgi, rER dan mitokondria. Pada umumnya, sel goblet mensekresikan yang berupa glikoprotein sulfat sebagai komponen utama dari mukus (Dellmann 1998). Keadaan sel goblet diamati pada perbesaran 40x10, pengamatan dilakukan pada deretan epitel bronkhiolus. Sel goblet dibedakan dengan sel epitel menggunakan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS). Pewarnaan PAS akan mewarnai mukus yang dihasilkan oleh sel goblet (Aughey 2001). Penghitungan sel goblet dilakukan pada deretan epitel sekeliling lumen bronkhiolus, kemudian ukuran keliling lumen bronkhiolus diukur menggunakan perangkat lunak image J. Sediaan histopatolgi dihitung dihitung pada 5 lapang pandang pengamatan dengan menggunakan perbesaran 40x 10. Hasil penghitungan terhadap sel goblet dapat dilihat pada tabel 9. Data disajikan dalam satuan sel goblet per 1000 m. Tabel 9 Jumlah Sel Goblet Pada Bronkhiolus Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Jumlah Sel Goblet (/1000 µm) Kontrol 19.47 ± 17.33a 39.47 ± 29.81b HS 0.1 HS 0.2 15.60 ± 16.04a HS-Madu 13.40 ± 9.88a Keterangan: Huruf superscript pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Kelompok HS 0.1 menunjukkan rata-rata jumlah sel goblet tertinggi. Tingginya jumlah sel goblet pada kelompok HS 0.1 dapat disebabkan karena dosis jintan hitam yang diberikan (0.1 ml/ekor/hari) belum cukup untuk memberikan efek perlindungan terhadap saluran nafas. Hal ini dibuktikan dengan hasil yang ditunjukkan oleh kelompok dengan dosis yang lebih tinggi (kelompok HS 0.2 dengan dosis 0.2 ml/ekor/hari) yang menunjukkan jumlah sel goblet yang lebih rendah. Tingginya jumlah sel goblet pada kelompok HS 0.1 bisa juga disebabkan karena adanya kejadian infeksi. Mencit yang digunakan dalam penelitian ini sudah diberikan masa adaptasi terlebih dahulu namun tidak menutup 31 kemungkinan terjadi infeksi atau iritasi yang disebabkan oleh agen-agen yang terbawa udara pernafasan karena udara yang masuk adalah udara bebas. Adanya perbedaan respon individu juga menyebabkan kelompok HS 0.1 menunjukkan hasil jumlah sel goblet yang lebih tinggi dibandingkan kelompok lainnya. Aktivasi sel goblet mempunyai hubungan dengan kejadian peradangan yang terjadi pada saluran nafas dan paru-paru. Penelitian yang dilakukan oleh Saetta dan Turato (2000) menunjukkan bahwa jumlah sel goblet dan sel radang meningkat berbanding lurus pada individu perokok. Infiltrasi sel radang akan menyebabkan peningkatan aktivasi sel goblet dan produksi mukus yang menyebabkan terjadinya gangguan seperti obstruksi saluran nafas. Jumlah sel goblet akan meningkat apabila terjadi peradangan. Perbedaan jumlah sel goblet pada kelompok yang diberi perlakuan dipengaruhi oleh aktifitas antiinflamasi bahan aktif yang terkandung dalam jintan hitam yaitu thymoquinon. Aktifitas anti inflamasi jintan hitam berasal dari kemampuan thymoquinone dalam menghambat pembentukan eicosanoid. Thymoquinone bekerja dengan cara menghambat cyclooxigenase dan 5-lipooxygenase dari metabolisme asam arachidonat (Houghton et al. 1995). Penelitian yang dilakukan oleh Rostika (2012) pada saluran pencernaan mencit yang diberi perlakuan jintan hitam dan kombinasi jintan hitam dan madu juga menunjukkan penurunan jumlah sel goblet yang berarti dapat memberikan efek yang baik bagi saluran pernafasan. El Gazzar et al. (2006) meneliti efek pemberian thymoquinone dari jintan hitam pada tikus yang menderita peradangan saluran nafas. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa thymoquinone secara signifikan dapat menghambat radang paru-paru yang dinduksi alergen eosinofilik serta penurunan sel goblet. Gambaran histopatologi sel goblet saluran pernafasan mencit dari masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada gambar 9. 32 Kontrol HS 0.2 HS 0.1 HS Madu Gambar 9. Gambaran histopatologi sel goblet dengan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) perbesaran 40X10. Sel Goblet ditandai dengan tanda panah. 4.3 Bronchial-Associated Lymphoid Tissue (BALT) Bronchial-associated lymphoid tissue (BALT) termasuk ke dalam kelompok organ limfoid sekunder. Selain BALT ada juga GALT yaitu Gutassociated lymphoid tissue. BALT berisi sel-sel limfoid yang bertugas yang bertanggung jawab terhadap respon imun yang diperantarai sel (McGavin 2007). Mencit memiliki BALT yang lebih sedikit jika dibandingkan kelinci dan marmut (Cesta 2006). Pengamatan keberadaan BALT dilakukan dengan menghitung rata-rata luas fokus BALT yang terlihat di sekitar bronkhus dan bronkhiolus pada setiap lapang pandang. Selain keberadaan fokus BALT juga dihitung rataan kepadatan sel limfoid pada BALT. Penghitungan luas fokus BALT dilakukan pada pembesaran 4x10. Pengamatan terhadap kepadatan sel BALT dilakukan pada pembesaran 100 X 10. Hasil pengamatan terhadap keberadaan fokus BALT dan kepadatan sel BALT dapat dilihat pada tabel 10. 33 Tabel 10 Hasil Pengamatan BALT pada Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Rata-rata luas fokus BALT (µm2) 2.76 ± 0.53a 2.69 ± 0.49a 3.08 ± 0.08a 2.49 ± 0.59a Kepadatan sel limfoid pada fokus BALT (luas lapang pandang 1000 µm2) 4.68 ± 0.07ab 4.68 ± 0.06ab 4.76 ± 0.03b 4.64 ± 0.06a Keterangan: Huruf superscript pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Gambaran histopatologi BALT pada mencit kelompok kontrol dapat dilihat pada gambar 10. Gambar 10. Gambaran histopatologi keberadaan fokus BALT (tanda panah) disekitar bronkhioli dengan pewarnaan HE, perbesaran 4x10 Hasil pengamatan luas fokus BALT tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan namun kelompok kontrol menunjukkan kecenderungan hasil yang lebih tinggi dibandingkan kelompok perlakuan. Pengamatan terhadap kepadatan sel limfoid BALT menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok. Kelompok HS 0.2 menunjukkan rata-rata paling tinggi dibandingkan dengan kelompok yang lainnya. Tingginya kepadatan sel limfoid BALT pada kelompok HS 0.2 bisa disebabkan karena dosis yang diberikan sudah melewati dosis efektif untuk memberikan efek sebagai immunomodulator. 34 Kelompok yang diberi perlakuan jintan hitam dengan dosis jintan hitam 0,1 ml/ekor/hari (kelompok HS 0.1) dan kelompok yang diberi perlakuan kombinasi jintan hitam dan madu (HS Madu) menunjukkan kepadatan sel limfoid BALT yang lebih rendah. Gambar histopatologi yang menunjukkan kepadatan sel limfoid pada fokus BALT pada masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada gambar 11. Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS Madu Gambar 11. Gambaran mikroskopi kepadatan sel limfoid pada BALT dengan pewarnaan HE, perbesaran 100×10 dari masing-masing kelompok perlakuan. BALT akan membesar dan meningkat jumlah sel limfoidnya jika terjadi reaksi imun atau peradangan. Jintan hitam diketahui mempunyai efek sebagai immunomodulator. Pemberian jintan hitam dapat meningkatkan rasio antara sel Thelper (T4) dan sel T-supressor (T8). Selain itu pemberian jintan hitam juga meningkatkan aktivitas sel natural killer (Omar et al. 1999). Selain itu jintan hitam juga diketahui dapat meningkatkan jumlah dan toksisitas dari sel natural killer (Salem 2005). Tingginya kepadatan sel pada kelompok HS 0.2 disebabkan karena pada kelompok tersebut memiliki kecenderungan peradangan yang lebih 35 tinggi dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainnya (HS 0.1 dan HS Madu). Peningkatan juga terjadi pada kelompok kontrol yang mempunyai jumlah fokus radang paling banyak, namun peningkatannya tidak sebanyak pada kelompok HS 0.2 karena pada kelompok kontrol tidak diberikan perlakuan apapun. Meningkatnya kepadatan sel limfoid pada BALT berarti menigkatkan sistem pertahanan pada saluran nafas. Jintan hitam dapat meningkatkan sistem imun pada saluran nafas. 4.4 Kongesti dan Hemoragi Kongesti merupakan penumpukan darah di dalam pembuluh darah. Hal ini bisa disebabkan karena aliran darah tidak lancar. Darah yang masuk melalui arteri terlalu banyak dan darah yang keluar melalui vena terlalu sedikit (Jones et al. 1997). Kongesti dapat berjalan secara aktif maupun pasif. Kongesti secara aktif terjadi karena pembuluh darah mengalami dilatasi dan diisi oleh darah sedangkan proses kongesti secara pasif terjadi karena adanya kelainan jantung (Cheville 2006). Hemoragi adalah ekstravasasi darah akibat rupturnya pembuluh darah. Secara mikroskopis, hemoragi yang terjadi di dalam jaringan terlihat dengan adanya sel darah merah di dalam jaringan di luar pembuluh darah (Cheville 2006). Pengamatan terhadap kongesti dan hemoragi dilakukan dengan perbesaran 20x10. Pengamatan dilakukan pada 10 lapang pandang dengan luas lapang pandang 0,24 mm2. Pengamatan terhadap kongesti dilakukan dengan menghitung jumlah pembuluh darah yang mengalami kongesti (terdapat sel darah di dalamnya). Pengamatan dilakukan baik pada pembuluh darah arteri maupun vena. Pengamatan terhadap hemoragi dilakukan dengan menghitung titik-titik pusat hemoragi. Pengamatan pada perubahan kongesti yang tidak disertai adanya adanya udema, menunjukkan bahwa kejadian kongesti adalah akut. pengamatan terhadap kongesti dan hemoragi dapat dilihat pada Tabel 11. Hasil 36 Tabel 11 Hasil Pengamatan Jumlah Kongesti dan Hemoragi Pada Paru-Paru Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Kongesti 5.13 ± 4.32b 5.00 ± 1.36b 5.20 ± 2.93b 1.73 ± 1.53a Hemoragi 2.87 ± 1.8a 2.53 ± 1.77a 2.80 ± 2.24a 1.47 ± 1.19a Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan pada taraf p<0.05 Hasil pengamatan kongesti pada sediaan menunjukkan bahwa terjadi perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan. Kelompok HS Madu menunjukkan jumlah kongesti yang paling rendah dibandingkan kelompok yang lainnya. Kongesti dan hemoragi pada sediaan histopatologi bisa juga disebabkan karena trauma yang terjadi saat penanganan hewan coba. Euthanasi dengan cara pemisahan sendi atlanto occipitalis diduga dapat menyebabkan terjadinya kongesti maupun hemoragi pada paru-paru. Hal ini dapat dilihat dengan tidak adanya peningkatan sel-sel radang yang menunjukkan adanya peradangan. Gambaran histopatologi kongesti dan hemoragi dapat dilihat pada gambar 12 dan 13. Gambar 12. Gambaran histopatologi kongesti (tanda panah) pembuluh darah vena pada organ paru-paru. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10 37 Gambar 13. Gambaran histopatologi hemoragi (tanda panah) pada organ paruparu. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10 4.5 Fokus Radang Pengamatan terhadap fokus radang pada paru-paru dilakukan dengan menghitung rata-rata jumlah fokus radang pada sepuluh lapang pandang dengan luas 6.16 x 104 µm2 secara acak menggunakan perbesaran 40x10. Hasil penghitungan masing-masing kelompok dapat dilihat pada tabel 12. Tabel 12. Rataan Jumlah Fokus Radang pada Paru-Paru Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam (luas lapang pandang 6.16 x 104 µm2) Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Jumlah Fokus Radang 2.00 ± 1.25b 0.67 ± 0.72a 1.20 ± 1.01a 1.00 ± 1.00a Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Pemberian habattussauda menurunkan jumlah fokus radang di paru-paru secara signifikan. Proses peradangan dapat dipicu oleh beberapa hal seperti trauma mekanis, sel kanker, reaksi alergi atau mikroba infeksius. Proses peradangan merupakan respon dari tubuh untuk mempertahankan diri. Pada dasarnya proses peradangan akan mengisolasi, mengencerkan dan mengeliminasi 38 agen yang menyebabkan peradangan terjadi. Pada organ paru-paru juga bisa terjadi peradangan. Peradangan pada paru-paru disebut dengan pneumonia (McGavin 2007). Fungsi dan struktur organ paru-paru memungkinkan untuk masuknya agen infeksius atau non-infeksius yang menyebabkan radang melalui rute aerogenous dan hematogenous. Fungsi organ paru-paru sebagai organ pernafasan membuat paru-paru terpapar udara setiap saat. Struktur paru-paru sebagai organ dengan pembuluh darah kapiler terbanyak juga membuat paru-paru mudah terserang agen infeksius atau non-infeksius yang menyebar secara hematogenous (Aughey 2001). Selain rute aerogenous dan hematogenous peradangan pada paru-paru juga bisa masuk secara langsung melalui luka pada organ paru-paru misalnya pada peristiwa tertusuknya paru-paru oleh benda asing. Pengamatan yang dilakukan pada gambaran histopatologi fokus radang pada paruparu menunjukkan bahwa radang menyebar melalui rute hematogenous. Fokusfokus radang terletak tersebar pada jaringan interstisial paru-paru, disekitar pembuluh darah dan tidak berada di dekat saluran pernafasan (bronkhus atau bronkhiolus). Penyebaran agen infeksius dan non-infeksius melalui rute hematogenous biasanya terjadi pada keadaan septisemia, paparan toksin, infeksi protozoa dan infeksi virus yang mempunyai target sel endotel. Selain itu penyebaran agen infeksi melalui rute hematogenous juga bisa disebabkan karena agen infeksius yang dibawa limfosit saat bersirkulasi (Mc Gavin 2007). Adanya fokus radang pada paru-paru mencit diduga akibat mencit terinfeksi oleh bakteri yang berasal dari lingkungan kandang. Gambaran histopatologi fokus-fokus radang dapat dilihat pada gambar 14. 39 Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS Madu Gambar 14. Gambaran histopatologi fokus-fokus radang (tanda panah) pada organ paru-paru. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10. Penurunan jumlah fokus radang pada kelompok yang diberi perlakuan jintan hitam ataupun kombinasi jintan hitam dan madu diduga akibat aktivitas anti bakteri dan anti inflamasi dari jintan hitam dan dan aktivitas anti bakteri dari madu. Baik jintan hitam dan madu keduanya memiliki khasiat sebagai anti bakteri (Estevinho 2008 dan Chaieb et al. 2011). Bourgou et al. (2010) dalam hasil penelitiannya menyebutkan bahwa aktivitas antimikroba jintan hitam berasal dari kandungan zat aktifnya yaitu thymoquinone dan longifolene. Thymoquinone dan longifolene mempunyai efek antibakteri terhadap S. aureus dengn nilai IC50 1,8µM (0,3µg/ml) dan 3,0 µM (0,6 µg/ml). Thymoquinone mempunyai aktivitas antibakteri yang tinggi terhadap bakteri gram positif. Thymoquinone juga dilaporkan mempunyai efek sinergi dengan streptomisin dan gentamisin (Salama 2010). Selain memiliki khasiat sebagai antibakteri, jintan hitam juga memiliki khasiat sebagai anti inflamasi. Dalam penelitian yang sama Bourgou et al. (2010) menguji efek antiinflamasi jintan hitam dengan mengukur kemampuan jintan 40 hitam dalam menghambat pembentukan NO (nitrat oksida). NO merupakan radikal bebas yang dihasilkan oleh jaringan tubuh. NO bisa dijadikan indikator keadaan patologis beberapa jenis inflamasi. Thymoquinone terbukti sebagai bahan aktif jintan hitam yang mampu menghambat pembentukan NO. 4.6 Ketebalan Otot Polos Pengamatan terhadap ketebalan otot polos dilakukan dengan mengukur otot polos yang berada pada bronkhus. Pengukuran otot polos dimaksudkan untuk melihat hipertrofi pada otot polos. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak image J. Pengamatan terhadap ketebalan otot polos dilakukan pada perbesaran 40x10. Pewarnaan yang digunakan untuk mengamati keadaan ketebalan otot adalah pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE). Pengamatan dilakukan pada sepuluh lapang pandang. Hasil pengamatan terhadap ketebalan otot polos disajikan pada tabel 13. Tabel 13 Hasil Pengamatan Terhadap Ketebalan Otot Polos Pada Bronkhus Mencit Yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Ketebalan Otot Polos (µm) 0.029 ± 0.023a 0.024 ± 0.012a 0.023 ± 0.008a 0.019 ± 0.006a Keterangan: Huruf superscript pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Hasil pengamatan terhadap ketebalan otot polos tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan, akan tetapi kelompok kontrol menujukkan kecenderungan yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok yang diberi perlakuan jintan hitam HS 0.1, HS 0.2 dan HS Madu). Gambaran histopatologi otot polos dapat dilihat pada gambar 16. 41 Gambar 16. Gambaran histopatologi otot polos (tanda panah) di sekitar bronkhus pada organ paru-paru. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10 Tidak lancarnya aliran udara dapat mempengaruhi ketebalan otot polos pada bronkhus dan bronkhiolus. Hal ini disebabkan otot polos bekerja lebih keras untuk menahan tekanan udara dalam bronkhus akibat terhambatnya aliran udara pernafasan. Peningkatan ketebalan otot polos pada paru-paru bisa merupakan indikasi adanya penyakit asma (Olmez et al. 2009). Perubahan yang dapat diamati pada preparat histopatologi organ paru-paru yang menderita asma menurut Yamauchi (2006) terdapat pada beberapa bagian. Bagian yang pertama adalah bagian lumen saluran pernafasan. Pada penderita asma, saluran pernafasan akan berisi eksudat. Bagian yang kedua yang dapat diamati pada penderita asma adalah lapisan mukus pada bronkhus. Pada mukosa bronkhus juga terdapat eksudat. Selain eksudat juga terlihat kelainan sel-sel epitel pada mukosa bronkhus. Bagian terakhir adalah dinding bronkhus. Pada penderita asma, dinding bronkhus akan mengalami kelainan berupa hipertrofi otot polos. Jintan hitam diketahui memiliki efek preventif terhadap penyakit asma. Boskabady et al. (2007) melakukan penelitian dengan memberikan ekstrak jintan hitam sebanyak 15 mL/kg dari 0.1 g% ekstrak kepada pasien yang menderita 42 asma selama 45 hari. Hasil yang didapat dari penelitian tersebut ekstrak jintan hitam menurunkan gejala asma. Penurunan ini disebabkan karena khasiat jintan hitam sebagai anti radang. Minyak esensial dari jintan hitam mampu mengurangi efek inflamasi yang terjadi pada saluran pernafasan. Efek anti inflamasi jintan hitam berasal dari kemampuan ekstrak jintan hitam menghambat pembentukan asam arachidonat (Houghton et al. 1995). Kemampuan ekstrak jintan hitam dalam menghambat histamin juga mendukung kemampuan jintan hitam dalam mencegah asma (Boskabady et al. 2007). 4.7 Emfisema Pengamatan daerah emfisema dilakukan dengan mengukur daerah yang mengalami emfisema. Daerah yang mengalami emfisema diukur dengan menggunakan perangkat lunak image J kemudian dibagi dengan luas lapang pandang secara keseluruhan. Hasil pengukuran daerah emfisema disajikan dalam bentuk presentasi dapat dilhat pada tabel 14. Tabel 14 Pengamatan Persentase Daerah Emfisema Pada Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Persentase Daerah yang Mengalami Emfisema (%) 19.07 ± 9.81b 15.53 ± 11.28ab 10.13 ± 4.31a 22.67 ± 11.97b Keterangan: Huruf superscript pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Pengamatan terhadap persentase daerah yang mengalami emfisema menunjukkan hasil yang berbeda secara statistik antar kelompok perlakuan. Ratarata luas daerah yang mengalami emfisema tertinggi terdapat pada kelompok kontrol dan kelompok HS Madu. Tingginya persentase daerah yang mengalami emfisema pada kelompok HS Madu diduga disebabkan karena pada kelompok HS Madu kandungan jintan hitamnya lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainnya (HS 0.1 dan HS 0.2). 43 Gambar 15. Gambaran histopatologi emfisema (tanda panah) pada organ paruparu. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10 Emfisema merupakan perluasan ruangan alveol yang terjadi akibat kerusakan dinding alveol tetapi tanpa diikuti fibrosis. Pada manusia emfisema merupakan penyakit yang disebabkan karena reaksi yang kompleks akibat proses peradangan. Pada hewan emfisema hampir selalu merupakan kejadian sekunder atau dipicu oleh keadaan lain (McGavin 2007). Biasanya emfisema pada hewan dipicu oleh terhalangnya aliran udara pada saluran nafas. Meningkatnya mukus pada saluran nafas dapat menyebabkan terganggunya aliran udara pernafasan. Peningkatan jumlah sel goblet pada saluran nafas dapat menyebabkan peningkatan mukus pada saluran nafas. Peningkatan sel goblet bisa dipicu akibat adanya antigen yang berhasil masuk kedalam saluran nafas. Peningkatan sel goblet merupakan respon tubuh terhadap masuknya antigen. 4.8 Pembahasan Umum Jintan hitam atau habbatussauda dikenal mempunyai banyak khasiat, salah satu khasiatnya adalah sebagai anti radang. Bahan aktif yang terkandung pada jintan hitam yaitu thymoquinone memiliki aktivitas anti radang karena dapat menghambat pembentukan NO (Bourgou et al. 2010) dan menghambat 44 pembentukan mediator inflamasi asam arachidonat dengan cara menghambat cyclooxigenase serta 5-lipooxygenase (Houghton et al. 1995). Aktifitas anti radang jintan hitam dibuktikan dengan menurunnya eksudat pada saluran nafas (bronkhus dan bronkhiolus) yang diberi perlakuan jintan hitam. Eksudat pada saluran nafas berhubungan dengan perisitiwa peradangan yang terjadi pada saluran nafas. Penurunan eksudat pada saluran nafas ini juga diikuti dengan penurunan jumlah sel goblet pada saluran nafas. Saetta dan Turato (2000) menyatakan bahwa pada kondisi terjadi peradangan akan terjadi peningkatan jumlah sel goblet. Sel goblet merupakan sel yang bertugas untuk menghasilkan mukus yang berfungsi sebagai sistem pertahanan pada saluran pernafasan. Meningkatnya jumlah sel goblet juga akan bepengaruh terhadap eksudat pada saluran nafas. Selain anti radang, thymoquinone juga memiliki khasiat sebagai anti bakteri. Bahan aktif yang terkandung dalam jintan hitam diketahui efektif dalam melawan bakteri yang sudah resisten terhadap antibiotik (Salman et al. 2008). Secara khusus Hannan (2008) melaporkan bahwa jintan hitam mempunyai kemampuan sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus yang sudah resisten terhadap methilcillin. Penurunan jumlah fokus radang juga diikuti dengan penurunan jumlah sel goblet pada saluran nafas. Penurunan jumlah fokus radang berpengaruh terhadap menurunnya jumlah sel goblet. Dengan demikian eksudat pada pada saluran nafas juga ikut berkurang. Berkurangnya eksudat pada saluran nafas diikuti dengan ketebalan otot pada kelompok perlakuan yang lebih rendah jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Eksudat pada saluran nafas membuat aliran udara pernafasan menjadi tidak lancar, hal ini akan membuat otot polos pada sekitar bronkhus bekerja lebih keras sehingga menjadi lebih tebal. Aliran udara yang tidak lancar akan mempengaruhi kejadian emfisema pada paru-paru. Hasil pengamatan terhadap deerah yang mengalami emfisema menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan, namun walaupun tidak menunjukkan perbedaan yang nyata kelompok yang diberi perlakuan menunjukkan kecenderungan yang lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol. Jintan 45 hitam memberikan pengaruh yang baik terhadap gambaran histopatologi paruparu mencit. Dosis yang efektif memberikan efek baik pada masing masing perubahan histopatologi yang diamati dapat dilihat pada tabel 15. Tabel 15. Dosis Efektif Jintan Hitam Berdasarkan Faktor Yang Diamati Faktor yang diamati Dosis yang paling efektif Hasil Analisis Statistik Eskudat pada bronkhus dan bronkhiolus HS 0.1 Jumlah Sel Goblet HS Madu Berbeda Nyata Luas BALT HS Madu Tidak Berbeda Nyata Tidak Berbeda Nyata Kepadatan Sel Limfoid HS Madu pada BALT Kongesti dan Hemoragi HS-Madu Berbeda Nyata Jumlah Fokus Radang HS Madu Berbeda Nyata Ketebalan Otot Polos HS Madu Tidak Berbeda Nyata Emfisema HS 0.2 Berbeda Nyata Berbeda Nyata Kelompok perlakuan HS Madu menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok perlakuan yang lainnya pada beberapa parameter pengamatan (Jumlah sel goblet, Luas dan kepadatan sel limfoid pada BALT, kongesti dan hemoragi, Jumlah fokus radang, dan ketebalan otot polos). Pada parameter pengamatan lainnya (emfisema) kelompok perlakuan HS 0.2 menunjukkan hasil yang baik. Secara umum dosis pada kelompok perlakuan HS Madu lebih baik dibandingkan kelompok perlakuan yang lainnya, namun masih perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mendapatkan dosis yang lebih akurat. 46 BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Konsumsi ekstrak minyak jintan hitam dan penambahan madu menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam dan madu tidak menyebabkan peningkatan eksudasi di bronkus dan bronkiolus lumen, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan area BALT dan meningkatkan densitas sel limfoid, mengurangi daerah hemoragi, fokus peradangan dan emfisema serta tidak meningkatkan penebalan otot polos. Pemberian jintan hitam dan madu efek menguntungkan pada histomorfologi paru-paru. Kelompok yang diberi perlakuan kombinasi HS Madu menunjukkan hasil terbaik dibandingkan kelompok perlakuan lainnya. 5.2 Saran 1. Perlu dilakukan penelitian dengan waktu penelitian yang lebih panjang, untuk mengetahui pengaruh penggunaan ekstrak minyak jintan hitam dalam jangka panjang. 2. Perlu dilakukan penelitian pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam dengan menggunakan hewan model yang mengalami gangguan pada sistem pernafasan. 3. Perlu dilakuan penelitian yang lebih lanjut untuk mendapatkan dosis yang tepat. 47 Daftar Pustaka Akers R M, D M Denbow. 2008. Anatomy and Physiology of Domestic Animal. Iowa: Blackwell Publishing: 396-397 Anonim. 2011. Healthy Lung [terhubung berkala] http://bio.rutgers.edu/~gb102/lab_10/1001am.html [17 oktober 2011] Antuono D L F, Alessandro M, Antonio FSL. 2002. Seed Yield, Yield Components, Oil Contents And Essential Oil Content And Composition of Nigella Sativa L. And Nigella Damascena L. IND CROP PROD 15: 59-69. Arrington LR. 1972. Introducing Laboratory Animal Science. The Breeding, Care, and Management of Experimental Animal. New York: The Interstate Printers & Publishers Inc. 29-35 Aughey E, Frye FL. 2001. Comparative Veterinary Histology: with Clinical Correlates. London: Manson Publishing. hlm 247 Aspinall V, M O’Reilly. 2004. Introduction to Veterinary Anatomy and Physiology. Philadelphia: Elsevier. Hlm 98-106. Bals R, DJ Weiner, JM Wilson. 1999. The Innate Immune System in Cystic Fibrosis Lung Disease. J CLIN INVEST 103: 303-307 Banks WJ. 1993. Applied Veterinary Histology 3rd Edition. Missouri: Mosby, Inc. 390-400 Boskabady M H, H Javan, M Sajady, H Rakhshandeh. 2007. The Possible Effect of Nigella sativa Seed Extract In Asthmatic Patients. FUND CLIN PHARMACOL 21: 559-556 Boskabady M H, VaNasim, ASediqa. 2008. The Protective Effect of Nigella sativa On Lung Injury Of Sulfur Mustard-Exposed Guinea Pigs. EXP LUNG RES 34: 183-194 48 Bourgou S, A Pichette, B Marzouk, J Legault. 2010. Bioactivities of Black Cumin Essential Oil and Its Main Terpenes From Tunisia. S AFR J BOT 76(2): 210-216 Cesta MF. 2006. Normal Structure, Function, and Histology of MucosaAssociated Lymphoid Tissue. TOXICOL PATHOL 34:599–608 Chaieb K, Hanene J, Kacem M, Amina B. 2011. Antibacterial Activity of Thymoquinone, an Active Pirnciple of Nigella sativa and Its Property to Prevent Bacterial Biofilm formation. J ALTERN COMPLEM MED 11(29): 1-6 Cheville NF. 2006. Introduction to Veterinary Pathology. Ed ke-3. Oxford: Blackwell Publishing. 147-150 Coonrod D. 1989. Role of Leukocytes in Lung Defences. Respiration 1989;55 (Suppl. 1):9-13 [terhubung berkala] http://content.karger.com/ProdukteDB/produkte.asp?Doi=195746 [8 Maret 2012] Coville T, JM Bassert. 2002. Clinical Anatomy and Physiology for Veterinary Technicians. Missoury: Mosby, Inc 220-235 D’Antuono L F, Alessandro M, Antonio FSL. 2002. Seed Yield, Yield Components, Oil Contents And Essential Oil Content And Composition of Nigella Sativa L. And Nigella Damascena L. IND CROP PROD 15: 5969. Dellmann HD, J A Eurell. 1998. Textbook of Veterinary Histology. Maryland: Lippincott Williams & Wilkins 847 850 Ela EI Aboul. 2002. Cytogenic Studies on Nigella sativa Seeds Extract and Thymoquinone on Mouse Cells Infected with Schistomiasis Using Karyotyping. Mutation Research 516: 11-17. El Danshary ES, MA Al-Gahazalia, FA Mannaab, HA Salema, NS Hassanc, MA. Abdel-Wahhabd. 2011. Dietary Honey and Ginseng Protect Against 49 Carbon Tetrachloride-Induced Hepatonephrotoxicity in Rats. EXP TOXICOL PATHOL 15:1-8 El Gazzar MA, El Mezayen R, Marecki JC, Nicolls MR, Canastar A, Dreskin SC. 2006. Anti-Inflammatory effect of Thymoquinone in a Mouse Model of Allergic Lung Inflammation. Int Immunopharmacol 6:1135-1142. Estevinho L, A P Pereira, L Moreira, L G. Dias, E Pereira. 2008. Antioxidant and antimicrobial effects of phenolic compounds extracts of Northeast Portugal honey. FOOD CHEM TOXICOL 46: 3774–3779 Fatoni. 2011. Bunga jinten hitam. http://proherbal.net/herbal-hebat-bernamahabbatussauda/. [26 Juli 2011]. Hannan A, S Saleem, S Chaudhary, M Barkaat, M U Arshad. 2008. Anti Bacterial Activity Of Nigella sativa Against Clinical Isolates Of Methilcillin Resistent Staphylococcus aureus. J Ayub Med Coll Abbottabad 20(3): 7274 Heitmann S, T. Tschernig, M. Larbig, I. Steinmetz, H.-J. Hedrich, R. Pabst. 1999. Immunohistological Characterization Of Leukocytes In The Lungs Of Healthy Mice And After Bacterial Intratracheal Infection. LAB ANIMAL 33: 288—294 Houghton P, R Zarka, B De Las Heras, J Hoult. 1995. Fixed Oil of Derived Thymoquinone Inhibit Generation in Leukocytes and Membrane Lipid Peroxidation. Planta Med 61(1): 33-36 Hussein AA, MK Rakha, ZI Nabil. 2003. Anti-Arrhytmic Effect of Wild Honey Against Cathecolamines Cardiotoxicity. J Med Sci 3(2): 127-136 Hutapea JR. 1994. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (III). Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Depkes RI. 332-340 Jones TC, Ronald DC, Norval WK. 2006. Veterinary Pathology. Iowa: Blackwell Publishing. 947-970 50 Kahn CM. 2010. Merck Veterinary Manual 10th Edition. [terhubung berkala] http://www.merckmanuals.com/vet/index.html [20 Agustus 2011] Mc Gavin, M Donald, JF Zachary. 2007. Pathologic Basic of Veterinary Dissease. Missouri: Mosby Elsevier. 463-558 Olmez D, A Babayigit, G Erbil, O Karaman, A Bagriyanik, O Yilmaz, N Uzuner 2009. Histopathologic Changes in Two Mouse Models of Asthma. J Investig Allergol Clin Immunol. 19(2): 132-138 Omar A, Ghosheh S, Abdulghani A, Houdi A, Crookscor PA. 1999. High performance liquid chromatographic analysis of the pharmacologically active quinones and related compounds in the oil of the black seed (L. Nigella sativa). J Pharm Biomed Anal. 19: 757– 62. Ramadhan U H, Munther A Mohammedali, Huda S Abood. 2011. Study The Analgesic Activity of Nigella sativa L. Volatile Oil Againts Pain in Mice. Journal of Current Pharmaceutical Research 5(1): 36-38. Ressang AA. 1984. Buku Pelajaran Patologi Khusus Veteriner. Denpasar: 221225 Rouhou S C, Souhail B, Basma H, Christophe B, Calude D, Hamadi A. 2007. Nigella sativa L.: Chemical Composition And Physicochemical Characteristics Of Lipid Fraction. FOOD CHEM 10: 673–681 Rostika N. 2012. Pengaruh Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) terhadap Gambaran Histopatologi Lambung dan Usus Halus Mencit (Mus musculus) [skripsi]. Bogor. Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor; 2012 Rubin E, HM Reisner. 2009. Essential of Robin’s Pathology 5th Edition. Philadhelphia: Wolster Kluwer. hlm 254-257 Saad B, Azaizeh H, Said O. 2005. Tradition and Prespective of Arab Herbal Medicine: A Review. eCam. 2(4): 475-479 51 Saetta M, G Turato. 2001. Airway pathology in asthma. Eur Respir J. 18: Suppl. 34: 18–23 Salama, Raaga H M. 2010. Clinical and Therapeutic Trials of Nigella Sativa. TAF Prev Med Bull 9(5): 513-522 Salem ML. 2005. Immunomodulatory and Therapeutic Effect of Nigella sativa L. Seed. Intl Pharmacol 5:1749-1770 Sancheti G, PK Goyal. 2011. Evaluation of Possible Radioprotective Action of Rosmarinus officinalis L. in Swiss albino Mice [terhubung berkala] http://www.rooj.com/Radioprotection.htm [16 oktober 2011] Sari L O R. 2006. Pemanfaatan Obat Tradisional dengan Pertimbangan Manfaat dan Keamanannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. 1: 1-7 Sarwono B. 2001. Lebah Madu. Jakarta: AgroMedia Pustaka. 61-69. Smith JBI, Mangkoewidjojo S. 1988. Pemeliharaan, Pembiakan dan Penggunaan Hewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta: UI Press. 80-81 Subarnas A. 2010. Pemanfaatan Obat Herbal dari Indigenus hingga Klinik. [terhubung berkala] http://farmasi.unpad.ac.id/blog/pemanfaatan-obat- herbal-dari-indigenus-hingga-klinik/ [10 Oktober 2011] Suranto A. 2004. Khasiat dan Manfaat Madu Herbal. Jakarta: AgroMedia Pustaka. 25-26 Tizard I. 1982. An Introduction to Veterinary Immunology. Philadelphia: WB Saunders Company: 154-156 [USDA] United States Department of Agriculture. 2011. Plants Profile. [terhubung berkala] http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=NISA2&mapType=nativity&p hotoID= [3 Agustus 2011] [WHO] World Health Oragnization. 2008. Traditional Medicine [terhubung berkala] http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/ [2 Agustus 2011] 52 [WHO] World Health Oragnization. 2011. Asthma [terhubung berkala] http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs307/en/index.html [6 Desember 2011] Yamauchi K. 2006. Airway Remodelling in Asthma and Its Influence on Clinical Pathophysiology. Tohoku J. Exp. Med 29: 75-87. 53 LAMPIRAN 54 Lampiran 1 Perhitungan Dosis 1. Perhitungan dosis pemberian Anthelmentik Albendazole 5% = 5 g/100ml = 50 gram/ml Dosis untuk mencit = 10 mg/kg BB Dosis untuk mencit BB 20 gram = = = 0,04 ml/ekor 2. Perhitungan dosis pemberian Antibiotik (Clavamox®) Konsentrasi = 125 mg/ml = 25 mg/ml Dosis untuk anak-anak BB 25 kg = 1 mg/kg BB/hari = 0,001 mg/g BB Dosis untuk mencit = Dosis untuk mencit BB 20 gram = = 0,0008 ml/ekor/hari 3. Perhitungan dosis pemberian Antiprotozoa (Flagyl®) Sediaan 500 mg/tablet Dosis untuk manusia BB 50 kg = 1500 mg/50 kg BB/hari = 30 mg/kg BB/hari Dosis untuk mencit = = 0,03 mg/g BB Dosis untuk mencit BB 25 gram = 25 (gram) x 0,03 mg/g BB = 0,75 mg/ekor/hari 55 4. Perhitungan Dosis Pemakaian Jintan Hitam Dosis Pemakaian = 1-2 sdm 3x sehari Dosis HS 0.1 Dosis HS 0.2 = = 0,3 ml/kg x 2 sdm = 0,6 ml/kg = x 0,6 x 3 = 0,054 ml ≈ 0,1 ml/ hari = 2x HS 0.1 = 0,2 ml/ hari Dosis Hs madu = 3x HS 0.1 = 0,3 ml/ hari 56 Lampiran 2 Jadwal Jadwal Pelaksanaan Penelitian Waktu Juni 2010 Kegiatan Mempersiapkan dan membersihkan Fasilitas Kandang Hewan Percobaan Bagian Patologi FKH IPB Persiapan peralatan perkandangan hewan coba seperti box kandang, alas kain, tempat makan, dan tempat minum 16 Agustus 2010 Mencit untuk hewan percobaan dimasukkan ke dalam kandang dan diistirahatkan selama 2 hari agar dapat beradaptasi dengan kandang 20 Agustus 2010 Pemberian antihelmintik pada mencit 23-27 Agustus 2010 Pemberian antibiotik pada mencit 28 Agustus 2010 Pemberian antihelmintik pada mencit 30 Agustus-3 September 2010 Pemberian antijamur pada mencit 16 September-16 November 2010 Pemberian ekstrak minyak jintan hitam dan kombinasi madu pada kelompok perlakuan 22 November 2010 Nekropsi mencit 29 November 2010 Trimming organ mencit 1-15 Desember 2010 Pembuatan preparat histopatologi Januari -Februari 2011 Pengamatan preparat histopatologi 57 Lampiran 3 Hasil Analisis Data Eksudat pada Bronkhus Bronkhus * Perlakuan Bronkhiolus * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 12 100.0% 0 .0% 12 100.0% 12 100.0% 0 .0% 12 100.0% Bronkhus Bronkhiolus * Perlakuan Perlakuan Kontrol Bronkhus Bronkhiolus 4.77545206 4.67955137 3 2 Std. Deviation 0.29493686 0.12883199 Mean 4.74032522 4.60517019 3 3 Std. Deviation 0.23409539 0.00000000 Mean 4.93209660 4.66594404 3 3 Std. Deviation 0.06801650 0.10526340 Mean 4.74031689 4.60517019 3 3 0.14461248 0.00000000 Mean N HS 0.1 N HS 0.2 N HS Madu N Std. Deviation ANOVA Sum of Squares df Bronkhus Between Groups Within Groups Total Bronkhiolus Between Groups Within Groups Total Mean Square 0.07542121 3 0.02514040 0.33465483 8 0.04183185 0.41007604 11 0.01397790 3 0.00465930 0.05535613 8 0.00691952 0.06933403 8 F Sig. 0.60 0.6323 0.67 .5921 58 Bronkhus Duncan Perlakuan N Subset for alpha = 0.05 1 HS0,2 3 4.9321 kontrol 3 4.7755 HS0,1 3 4.7403 Hsmadu 3 4.7403 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Bronkhiolus Duncan Perlakuan N Subset for alpha = 0.05 1 HS0,2 3 4.9321 kontrol 3 4.7755 HS0,1 3 4.7403 Hsmadu 3 4.7403 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 59 Lampiran 4 Hasil Analisis Data Jumlah Sel Goblet Jumlah * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 60 100.0% 0 .0% 100.0% Sel Goblet * Perlakuan Perlakuan Kontrol Bronkhus Mean 19.4667 N HS 0.1 15 Std. Deviation 17.32820 Mean 39.4667 N HS 0.2 15 Std. Deviation 29.80860 Mean 15.6000 N HS Madu 15 Std. Deviation 16.04369 Mean 13.4000 N 15 Std. Deviation 9.88361 ANOVA Sum of Squares df Bronkhus Between Groups Within Groups Total Mean Square F Sig. 5.524 .002 6396.317 3 2132.106 21614.667 56 385.976 28010.983 59 60 Jumlah Sel Goblet Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS Madu 15 13.4000 HS 0.2 15 15.6000 Kontrol 15 19.4667 HS 0.1 15 39.4667 Sig. .431 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 61 Lampiran 5 Hasil Analisis Data Pengamatan BALT Luas BALT * Perlakuan Kepadatan Sel Limfoid * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 12 100.0% 0 .0% 12 100.0% 12 100.0% 0 .0% 12 100.0% Luas BALT Kepadatan Sel Limfoid * Perlakuan Luas BALT Kepadatan Sel Limfoid 2.75809640 4.68321182 3 3 Std. Deviation 0.53360258 0.06837588 Mean 2.69261113 4.67659552 3 3 Std. Deviation 0.49223316 0.06203232 Mean 3.08420674 4.75870132 3 3 Std. Deviation 0.08546926 0.03306870 Mean 2.48791508 4.64091644 3 3 0.59227314 0.06191432 Perlakuan Kontrol Mean N HS 0.1 N HS 0.2 N HS Madu N Std. Deviation 62 ANOVA Sum of Squares df Luas BALT Kepadatan Sel Limfoid Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Mean Square 0.55083417 3 0.18361139 1.77023533 8 0.22127942 2.32106950 11 0.02206423 3 0.00735474 0.02690038 8 0.00336255 0.04896462 11 Luas BALT Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 HS0,2 3 3.0842 kontrol 3 2.7581 HS0,1 3 2.6926 Hsmadu 3 2.4879 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Kepadatan Sel Limfoid Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS0,2 3 4.75870 kontrol 3 4.68321 4.68321 HS0,1 3 4.67660 4.67660 Hsmadu 3 4.64092 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. F Sig. 0.83 0.5138 2.19 0.1673 63 Lampiran 6 Hasil Analisis Data Pengamatan Kongesti dan Hemoragi Kongesti * Perlakuan Hemoragi * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 100.0% 0 .0% 60 100.0% 60 100.0% 0 .0% 60 100.0% Kongesti Hemoraghi * Perlakuan Perlakuan Kontrol Kongesti Hemoraghi 5.1333 2.8667 15 15 Std. Deviation 4.32380 1.80739 Mean 5.0000 2.5333 15 15 Std. Deviation 1.36277 1.76743 Mean 5.2000 2.8000 15 15 Std. Deviation 2.93258 2.24245 Mean 1.7333 1.4667 15 15 1.53375 1.18723 Mean N HS 0.1 N HS 0.2 N HS Madu N Std. Deviation ANOVA Sum of Squares df Kongesti Hemoraghi Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Mean Square F Sig. 5.445 .002 1.973 .128 128.667 3 42.889 441.067 56 7.876 569.733 59 18.983 3 6.328 179.600 56 3.207 198.583 59 64 Kongesti Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS Madu 15 1.7333 HS 0.1 15 5.0000 Kontrol 15 5.1333 HS 0.2 15 5.2000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Hemoraghi Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 HS Madu 15 1.4667 HS 0.1 15 2.5333 HS 0.2 15 2.8000 Kontrol 15 2.8667 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 65 Lampiran 7 Hasil Analisis Data Pengamatan Fokus Radang Fokus Radang * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 60 100.0% 0 .0% 100.0% Fokus Radang * Perlakuan Perlakuan Kontrol Kongesti Mean 2.0000 N 15 Std. Deviation HS 0.1 1.25357 Mean .6667 N HS 0.2 15 Std. Deviation .72375 Mean 1.2000 N HS Madu 15 Std. Deviation 1.01419 Mean 1.0000 N 15 Std. Deviation 1.0000 ANOVA Sum of Squares df Fokus Radang Between Groups Within Groups Total Mean Square F Sig. 4.672 .006 14.450 3 4.817 57.733 56 1.031 72.183 59 66 Fokus Radang Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS 0.1 15 .6667 HS Madu 15 1.0000 HS 0.2 15 1.2000 Kontrol 15 2.0000 Sig. .180 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 67 Lampiran 8 Hasil Analisis Data Ketebalan Otot Polos Fokus Radang * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 60 100.0% 0 .0% 100.0% Ketebalan Otot Polos * Perlakuan Ketebalan Otot Polos Perlakuan Kontrol Mean .0287 N HS 0.1 15 Std. Deviation .02326 Mean .0240 N HS 0.2 15 Std. Deviation .01183 Mean .0227 N HS Madu 15 Std. Deviation .00884 Mean .0193 N 15 Std. Deviation Sum of Squares Between Groups .001 Within Groups .011 Total .012 .00594 ANOVA df Mean Square 3 .000 56 .000 59 F 1.130 Sig. .345 68 Ketebalan Otot Polos Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 HS Madu 15 .0193 HS 0.2 15 .0227 HS 0.1 15 .0240 Kontrol 15 .0287 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 69 Lampiran 9 Hasil Analisis Data Emfisema Emfisema * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 60 100.0% 0 .0% 100.0% Ketebalan Otot Polos * Perlakuan Ketebalan Otot Polos Perlakuan Kontrol Mean 19.0667 N HS 0.1 15 Std. Deviation 9.80865 Mean 15.5333 N HS 0.2 15 Std. Deviation 11.28125 Mean 10.1333 N HS Madu 15 Std. Deviation 4.30725 Mean 22.6667 N 15 Std. Deviation Sum of Squares Between Groups 1283.917 Within Groups 5393.733 Total 6677.650 11.96821 ANOVA df Mean Square 3 427.972 56 96.317 59 F 4.443 Sig. .007 70 Emfisema Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS 0.2 15 10.1333 HS 0.1 15 15.5333 15.5333 Kontrol 15 19.0667 HS Madu 15 22.6667 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Saluran pernafasan merupakan organ yang mudah terserang penyakit, hal ini disebabkan karena saluran pernafasan termasuk ke dalam kelompok saluran terbuka. Artinya saluran pernafasan berhubungan langsung dengan lingkungan luar (Aspinall 2004). Salah satu permasalahan kesehatan paru-paru adalah penyakit asma. WHO (2011) menyebutkan bahwa saat ini sebanyak 235 juta penduduk dunia mengidap penyakit asma. Penyakit pernafasan kronik ini sudah menjadi masalah kesehatan masyarakat. Asma sudah masuk ke semua negara baik yang mempunyai pendapatan yang tinggi ataupun rendah. Saluran pernafasan memiliki mekanisme pertahanan yang dapat mencegah masuknya kuman kedalam tubuh melalui saluran pernafasan. Mekanisme ini berupa sistem kekebalan bawaan yang bersifat umum dan sistem kekebalan dapatan yang bersifat khusus (Robert 1999). Namun terkadang sistem pertahanan yang ada pada organ paru-paru tidak dapat menahan mikroorganisme patogen yang masuk. Agar tidak terjadi kerusakan pada paru-paru, diperlukan zat yang mampu meningkatkan sistem pertahanan pada organ paru-paru sehingga dapat mencegah masuknya mikroorganisme patogen maupun benda asing yang dapat menyebabkan kerusakan pada paru-paru. Salah satu cara untuk meningkatkan sistem imun pada paru-paru adalah dengan menggunakan obat-obatan herbal. Penggunaan tanaman herbal untuk pengobatan sudah dikenal sejak ribuan tahun yang lalu. Secara umum penggunaan herbal dalam dunia pengobatan dikelompokkan menjadi empat kelompok yaitu pengobatan tradisional herbal cina, ayuverda, pengobatan herbal barat dan pengobatan herbal dari arab. Saat ini banyak obat-obatan modern yang masih diturunkan dari tanaman dan ±25% dari semua resep mengandung satu atau lebih bahan aktif dari tanaman (Saad 2005). Di Asia dan Afrika 80% penduduknya menggunakan pengobatan herbal untuk menangani masalah kesehatan yang dialami (WHO 2008). Penggunaan tanaman 2 herbal sebagai obat-obatan banyak disukai karena secara umum obat herbal lebih aman dibandingkan dengan obat modern (Sari 2006). Peningkatan penggunaan obat herbal juga terjadi di Indonesia. Hal ini menandakan bahwa masyarakat di Indonesia semakin percaya terhadap efek obat herbal. Penggunaan obat herbal di Indonesia juga tidak terbatas pada strata masyarakat tertentu. Penggunaan obat herbal sudah menembus seluruh lapisan masyarakat. Meskipun demikian kajian dan pengembangan terhadap potensi obat herbal harus terus dilakukan agar masyarakat mendapatkan manfaat dari penggunaan obat herbal secara maksimal (Subarnas 2010). Pemerintah Indonesia juga sudah mendukung penggunaan obat herbal ini. Pada tahun 2004 BPOM mengeluarkan Keputusan Kepala BPOM No. HK.00.05.4.2411 tentang Ketentuan Pokok Pengelompokan dan Penandaan Obat. Nigella sativa atau yang dikenal dengan nama jintan hitam adalah tanaman herbal yang berasal dari daerah di sekitar laut mediterania (Rouhou et al. 2007). Biji dan minyak dari jintan hitam memiliki khasiat sebagai antiinflamasi, analgesik, antipiretik, antimikroba dan antineoplasma. Beberapa laporan juga menyebutkan bahwa jintan hitam juga efektif untuk pencegahan penyakit asma. Jintan hitam sudah digunakan sebagai obat herbal sejak ribuan tahun yang lalu. Masyarakat pada daerah timur tengah dan beberapa negara lain di Asia barat menggunakan jintan hitam sebagai obat untuk mengobati penyakit. Selain sebagai obat herbal, jintan hitam juga digunakan sebagai bahan tambahan makanan (Salama 2010). Saat ini jintan hitam sudah banyak ditemukan di pasaran baik dalam bentuk bubuk dalam kapsul dan minyak. Melihat potensi jintan hitam dan tren penggunaan obat herbal pada masyarakat maka perlu diadakan kajian untuk mendapatkan informasi ilmiah tentang manfaat jintan hitam terutama pada organ paru-paru. 3 1.2 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa) dan kombinasi ekstrak jintan hitam dengan madu terhadap gambaran mikroskopis organ paru-paru pada mencit (Mus musculus). 1.3 Manfaat Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah informasi tentang khasiat jintan Hitam khususnya pada paru-paru mencit (Mus musculus). Dengan informasi dari penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan penggunaan jintan hitam sebagai obat herbal yang dapat mengatasi permasalahan pada paru-paru baik pada hewan maupun pada manusia. 1.4 Hipotesis H0: Tidak terdapat perbedaan gambaran mikroskopis organ paru-paru mencit yang diberi perlakuan (ekstrak minyak jintan hitam) dengan kelompok kontrol negatif (tidak diberi ekstrak minyak jintan hitam). H1: Terdapat perbedaan gambaran mikroskopis organ paru-paru antara kelompok mencit yang diberi perlakuan (diberi ekstrak minyak jintan hitam) dengan kelompok kontrol negatif (tidak diberi ekstrak minyak jintan hitam). 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Jintan Hitam Nigella sativa merupakan tanaman herbal tahunan. Tanaman ini sudah digunakan sejak ribuan tahun yang lalu sebagai bumbu dan pengawet makanan. Tanaman ini biasanya tumbuh di Eropa, Timur Tengah dan Asia Barat. Jintan hitam tumbuh pada keadaan tanah semi arid. Bunga jintan hitam berwarna kebirubiruan dengan variasi jumlah kelopak (Gambar 5). Bunga jintan hitam juga ditandai dengan adanya nektar. Biji jintan hitam berukuran kecil dengan berat antara 1-5 mg berwarna abu-abu gelap atau hitam dengan permukaan kulit yang berkerut (Antuono et al. 2002). Jintan hitam dikenal sebagai obat-obatan herbal sejak ribuan tahun yang lalu. Jintan hitam sering digunakan sebagai obat-obatan tradisional untuk mengobati berbagai penyakit seperti demam, flu, sakit kepala, asma, rematik, infeksi oleh mikroba, untuk mengatasi cacing pada saluran pencernaan dan juga untuk meningkatkan status kesehatan (Salama 2010). Nigella sativa di Indonesia dikenal sebagai jintan hitam. Sedangkan di Arab Saudi N. Sativa dikenal dengan nama Al-Habbah Al Sawda, Habbet ElBaraka, Kamoun Aswad, Schuniz dan Khodria. Di Pakistan India, dan Sri Lanka dikenal sebagai Kalvanji, Kalunji, Azmut, Gurat, Aof dan Aosetta. Dalam bahasa Inggris tanaman ini dikenal dengan nama black seed, black cumin, black caraway, cinnamon flower, nutmeg flower dan love-in-a-mist (Salama 2010). Klasifikasi ilmiah jintan hitam (USDA 2011) adalah sebagai berikut: Kingdom : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Ranunculales 5 Famili : Ranunculaceae Genus : Nigella L. Spesies : Nigella sativa L. A B Gambar 1. Bunga dan Biji Jintan Hitam (Sumber: Gambar A: USDA 2011; Gambar B: Fatoni 2011) Biji jintan hitam diketahui mempunyai banyak manfaat bagi kesehatan. Karakteristik kimia biji jintan hitam menurut Rouhou et al. 2007 dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1.Karakteristik Kimia Biji Jintan Hitam Komposisi Dry matter (%) Oila Crude proteina Asha Potassiumb Magnesiumb Calciumb Phosphorusb Sodiumb Ironb Copperb Zincb Manganeseb Total carbohydratea a Dalam % basis bahan kering Dalam mg/kg dari bahan kering Sumber: Rouhou et al. (2007) b Jumlah 91.35 ± 0.26 28.48 ± 0.05 26.7 ± 0.35 4.86 ± 0.06 783 ± 6.61 235 ± 4.87 572 ± 21.5 48.9 ± 0.04 20.8 ± 2.21 8.65 ± 0.65 1.65 ± 0.03 8.04 ± 0.21 4.43 ± 0.11 40.0 ± 0.46 6 Kandungan asam lemak dari minyak jintan hitam didominasi oleh asam linoleat, asam oleat, dan asam palmitoleat. Perbandingan antara asam linoleat dan asam oleat lebih besar dari 2:1. Perbandingan antara asam linoleat dan asam oleat pada minyak jagung dan minyak kedelai dilaporkan juga memiliki perbandingan yang lebih besar dari 2:1 (Rouhou et al. 2007). Tabel 2. Komposisi Asam Lemak Minyak Jintan Hitam Asam Lemak Jumlah Myristic C14:0 0.35 ± 0.02 Myristoleic C14:1 Sedikit Palmitic C16:0 17.2 ± 0.15 Palmitoleic C16:1 1.15 ± 0.05 Margaric C17:0 Sedikit Margaroleic C17:1 Sedikit Stearic C18:0 2.84 ± 0.08 Oleic C18:1 25.0 ± 0.24 Linoleic C18:2 50.31 ± 0.25 Arachidic C20:0 0.14 ± 0.02 Eicosenoic C20:1 0.32 ± 0.04 Behenic C22:0 1.98 ± 0.08 Lignoceric C24:0 Sedikit Sumber: Rouhou et al. (2007) Jintan hitam diketahui memiliki berbagai macam khasiat antara lain anti bakteri, anti jamur, anti kanker, antioksidan, antiparasit, analgesik, anti koagulan dan juga agen hipoglikemik (Salama 2010). Aktivitas antimikroba jintan hitam berasal dari kandungan zat aktifnya yaitu thymoquinone dan longifolene. Dalam sebuah penelitian disebutkan bahwa thymoquinone dan longifolene mempunyai efek antibakteri terhadap S. aureus dengn nilai IC50 1,8µM (0,3µg/ml) dan 3,0 µM (0,6 µg/ml) (Bourgou et al. 2010). Thymoquinone mempunyai aktivitas antibakteri yang tinggi terhadap bakteri gram positif. Thymoquinone juga dilaporkan mempunyai efek sinergi dengan streptomycin dan gentamycin. Cahieb et al. (2011) menguji kemampuan thymoquinone secara in vitro dalam melawan bakteri dengan bakteri patogen yang ada pada manusia. Hasil dari percobaan tersebut dapat dilihat pada Tabel 3. 7 Tabel 3. Aktivitas Antimikroba Thymoquinone dibandingkan Gentamycin dan Erythromycin terhadap Bakteri Patogen pada Manusia Strain Bakteri batang gram negatif Escherichi coli ATCC 35218 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 Vibrio alginolyticus ATCC 33787 Vibrio paraheamolyticus ATCC 17802 Gram positive bacilli Bacillus cereus ATCC 14579 Listeria monocytogene ATCC 19115 Gram positive cocci Enterococcus faecalis ATCC 29212 Micrococcus luteus NCIMB 8166 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus epidermidis CIP 106510 a b Antimicrobial susceptibility Gentamycin Erythromycin Thymoquinone (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) a b MIC MBC aMIC bMBC aMIC bMBC 8 2 16 4 32 256 64 >256 >512 >512 >512 >512 2 32 8 8 64 16 >256 >256 128 >256 >256 256 >512 256 32 >512 >512 64 4 2 8 4 8 1 16 4 8 16 8 32 32 64 256 >256 32 64 2 16 4 8 32 8 4 16 16 16 32 32 8 8 8 64 16 8 Minimum Inhibitory Concentration Minimum Bactericidal Concentration Sumber: Chaieb et al (2011) Selain memiliki aktivitas antimikroba, jintan hitam juga diketahui memiliki aktivitas antifungi dan antihelmintika. Biji jintan hitam berkhasiat sebagai obat cacing (Hutapea 1994). Ela (2002) meneliti tentang efek ekstrak jintan hitam terhadap tikus yang mengalami schistosomiasis. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa thymoquinone yang merupakan kandungan dari jintan hitam memberikan efek mencegah aberasi kromosom pada mencit yang diinfeksi schistomiasis. Thymoquinone yang merupakan bahan yang terdapat pada jintan hitam juga dilaporkan memiliki efek protektif terhadap aberasi kromosom. Ekstrak jintan hitam juga mempunyai efek inhibisi terhadap khamir patogen Candida albican (Salama 2010). Jintan hitam di Arab Saudi biasanya digunakan sebagai obat untuk penyakit asma (Salama 2010). Penelitian yang dilakukan oleh Boskabady et al. (2007) menunjukkan bahwa jintan hitam memiliki efek pencegahan pada pasien penderita asma. Efek protektif dan kuratif terhadap penyakit asma diduga berasal dari efek anti histamin yang dimiliki oleh jintan hitam. Dalam penelitian yang lain Boskabady et al. (2008) menyatakan bahwa jintan hitam juga memberikan efek 8 protektif pada paru-paru marmut yang dipapar gas berbahaya yaitu sulfur mustard. Ramadhan (2011) menggunakan mencit untuk menguji efek analgesik jintan hitam. Mencit jantan yang terlebih dahulu diberi minyak jintan hitam lebih tahan terhadap rasa sakit yang disebabkan oleh asam asetat dibandingkan mencit jantan pada kelompok kontrol. Mencit betina mempunyai mekanisme yang berbeda dengan mencit jantan dalam merespon rasa sakit yang ditimbulkan oleh asam asetat. Namun demikian pemberian minyak jintan hitam juga menunjukkan efek yang sama dengan yang ditimbulkan pada mencit jantan. Efek analgesik jintan hitam berasal dari kandungan aktif jintan hitam yaitu thymoquinone. Efek antiinflamasi juga ditunjukkan oleh jintan hitam. Borgou et al. (2010) menguji efek antiinflamasi jintan hitam dengan mengukur kemampuan jintan hitam dalam menghambat pembentukan NO (nitrat oksida). NO merupakan radikal bebas yang dihasilkan oleh jaringan tubuh. NO bisa dijadikan indikator keadaan patologis beberapa jenis inflamasi. Thymoquinone terbukti sebagai bahan aktif jintan hitam yang mampu menghambat pembentukan NO. Seperti yang disebutkan di atas, jintan hitam juga memiliki efek antioksidan. Antioksidan berfungsi dalam menangkal radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan pada sel. Jintan hitam terbukti dapat menurunkan produksi ROS (reactive oxygen species) yang dapat merusak sel. Efek antioksidan dari jintan hitam berasal dari thymoquinone (Borgou et al. 2010). Boskabady et al. (2007) dalam penelitiannya mengamati efek jintan terhadap pasien penyakit asma. Dalam penelitian tersebut disimpulkan bahwa jintan hitam memiliki efek preventif terhadap asma. Terjadi peningkatan nilai PFT (Pulmonary Function Test) pada kelompok pasien asma yang diberi jintan hitam. Respon alergi merupakan salah satu penyebab penyakit asma. Jintan hitam dilaporkan dalam beberapa uji in vivo dilaporkan tidak memiliki efek samping. Hal ini tentu sangat membantu pengobatan asma tanpa menimbulkan alergi. Selain itu jintan hitam juga diketahui memiliki efek hepatoprotektif yang akan mendukung proses penyembuhan penyakit asma (Boskabady et al. 2007). 9 2.2 Madu Madu merupakan zat manis alami yang dihasilkan oleh lebah. Bahan baku madu adalah nektar. Nektar adalah senyawa kompleks yang dihasilkan oleh kelenjar tanaman dalam bentuk larutan gula. Perubahan nektar menjadi madu dimulai ketika lebah pekerja membawa nektar ke sarangnya. Untuk menghasilkan 1 kg madu, lebah harus mengumpulkan 120.000-150.000 tetes nektar atau 3-4 kg nektar dengan menempuh jarak 360.000-450.000 Km (Sarwono 2001). Berdasarkan asal nektarnya, madu dapat digolongkan menjadi tiga golongan yaitu madu flora, madu ekstra flora dan madu embun. Madu flora adalah madu yang bahan bakunya berasal dari bunga. Disebut madu monoflora jika hanya berasal dari satu jenis bunga dan poliflora jika berasal dari berbagai macam bunga. Madu ekstraflora adalah madu yang berasal dari luar daun, misalnya batang, cabang atau daun tanaman. Sedangkan madu embun adalah madu yang dihasilkan dari hasil suksesi serangga yang kemudian eksudatnya diambil oleh lebah madu (Sarwono 2001). Sejak zaman mesir kuno 2600 SM madu sudah dikenal sebagai obat. Diantaranya madu digunakan sebagai salep antiseptik untuk mengobati luka oleh bangsa Yunani, Romawi, Assyiria, dan Cina kuno. Madu juga dapat mencegah pertumbuhan mikroba seperti Salmonella, Shigella, E. Coli dan V. cholerae yang dapat menyebabkan diare. Apabila kandungan gula pada madu dihilangkan, maka madu mempunyai khasiat yang sama dengan streptomycin dalam membunuh bakteri (Sarwono 2001). Selain itu, madu juga mempunyai efek anti aritmia akibat keracunan katekolamin. Efek anti aritmia ini berasal dari aktivitas hiperadrenergik yang dimiliki oleh madu (Hussein 2003). Madu juga mempunyai efek protektif terhadap hati. Pada suatu penelitian dibuktikan bahwa madu mempunyai efek protektif terhadap kerusakan hati yang disebabkan oleh karbon tetraklorida (CCl4). Kerusakan hati akibat CCl4 dapat menyebabkan penurunan berat badan, penurunan asupan makanan serta penurunan bobot hati dan ginjal (El Denshary et al. 2011). 10 Tabel 4. Komposisi Kimia Madu per 100 gr Komposisi Kalori Kadar Air Protein Karbohidrat Jumlah 328 kal 17,2 g 0,5 g 82,4 g Sumber: Suranto (2004) Selain memiliki kandungan gula, madu juga memiliki kandungan nutrisi lain yang penting bagi tubuh. Madu mengandung garam mineral, protein, lemak, dan vitamin A, vitamin B dan vitamin C. Dalam 100 gr madu terkandung 294 kalori, 9,5 g karbohidrat, 24 g air, 16 mg fosfor, 5 mg kalsium dan 4 mg vitamin C (Sarwono 2001). 2.3 Mencit Klasifikasi mencit putih Arrington (1972): Kingdom : Animalia Filum : Chordata Kelas : Mamalia Ordo : Rodentia Family : Muridae Genus : Mus Species : Mus musculus Mencit merupakan hewan jinak, lemah, mudah ditangani, takut cahaya dan aktif pada malam hari. Mencit yang dipelihara sendiri makannya lebih sedikit dan bobot badan lebih ringan daripada yang dipelihara bersama-sama dalam satu kandang. Beberapa mencit mempunyai sifat kanibal (Penn 1999). Mencit bersifat sosial, aktif, dan cerdas. Memiliki kemampuan beradaptasi, ukuran yang kecil, reproduksi cepat dan karakteristik genetik yang luas juga menambah nilai tikus dan mencit sebagai hewan percobaan. 11 Gambar 2. Mencit (Mus musculus) Sumber: Sancheti 2011 Banyak strain berbeda dari mencit laboratorium yang telah dikembangkan oleh ahli genetik, beberapa strain seperti swiss webster dikembangkan secara outbreed, sementara beberapa strain lain seperti DDY, Balb/c, DBA, dan BC dikembangkan secara inbreed dengan gen-gen yang homozigot (Penn 1999). Tabel 5. Data Dasar Fisiologis Mencit Berat Dewasa Jantan Betina Berat Lahir Masa Kebuntingan Masa Hidup Suhu Tubuh Konsumsi Pakan Konsumsi Air Hemoglobin Rataan Kisaran Hematokrit Eritrosit Rataan Kisaran Limfosit Rataan Kisaran Sumber: Arrington (1972) 20-40 gr 18-35 gr 1,0-1,5 gr 18-21 hari 1-2 tahun 37,4 0C 4-5 gr/100 gr BB/ hari 4-7 gr/ 100 gr BB/ hari 14,8 gr% 10-19 gr% 41,5 % 9,3 x 106/µL 7,7-12,5 x 106/µL 8 x 103/ µL 4-12 x 103/ µL Mencit mempunyai lama hidup sekitar satu hingga dua tahun. Bahkan beberapa bisa mencapai usia tiga tahun dengan lama masa produktif selama sembilan bulan. Mencit mencapai dewasa kelamin pada usia 35 hari dan setalah usia delapan minggu, mencit sudah dapat dikawinkan. Pencapaian pubertas dan 12 siklus estrus dipengaruhi oleh paparan pheromon. Lama kebuntingan mencit adalah 18-21 hari dengan jumlah anak rata-rata enam ekor. Kebuntingan dapat diketahui pada hari ke 14 dengan cara palpasi, peningkatan bobot badan, dan perkembangan kelenjar mamae. Bobot badan mencit jantan dewasa adalah 20-40 gr dan bobot badan mencit betina dewasa adalah 18-35 gr. Mencit dapat dipelihara pada kotak dengan berbagai macam bahan seperti plastik (polipropilen atau polikarbonat), aluminium atau baja tahan karat (Smith & Mangkoewidjaja 1988). Biasanya mencit jantan mempunyai ukuran yang lebih besar dibandingkan dengan betina. Mencit memiliki kelenjar Harderian yang memproduksi pigmen porfirin yang dapat teramati di sekitar mata ketika hewan mengalami stress atau sedang sakit. Mencit tidak bisa muntah dan tidak memiliki kantung empedu. Mencit albino mengalami degenerasi retina dan memiliki kemampuan penglihatan yang lemah (Kahn 2010). 2.4 Organ sistem pernafasan mencit 2.4.1 Saluran nafas Secara sederhana fungsi utama sistem pernafasan adalah membawa oksigen (O2) masuk ke dalam tubuh dan membuang karbon dioksida (CO2) keluar dari tubuh. Semua organ yang terkait dengan pernafasan mempunyai tugas untuk mendukung fungsi tersebut. Oksigen dibutuhkan untuk proses metabolisme tubuh. Sedangkan karbon dioksida merupakan limbah dari proses metabolisme tubuh. Proses pertukaran oksigen dan karbonsioksida disebut pernafasan. Pernafasan dapat dibagi menjadi pernafasan internal dan pernafasan eksternal. Pernafasan internal adalah pernafasan yang terjadi pada tingkat sel, sedangkan pernafasan eksternal adalah pernafasan yang terjadi pada paru-paru. Selain fungsi utama sebagai penyalur udara dan pertukaran gas, sistem respirasi juga memiliki fungsi tambahan yaitu menghasilkan suara, penciuman, pengaturan suhu tubuh, ekskresi, keseimbangan asam basa dan tekanan darah (Coville 2002). Struktur dari sistem pernafasan berdasarkan fungsinya dapat dibedakan menjadi tiga bagian yaitu komponen konduktif, komponen transisi dan komponen 13 pertukaran gas. Komponen konduktif memanjang dari rongga hidung sampai bronkhiol. Komponen konduktif mempunyai fungsi sebagai penyalur udara. Komponen transisi yaitu komponen yang berfungsi sebagai penyalur (konduksi) sekaligus sebagai tempat pertukaran gas. Komponen pertukaran gas sesuai dengan namanya mempunyai fungsi sebagai tempat bertukarnya gas oksigen dan karbon dioksida. Bagian-bagian yang termasuk dalam komponen pertukaran gas yaitu ductus alveolar, alveolar sac dan alveoli (Banks 1993). 2.4.1 Paru-paru Paru-paru mempunyai bentuk yang menyerupai kerucut. Umumnya pada hewan paru-paru terbagi pada beberapa bagian yang yang disebut lobus. Lobus ditandai dengan adanya percabangan bronkhus yang besar. Paru-paru merupakan organ yang ringan dan berbentuk seperti spons. Paru-paru belum berfungsi pada saat hewan masih berada dalam kandungan. Paru-paru fetus mempunyai konsistensi yang padat dan lebih mirip hati. Pada saat hewan dilahirkan dan melakukan pernafasan untuk pertama kalinya maka paru-paru akan mengembang. Surfaktan merupakan substansi yang dihasilkan oleh sel alveolar tipe II yang menjaga agar paru-paru tetap mengembang (Coville 2002). Paru-paru dapat digolongkan menjadi dua bagian besar, yang pertama adalah susunan bronkhial sedangkan yang kedua adalah alveoli. Susunan bronkhus terbentuk dari pertumbuhan dan diferensiasi usus depan, sedangkan alveolar terbentuk dari jaringan mesenkhim. Jaringan-jaringan ini sudah terbentuk sejak masa embrional (Coville 2002; Aspinall 2004) Fungsi utama paru-paru adalah pertukaran gas. Paru-paru bisa dikatakan sebagai gabungan dari kelenjar tubuloalveolar yang mengekskresikan CO2 dan menukarnya dengan O2. Pertukaran oksigen dan karbon dioksida pada paru-paru terjadi di alveoli. Alveoli berbentuk kantung dengan dinding yang tipis. Alveoli dikelilingi oleh jaring-jaring pembuluh darah kapiler. Dinding alveoli yang tipis serta dinding pembuluh darah kapiler yang juga tipis memungkinkan terjadinya pertukaran gas pada alveoli (Coville 2002). 14 2.4.2 Histologi Paru-paru Sel penyusun utama paru-paru adalah sel alveolar tipe I. Pada sel inilah terjadi pertukaran antara oksigen dan karbon dioksida. Sel ini merupakan sel yang berbentuk pipih. Inti dari sel alveolar tipe I menonjol ke dalam kantung alveol. Sel alveolar tipe I mempunyai fungsi sebagai tempat pertukaran oksigen dan karbon dioksida. Selain sel alveolar tipe I pada paru-paru juga terdapat sel alveolar tipe II dan otot polos. Sel alveolar tipe II merupakan sel sekretori. Pada mikroskop cahaya sel ini terlihat berbentuk bulat atau kubus. Sel alveolar tipe II mempunyai fungsi mengeluarkan sekreta yang disebut surfaktan. Surfaktan mempunyai fungsi untuk menjaga tegangan permukaan untuk mencegah kolapsnya paru-paru (Akers 2008). Gambar 3. Histologi normal paru-paru. BV menandakan pembuluh darah, AV menandakan saluran nafas dan EP menandakan Epitel. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber: Olmez et al. 2009) 2.4.3 Sistem Pertahanan pada Paru-paru Sistem pertahan pada paru-paru secara umum dapat dibagi menjadi sistem pertahanan spesifik dan sistem pertahanan non spesifik. Sistem pertahanan non spesifik terdiri silia, mukus yang dihasilkan, dan refleks batuk. Apabila sistem pertahanan non spesifik tidak mampu menangkal antigen yang masuk maka antigen akan berhadapan dengan sistem pertahanan spesifik. 15 Antibodi spesifik terdiri dari immunoglobulin yang dihasilkan oleh sel limfoid yang banyak tersebar pada saluran pernafasan. Sel-sel limfoid ini berupa limfosit yang tersebar secara acak. Pada saluran pernafasan bagian atas limfosit banyak menghasilkan IgA. Sedangkan pada bronkhiol dan alveoli sekreta yang dihasilkan lebih banyak mengandung IgG. IgA bertugas untuk mencegah penempelan antigen pada dinding saluran pernafasan sehingga antigen tidak bisa menimbulkan kerusakan yang lebih parah. Sedangkan IgG yang banyak dihasilkan pada alveoli dan bronkhioli bertugas ketika terjadi peradangan yang akut transudasi serum protein (Tizard 2008). Gambar 4. Mekanisme Sistem Pertahanan pada Paru-paru (Sumber: Bals 1999) Pada dinding alveol banyak sekali terdapat makrofag. Dalam menjalankan tugasnya makrofag bisa bersifat tetap (tidak berpindah tempat) atau bergerak. Karena makrofag dapat bergerak bebas maka makrofag bisa bekerja secara maksimal dalam membuang sisa antigen pada paru-paru. Makrofag yang bergerak ini dapat meninggalkan paru-paru karena terbawa oleh mukus ke arah laring atau menembus sel alveolar dan masuk ke dalam pembuluh limfe paru-paru (Akers 2008). Conrod (1989) dalam penelitiannya juga menyebutkan bahwa alveolar 16 makrofag merupakan sel yang utama yang melindungi paru-paru dari mikroba yang masuk ke dalam paru-paru. Alveolar makrofag membunuh mikroba baik dengan mekanisme oksidatif maupun non-oksidatif. Selain itu, alveolar makrofag juga mensekresikan faktor anti mikrobial termasuk lisozim, peptida dan transferrin yang memungkinkan alveolar makrofag membunuh mikroba secara ekstraselular. Selain berfungsi untuk membunuh mikroba yang masuk atau terhirup ke paru-paru, sekresi yang dikeluarkan alveolar makrofag juga berfungsi sebagai inisiasi proses peradangan untuk membasmi mikroba secara tuntas. Heitmann (1999) menggunakan mencit unuk mengamati karakteristik immunohistologi dari paru-paru mencit sehat dan melihat jenis sel radang pada paru-paru mencit saat peradangan akut terjadi. Dalam penelitiannya tersebut Heitmann menggunakan Haemophilus influenza tipe b (Hib) yang diberikan secara intratrakhea. Pada paru-paru mencit yang sehat populasi sel radang didominasi oleh sel T, dan sel CD4+. Saat peradangan akut terjadi, jumlah neutrofil pada jaringan parenkhim dan BALT meningkat. Peningkatan neutrofil terjadi pada satu jam pertama setelah infeksi bakteri dan kembali ke jumlah minimum dalam waktu satu minggu. 2.4.5 Perubahan Histopatologi Paru-Paru Pada Penderita Asma Asma didefiniskan sebagai peradangan kronis pada saluran pernafasan yang biasanya dihubungkan dengan kejadian peningkatan sel radang. Gejala klinis yang timbul adalah memendeknya nafas, batuk, sesak nafas, dan mengeluarkan bunyi yang khas saat bernafas (mengi) (Barrios et al. 2006). Olmez et al. 2009 dalam penelitiannya menyebutkan bahwa terjadi beberapa perubahan pada struktur histopatologi pada mencit yang digunakan sebagai model penyakit asma. Dalam penelitiannya tersebut Olmez et al. (2009) mengamati perubahan ketebalan membran basal, ketebalan otot polos subepitelial, ketebalan jaringan epitel, jumlah sel mast, dan jumlah sel goblet. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa pada mencit yang menderita asma terjadiperubahan ketebalan membran basal, ketebalan otot polos subepitelial, ketebalan jaringan epitel, jumlah sel mast, dan jumlah sel goblet. 17 Gambar 5. Perubahan yang terjadi pada jaringan paru-paru mencit model penyakit asma. Bagian yang ditunjuk oleh tanda panah adalah bagian epitel yang menebal. Bagian yang ditunjuk dengan tanda GC adalah peningkatan jumlah sel Goblet. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber Olmez et al. 2009) Gambar 6. Perubahan yang terjadi pada jaringan paru-paru mencit model penyakit asma. Bagian yang ditunjuk dengan tanda GC adalah peningkatan jumlah sel Goblet. Bagian yang ditandai dengan tanda elips menunjukkan infiltrasi sel mononuklear. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber Olmez et al. 2009). 18 Perubahan yang dapat diamati pada preparat histopatologi organ paru-paru yang menderita asma menurut Yamauchi (2006) terdapat pada beberapa bagian. Bagian yang pertama adalah bagian lumen saluran pernafasan. Pada penderita asma, saluran pernafasan akan berisi eksudat. Bagian yang kedua yang dapat diamati pada penderita asma adalah lapisan mukus pada bronkhus. Pada mukosa bronkhus juga terdapat eksudat. Selain eksudat juga terlihat kelainan sel-sel epitel pada mukosa bronkhus. Bagian terakhir adalah dinding bronkhus. Pada penderita asma, dinding bronkhus akan mengalami kelainan berupa hipertrofi otot polos. Emfisema dan asma biasanya dikelompokkan dalam satu kelompok yaitu chronic obstructive pulmonary dissease (COPD). Emfisema adalah perluasan ruangan alveol yang terjadi akibat kerusakan dinding alveol tetapi tanpa diikuti fibrosis. Berdasarkan lokasinya emfisema dapat dibedakan menjadi emfisema sentrilobular, emfisema pan-asinar dan emfisema lokal. Emfisema sentrilobular biasanya disebabkan oleh asap rokok. Emfisema jenis ini banyak sekali ditemui pada paru-paru perokok. Emfisema sentrilobular ditandai dengan emfisema yang terjadi di bronkhus terminal hingga ujung bronkhus. Berbeda dengan emfisema sentrilobular, pada emfisema pan-asinar, kerusakan dinding alveol tidak hanya terjadi di dekat bronkhus terminal, tetapi terjadi di seluruh bagian alveolar. Emfisema lokal adalah emfisema yang hanya terjadi pada daerah-daerah tertentu pada paru-paru, misalnya pada apeks paru-paru (Rubin 2009). 19 BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan. Pemeliharaan hewan coba dan pemberian perlakuan pada hewan coba dilakukan di fasilitas kandang hewan percobaan Bagian Patologi, departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Sedangkan pembuatan preparat Histopatologi dilakukan di Laboratorium Histopatologi, Bagian Patologi, departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Dua belas ekor mencit jantan usia empat minggu 2. Obat-obatan untuk persiapan hewan percobaan sebelum dilakukan perlakuan seperti obat anthelmintik (Albendazole 5%), antibiotik (Clavamox®) dan anti protozoa (Flagyl®). 3. Minyak jintan hitam dan kombinasi minyak jintan hitam dengan madu (sediaan komersial). 4. Kebutuhan mencit seperti pakan dan air minum. 5. Bahan-bahan yang dperlukan untuk keperluan nekropsi dan pengambilan sampel organ seperti kertas tisu, ether, buffered neutral formaline (BNF) 10%, xylol, alkohol, alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, parafin, Mayer’s hematoksilin, lithium karbonat, eosin, larutan albumin, air hangat dengan suhu 45°C, larutan periodic acid 1%, schiff reagent, sodium bisulfit 10%, 1 N HCl dan aquadest. 20 Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1. Alat yang dibutuhkan dalam pemeliharaan mencit berupa boks yang dimodifikasi menjadi kandang, timbangan digital, sonde lambung, dan syringe 1 ml. 2. Alat-alat nekropsi berupa skalpel, gunting pinset dan pot plastik. 3. Alat pembuatan preparat histologi seperti tissue basket, gelas objek, cover glass, spidol, label, tissue cassette, Sakura® automatic tissue processor, Sakura® tissue embedding console, inkubator, dan mikrotom. 4. Mikroskop cahaya dan digital electronic eyepiece camera serta satu unit komputer untuk pengambilan foto preparat histologi. 5. Perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows® untuk penghitungan sel. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Persiapan Hewan Coba Penelitian ini menggunakan dua belas ekor mencit jantan berusia empat minggu. Mencit dipelihara dalam sebuah boks plastik dengan alas kain selama dua bulan. Penggunaan kain dimaksudkan untuk mengurangi resiko yang ditimbulkan akibat debu apabila menggunakan alas sekam atau serbuk gergaji. Sebelum diberikan perlakuan terlebih dahulu dilakukan adaptasi dengan mengistirahatkan mencit selama dua hari. Setelah dilakukan adaptasi mencit diberikan antibiotik, antijamur dan obat cacing untuk menetralkan infeksi. Antibiotik yang digunakan adalah Clavamox® yang berisi kombinasi amoxicillin dan asam clavulanat. Dosis antibiotik yang diberikan adalah 250 mg/ kg BB. Obat cacing yang diberikan adalah obat cacing jenis albendazole dengan konsentrasi 5% dengan dosis 10 mg/ kg BB. Selain itu juga diberikan obat anti protozoa yaitu Flagyl® 500mg yang memmiliki kandungan bahan aktif metronidazole. Pemberian dilakukan selama lima hari berturut-turut dengan dosis pemberian 30 mg/ kg BB. Setelah pemberian obat-obatan selesai dilanjutkan dengan perlakuan yang berlangsung selama dua bulan. 21 3.3.2 Kandang Hewan Coba Hewan coba dipelihara dalam sebuah boks plastik. Pada boks tersebut diletakkan wadah pakan dan wadah minum. Setiap hari dilakukan desinfeksi pada boks, wadah pakan, dan wadah minum menggunakan cairan desinfektan (Bayclin®). Agar hewan coba merasa nyaman maka pada boks diletakkan potongan kain kecil-kecil yang juga didesinfeksi menggunakan Bayclin® setiap hari. A B Gambar 7 Kandang Hewan coba. A Pengelompokan mencit berdasarkan perlakuan B Kandang mencit yang menggunakan alas kain 3.3.3 Pakan dan Minum Pemberian pakan dilakukan satu kali dalam satu hari dengan jumlah 5 gr/ekor/hari. Jumlah tersebut sudah melebihi jumlah kebutuhan pakan untuk satu ekor mencit per hari (Arrington 1972). Pemberian jumlah pakan yang berlebih bertujuan untuk mengantisipasi pakan yang terbuang ketika hewan coba berebut pakan. Pakan yang diberikan merupakan pakan khusus untuk mencit. Air minum diberikan secara ad libitum. Air yang digunakan merupakan air layak minum. 3.3.4 Kelompok Perlakuan Penelitian Penelitian ini menggunakan 12 ekor mencit jantan. Mencit tersebut dibagi menjadi empat kelompok. Masing masing kelompok terdiri dari 3 ekor mencit jantan. Kelompok yang pertama merupakan kelompok kontrol negatif (dicekok air 22 minum) selanjutnya disebut dengan kelompok kontrol, kelompok kedua diberi perlakuan dengan dicekok ekstrak minyak jintan hitam dengan dosis 0,1 ml/ekor/hari selanjutnya disebut dengan kelompok HS 0.1. Kelompok ketiga diberi perlakuan dengan dicekok ekstrak minyak jintan hitam dengan dosis 0,2 ml/ekor/hari selanjutnya disebut dengan kelompok HS 0.2. Kelompok keempat diberi perlakuan dengan dicekok sediaan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dengan madu dengan perbandingan 1:20, selanjutnya disebut dengan kelompok HS-Madu. Dosis sediaan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dengan madu yang diberikan adalah 0,3 ml/ekor/hari (jumlah madu = 0,285 ml, jumlah ekstrak minyak jintan hitam = 0,015 ml). Dosis yang digunakan merupakan konversi dari dosis yang biasa digunakan pada manusia. Pemberian perlakuan ini dilakukan setiap hari selama dua bulan. 3.3.5 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ Setelah masa perlakuan selesai hewan coba dimatikan dengan cara dislokasio atlanto-occipitalis. Hewan kemudian dinekropsi untuk diambil sampel organ paru-parunya. Organ ini kemudian akan diproses menjadi preparat histopatologi yang kemudian akan diamati perubahan histopatologinya. Dari perubahan histopatologi organ tersebut dapat diketahui efek yang ditimbulkan oleh ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa). Segera setelah dilakukan pengambilan, sampel organ langsung difiksasi ke dalam Buffer Neutral Formalin (BNF) 10%. Fiksasi ini dimaksudkan untuk mencegah kerusakan jaringan karena proses pembusukan. 3.3.6 Pembuatan Sediaan Histopatologi Sampel organ yang telah difiksasi dalam cairan BNF 10% kemudian ditrimming dan dimasukkan dalam tissue basket dan kembali difiksasi dalam cairan BNF 10%. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan cara merendam sampel organ secara berturut-turut dalam larutan alkohol konsentrasi bertingkat 70%, 80%, 90%, alkohol absolut dua kali ulangan, silol dua kali ulangan, dan parafin dua kali ulangan. Perendaman pada masing-masing larutan dilakukan selama dua 23 jam. Perendaman dilakukan secara otomatis dengan menggunakan alat Sakura® tissue processor selama satu malam. Setelah melalui serangkaian proses di atas, potongan organ dimasukkan kedalam alat pencetak yang berisi parafin cair (Sakura® tissue embedding console). Letak potongan ditahan agar posisi potongan organ tetap berada di tengah. Setelah mulai membeku, kembali ditambahkan parafin hingga alat pencetak penuh lalu parafin dibiarkan mengeras dan diberi label. Selanjutnya blok parafin yang berisi potongan organ dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5µm. Hasil potongan akan berbentuk pita (ribbon). Untuk menghilangkan lipatan akibat pemotongan pada pita, pita diletakkan di atas permukaan air hangat (450C). Sediaan diangkat dari permukaan air dengan menggunakan gelas objek yang sebelumnya telah dilapisi dengan larutan albumin sebagai perekat. Selanjutnya sediaan dikeringkan pada suhu 600C selama satu malam. Selanjutnya preparat dimasukkan ke dalam larutan silol untuk dideparafinasi sebanyak dua kali. Setelah proses deparafinasi dilakukan proses rehidrasi. Proses rehidrasi diawali dengan mencelupkan preparat ke dalam larutan alkohol absolut sampai larutan alkohol 80%. Pencelupan pada masing-masing larutan dilakukan selama dua menit. Setelah melalui proses rehidrasi preparat dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 3.3.7 Pewarnaan Sediaan Histopatologi Proses selanjutnya adalah proses pewarnaan sediaan histopatologi. Pada penelitian ini dilakukan dua pewarnaan yaitu pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE) dan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS). Pewarnaan HE dilakukan agar perubahan-perubahan umum yang terjadi pada jaringan dapat diamati. Pewarnaan PAS dilakukan agar perubahan pada sel goblet dapat terlihat. Pewarnaan hematoksilin dilakukan lebih dulu dan dilanjutkan dengan pewarnaan eosin. Pewarnaan hematoksilin dilakukan dengan menggunakan pewarna Mayer’s Hematoksilin selama delapan menit, kemudian dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan 24 air, dan diwarnai dengan pewarna eosin selama 2 menit. Selanjutnya sediaan dicuci dengan menggunakan air mengalir untuk menghilangkan pewarna eosin yang berlebih sebelum akhirnya diangkat dan dikeringkan. Setelah sediaan kering, sediaan dicelupkan ke dalam alkohol 90% sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut I sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, silol dua kali ulangan masing-masing selama dua menit. Setelah itu sediaan ditetesi perekat permount dan kemudian ditutup dengan gelas penutup (cover glass) dan dibiarkan kering. Setelah itu sediaan dapat diamati dengan mikroskop cahaya. Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) merupakan pewarnaan khusus. Sediaan yang sudah dideparafinasi digenangi dengan periodic acid 1% selama 10 menit. Periodic acid 1% yang digunakan harus dalam keadaan segar atau baru dibuat. Setelah digenangi dengan periodic acid 1% sediaan dicuci dengan akuades. Sediaan digenangi kembali dengan Schiff reagent selama 20 menit kemudian dibilas dengan air sulfit sebanyak tiga kali. Setelah itu sediaan dicuci dengan air mengalir dan bilas menggunakan akuades. Setelah sediaan dibilas dengan akuades dilakukan proses dehidrasi dan sediaan ditutup dengan menggunakan cover glass dan diamati menggunakan mikroskop cahaya. 3.3.7 Pengamatan Sediaan Histopatologi Pengamatan sediaan histopatologi dilakukan dengan mikroskop cahaya dan dibantu dengan menggunakan alat digital electronic eyepiece camera yang terhubung dengan komputer. Pengamatan ini bertujuan untuk melihat perubahan histopatologi yang terjadi pada organ paru-paru. Pengamatan dilakukan baik terhadap saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru maupun jaringan parenkhim paru-paru. Pembesaran yang digunakan disesuaikan dengan keadaan preparat agar pengamatan dapat dilakukan dengan optimal. Pengamatan terhadap saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru dilakukan dengan menghitung jumlah saluran pernafasan (bronkhus dan bronkhioli) yang dapat terlihat pada lapang pandang 6,32 mm2 semua preparat histopatologi serta mengamati perubahan-perubahan yang terjadi. Perubahan pada 25 saluran nafas yang diamati adalah perubahan epitel dan hadirnya cairan pada saluran nafas serta penghitungan jumlah sel goblet sepanjang 1000 µm, pada 5 lapang pandang. Khusus untuk penghitungan sel goblet digunakan pewarnaan khusus yaitu pewarnaan PAS. Pengamatan keadaan bronkhus associate lymphoid tissue (BALT) pada saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru. Pengamatan meliputi jumlah, diameter dan kepadatan sel limfoid. Selain itu juga diamati perubahan ketebalan yang terjadi pada jaringan otot polos di sekitar saluran nafas (Pembesaran mikroskop yang digunakan pada pengamatan perubahan epitel pada saluran nafas serta penghitungan jumlah saluran pernafasan maupun pengamatan BALT adalah 4 X 10. Sedangkan untuk penghitungan sel goblet digunakan pembesaran 40 X 10. Perubahan jaringan parenkhim paru-paru yang diamati adalah emfisema, fokus-fokus radang, serta keadaan kongesti maupun hemoragi. Pembesaran yang digunakan pada pengamatan emphisema organ paru-paru adalah 40 X 10. Pengamatan terhadap fokus-fokus radang dilakukan dengan mengukur luas wilayah radang dibandingkan dengan luas lapang pandang. Selain luas wilayah radang juga diamati jenis-jenis sel radang yang terdapat pada fokus-fokus radang. Pengamatan terhadap fokus-fokus radang menggunakan pembesaran 40 X 10. Pengamatan keadaan kongesti dan hemoragi dilakukan dengan pembesaran 20 X 10. Pengamatan jaringan otot polos pada saluran pernafasan menggunakan pewarnaan HE dan diamati pada pembesaran 4 X 10. Pengamatan perubahanperubahan histopatologi yaitu ketebalan otot polos yang terjadi dibantu perangkat lunak ImageJ. Penggunaan perangkat lunak ini bertujuan untuk memudahkan pengamatan dan pengukuran. Hasil dari pengamatan ini merupakan indikator yang bisa menggambarkan efek yang ditimbulkan oleh jintan hitam serta kombinasi jintan hitam dan madu. 3.3.8 Analisis Statistik Hasil pengamatan berupa peruahan-perubahan yang terjadi pada saluran nafas, jumlah sel goblet pada saluran nafas, perubahan yang terjadi pada BALT, 26 jenis sel radang pada fokus-fokus radang, perubahan pada jaringan otot, dan perubahan-perubahan lain berupa emfisema, kongesti dan hemoragi. Hasil pengamatan kemudian dianalisa secara statistik menggunakan metode One Way ANOVA dan uji lanjut Duncan untuk melihat perbedaan yang nyata antar kelompok perlakuan. 27 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh pemberian ekstrak jintan hitam terhadap fungsi pernafasan dapat dipelajari dari gambaran histopatologi organ paru-paru dengan adanya perubahanperubahan yang terjadi pada jaringan organ tersebut. Perubahan pada paru-paru dilihat dengan mengamati sistem saluran pernafasan, bronkhus, bronkhiolus dan jaringan parenkhim paru-paru yaitu alveol. Pada penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap bronkhus dan bronkhiolus meliputi adanya eksudat pada saluran nafas, dan jumlah sel goblet pada bronkhiolus. Selain itu juga dilakukan pengamatan terhadap ketebalan otot polos di sekitar bronkhus. Pengamatan terhadap Bronchial Associated Lymphoid Tissue (BALT) meliputi luas fokus BALT pada bronkhus serta kepadatan sel BALT tersebut. Pengamatan terhadap jaringan parenkhim paru-paru meliputi pengamatan terhadap keadaan kongesti dan hemoragi serta pengamatan terhadap fokus-fokus radang. Selain itu juga dilakukan pengamatan terhadap emfisema. 4.1 Eksudat pada bronkhus dan bronkhiolus Pengamatan terhadap adanya eksudat di saluran nafas yaitu bronkhus dan bronkhiolus dilakukan pada perbesaran 10x10. Pengamatan dilakukan pada semua bronkhus dan bronkhiolus pada jaringan paru di seluruh sediaan. Perhitungan dilakukan dengan membagi jumlah bronkhus dan bronkhiolus yang lumennya berisi eksudat dengan jumlah bronkhus dan bronkhiolus yang ditemukan secara keseluruhan pada semua bidang sayatan sediaan. Hasil pengamatan terhadap bronkhus dan bronkhiolus disajikan pada tabel 8. Tabel 8 Persentase bronkhus dan bronkhiolus yang bereksudat pada mencit yang diberi perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Persentase bronkhus yang Persentase bronkhiolus bereksudat (%) yang bereksudat (%) a Kontrol 4.77±0.29 4.68±0.00a HS 0.1 4.74±0.23a 4.60±0.10a a HS 0.2 4.93±0.07 4.67± 0.00a HS-Madu 4.74±0.14a 4.60±0.13a Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan pada taraf p<0.05 28 Pengamatan terhadap saluran nafas baik bronkhus dan bronkhiolus menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan tidak ditemukan adanya tanda-tanda udema pulmonum serta peradangan pada bronkhus maupun bronkhiolus. Adanya eksudat atau cairan dalam saluran pernafasan merupakan indikasi adanya udema pulmonum, aktivasi sel goblet pada epitel penutup saluran pernafasan akibat bronkhitis dan bronkhiolitis (Mc Gavin 2007). Secara umum eksudat yang ditemukan pada bronkhus dan bronkhiolus hanya dalam jumlah yang kecil (terlihat pada gambar 8). Eksudat dalam jumlah yang kecil bisa disebabkan karena proses fisiologis seperti adanya regenerasi epitel permukaan lumen saluran nafas atau mukus pada saluran nafas (Akers 2008). Permukaan saluran nafas adalah salah satu pintu masuk patogen ke dalam sistem pernafasan. Permukaan saluran pernafasan mempunyai sistem pertahanan yang terdiri dari mukus, lysozim, immunoglobulin dan mukosiliari. Mukus adalah campuran kompleks dari air, glikoprotein, imunoglobulin, lipid dan elektrolit. Mukus dihasilkan oleh sel goblet, sel serous, kelenjar submukosa dan cairan dari proses transport air dan ion. Mukus pada saluran nafas berfungsi sebagai pertahanan pada permukaan saluran nafas. Mukus akan mengikat partikel-partikel yang terbawa oleh udara pernafasan. Mukus juga mempunyai kemampuan untuk menetralkan gas-gas yang terdapat pada udara pernafasan (Mc Gavin 2007). Selain mukus, pada saluran nafas juga terdapat liozim dan antibodi. Lisozim merupakan bahan anti mikrobial yang berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang terbawa oleh udara pernafasan. Lisozim berupa enzim yang dapat membunuh mikroba. Immunoglobulin (Ig) merupakan protein yang mempunyai aktifitas sebagai antibodi. Immunoglobulin yang terdapat pada mukosa saluran nafas bagian atas adalah immunoglobulin A (IgA). IgA tidak bersifat bakterisidal walaupun IgA mempunyai kemampuan untuk menetralkan beberapa virus dan enzim bakteri tertentu. IgA diproduksi pada sel plasma pada saluran intestinal, kemudian didistribusikan ke saluran respirasi dan kelenjar mamae. IgA berperan untuk menghambat perlekatan pada mukosa (Tizard 1982). Mukosiliari berfungsi untuk membuang gas dan partikel yang menempel pada mukus saluran nafas. Mukosiliari berperan sebagai pertahanan utama pada 29 permukaan saluran nafas. Sistem pertahanan mukosiliari berupa selimut mukosiliari yang akan bergerak secara cepat dan bergelombang untuk mengeluarkan partikel keluar dari saluran pernafasan. Mukosiliari juga mencegah masuknya gas berbahaya kedalam paru-paru dengan cara mengencerkannya (McGavin 2007). Peningkatan produksi mukus pada saluran pernafasan dapat dipicu oleh adanya proses peradangan. Jintan hitam diketahui memiliki khasiat sebagai anti radang. Bahan aktif yang terkandung dalam jintan hitam yaitu thymoquinone dapat menghambat terbentuknya mediator inflamasi yaitu asam arachidonat. Thymoquinone terbukti dapat menghambat pembentukan cyclooxigenase dan 5cyclooxigenase dalam proses sintesa asam arachidonat (Houghton et al. 1995). Adanya aktivitas anti radang ini diduga berpengaruh terhadap eksudat yang terdapat pada saluran nafas mencit. Selain aktivitas anti radang, jintan hitam dan madu juga mempunyai aktivitas anti bakteri yang bisa menurunkan resiko terjadinya peradangan oleh bakteri (Estevinho 2008 dan Chaieb et al. 2011). Gambaran histopatologi eksudat pada saluran nafas dapat dilihat pada gambar 8. Gambar 8 Gambaran histopatologi bronkhus yang bereksudat sedikit (tanda panah). Pewarnaan HE perbesaran 4x10. Gambar histopatologi diambil dari kelompok mencit kelompok kontrol 30 4.2 Sel Goblet pada Bronkhiolus Sel goblet merupakan sel yang menghasilkan mukus pada saluran pernafasan. Sel goblet mempunyai inti yang terletak di bagian dasar sel. Tekanan dari mukus yang dihasilkan oleh sel goblet membuat inti sel ini terletak di bagian dasar sel. Organel sel pada sel goblet seperti organel sel pada umumnya, terdapat badan golgi, rER dan mitokondria. Pada umumnya, sel goblet mensekresikan yang berupa glikoprotein sulfat sebagai komponen utama dari mukus (Dellmann 1998). Keadaan sel goblet diamati pada perbesaran 40x10, pengamatan dilakukan pada deretan epitel bronkhiolus. Sel goblet dibedakan dengan sel epitel menggunakan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS). Pewarnaan PAS akan mewarnai mukus yang dihasilkan oleh sel goblet (Aughey 2001). Penghitungan sel goblet dilakukan pada deretan epitel sekeliling lumen bronkhiolus, kemudian ukuran keliling lumen bronkhiolus diukur menggunakan perangkat lunak image J. Sediaan histopatolgi dihitung dihitung pada 5 lapang pandang pengamatan dengan menggunakan perbesaran 40x 10. Hasil penghitungan terhadap sel goblet dapat dilihat pada tabel 9. Data disajikan dalam satuan sel goblet per 1000 m. Tabel 9 Jumlah Sel Goblet Pada Bronkhiolus Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Jumlah Sel Goblet (/1000 µm) Kontrol 19.47 ± 17.33a 39.47 ± 29.81b HS 0.1 HS 0.2 15.60 ± 16.04a HS-Madu 13.40 ± 9.88a Keterangan: Huruf superscript pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Kelompok HS 0.1 menunjukkan rata-rata jumlah sel goblet tertinggi. Tingginya jumlah sel goblet pada kelompok HS 0.1 dapat disebabkan karena dosis jintan hitam yang diberikan (0.1 ml/ekor/hari) belum cukup untuk memberikan efek perlindungan terhadap saluran nafas. Hal ini dibuktikan dengan hasil yang ditunjukkan oleh kelompok dengan dosis yang lebih tinggi (kelompok HS 0.2 dengan dosis 0.2 ml/ekor/hari) yang menunjukkan jumlah sel goblet yang lebih rendah. Tingginya jumlah sel goblet pada kelompok HS 0.1 bisa juga disebabkan karena adanya kejadian infeksi. Mencit yang digunakan dalam penelitian ini sudah diberikan masa adaptasi terlebih dahulu namun tidak menutup 31 kemungkinan terjadi infeksi atau iritasi yang disebabkan oleh agen-agen yang terbawa udara pernafasan karena udara yang masuk adalah udara bebas. Adanya perbedaan respon individu juga menyebabkan kelompok HS 0.1 menunjukkan hasil jumlah sel goblet yang lebih tinggi dibandingkan kelompok lainnya. Aktivasi sel goblet mempunyai hubungan dengan kejadian peradangan yang terjadi pada saluran nafas dan paru-paru. Penelitian yang dilakukan oleh Saetta dan Turato (2000) menunjukkan bahwa jumlah sel goblet dan sel radang meningkat berbanding lurus pada individu perokok. Infiltrasi sel radang akan menyebabkan peningkatan aktivasi sel goblet dan produksi mukus yang menyebabkan terjadinya gangguan seperti obstruksi saluran nafas. Jumlah sel goblet akan meningkat apabila terjadi peradangan. Perbedaan jumlah sel goblet pada kelompok yang diberi perlakuan dipengaruhi oleh aktifitas antiinflamasi bahan aktif yang terkandung dalam jintan hitam yaitu thymoquinon. Aktifitas anti inflamasi jintan hitam berasal dari kemampuan thymoquinone dalam menghambat pembentukan eicosanoid. Thymoquinone bekerja dengan cara menghambat cyclooxigenase dan 5-lipooxygenase dari metabolisme asam arachidonat (Houghton et al. 1995). Penelitian yang dilakukan oleh Rostika (2012) pada saluran pencernaan mencit yang diberi perlakuan jintan hitam dan kombinasi jintan hitam dan madu juga menunjukkan penurunan jumlah sel goblet yang berarti dapat memberikan efek yang baik bagi saluran pernafasan. El Gazzar et al. (2006) meneliti efek pemberian thymoquinone dari jintan hitam pada tikus yang menderita peradangan saluran nafas. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa thymoquinone secara signifikan dapat menghambat radang paru-paru yang dinduksi alergen eosinofilik serta penurunan sel goblet. Gambaran histopatologi sel goblet saluran pernafasan mencit dari masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada gambar 9. 32 Kontrol HS 0.2 HS 0.1 HS Madu Gambar 9. Gambaran histopatologi sel goblet dengan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) perbesaran 40X10. Sel Goblet ditandai dengan tanda panah. 4.3 Bronchial-Associated Lymphoid Tissue (BALT) Bronchial-associated lymphoid tissue (BALT) termasuk ke dalam kelompok organ limfoid sekunder. Selain BALT ada juga GALT yaitu Gutassociated lymphoid tissue. BALT berisi sel-sel limfoid yang bertugas yang bertanggung jawab terhadap respon imun yang diperantarai sel (McGavin 2007). Mencit memiliki BALT yang lebih sedikit jika dibandingkan kelinci dan marmut (Cesta 2006). Pengamatan keberadaan BALT dilakukan dengan menghitung rata-rata luas fokus BALT yang terlihat di sekitar bronkhus dan bronkhiolus pada setiap lapang pandang. Selain keberadaan fokus BALT juga dihitung rataan kepadatan sel limfoid pada BALT. Penghitungan luas fokus BALT dilakukan pada pembesaran 4x10. Pengamatan terhadap kepadatan sel BALT dilakukan pada pembesaran 100 X 10. Hasil pengamatan terhadap keberadaan fokus BALT dan kepadatan sel BALT dapat dilihat pada tabel 10. 33 Tabel 10 Hasil Pengamatan BALT pada Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Rata-rata luas fokus BALT (µm2) 2.76 ± 0.53a 2.69 ± 0.49a 3.08 ± 0.08a 2.49 ± 0.59a Kepadatan sel limfoid pada fokus BALT (luas lapang pandang 1000 µm2) 4.68 ± 0.07ab 4.68 ± 0.06ab 4.76 ± 0.03b 4.64 ± 0.06a Keterangan: Huruf superscript pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Gambaran histopatologi BALT pada mencit kelompok kontrol dapat dilihat pada gambar 10. Gambar 10. Gambaran histopatologi keberadaan fokus BALT (tanda panah) disekitar bronkhioli dengan pewarnaan HE, perbesaran 4x10 Hasil pengamatan luas fokus BALT tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan namun kelompok kontrol menunjukkan kecenderungan hasil yang lebih tinggi dibandingkan kelompok perlakuan. Pengamatan terhadap kepadatan sel limfoid BALT menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok. Kelompok HS 0.2 menunjukkan rata-rata paling tinggi dibandingkan dengan kelompok yang lainnya. Tingginya kepadatan sel limfoid BALT pada kelompok HS 0.2 bisa disebabkan karena dosis yang diberikan sudah melewati dosis efektif untuk memberikan efek sebagai immunomodulator. 34 Kelompok yang diberi perlakuan jintan hitam dengan dosis jintan hitam 0,1 ml/ekor/hari (kelompok HS 0.1) dan kelompok yang diberi perlakuan kombinasi jintan hitam dan madu (HS Madu) menunjukkan kepadatan sel limfoid BALT yang lebih rendah. Gambar histopatologi yang menunjukkan kepadatan sel limfoid pada fokus BALT pada masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada gambar 11. Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS Madu Gambar 11. Gambaran mikroskopi kepadatan sel limfoid pada BALT dengan pewarnaan HE, perbesaran 100×10 dari masing-masing kelompok perlakuan. BALT akan membesar dan meningkat jumlah sel limfoidnya jika terjadi reaksi imun atau peradangan. Jintan hitam diketahui mempunyai efek sebagai immunomodulator. Pemberian jintan hitam dapat meningkatkan rasio antara sel Thelper (T4) dan sel T-supressor (T8). Selain itu pemberian jintan hitam juga meningkatkan aktivitas sel natural killer (Omar et al. 1999). Selain itu jintan hitam juga diketahui dapat meningkatkan jumlah dan toksisitas dari sel natural killer (Salem 2005). Tingginya kepadatan sel pada kelompok HS 0.2 disebabkan karena pada kelompok tersebut memiliki kecenderungan peradangan yang lebih 35 tinggi dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainnya (HS 0.1 dan HS Madu). Peningkatan juga terjadi pada kelompok kontrol yang mempunyai jumlah fokus radang paling banyak, namun peningkatannya tidak sebanyak pada kelompok HS 0.2 karena pada kelompok kontrol tidak diberikan perlakuan apapun. Meningkatnya kepadatan sel limfoid pada BALT berarti menigkatkan sistem pertahanan pada saluran nafas. Jintan hitam dapat meningkatkan sistem imun pada saluran nafas. 4.4 Kongesti dan Hemoragi Kongesti merupakan penumpukan darah di dalam pembuluh darah. Hal ini bisa disebabkan karena aliran darah tidak lancar. Darah yang masuk melalui arteri terlalu banyak dan darah yang keluar melalui vena terlalu sedikit (Jones et al. 1997). Kongesti dapat berjalan secara aktif maupun pasif. Kongesti secara aktif terjadi karena pembuluh darah mengalami dilatasi dan diisi oleh darah sedangkan proses kongesti secara pasif terjadi karena adanya kelainan jantung (Cheville 2006). Hemoragi adalah ekstravasasi darah akibat rupturnya pembuluh darah. Secara mikroskopis, hemoragi yang terjadi di dalam jaringan terlihat dengan adanya sel darah merah di dalam jaringan di luar pembuluh darah (Cheville 2006). Pengamatan terhadap kongesti dan hemoragi dilakukan dengan perbesaran 20x10. Pengamatan dilakukan pada 10 lapang pandang dengan luas lapang pandang 0,24 mm2. Pengamatan terhadap kongesti dilakukan dengan menghitung jumlah pembuluh darah yang mengalami kongesti (terdapat sel darah di dalamnya). Pengamatan dilakukan baik pada pembuluh darah arteri maupun vena. Pengamatan terhadap hemoragi dilakukan dengan menghitung titik-titik pusat hemoragi. Pengamatan pada perubahan kongesti yang tidak disertai adanya adanya udema, menunjukkan bahwa kejadian kongesti adalah akut. pengamatan terhadap kongesti dan hemoragi dapat dilihat pada Tabel 11. Hasil 36 Tabel 11 Hasil Pengamatan Jumlah Kongesti dan Hemoragi Pada Paru-Paru Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Kongesti 5.13 ± 4.32b 5.00 ± 1.36b 5.20 ± 2.93b 1.73 ± 1.53a Hemoragi 2.87 ± 1.8a 2.53 ± 1.77a 2.80 ± 2.24a 1.47 ± 1.19a Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan pada taraf p<0.05 Hasil pengamatan kongesti pada sediaan menunjukkan bahwa terjadi perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan. Kelompok HS Madu menunjukkan jumlah kongesti yang paling rendah dibandingkan kelompok yang lainnya. Kongesti dan hemoragi pada sediaan histopatologi bisa juga disebabkan karena trauma yang terjadi saat penanganan hewan coba. Euthanasi dengan cara pemisahan sendi atlanto occipitalis diduga dapat menyebabkan terjadinya kongesti maupun hemoragi pada paru-paru. Hal ini dapat dilihat dengan tidak adanya peningkatan sel-sel radang yang menunjukkan adanya peradangan. Gambaran histopatologi kongesti dan hemoragi dapat dilihat pada gambar 12 dan 13. Gambar 12. Gambaran histopatologi kongesti (tanda panah) pembuluh darah vena pada organ paru-paru. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10 37 Gambar 13. Gambaran histopatologi hemoragi (tanda panah) pada organ paruparu. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10 4.5 Fokus Radang Pengamatan terhadap fokus radang pada paru-paru dilakukan dengan menghitung rata-rata jumlah fokus radang pada sepuluh lapang pandang dengan luas 6.16 x 104 µm2 secara acak menggunakan perbesaran 40x10. Hasil penghitungan masing-masing kelompok dapat dilihat pada tabel 12. Tabel 12. Rataan Jumlah Fokus Radang pada Paru-Paru Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam (luas lapang pandang 6.16 x 104 µm2) Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Jumlah Fokus Radang 2.00 ± 1.25b 0.67 ± 0.72a 1.20 ± 1.01a 1.00 ± 1.00a Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Pemberian habattussauda menurunkan jumlah fokus radang di paru-paru secara signifikan. Proses peradangan dapat dipicu oleh beberapa hal seperti trauma mekanis, sel kanker, reaksi alergi atau mikroba infeksius. Proses peradangan merupakan respon dari tubuh untuk mempertahankan diri. Pada dasarnya proses peradangan akan mengisolasi, mengencerkan dan mengeliminasi 38 agen yang menyebabkan peradangan terjadi. Pada organ paru-paru juga bisa terjadi peradangan. Peradangan pada paru-paru disebut dengan pneumonia (McGavin 2007). Fungsi dan struktur organ paru-paru memungkinkan untuk masuknya agen infeksius atau non-infeksius yang menyebabkan radang melalui rute aerogenous dan hematogenous. Fungsi organ paru-paru sebagai organ pernafasan membuat paru-paru terpapar udara setiap saat. Struktur paru-paru sebagai organ dengan pembuluh darah kapiler terbanyak juga membuat paru-paru mudah terserang agen infeksius atau non-infeksius yang menyebar secara hematogenous (Aughey 2001). Selain rute aerogenous dan hematogenous peradangan pada paru-paru juga bisa masuk secara langsung melalui luka pada organ paru-paru misalnya pada peristiwa tertusuknya paru-paru oleh benda asing. Pengamatan yang dilakukan pada gambaran histopatologi fokus radang pada paruparu menunjukkan bahwa radang menyebar melalui rute hematogenous. Fokusfokus radang terletak tersebar pada jaringan interstisial paru-paru, disekitar pembuluh darah dan tidak berada di dekat saluran pernafasan (bronkhus atau bronkhiolus). Penyebaran agen infeksius dan non-infeksius melalui rute hematogenous biasanya terjadi pada keadaan septisemia, paparan toksin, infeksi protozoa dan infeksi virus yang mempunyai target sel endotel. Selain itu penyebaran agen infeksi melalui rute hematogenous juga bisa disebabkan karena agen infeksius yang dibawa limfosit saat bersirkulasi (Mc Gavin 2007). Adanya fokus radang pada paru-paru mencit diduga akibat mencit terinfeksi oleh bakteri yang berasal dari lingkungan kandang. Gambaran histopatologi fokus-fokus radang dapat dilihat pada gambar 14. 39 Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS Madu Gambar 14. Gambaran histopatologi fokus-fokus radang (tanda panah) pada organ paru-paru. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10. Penurunan jumlah fokus radang pada kelompok yang diberi perlakuan jintan hitam ataupun kombinasi jintan hitam dan madu diduga akibat aktivitas anti bakteri dan anti inflamasi dari jintan hitam dan dan aktivitas anti bakteri dari madu. Baik jintan hitam dan madu keduanya memiliki khasiat sebagai anti bakteri (Estevinho 2008 dan Chaieb et al. 2011). Bourgou et al. (2010) dalam hasil penelitiannya menyebutkan bahwa aktivitas antimikroba jintan hitam berasal dari kandungan zat aktifnya yaitu thymoquinone dan longifolene. Thymoquinone dan longifolene mempunyai efek antibakteri terhadap S. aureus dengn nilai IC50 1,8µM (0,3µg/ml) dan 3,0 µM (0,6 µg/ml). Thymoquinone mempunyai aktivitas antibakteri yang tinggi terhadap bakteri gram positif. Thymoquinone juga dilaporkan mempunyai efek sinergi dengan streptomisin dan gentamisin (Salama 2010). Selain memiliki khasiat sebagai antibakteri, jintan hitam juga memiliki khasiat sebagai anti inflamasi. Dalam penelitian yang sama Bourgou et al. (2010) menguji efek antiinflamasi jintan hitam dengan mengukur kemampuan jintan 40 hitam dalam menghambat pembentukan NO (nitrat oksida). NO merupakan radikal bebas yang dihasilkan oleh jaringan tubuh. NO bisa dijadikan indikator keadaan patologis beberapa jenis inflamasi. Thymoquinone terbukti sebagai bahan aktif jintan hitam yang mampu menghambat pembentukan NO. 4.6 Ketebalan Otot Polos Pengamatan terhadap ketebalan otot polos dilakukan dengan mengukur otot polos yang berada pada bronkhus. Pengukuran otot polos dimaksudkan untuk melihat hipertrofi pada otot polos. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak image J. Pengamatan terhadap ketebalan otot polos dilakukan pada perbesaran 40x10. Pewarnaan yang digunakan untuk mengamati keadaan ketebalan otot adalah pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE). Pengamatan dilakukan pada sepuluh lapang pandang. Hasil pengamatan terhadap ketebalan otot polos disajikan pada tabel 13. Tabel 13 Hasil Pengamatan Terhadap Ketebalan Otot Polos Pada Bronkhus Mencit Yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Ketebalan Otot Polos (µm) 0.029 ± 0.023a 0.024 ± 0.012a 0.023 ± 0.008a 0.019 ± 0.006a Keterangan: Huruf superscript pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Hasil pengamatan terhadap ketebalan otot polos tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan, akan tetapi kelompok kontrol menujukkan kecenderungan yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok yang diberi perlakuan jintan hitam HS 0.1, HS 0.2 dan HS Madu). Gambaran histopatologi otot polos dapat dilihat pada gambar 16. 41 Gambar 16. Gambaran histopatologi otot polos (tanda panah) di sekitar bronkhus pada organ paru-paru. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10 Tidak lancarnya aliran udara dapat mempengaruhi ketebalan otot polos pada bronkhus dan bronkhiolus. Hal ini disebabkan otot polos bekerja lebih keras untuk menahan tekanan udara dalam bronkhus akibat terhambatnya aliran udara pernafasan. Peningkatan ketebalan otot polos pada paru-paru bisa merupakan indikasi adanya penyakit asma (Olmez et al. 2009). Perubahan yang dapat diamati pada preparat histopatologi organ paru-paru yang menderita asma menurut Yamauchi (2006) terdapat pada beberapa bagian. Bagian yang pertama adalah bagian lumen saluran pernafasan. Pada penderita asma, saluran pernafasan akan berisi eksudat. Bagian yang kedua yang dapat diamati pada penderita asma adalah lapisan mukus pada bronkhus. Pada mukosa bronkhus juga terdapat eksudat. Selain eksudat juga terlihat kelainan sel-sel epitel pada mukosa bronkhus. Bagian terakhir adalah dinding bronkhus. Pada penderita asma, dinding bronkhus akan mengalami kelainan berupa hipertrofi otot polos. Jintan hitam diketahui memiliki efek preventif terhadap penyakit asma. Boskabady et al. (2007) melakukan penelitian dengan memberikan ekstrak jintan hitam sebanyak 15 mL/kg dari 0.1 g% ekstrak kepada pasien yang menderita 42 asma selama 45 hari. Hasil yang didapat dari penelitian tersebut ekstrak jintan hitam menurunkan gejala asma. Penurunan ini disebabkan karena khasiat jintan hitam sebagai anti radang. Minyak esensial dari jintan hitam mampu mengurangi efek inflamasi yang terjadi pada saluran pernafasan. Efek anti inflamasi jintan hitam berasal dari kemampuan ekstrak jintan hitam menghambat pembentukan asam arachidonat (Houghton et al. 1995). Kemampuan ekstrak jintan hitam dalam menghambat histamin juga mendukung kemampuan jintan hitam dalam mencegah asma (Boskabady et al. 2007). 4.7 Emfisema Pengamatan daerah emfisema dilakukan dengan mengukur daerah yang mengalami emfisema. Daerah yang mengalami emfisema diukur dengan menggunakan perangkat lunak image J kemudian dibagi dengan luas lapang pandang secara keseluruhan. Hasil pengukuran daerah emfisema disajikan dalam bentuk presentasi dapat dilhat pada tabel 14. Tabel 14 Pengamatan Persentase Daerah Emfisema Pada Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Kontrol HS 0.1 HS 0.2 HS-Madu Persentase Daerah yang Mengalami Emfisema (%) 19.07 ± 9.81b 15.53 ± 11.28ab 10.13 ± 4.31a 22.67 ± 11.97b Keterangan: Huruf superscript pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf p<0.05 Pengamatan terhadap persentase daerah yang mengalami emfisema menunjukkan hasil yang berbeda secara statistik antar kelompok perlakuan. Ratarata luas daerah yang mengalami emfisema tertinggi terdapat pada kelompok kontrol dan kelompok HS Madu. Tingginya persentase daerah yang mengalami emfisema pada kelompok HS Madu diduga disebabkan karena pada kelompok HS Madu kandungan jintan hitamnya lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainnya (HS 0.1 dan HS 0.2). 43 Gambar 15. Gambaran histopatologi emfisema (tanda panah) pada organ paruparu. Pewarnaan HE. Perbesaran 40x10 Emfisema merupakan perluasan ruangan alveol yang terjadi akibat kerusakan dinding alveol tetapi tanpa diikuti fibrosis. Pada manusia emfisema merupakan penyakit yang disebabkan karena reaksi yang kompleks akibat proses peradangan. Pada hewan emfisema hampir selalu merupakan kejadian sekunder atau dipicu oleh keadaan lain (McGavin 2007). Biasanya emfisema pada hewan dipicu oleh terhalangnya aliran udara pada saluran nafas. Meningkatnya mukus pada saluran nafas dapat menyebabkan terganggunya aliran udara pernafasan. Peningkatan jumlah sel goblet pada saluran nafas dapat menyebabkan peningkatan mukus pada saluran nafas. Peningkatan sel goblet bisa dipicu akibat adanya antigen yang berhasil masuk kedalam saluran nafas. Peningkatan sel goblet merupakan respon tubuh terhadap masuknya antigen. 4.8 Pembahasan Umum Jintan hitam atau habbatussauda dikenal mempunyai banyak khasiat, salah satu khasiatnya adalah sebagai anti radang. Bahan aktif yang terkandung pada jintan hitam yaitu thymoquinone memiliki aktivitas anti radang karena dapat menghambat pembentukan NO (Bourgou et al. 2010) dan menghambat 44 pembentukan mediator inflamasi asam arachidonat dengan cara menghambat cyclooxigenase serta 5-lipooxygenase (Houghton et al. 1995). Aktifitas anti radang jintan hitam dibuktikan dengan menurunnya eksudat pada saluran nafas (bronkhus dan bronkhiolus) yang diberi perlakuan jintan hitam. Eksudat pada saluran nafas berhubungan dengan perisitiwa peradangan yang terjadi pada saluran nafas. Penurunan eksudat pada saluran nafas ini juga diikuti dengan penurunan jumlah sel goblet pada saluran nafas. Saetta dan Turato (2000) menyatakan bahwa pada kondisi terjadi peradangan akan terjadi peningkatan jumlah sel goblet. Sel goblet merupakan sel yang bertugas untuk menghasilkan mukus yang berfungsi sebagai sistem pertahanan pada saluran pernafasan. Meningkatnya jumlah sel goblet juga akan bepengaruh terhadap eksudat pada saluran nafas. Selain anti radang, thymoquinone juga memiliki khasiat sebagai anti bakteri. Bahan aktif yang terkandung dalam jintan hitam diketahui efektif dalam melawan bakteri yang sudah resisten terhadap antibiotik (Salman et al. 2008). Secara khusus Hannan (2008) melaporkan bahwa jintan hitam mempunyai kemampuan sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus yang sudah resisten terhadap methilcillin. Penurunan jumlah fokus radang juga diikuti dengan penurunan jumlah sel goblet pada saluran nafas. Penurunan jumlah fokus radang berpengaruh terhadap menurunnya jumlah sel goblet. Dengan demikian eksudat pada pada saluran nafas juga ikut berkurang. Berkurangnya eksudat pada saluran nafas diikuti dengan ketebalan otot pada kelompok perlakuan yang lebih rendah jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Eksudat pada saluran nafas membuat aliran udara pernafasan menjadi tidak lancar, hal ini akan membuat otot polos pada sekitar bronkhus bekerja lebih keras sehingga menjadi lebih tebal. Aliran udara yang tidak lancar akan mempengaruhi kejadian emfisema pada paru-paru. Hasil pengamatan terhadap deerah yang mengalami emfisema menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan, namun walaupun tidak menunjukkan perbedaan yang nyata kelompok yang diberi perlakuan menunjukkan kecenderungan yang lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol. Jintan 45 hitam memberikan pengaruh yang baik terhadap gambaran histopatologi paruparu mencit. Dosis yang efektif memberikan efek baik pada masing masing perubahan histopatologi yang diamati dapat dilihat pada tabel 15. Tabel 15. Dosis Efektif Jintan Hitam Berdasarkan Faktor Yang Diamati Faktor yang diamati Dosis yang paling efektif Hasil Analisis Statistik Eskudat pada bronkhus dan bronkhiolus HS 0.1 Jumlah Sel Goblet HS Madu Berbeda Nyata Luas BALT HS Madu Tidak Berbeda Nyata Tidak Berbeda Nyata Kepadatan Sel Limfoid HS Madu pada BALT Kongesti dan Hemoragi HS-Madu Berbeda Nyata Jumlah Fokus Radang HS Madu Berbeda Nyata Ketebalan Otot Polos HS Madu Tidak Berbeda Nyata Emfisema HS 0.2 Berbeda Nyata Berbeda Nyata Kelompok perlakuan HS Madu menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok perlakuan yang lainnya pada beberapa parameter pengamatan (Jumlah sel goblet, Luas dan kepadatan sel limfoid pada BALT, kongesti dan hemoragi, Jumlah fokus radang, dan ketebalan otot polos). Pada parameter pengamatan lainnya (emfisema) kelompok perlakuan HS 0.2 menunjukkan hasil yang baik. Secara umum dosis pada kelompok perlakuan HS Madu lebih baik dibandingkan kelompok perlakuan yang lainnya, namun masih perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mendapatkan dosis yang lebih akurat. 46 BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan Konsumsi ekstrak minyak jintan hitam dan penambahan madu menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam dan madu tidak menyebabkan peningkatan eksudasi di bronkus dan bronkiolus lumen, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan area BALT dan meningkatkan densitas sel limfoid, mengurangi daerah hemoragi, fokus peradangan dan emfisema serta tidak meningkatkan penebalan otot polos. Pemberian jintan hitam dan madu efek menguntungkan pada histomorfologi paru-paru. Kelompok yang diberi perlakuan kombinasi HS Madu menunjukkan hasil terbaik dibandingkan kelompok perlakuan lainnya. 5.2 Saran 1. Perlu dilakukan penelitian dengan waktu penelitian yang lebih panjang, untuk mengetahui pengaruh penggunaan ekstrak minyak jintan hitam dalam jangka panjang. 2. Perlu dilakukan penelitian pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam dengan menggunakan hewan model yang mengalami gangguan pada sistem pernafasan. 3. Perlu dilakuan penelitian yang lebih lanjut untuk mendapatkan dosis yang tepat. PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK MINYAK JINTAN HITAM (Nigella sativa) TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS PARU-PARU MENCIT (Mus musculus) AGUNG SUDOMO FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTUTUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 47 Daftar Pustaka Akers R M, D M Denbow. 2008. Anatomy and Physiology of Domestic Animal. Iowa: Blackwell Publishing: 396-397 Anonim. 2011. Healthy Lung [terhubung berkala] http://bio.rutgers.edu/~gb102/lab_10/1001am.html [17 oktober 2011] Antuono D L F, Alessandro M, Antonio FSL. 2002. Seed Yield, Yield Components, Oil Contents And Essential Oil Content And Composition of Nigella Sativa L. And Nigella Damascena L. IND CROP PROD 15: 59-69. Arrington LR. 1972. Introducing Laboratory Animal Science. The Breeding, Care, and Management of Experimental Animal. New York: The Interstate Printers & Publishers Inc. 29-35 Aughey E, Frye FL. 2001. Comparative Veterinary Histology: with Clinical Correlates. London: Manson Publishing. hlm 247 Aspinall V, M O’Reilly. 2004. Introduction to Veterinary Anatomy and Physiology. Philadelphia: Elsevier. Hlm 98-106. Bals R, DJ Weiner, JM Wilson. 1999. The Innate Immune System in Cystic Fibrosis Lung Disease. J CLIN INVEST 103: 303-307 Banks WJ. 1993. Applied Veterinary Histology 3rd Edition. Missouri: Mosby, Inc. 390-400 Boskabady M H, H Javan, M Sajady, H Rakhshandeh. 2007. The Possible Effect of Nigella sativa Seed Extract In Asthmatic Patients. FUND CLIN PHARMACOL 21: 559-556 Boskabady M H, VaNasim, ASediqa. 2008. The Protective Effect of Nigella sativa On Lung Injury Of Sulfur Mustard-Exposed Guinea Pigs. EXP LUNG RES 34: 183-194 48 Bourgou S, A Pichette, B Marzouk, J Legault. 2010. Bioactivities of Black Cumin Essential Oil and Its Main Terpenes From Tunisia. S AFR J BOT 76(2): 210-216 Cesta MF. 2006. Normal Structure, Function, and Histology of MucosaAssociated Lymphoid Tissue. TOXICOL PATHOL 34:599–608 Chaieb K, Hanene J, Kacem M, Amina B. 2011. Antibacterial Activity of Thymoquinone, an Active Pirnciple of Nigella sativa and Its Property to Prevent Bacterial Biofilm formation. J ALTERN COMPLEM MED 11(29): 1-6 Cheville NF. 2006. Introduction to Veterinary Pathology. Ed ke-3. Oxford: Blackwell Publishing. 147-150 Coonrod D. 1989. Role of Leukocytes in Lung Defences. Respiration 1989;55 (Suppl. 1):9-13 [terhubung berkala] http://content.karger.com/ProdukteDB/produkte.asp?Doi=195746 [8 Maret 2012] Coville T, JM Bassert. 2002. Clinical Anatomy and Physiology for Veterinary Technicians. Missoury: Mosby, Inc 220-235 D’Antuono L F, Alessandro M, Antonio FSL. 2002. Seed Yield, Yield Components, Oil Contents And Essential Oil Content And Composition of Nigella Sativa L. And Nigella Damascena L. IND CROP PROD 15: 5969. Dellmann HD, J A Eurell. 1998. Textbook of Veterinary Histology. Maryland: Lippincott Williams & Wilkins 847 850 Ela EI Aboul. 2002. Cytogenic Studies on Nigella sativa Seeds Extract and Thymoquinone on Mouse Cells Infected with Schistomiasis Using Karyotyping. Mutation Research 516: 11-17. El Danshary ES, MA Al-Gahazalia, FA Mannaab, HA Salema, NS Hassanc, MA. Abdel-Wahhabd. 2011. Dietary Honey and Ginseng Protect Against 49 Carbon Tetrachloride-Induced Hepatonephrotoxicity in Rats. EXP TOXICOL PATHOL 15:1-8 El Gazzar MA, El Mezayen R, Marecki JC, Nicolls MR, Canastar A, Dreskin SC. 2006. Anti-Inflammatory effect of Thymoquinone in a Mouse Model of Allergic Lung Inflammation. Int Immunopharmacol 6:1135-1142. Estevinho L, A P Pereira, L Moreira, L G. Dias, E Pereira. 2008. Antioxidant and antimicrobial effects of phenolic compounds extracts of Northeast Portugal honey. FOOD CHEM TOXICOL 46: 3774–3779 Fatoni. 2011. Bunga jinten hitam. http://proherbal.net/herbal-hebat-bernamahabbatussauda/. [26 Juli 2011]. Hannan A, S Saleem, S Chaudhary, M Barkaat, M U Arshad. 2008. Anti Bacterial Activity Of Nigella sativa Against Clinical Isolates Of Methilcillin Resistent Staphylococcus aureus. J Ayub Med Coll Abbottabad 20(3): 7274 Heitmann S, T. Tschernig, M. Larbig, I. Steinmetz, H.-J. Hedrich, R. Pabst. 1999. Immunohistological Characterization Of Leukocytes In The Lungs Of Healthy Mice And After Bacterial Intratracheal Infection. LAB ANIMAL 33: 288—294 Houghton P, R Zarka, B De Las Heras, J Hoult. 1995. Fixed Oil of Derived Thymoquinone Inhibit Generation in Leukocytes and Membrane Lipid Peroxidation. Planta Med 61(1): 33-36 Hussein AA, MK Rakha, ZI Nabil. 2003. Anti-Arrhytmic Effect of Wild Honey Against Cathecolamines Cardiotoxicity. J Med Sci 3(2): 127-136 Hutapea JR. 1994. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (III). Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Depkes RI. 332-340 Jones TC, Ronald DC, Norval WK. 2006. Veterinary Pathology. Iowa: Blackwell Publishing. 947-970 50 Kahn CM. 2010. Merck Veterinary Manual 10th Edition. [terhubung berkala] http://www.merckmanuals.com/vet/index.html [20 Agustus 2011] Mc Gavin, M Donald, JF Zachary. 2007. Pathologic Basic of Veterinary Dissease. Missouri: Mosby Elsevier. 463-558 Olmez D, A Babayigit, G Erbil, O Karaman, A Bagriyanik, O Yilmaz, N Uzuner 2009. Histopathologic Changes in Two Mouse Models of Asthma. J Investig Allergol Clin Immunol. 19(2): 132-138 Omar A, Ghosheh S, Abdulghani A, Houdi A, Crookscor PA. 1999. High performance liquid chromatographic analysis of the pharmacologically active quinones and related compounds in the oil of the black seed (L. Nigella sativa). J Pharm Biomed Anal. 19: 757– 62. Ramadhan U H, Munther A Mohammedali, Huda S Abood. 2011. Study The Analgesic Activity of Nigella sativa L. Volatile Oil Againts Pain in Mice. Journal of Current Pharmaceutical Research 5(1): 36-38. Ressang AA. 1984. Buku Pelajaran Patologi Khusus Veteriner. Denpasar: 221225 Rouhou S C, Souhail B, Basma H, Christophe B, Calude D, Hamadi A. 2007. Nigella sativa L.: Chemical Composition And Physicochemical Characteristics Of Lipid Fraction. FOOD CHEM 10: 673–681 Rostika N. 2012. Pengaruh Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) terhadap Gambaran Histopatologi Lambung dan Usus Halus Mencit (Mus musculus) [skripsi]. Bogor. Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor; 2012 Rubin E, HM Reisner. 2009. Essential of Robin’s Pathology 5th Edition. Philadhelphia: Wolster Kluwer. hlm 254-257 Saad B, Azaizeh H, Said O. 2005. Tradition and Prespective of Arab Herbal Medicine: A Review. eCam. 2(4): 475-479 51 Saetta M, G Turato. 2001. Airway pathology in asthma. Eur Respir J. 18: Suppl. 34: 18–23 Salama, Raaga H M. 2010. Clinical and Therapeutic Trials of Nigella Sativa. TAF Prev Med Bull 9(5): 513-522 Salem ML. 2005. Immunomodulatory and Therapeutic Effect of Nigella sativa L. Seed. Intl Pharmacol 5:1749-1770 Sancheti G, PK Goyal. 2011. Evaluation of Possible Radioprotective Action of Rosmarinus officinalis L. in Swiss albino Mice [terhubung berkala] http://www.rooj.com/Radioprotection.htm [16 oktober 2011] Sari L O R. 2006. Pemanfaatan Obat Tradisional dengan Pertimbangan Manfaat dan Keamanannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. 1: 1-7 Sarwono B. 2001. Lebah Madu. Jakarta: AgroMedia Pustaka. 61-69. Smith JBI, Mangkoewidjojo S. 1988. Pemeliharaan, Pembiakan dan Penggunaan Hewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta: UI Press. 80-81 Subarnas A. 2010. Pemanfaatan Obat Herbal dari Indigenus hingga Klinik. [terhubung berkala] http://farmasi.unpad.ac.id/blog/pemanfaatan-obat- herbal-dari-indigenus-hingga-klinik/ [10 Oktober 2011] Suranto A. 2004. Khasiat dan Manfaat Madu Herbal. Jakarta: AgroMedia Pustaka. 25-26 Tizard I. 1982. An Introduction to Veterinary Immunology. Philadelphia: WB Saunders Company: 154-156 [USDA] United States Department of Agriculture. 2011. Plants Profile. [terhubung berkala] http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=NISA2&mapType=nativity&p hotoID= [3 Agustus 2011] [WHO] World Health Oragnization. 2008. Traditional Medicine [terhubung berkala] http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/ [2 Agustus 2011] 52 [WHO] World Health Oragnization. 2011. Asthma [terhubung berkala] http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs307/en/index.html [6 Desember 2011] Yamauchi K. 2006. Airway Remodelling in Asthma and Its Influence on Clinical Pathophysiology. Tohoku J. Exp. Med 29: 75-87. 53 LAMPIRAN 54 Lampiran 1 Perhitungan Dosis 1. Perhitungan dosis pemberian Anthelmentik Albendazole 5% = 5 g/100ml = 50 gram/ml Dosis untuk mencit = 10 mg/kg BB Dosis untuk mencit BB 20 gram = = = 0,04 ml/ekor 2. Perhitungan dosis pemberian Antibiotik (Clavamox®) Konsentrasi = 125 mg/ml = 25 mg/ml Dosis untuk anak-anak BB 25 kg = 1 mg/kg BB/hari = 0,001 mg/g BB Dosis untuk mencit = Dosis untuk mencit BB 20 gram = = 0,0008 ml/ekor/hari 3. Perhitungan dosis pemberian Antiprotozoa (Flagyl®) Sediaan 500 mg/tablet Dosis untuk manusia BB 50 kg = 1500 mg/50 kg BB/hari = 30 mg/kg BB/hari Dosis untuk mencit = = 0,03 mg/g BB Dosis untuk mencit BB 25 gram = 25 (gram) x 0,03 mg/g BB = 0,75 mg/ekor/hari 55 4. Perhitungan Dosis Pemakaian Jintan Hitam Dosis Pemakaian = 1-2 sdm 3x sehari Dosis HS 0.1 Dosis HS 0.2 = = 0,3 ml/kg x 2 sdm = 0,6 ml/kg = x 0,6 x 3 = 0,054 ml ≈ 0,1 ml/ hari = 2x HS 0.1 = 0,2 ml/ hari Dosis Hs madu = 3x HS 0.1 = 0,3 ml/ hari 56 Lampiran 2 Jadwal Jadwal Pelaksanaan Penelitian Waktu Juni 2010 Kegiatan Mempersiapkan dan membersihkan Fasilitas Kandang Hewan Percobaan Bagian Patologi FKH IPB Persiapan peralatan perkandangan hewan coba seperti box kandang, alas kain, tempat makan, dan tempat minum 16 Agustus 2010 Mencit untuk hewan percobaan dimasukkan ke dalam kandang dan diistirahatkan selama 2 hari agar dapat beradaptasi dengan kandang 20 Agustus 2010 Pemberian antihelmintik pada mencit 23-27 Agustus 2010 Pemberian antibiotik pada mencit 28 Agustus 2010 Pemberian antihelmintik pada mencit 30 Agustus-3 September 2010 Pemberian antijamur pada mencit 16 September-16 November 2010 Pemberian ekstrak minyak jintan hitam dan kombinasi madu pada kelompok perlakuan 22 November 2010 Nekropsi mencit 29 November 2010 Trimming organ mencit 1-15 Desember 2010 Pembuatan preparat histopatologi Januari -Februari 2011 Pengamatan preparat histopatologi 57 Lampiran 3 Hasil Analisis Data Eksudat pada Bronkhus Bronkhus * Perlakuan Bronkhiolus * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 12 100.0% 0 .0% 12 100.0% 12 100.0% 0 .0% 12 100.0% Bronkhus Bronkhiolus * Perlakuan Perlakuan Kontrol Bronkhus Bronkhiolus 4.77545206 4.67955137 3 2 Std. Deviation 0.29493686 0.12883199 Mean 4.74032522 4.60517019 3 3 Std. Deviation 0.23409539 0.00000000 Mean 4.93209660 4.66594404 3 3 Std. Deviation 0.06801650 0.10526340 Mean 4.74031689 4.60517019 3 3 0.14461248 0.00000000 Mean N HS 0.1 N HS 0.2 N HS Madu N Std. Deviation ANOVA Sum of Squares df Bronkhus Between Groups Within Groups Total Bronkhiolus Between Groups Within Groups Total Mean Square 0.07542121 3 0.02514040 0.33465483 8 0.04183185 0.41007604 11 0.01397790 3 0.00465930 0.05535613 8 0.00691952 0.06933403 8 F Sig. 0.60 0.6323 0.67 .5921 58 Bronkhus Duncan Perlakuan N Subset for alpha = 0.05 1 HS0,2 3 4.9321 kontrol 3 4.7755 HS0,1 3 4.7403 Hsmadu 3 4.7403 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Bronkhiolus Duncan Perlakuan N Subset for alpha = 0.05 1 HS0,2 3 4.9321 kontrol 3 4.7755 HS0,1 3 4.7403 Hsmadu 3 4.7403 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 59 Lampiran 4 Hasil Analisis Data Jumlah Sel Goblet Jumlah * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 60 100.0% 0 .0% 100.0% Sel Goblet * Perlakuan Perlakuan Kontrol Bronkhus Mean 19.4667 N HS 0.1 15 Std. Deviation 17.32820 Mean 39.4667 N HS 0.2 15 Std. Deviation 29.80860 Mean 15.6000 N HS Madu 15 Std. Deviation 16.04369 Mean 13.4000 N 15 Std. Deviation 9.88361 ANOVA Sum of Squares df Bronkhus Between Groups Within Groups Total Mean Square F Sig. 5.524 .002 6396.317 3 2132.106 21614.667 56 385.976 28010.983 59 60 Jumlah Sel Goblet Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS Madu 15 13.4000 HS 0.2 15 15.6000 Kontrol 15 19.4667 HS 0.1 15 39.4667 Sig. .431 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 61 Lampiran 5 Hasil Analisis Data Pengamatan BALT Luas BALT * Perlakuan Kepadatan Sel Limfoid * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 12 100.0% 0 .0% 12 100.0% 12 100.0% 0 .0% 12 100.0% Luas BALT Kepadatan Sel Limfoid * Perlakuan Luas BALT Kepadatan Sel Limfoid 2.75809640 4.68321182 3 3 Std. Deviation 0.53360258 0.06837588 Mean 2.69261113 4.67659552 3 3 Std. Deviation 0.49223316 0.06203232 Mean 3.08420674 4.75870132 3 3 Std. Deviation 0.08546926 0.03306870 Mean 2.48791508 4.64091644 3 3 0.59227314 0.06191432 Perlakuan Kontrol Mean N HS 0.1 N HS 0.2 N HS Madu N Std. Deviation 62 ANOVA Sum of Squares df Luas BALT Kepadatan Sel Limfoid Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Mean Square 0.55083417 3 0.18361139 1.77023533 8 0.22127942 2.32106950 11 0.02206423 3 0.00735474 0.02690038 8 0.00336255 0.04896462 11 Luas BALT Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 HS0,2 3 3.0842 kontrol 3 2.7581 HS0,1 3 2.6926 Hsmadu 3 2.4879 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Kepadatan Sel Limfoid Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS0,2 3 4.75870 kontrol 3 4.68321 4.68321 HS0,1 3 4.67660 4.67660 Hsmadu 3 4.64092 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. F Sig. 0.83 0.5138 2.19 0.1673 63 Lampiran 6 Hasil Analisis Data Pengamatan Kongesti dan Hemoragi Kongesti * Perlakuan Hemoragi * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 100.0% 0 .0% 60 100.0% 60 100.0% 0 .0% 60 100.0% Kongesti Hemoraghi * Perlakuan Perlakuan Kontrol Kongesti Hemoraghi 5.1333 2.8667 15 15 Std. Deviation 4.32380 1.80739 Mean 5.0000 2.5333 15 15 Std. Deviation 1.36277 1.76743 Mean 5.2000 2.8000 15 15 Std. Deviation 2.93258 2.24245 Mean 1.7333 1.4667 15 15 1.53375 1.18723 Mean N HS 0.1 N HS 0.2 N HS Madu N Std. Deviation ANOVA Sum of Squares df Kongesti Hemoraghi Between Groups Within Groups Total Between Groups Within Groups Total Mean Square F Sig. 5.445 .002 1.973 .128 128.667 3 42.889 441.067 56 7.876 569.733 59 18.983 3 6.328 179.600 56 3.207 198.583 59 64 Kongesti Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS Madu 15 1.7333 HS 0.1 15 5.0000 Kontrol 15 5.1333 HS 0.2 15 5.2000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Hemoraghi Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 HS Madu 15 1.4667 HS 0.1 15 2.5333 HS 0.2 15 2.8000 Kontrol 15 2.8667 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 65 Lampiran 7 Hasil Analisis Data Pengamatan Fokus Radang Fokus Radang * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 60 100.0% 0 .0% 100.0% Fokus Radang * Perlakuan Perlakuan Kontrol Kongesti Mean 2.0000 N 15 Std. Deviation HS 0.1 1.25357 Mean .6667 N HS 0.2 15 Std. Deviation .72375 Mean 1.2000 N HS Madu 15 Std. Deviation 1.01419 Mean 1.0000 N 15 Std. Deviation 1.0000 ANOVA Sum of Squares df Fokus Radang Between Groups Within Groups Total Mean Square F Sig. 4.672 .006 14.450 3 4.817 57.733 56 1.031 72.183 59 66 Fokus Radang Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS 0.1 15 .6667 HS Madu 15 1.0000 HS 0.2 15 1.2000 Kontrol 15 2.0000 Sig. .180 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 67 Lampiran 8 Hasil Analisis Data Ketebalan Otot Polos Fokus Radang * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 60 100.0% 0 .0% 100.0% Ketebalan Otot Polos * Perlakuan Ketebalan Otot Polos Perlakuan Kontrol Mean .0287 N HS 0.1 15 Std. Deviation .02326 Mean .0240 N HS 0.2 15 Std. Deviation .01183 Mean .0227 N HS Madu 15 Std. Deviation .00884 Mean .0193 N 15 Std. Deviation Sum of Squares Between Groups .001 Within Groups .011 Total .012 .00594 ANOVA df Mean Square 3 .000 56 .000 59 F 1.130 Sig. .345 68 Ketebalan Otot Polos Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 HS Madu 15 .0193 HS 0.2 15 .0227 HS 0.1 15 .0240 Kontrol 15 .0287 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. 69 Lampiran 9 Hasil Analisis Data Emfisema Emfisema * Perlakuan Case Processing Summary Cases Included Excluded N Percent N Percent Total N Percent 60 60 100.0% 0 .0% 100.0% Ketebalan Otot Polos * Perlakuan Ketebalan Otot Polos Perlakuan Kontrol Mean 19.0667 N HS 0.1 15 Std. Deviation 9.80865 Mean 15.5333 N HS 0.2 15 Std. Deviation 11.28125 Mean 10.1333 N HS Madu 15 Std. Deviation 4.30725 Mean 22.6667 N 15 Std. Deviation Sum of Squares Between Groups 1283.917 Within Groups 5393.733 Total 6677.650 11.96821 ANOVA df Mean Square 3 427.972 56 96.317 59 F 4.443 Sig. .007 70 Emfisema Duncan Subset for alpha = 0.05 Perlakuan N 1 2 HS 0.2 15 10.1333 HS 0.1 15 15.5333 15.5333 Kontrol 15 19.0667 HS Madu 15 22.6667 Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Dokumen baru
Dokumen yang terkait
Tags

Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jinten Hita..

Gratis

Feedback