Feedback

Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jinten Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paruparu Mencit (Mus musculus)

Informasi dokumen
2 ABSTRAK AGUNG SUDOMO Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus). Dibimbing oleh SRI ESTUNINGSIH dan DEWI RATIH AGUNGPRIYONO Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi mengenai efek pemberian ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa) terhadap gambaran histopatologi paru-paru mencit. Sebanyak 12 ekor mencit jantan usia 4 minggu dibagi menjadi empat kelompok, masing masing kelompok beranggotakan tiga ekor mencit. Kelompok K atau kontrol negatif menerima perlakuan aquades, kelompok HS 0.1 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml, kelompok HS 0.2 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml dan kelompok HS Madu menerima perlakuan kombinasi ekstrak minyak jintan hitam dengan madu (perbandingan 1:20) sebanyak 0.3 ml. Perlakuan dilakukan selama dua bulan. Kemudian mencit dieutanasi dengan cara dislokasi sendi atlanto-occipitalis kemudian mencit dinekropsi untuk mendapatkan sampel organ paru-paru. Paru-paru diproses menjadi sediaan histopatologi kemudian diwarnai dengan pewarnaan Hematoxyllin-Eosin dan Periodic Acid Schiff. Parameter yang diamati adalah persenatse bronkhus yang bereksudat, jumlah sel goblet pada saluran nafas, luas area dan kepadatan sel BALT, kongesti dan hemoragi, fokus-fokus radang, ketebalan otot polos di sekitar saluran nafas serta kejadian emfisema menggunakan perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows®. Analisis data dilakukan denganmenggunakan perangkat lunak SPSS® 16.0, uji statistik yang digunakan adalah ANOVA dan uji lanjut Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam tidak menyebabkan eksuddasi yang berlbihan, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan luas BALT dan meningkatkan kepadatan sel limfoid BALT, menurunkan kejadian kongesti dan heomragi, menurunkan peradangan dan tidak menyebabkan hipertrofi otot polos. Kandungan dari jintan hitam yaitu thymoquinone dan longifelone diduga memberikan efek yang baik untuk histomorfologi organ paruparu. Kata kunci: Mencit, Nigella sativa, paru-paru, mikroskopis sistem pernapasan 3 ABSTRACT AGUNG SUDOMO The Effect of Blackseed (Nigella sativa) Extract on Mice (Mus musculus) Lung Microscopy. Under direction of SRI ESTUNINGSIH and DEWI RATIH AGUNGPRIYONO This study was aimed to get information about the effect of blackseed (Nigella sativa) effect on the histopathology of mice lung. Twelve male mice of 4 weeks old were divided into four groups, each group consisted of three mice. Group K or negative control received aquadest, group HS 0.1 was received 0.1 ml blackseed oil, group HS 0.2 was received 0.2 blackseed oil and group HS Madu was received 0.3 ml mixed of blackseed oil and honey (1:20) for two months. At the end of the experiment, the mice were euthanized by atlanto occipital dislocation and necropsied to collect the lung sample. The lungs were processed to prepare the histopathology slides with Hematoxyllin-Eosin and Periodic Acid Schiff (PAS) stain. The parameters observed include counting percentage of bronchus and bronchial presenting exudates, counting the goblet cell between the respiratory epithelial cell, calculating the BALT area, counting the limfoid cell density of the BALT, counting the congestion, hemorrhage, inflammation and emphysema area on the certain fields of view, measuring the thickness of smooth muscle surround bronchial using Image J® for Microsoft® Windows®. Quantitative data were analyzed using SPSS® 16.0 software and ANOVA test followed Duncan test. The result showed that Nigella sativa treatment does not lead to increase exudation in the bronchus and bronchioles lumen,a decrease in the activity of goblet cells, a decrease the BALT area and an increase in the lymphoid cell density,a reduce the area of congestion and hemorrhage, inflammation and emphysema, reduction at the smooth muscle thickness. The blackseed content such thymoquinone and longifolene were thought to provide a favorable effect on lung histomorphology. Keyword: Mice, Nigella sativa, lung, microscopy of respiratory system 4 RINGKASAN AGUNG SUDOMO Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus). Dibimbing oleh SRI ESTUNINGSIH dan DEWI RATIH AGUNGPRIYONO Saluran pernafasan merupakan organ yang mudah terserang penyakit, hal ini disebabkan karena saluran pernafasan termasuk ke dalam kelompok saluran terbuka. Artinya saluran pernafasan berhubungan langsung dengan lingkungan luar (Aspinall dan O’Reilly 2004). Saluran pernafasan memiliki mekanisme pertahanan yang dapat mencegah masuknya kuman ke dalam tubuh melalui saluran pernafasan (Bals et al. 1999). Terkadang sistem pertahanan yang ada pada organ paru-paru tidak dapat menahan gempuran mikroorganisme patogen yang masuk. Salah satu cara untuk meningkatkan sistem imun pada paru-paru adalah dengan menggunakan obat-obatan herbal. Penggunaan tanaman herbal pada pengobatan sudah dikenal sejak ribuan tahun yang lalu. Hingga saat ini banyak obat-obatan modern yang masih diturunkan dari tanaman dan ±25% dari semua resep mengandung satu atau lebih bahan aktif dari tanaman (Saad et al. 2005). Delapan puluh persen penduduk Asia dan Afrika menggunakan pengobatan herbal untuk menangani masalah kesehatan (WHO 2008). Penggunaan tanaman herbal sebagai obat-obatan banyak disukai karena secara umum obat herbal lebih aman dibandingkan dengan obat modern (Sari 2006). Nigella sativa atau yang dikenal dengan nama jintan hitam adalah tanaman herbal yang berasal dari daerah di sekitar laut mediterania (Rouhou et al. 2007). Biji dan minyak dari jintan hitam memiliki khasiat sebagai antiinflamasi, analgesik, antipiretik, antimikroba dan antineoplasma. Beberapa laporan juga menyebutkan bahwa jintan hitam juga efektif untuk pencegahan penyakit asma (Salama dan Ragaa 2010). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak minyak jintan hitam dan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dan madu terhadap gambaran mikroskopis organ paru-paru. Perubahan yang terjadi pada gambaran mikroskopis organ paru dapat digunakan sebagai acuan untuk mempelajari efek jintan hitam lebih lanjut. Sebanyak 12 ekor mencit jantan usia 4 minggu dibagi menjadi empat kelompok, masing masing kelompok beranggotakan tiga ekor mencit. Kelompok K atau kontrol negatif menerima perlakuan aquades, kelompok HS 0.1 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml, kelompok HS 0.2 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml dan kelompok HS Madu menerima perlakuan kombinasi ekstrak minyak jintan hitam dengan madu (perbandingan 1:20) sebanyak 0.3 ml. Perlakuan dilakukan selama dua bulan. Kemudian mencit dieutanasi dengan cara dislokasi sendi atlanto-occipitalis kemudian mencit dinekropsi untuk mendapatkan sampel organ paru-paru. Paruparu diproses menjadi sediaan m kemudian diwarnai dengan pewarnaan Hematoxyllin-Eosin dan Periodic Acid Schiff. Parameter yang diamati adalah persenatse bronkhus yang bereksudat, jumlah sel goblet pada saluran nafas, luas area dan kepadatan sel BALT, kongesti dan hemoragi, fokus-fokus radang, ketebalan otot polos di sekitar saluran nafas serta kejadian emfisema menggunakan perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows®. Analisis data 5 dilakukan denganmenggunakan perangkat lunak SPSS® 16.0, uji statistik yang digunakan adalah ANOVA dan uji lanjut Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam tidak menyebabkan eksuddasi yang berlbihan, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan luas BALT dan meningkatkan kepadatan sel limfoid BALT, menurunkan kejadian kongesti dan heomragi, menurunkan peradangan dan tidak menyebabkan hipertrofi otot polos. Kandungan dari jintan hitam yaitu thymoquinone dan longifelone diduga memberikan efek yang baik untuk histomorfologi organ paru-paru. Kata kunci: Mencit, Nigella sativa, paru-paru, mikroskopis sistem pernapasan PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK MINYAK JINTAN HITAM (Nigella sativa) TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS PARU-PARU MENCIT (Mus musculus) AGUNG SUDOMO FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTUTUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 2 ABSTRAK AGUNG SUDOMO Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus). Dibimbing oleh SRI ESTUNINGSIH dan DEWI RATIH AGUNGPRIYONO Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi mengenai efek pemberian ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa) terhadap gambaran histopatologi paru-paru mencit. Sebanyak 12 ekor mencit jantan usia 4 minggu dibagi menjadi empat kelompok, masing masing kelompok beranggotakan tiga ekor mencit. Kelompok K atau kontrol negatif menerima perlakuan aquades, kelompok HS 0.1 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml, kelompok HS 0.2 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml dan kelompok HS Madu menerima perlakuan kombinasi ekstrak minyak jintan hitam dengan madu (perbandingan 1:20) sebanyak 0.3 ml. Perlakuan dilakukan selama dua bulan. Kemudian mencit dieutanasi dengan cara dislokasi sendi atlanto-occipitalis kemudian mencit dinekropsi untuk mendapatkan sampel organ paru-paru. Paru-paru diproses menjadi sediaan histopatologi kemudian diwarnai dengan pewarnaan Hematoxyllin-Eosin dan Periodic Acid Schiff. Parameter yang diamati adalah persenatse bronkhus yang bereksudat, jumlah sel goblet pada saluran nafas, luas area dan kepadatan sel BALT, kongesti dan hemoragi, fokus-fokus radang, ketebalan otot polos di sekitar saluran nafas serta kejadian emfisema menggunakan perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows®. Analisis data dilakukan denganmenggunakan perangkat lunak SPSS® 16.0, uji statistik yang digunakan adalah ANOVA dan uji lanjut Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam tidak menyebabkan eksuddasi yang berlbihan, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan luas BALT dan meningkatkan kepadatan sel limfoid BALT, menurunkan kejadian kongesti dan heomragi, menurunkan peradangan dan tidak menyebabkan hipertrofi otot polos. Kandungan dari jintan hitam yaitu thymoquinone dan longifelone diduga memberikan efek yang baik untuk histomorfologi organ paruparu. Kata kunci: Mencit, Nigella sativa, paru-paru, mikroskopis sistem pernapasan 3 ABSTRACT AGUNG SUDOMO The Effect of Blackseed (Nigella sativa) Extract on Mice (Mus musculus) Lung Microscopy. Under direction of SRI ESTUNINGSIH and DEWI RATIH AGUNGPRIYONO This study was aimed to get information about the effect of blackseed (Nigella sativa) effect on the histopathology of mice lung. Twelve male mice of 4 weeks old were divided into four groups, each group consisted of three mice. Group K or negative control received aquadest, group HS 0.1 was received 0.1 ml blackseed oil, group HS 0.2 was received 0.2 blackseed oil and group HS Madu was received 0.3 ml mixed of blackseed oil and honey (1:20) for two months. At the end of the experiment, the mice were euthanized by atlanto occipital dislocation and necropsied to collect the lung sample. The lungs were processed to prepare the histopathology slides with Hematoxyllin-Eosin and Periodic Acid Schiff (PAS) stain. The parameters observed include counting percentage of bronchus and bronchial presenting exudates, counting the goblet cell between the respiratory epithelial cell, calculating the BALT area, counting the limfoid cell density of the BALT, counting the congestion, hemorrhage, inflammation and emphysema area on the certain fields of view, measuring the thickness of smooth muscle surround bronchial using Image J® for Microsoft® Windows®. Quantitative data were analyzed using SPSS® 16.0 software and ANOVA test followed Duncan test. The result showed that Nigella sativa treatment does not lead to increase exudation in the bronchus and bronchioles lumen,a decrease in the activity of goblet cells, a decrease the BALT area and an increase in the lymphoid cell density,a reduce the area of congestion and hemorrhage, inflammation and emphysema, reduction at the smooth muscle thickness. The blackseed content such thymoquinone and longifolene were thought to provide a favorable effect on lung histomorphology. Keyword: Mice, Nigella sativa, lung, microscopy of respiratory system 4 RINGKASAN AGUNG SUDOMO Pengaruh Pemberian Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus). Dibimbing oleh SRI ESTUNINGSIH dan DEWI RATIH AGUNGPRIYONO Saluran pernafasan merupakan organ yang mudah terserang penyakit, hal ini disebabkan karena saluran pernafasan termasuk ke dalam kelompok saluran terbuka. Artinya saluran pernafasan berhubungan langsung dengan lingkungan luar (Aspinall dan O’Reilly 2004). Saluran pernafasan memiliki mekanisme pertahanan yang dapat mencegah masuknya kuman ke dalam tubuh melalui saluran pernafasan (Bals et al. 1999). Terkadang sistem pertahanan yang ada pada organ paru-paru tidak dapat menahan gempuran mikroorganisme patogen yang masuk. Salah satu cara untuk meningkatkan sistem imun pada paru-paru adalah dengan menggunakan obat-obatan herbal. Penggunaan tanaman herbal pada pengobatan sudah dikenal sejak ribuan tahun yang lalu. Hingga saat ini banyak obat-obatan modern yang masih diturunkan dari tanaman dan ±25% dari semua resep mengandung satu atau lebih bahan aktif dari tanaman (Saad et al. 2005). Delapan puluh persen penduduk Asia dan Afrika menggunakan pengobatan herbal untuk menangani masalah kesehatan (WHO 2008). Penggunaan tanaman herbal sebagai obat-obatan banyak disukai karena secara umum obat herbal lebih aman dibandingkan dengan obat modern (Sari 2006). Nigella sativa atau yang dikenal dengan nama jintan hitam adalah tanaman herbal yang berasal dari daerah di sekitar laut mediterania (Rouhou et al. 2007). Biji dan minyak dari jintan hitam memiliki khasiat sebagai antiinflamasi, analgesik, antipiretik, antimikroba dan antineoplasma. Beberapa laporan juga menyebutkan bahwa jintan hitam juga efektif untuk pencegahan penyakit asma (Salama dan Ragaa 2010). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak minyak jintan hitam dan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dan madu terhadap gambaran mikroskopis organ paru-paru. Perubahan yang terjadi pada gambaran mikroskopis organ paru dapat digunakan sebagai acuan untuk mempelajari efek jintan hitam lebih lanjut. Sebanyak 12 ekor mencit jantan usia 4 minggu dibagi menjadi empat kelompok, masing masing kelompok beranggotakan tiga ekor mencit. Kelompok K atau kontrol negatif menerima perlakuan aquades, kelompok HS 0.1 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml, kelompok HS 0.2 menerima perlakuan ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml dan kelompok HS Madu menerima perlakuan kombinasi ekstrak minyak jintan hitam dengan madu (perbandingan 1:20) sebanyak 0.3 ml. Perlakuan dilakukan selama dua bulan. Kemudian mencit dieutanasi dengan cara dislokasi sendi atlanto-occipitalis kemudian mencit dinekropsi untuk mendapatkan sampel organ paru-paru. Paruparu diproses menjadi sediaan m kemudian diwarnai dengan pewarnaan Hematoxyllin-Eosin dan Periodic Acid Schiff. Parameter yang diamati adalah persenatse bronkhus yang bereksudat, jumlah sel goblet pada saluran nafas, luas area dan kepadatan sel BALT, kongesti dan hemoragi, fokus-fokus radang, ketebalan otot polos di sekitar saluran nafas serta kejadian emfisema menggunakan perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows®. Analisis data 5 dilakukan denganmenggunakan perangkat lunak SPSS® 16.0, uji statistik yang digunakan adalah ANOVA dan uji lanjut Duncan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian jintan hitam tidak menyebabkan eksuddasi yang berlbihan, menurunkan aktivitas sel goblet, menurunkan luas BALT dan meningkatkan kepadatan sel limfoid BALT, menurunkan kejadian kongesti dan heomragi, menurunkan peradangan dan tidak menyebabkan hipertrofi otot polos. Kandungan dari jintan hitam yaitu thymoquinone dan longifelone diduga memberikan efek yang baik untuk histomorfologi organ paru-paru. Kata kunci: Mencit, Nigella sativa, paru-paru, mikroskopis sistem pernapasan 6 PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK MINYAK JINTAN HITAM (Nigella sativa) TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS PARU-PARU MENCIT (Mus musculus) AGUNG SUDOMO Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTUTUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 7 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi “Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jintan Hitam (Nigella sativa) terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-Paru Mencit (Mus musculus)” adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada Perguruan Tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Bogor, September 2012 Agung Sudomo NIM B04070007 8 © Hak Cipta milik IPB, tahun 2012 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyususnan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB 9 LEMBAR PENGESAHAN Judul Penelitian : Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jinten Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paruparu Mencit (Mus musculus) Nama Mahasiswa : Agung Sudomo NRP : B04070007 Program Studi : Kedokteran Hewan Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor Disetujui Komisi Pembimbing Pembimbing I Pembimbing II Dr.Drh. Sri Estuningsih, MSi, APVet NIP. 19600629 199002 2 001 Drh. Dewi Ratih Agungpriyono, PhD, APVet NIP. 19631201 198803 2 001 Mengetahui, A.n. Dekan Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor Drh. Agus Setiyono, MS. PhD, APVet NIP. 19630810 198803 1 004 Tanggal lulus: 10 PRAKATA Puji syukur ke hadirat Allah SWT atas berkat, rahmat, dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyususnan skripsi yang berjudul Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jintan Hitam (Nigella sativa) terhadap Gambaran Mikroskopis Paru-paru Mencit (Mus musculus). Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Proses penulisan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan rasa tulus dan hormat, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Ayah (Sukemi) dan Ibu (Nurmarini) tercinta selaku orang tua penulis, atas kasih sayang, doa, motivasi, nasihat, dan dorongan yang luar biasa dan tak henti-hentinya kepada penulis. 2. Dr. Drh. Sri Estuningsih, MSi. APVet Drh. Dewi Ratih Agungpriyono, PhD. APVet selaku dosen pembimbing skripsi atas bimbingan, arahan, motivasi, waktu, dan pemikiran selama proses penelitian dan penyelesaian skripsi ini. 3. Drh. Isdoni, M.Biomed selaku dosen pembimbing akademik. 4. Saudara tercinta Awaluddin Nurmiyanto, Nurafni Aridhona atas dukungan dan inspirasi yang luar biasa. 5. Tim Habbatussauda (Dian Mayasafira, Niken Rostika, Cut Dara, Nova Febrina, Ornella Zynesha, dan Annisa Rahmi) dan teman-teman seperjuangan di Lab. Patologi Rahmah, Desray, Fatma, Mutia, Zaza, Juju, Tizzani dan Iren atas kebersamaannya. 6. Danang, Fakhri, Disa, Tami, dan Arni atas bantuan dan dukungan moril dan kebersamaan yang telah kita lalui. 7. Staf Bagian Patologi FKH IPB (Pak Kasnadi, Pak Endang, Pak Soleh, dan Mbak Kiki) atas segala bantuannya. 8. Keluarga Bapak Haryadi dan keluarga bapak Bambang HR atas dukungannya 9. Teman-teman yang tergabung dalam Gianuzzi FKH 44. 11 10. Teman-teman HIMPRO Satwaliar (Pandu, Yoha, Ines, Rere, Nindi dan Talitha) atas kebersamaan dan dukungan selama ini. 11. Teman-teman IMAKUSI dan Asrama Kuansing (Misep, Pras, Disfa, Abrar, Iqbar, Aji, Yufi) atas kebersamaan dan dukungannya. 12. Teman-teman Blogger IPB Yusuf, Elka, Miftah, Adietya, Sentani dan Momo atas kebersamaan dan dukungannya. Terakhir penulis mengucapkan terima kasih banyak kepada seluruh civitas akademik Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Segala sesuatu tidak ada yang sempurna, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Bogor, September 2012 Agung Sudomo NIM B04070007 i PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK MINYAK JINTAN HITAM (Nigella sativa) TERHADAP GAMBARAN MIKROSKOPIS PARU-PARU MENCIT (Mus musculus) AGUNG SUDOMO FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTUTUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 ii DAFTAR ISI Halaman Daftar Isi.....................................................................................................................i Daftar Gambar ............................................................................................................iii Daftar Tabel ...............................................................................................................iv Daftar Lampiran .........................................................................................................vii Bab I Pendahuluan .....................................................................................................1 1.1 Latar Belakang .........................................................................................1 1.2 Tujuan ......................................................................................................2 1.3 Manfaat ....................................................................................................3 1.4 Hipotesis ...................................................................................................3 Bab II Tinjauan Pustaka .............................................................................................4 2.1 Jintan Hitam ............................................................................................4 2.2 Madu.........................................................................................................9 2.3 Mencit.......................................................................................................10 2.4 Organ Sistem Pernafasan Mencit .............................................................12 2.4.1 Saluran Nafas.............................................................................12 2.4.1 Paru-paru ...................................................................................13 2.4.2 Histologi Paru-paru ...................................................................14 2.4.3 Sistem Pertahanan pada Paru-paru ............................................14 2.4.4 Perubahan Histopatologi Paru-Paru pada Penderita Asma .......16 Bab III Bahan dan Metode .........................................................................................19 3.1 Waktu dan Tempat ...................................................................................19 3.2 Bahan dan Alat .........................................................................................19 iii 3.3 Metode Penelitian .....................................................................................20 3.3.1 Persiapan Hewan Coba .............................................................20 3.3.2 Kandang Hewan Coba...............................................................21 3.3.3 Pakan dan Minum .....................................................................22 3.3.4 Kelompok Perlakuan Penelitian ................................................22 3.3.5 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ ...............................22 3.3.6 Pembuatan Sediaan Histologi ...................................................23 3.3.7 Pewarnaan Sediaan Histologi ....................................................24 3.3.8 Pengamatan Sediaan Histologi ..................................................24 3.3.9 Analisis Statistik .......................................................................27 BAB IV Hasil dan Pembahasan .................................................................................27 4.1 Eksudat pada bronkhus dan bronkhiolus..................................................27 4.2 Sel Goblet pada bronkhiolus ....................................................................29 4.3 Bronchial-Associated Lymphoid Tissue (BALT) .....................................32 4.4 Kongesti dan Hemoragi............................................................................34 4.5 Fokus Radang ...........................................................................................36 4.6 Ketebalan otot polos .................................................................................39 4.7 Emfisema..................................................................................................41 4.8 Pembahasan Umum ..................................................................................42 BAB V Penutup .........................................................................................................45 5.1 Kesimpulan ..............................................................................................45 5.2 Saran .........................................................................................................45 Daftar Pustaka ............................................................................................................46 Lampiran ....................................................................................................................52 iv DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1 Bunga dan Biji Jintan Hitam .....................................................................5 Gambar 2 Mencit (Mus musculus) ............................................................................11 Gambar 3 Histologi Normal Paru-paru .....................................................................14 Gambar 4 Mekanisme Sistem Pertahanan pada Paru-paru .......................................15 Gambar 5 Penebalan Epitel pada Paru-Paru Mencit Model Penyakit Asma ............17 Gambar 6 Peningkatan Jumlah Sel Goblet pada Mencit Model Penyakit Asma ......17 Gambar 7 Kandang Hewan coba ...............................................................................21 Gambar 8 Gambaran Histopatologi Bronkhus Yang Bereksudat Sedikit ..................29 Gambar 9 Gambaran Histopatologi Sel Goblet Dengan Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) .............................................................................................31 Gambar 10 Gambaran Histopatologi Keberadaan Fokus BALT di Sekitar Bronkhioli dengan Pewarnaan HE ..........................................................32 Gambar 11 Gambaran Mikroskopi Kepadatan Sel Limfoid pada BALT dengan Pewarnaan HE .........................................................................................33 Gambar 12 Gambaran Histopatologi Kongesti Pembuluh Darah Vena pada Organ Paru-paru .................................................................................................35 Gambar 13 Gambaran Histopatologi Hemoragi pada Organ Paru-paru ....................36 Gambar 14 Gambaran Histopatologi Fokus-Fokus Radang Pada Organ Paru-Paru .38 Gambar 15 Gambaran Histopatologi Otot Polos Di Sekitar Bronkhus Pada Organ Paru-Paru .................................................................................................40 Gambar 16 Gambaran Histopatologi Emfisema Pada Organ Paru-Paru ...................42 v DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Karakteristik Kimia Biji Jintan Hitam .........................................................5 Tabel 2. Komposisi Asam Lemak Minyak Jintan Hitam ..........................................6 Tabel 3. Aktivitas Antimikroba Thymoquinone dibandingkan Gentamycin dan Erythromycin terhadap Bakteri Patogen pada Manusia...............................7 Tabel 4. Komposisi kimia madu per 100 gr ...............................................................10 Tabel 5. Data Dasar Fisiologis Mencit .......................................................................11 Tabel 6. Jadwal Kegiatan Penelitian ..........................................................................19 Tabel 7 Persentase Bronkhus dan Bronkhiolus yang Bereksudat pada Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam .....................................................................27 Tabel 8 Jumlah Sel Goblet pada Bronkhiolus Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam............................................................................................................30 Tabel 9 Hasil Pengamatan BALT pada Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam............................................................................................................32 Tabel 10 Hasil Pengamatan Kongesti dan Hemoragi pada Paru-paru Mencit yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam .....................................................................34 Tabel 11 Rataan Jumlah Fokus Radang Pada Paru-Paru Mencit Yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam ................................................................................36 Tabel 12 Hasil Pengamatan Terhadap Otot Polos Pada Bronkhus Mencit Yang Diberi Perlakuan Jintan Hitam .....................................................................39 Tabel 13 Persentase Daerah Emfisema pada Mencit yang diberi Perlakuan Jintan Hitam............................................................................................................41 Tabel 14 Dosis Efektif Jintan Hitam Berdasarkan Faktor yang Diamati ...................44 vi Daftar Lampiran Halaman Lampiran 1 Perhitungan Dosis ...................................................................................53 Lampiran 2 Jadwal Pelaksanaan Kegiatan .................................................................55 Lampiran 3 Hasil Analisis Data Eksudat pada Bronkhus ..........................................56 Lampiran 4 Hasil Analisis Data Jumlah Sel Goblet ..................................................58 Lampiran 5 Hasil Analisis Data Pengamatan BALT .................................................60 Lampiran 6 Hasil Analisis Data Pengamatan Kongesti dan Hemoragi .....................62 Lampiran 7 Hasil Analisis Data Pengamatan Fokus Radang.....................................64 Lampiran 8 Hasil Analisis Data Ketebalan Otot Polos ..............................................66 Lampiran 9 Hasil Analisis Data Emfisema ................................................................68 1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Saluran pernafasan merupakan organ yang mudah terserang penyakit, hal ini disebabkan karena saluran pernafasan termasuk ke dalam kelompok saluran terbuka. Artinya saluran pernafasan berhubungan langsung dengan lingkungan luar (Aspinall 2004). Salah satu permasalahan kesehatan paru-paru adalah penyakit asma. WHO (2011) menyebutkan bahwa saat ini sebanyak 235 juta penduduk dunia mengidap penyakit asma. Penyakit pernafasan kronik ini sudah menjadi masalah kesehatan masyarakat. Asma sudah masuk ke semua negara baik yang mempunyai pendapatan yang tinggi ataupun rendah. Saluran pernafasan memiliki mekanisme pertahanan yang dapat mencegah masuknya kuman kedalam tubuh melalui saluran pernafasan. Mekanisme ini berupa sistem kekebalan bawaan yang bersifat umum dan sistem kekebalan dapatan yang bersifat khusus (Robert 1999). Namun terkadang sistem pertahanan yang ada pada organ paru-paru tidak dapat menahan mikroorganisme patogen yang masuk. Agar tidak terjadi kerusakan pada paru-paru, diperlukan zat yang mampu meningkatkan sistem pertahanan pada organ paru-paru sehingga dapat mencegah masuknya mikroorganisme patogen maupun benda asing yang dapat menyebabkan kerusakan pada paru-paru. Salah satu cara untuk meningkatkan sistem imun pada paru-paru adalah dengan menggunakan obat-obatan herbal. Penggunaan tanaman herbal untuk pengobatan sudah dikenal sejak ribuan tahun yang lalu. Secara umum penggunaan herbal dalam dunia pengobatan dikelompokkan menjadi empat kelompok yaitu pengobatan tradisional herbal cina, ayuverda, pengobatan herbal barat dan pengobatan herbal dari arab. Saat ini banyak obat-obatan modern yang masih diturunkan dari tanaman dan ±25% dari semua resep mengandung satu atau lebih bahan aktif dari tanaman (Saad 2005). Di Asia dan Afrika 80% penduduknya menggunakan pengobatan herbal untuk menangani masalah kesehatan yang dialami (WHO 2008). Penggunaan tanaman 2 herbal sebagai obat-obatan banyak disukai karena secara umum obat herbal lebih aman dibandingkan dengan obat modern (Sari 2006). Peningkatan penggunaan obat herbal juga terjadi di Indonesia. Hal ini menandakan bahwa masyarakat di Indonesia semakin percaya terhadap efek obat herbal. Penggunaan obat herbal di Indonesia juga tidak terbatas pada strata masyarakat tertentu. Penggunaan obat herbal sudah menembus seluruh lapisan masyarakat. Meskipun demikian kajian dan pengembangan terhadap potensi obat herbal harus terus dilakukan agar masyarakat mendapatkan manfaat dari penggunaan obat herbal secara maksimal (Subarnas 2010). Pemerintah Indonesia juga sudah mendukung penggunaan obat herbal ini. Pada tahun 2004 BPOM mengeluarkan Keputusan Kepala BPOM No. HK.00.05.4.2411 tentang Ketentuan Pokok Pengelompokan dan Penandaan Obat. Nigella sativa atau yang dikenal dengan nama jintan hitam adalah tanaman herbal yang berasal dari daerah di sekitar laut mediterania (Rouhou et al. 2007). Biji dan minyak dari jintan hitam memiliki khasiat sebagai antiinflamasi, analgesik, antipiretik, antimikroba dan antineoplasma. Beberapa laporan juga menyebutkan bahwa jintan hitam juga efektif untuk pencegahan penyakit asma. Jintan hitam sudah digunakan sebagai obat herbal sejak ribuan tahun yang lalu. Masyarakat pada daerah timur tengah dan beberapa negara lain di Asia barat menggunakan jintan hitam sebagai obat untuk mengobati penyakit. Selain sebagai obat herbal, jintan hitam juga digunakan sebagai bahan tambahan makanan (Salama 2010). Saat ini jintan hitam sudah banyak ditemukan di pasaran baik dalam bentuk bubuk dalam kapsul dan minyak. Melihat potensi jintan hitam dan tren penggunaan obat herbal pada masyarakat maka perlu diadakan kajian untuk mendapatkan informasi ilmiah tentang manfaat jintan hitam terutama pada organ paru-paru. 3 1.2 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa) dan kombinasi ekstrak jintan hitam dengan madu terhadap gambaran mikroskopis organ paru-paru pada mencit (Mus musculus). 1.3 Manfaat Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah informasi tentang khasiat jintan Hitam khususnya pada paru-paru mencit (Mus musculus). Dengan informasi dari penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan penggunaan jintan hitam sebagai obat herbal yang dapat mengatasi permasalahan pada paru-paru baik pada hewan maupun pada manusia. 1.4 Hipotesis H0: Tidak terdapat perbedaan gambaran mikroskopis organ paru-paru mencit yang diberi perlakuan (ekstrak minyak jintan hitam) dengan kelompok kontrol negatif (tidak diberi ekstrak minyak jintan hitam). H1: Terdapat perbedaan gambaran mikroskopis organ paru-paru antara kelompok mencit yang diberi perlakuan (diberi ekstrak minyak jintan hitam) dengan kelompok kontrol negatif (tidak diberi ekstrak minyak jintan hitam). 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Jintan Hitam Nigella sativa merupakan tanaman herbal tahunan. Tanaman ini sudah digunakan sejak ribuan tahun yang lalu sebagai bumbu dan pengawet makanan. Tanaman ini biasanya tumbuh di Eropa, Timur Tengah dan Asia Barat. Jintan hitam tumbuh pada keadaan tanah semi arid. Bunga jintan hitam berwarna kebirubiruan dengan variasi jumlah kelopak (Gambar 5). Bunga jintan hitam juga ditandai dengan adanya nektar. Biji jintan hitam berukuran kecil dengan berat antara 1-5 mg berwarna abu-abu gelap atau hitam dengan permukaan kulit yang berkerut (Antuono et al. 2002). Jintan hitam dikenal sebagai obat-obatan herbal sejak ribuan tahun yang lalu. Jintan hitam sering digunakan sebagai obat-obatan tradisional untuk mengobati berbagai penyakit seperti demam, flu, sakit kepala, asma, rematik, infeksi oleh mikroba, untuk mengatasi cacing pada saluran pencernaan dan juga untuk meningkatkan status kesehatan (Salama 2010). Nigella sativa di Indonesia dikenal sebagai jintan hitam. Sedangkan di Arab Saudi N. Sativa dikenal dengan nama Al-Habbah Al Sawda, Habbet ElBaraka, Kamoun Aswad, Schuniz dan Khodria. Di Pakistan India, dan Sri Lanka dikenal sebagai Kalvanji, Kalunji, Azmut, Gurat, Aof dan Aosetta. Dalam bahasa Inggris tanaman ini dikenal dengan nama black seed, black cumin, black caraway, cinnamon flower, nutmeg flower dan love-in-a-mist (Salama 2010). Klasifikasi ilmiah jintan hitam (USDA 2011) adalah sebagai berikut: Kingdom : Plantae Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Ranunculales 5 Famili : Ranunculaceae Genus : Nigella L. Spesies : Nigella sativa L. A B Gambar 1. Bunga dan Biji Jintan Hitam (Sumber: Gambar A: USDA 2011; Gambar B: Fatoni 2011) Biji jintan hitam diketahui mempunyai banyak manfaat bagi kesehatan. Karakteristik kimia biji jintan hitam menurut Rouhou et al. 2007 dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1.Karakteristik Kimia Biji Jintan Hitam Komposisi Dry matter (%) Oila Crude proteina Asha Potassiumb Magnesiumb Calciumb Phosphorusb Sodiumb Ironb Copperb Zincb Manganeseb Total carbohydratea a Dalam % basis bahan kering Dalam mg/kg dari bahan kering Sumber: Rouhou et al. (2007) b Jumlah 91.35 ± 0.26 28.48 ± 0.05 26.7 ± 0.35 4.86 ± 0.06 783 ± 6.61 235 ± 4.87 572 ± 21.5 48.9 ± 0.04 20.8 ± 2.21 8.65 ± 0.65 1.65 ± 0.03 8.04 ± 0.21 4.43 ± 0.11 40.0 ± 0.46 6 Kandungan asam lemak dari minyak jintan hitam didominasi oleh asam linoleat, asam oleat, dan asam palmitoleat. Perbandingan antara asam linoleat dan asam oleat lebih besar dari 2:1. Perbandingan antara asam linoleat dan asam oleat pada minyak jagung dan minyak kedelai dilaporkan juga memiliki perbandingan yang lebih besar dari 2:1 (Rouhou et al. 2007). Tabel 2. Komposisi Asam Lemak Minyak Jintan Hitam Asam Lemak Jumlah Myristic C14:0 0.35 ± 0.02 Myristoleic C14:1 Sedikit Palmitic C16:0 17.2 ± 0.15 Palmitoleic C16:1 1.15 ± 0.05 Margaric C17:0 Sedikit Margaroleic C17:1 Sedikit Stearic C18:0 2.84 ± 0.08 Oleic C18:1 25.0 ± 0.24 Linoleic C18:2 50.31 ± 0.25 Arachidic C20:0 0.14 ± 0.02 Eicosenoic C20:1 0.32 ± 0.04 Behenic C22:0 1.98 ± 0.08 Lignoceric C24:0 Sedikit Sumber: Rouhou et al. (2007) Jintan hitam diketahui memiliki berbagai macam khasiat antara lain anti bakteri, anti jamur, anti kanker, antioksidan, antiparasit, analgesik, anti koagulan dan juga agen hipoglikemik (Salama 2010). Aktivitas antimikroba jintan hitam berasal dari kandungan zat aktifnya yaitu thymoquinone dan longifolene. Dalam sebuah penelitian disebutkan bahwa thymoquinone dan longifolene mempunyai efek antibakteri terhadap S. aureus dengn nilai IC50 1,8µM (0,3µg/ml) dan 3,0 µM (0,6 µg/ml) (Bourgou et al. 2010). Thymoquinone mempunyai aktivitas antibakteri yang tinggi terhadap bakteri gram positif. Thymoquinone juga dilaporkan mempunyai efek sinergi dengan streptomycin dan gentamycin. Cahieb et al. (2011) menguji kemampuan thymoquinone secara in vitro dalam melawan bakteri dengan bakteri patogen yang ada pada manusia. Hasil dari percobaan tersebut dapat dilihat pada Tabel 3. 7 Tabel 3. Aktivitas Antimikroba Thymoquinone dibandingkan Gentamycin dan Erythromycin terhadap Bakteri Patogen pada Manusia Strain Bakteri batang gram negatif Escherichi coli ATCC 35218 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 Vibrio alginolyticus ATCC 33787 Vibrio paraheamolyticus ATCC 17802 Gram positive bacilli Bacillus cereus ATCC 14579 Listeria monocytogene ATCC 19115 Gram positive cocci Enterococcus faecalis ATCC 29212 Micrococcus luteus NCIMB 8166 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus epidermidis CIP 106510 a b Antimicrobial susceptibility Gentamycin Erythromycin Thymoquinone (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) a b MIC MBC aMIC bMBC aMIC bMBC 8 2 16 4 32 256 64 >256 >512 >512 >512 >512 2 32 8 8 64 16 >256 >256 128 >256 >256 256 >512 256 32 >512 >512 64 4 2 8 4 8 1 16 4 8 16 8 32 32 64 256 >256 32 64 2 16 4 8 32 8 4 16 16 16 32 32 8 8 8 64 16 8 Minimum Inhibitory Concentration Minimum Bactericidal Concentration Sumber: Chaieb et al (2011) Selain memiliki aktivitas antimikroba, jintan hitam juga diketahui memiliki aktivitas antifungi dan antihelmintika. Biji jintan hitam berkhasiat sebagai obat cacing (Hutapea 1994). Ela (2002) meneliti tentang efek ekstrak jintan hitam terhadap tikus yang mengalami schistosomiasis. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa thymoquinone yang merupakan kandungan dari jintan hitam memberikan efek mencegah aberasi kromosom pada mencit yang diinfeksi schistomiasis. Thymoquinone yang merupakan bahan yang terdapat pada jintan hitam juga dilaporkan memiliki efek protektif terhadap aberasi kromosom. Ekstrak jintan hitam juga mempunyai efek inhibisi terhadap khamir patogen Candida albican (Salama 2010). Jintan hitam di Arab Saudi biasanya digunakan sebagai obat untuk penyakit asma (Salama 2010). Penelitian yang dilakukan oleh Boskabady et al. (2007) menunjukkan bahwa jintan hitam memiliki efek pencegahan pada pasien penderita asma. Efek protektif dan kuratif terhadap penyakit asma diduga berasal dari efek anti histamin yang dimiliki oleh jintan hitam. Dalam penelitian yang lain Boskabady et al. (2008) menyatakan bahwa jintan hitam juga memberikan efek 8 protektif pada paru-paru marmut yang dipapar gas berbahaya yaitu sulfur mustard. Ramadhan (2011) menggunakan mencit untuk menguji efek analgesik jintan hitam. Mencit jantan yang terlebih dahulu diberi minyak jintan hitam lebih tahan terhadap rasa sakit yang disebabkan oleh asam asetat dibandingkan mencit jantan pada kelompok kontrol. Mencit betina mempunyai mekanisme yang berbeda dengan mencit jantan dalam merespon rasa sakit yang ditimbulkan oleh asam asetat. Namun demikian pemberian minyak jintan hitam juga menunjukkan efek yang sama dengan yang ditimbulkan pada mencit jantan. Efek analgesik jintan hitam berasal dari kandungan aktif jintan hitam yaitu thymoquinone. Efek antiinflamasi juga ditunjukkan oleh jintan hitam. Borgou et al. (2010) menguji efek antiinflamasi jintan hitam dengan mengukur kemampuan jintan hitam dalam menghambat pembentukan NO (nitrat oksida). NO merupakan radikal bebas yang dihasilkan oleh jaringan tubuh. NO bisa dijadikan indikator keadaan patologis beberapa jenis inflamasi. Thymoquinone terbukti sebagai bahan aktif jintan hitam yang mampu menghambat pembentukan NO. Seperti yang disebutkan di atas, jintan hitam juga memiliki efek antioksidan. Antioksidan berfungsi dalam menangkal radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan pada sel. Jintan hitam terbukti dapat menurunkan produksi ROS (reactive oxygen species) yang dapat merusak sel. Efek antioksidan dari jintan hitam berasal dari thymoquinone (Borgou et al. 2010). Boskabady et al. (2007) dalam penelitiannya mengamati efek jintan terhadap pasien penyakit asma. Dalam penelitian tersebut disimpulkan bahwa jintan hitam memiliki efek preventif terhadap asma. Terjadi peningkatan nilai PFT (Pulmonary Function Test) pada kelompok pasien asma yang diberi jintan hitam. Respon alergi merupakan salah satu penyebab penyakit asma. Jintan hitam dilaporkan dalam beberapa uji in vivo dilaporkan tidak memiliki efek samping. Hal ini tentu sangat membantu pengobatan asma tanpa menimbulkan alergi. Selain itu jintan hitam juga diketahui memiliki efek hepatoprotektif yang akan mendukung proses penyembuhan penyakit asma (Boskabady et al. 2007). 9 2.2 Madu Madu merupakan zat manis alami yang dihasilkan oleh lebah. Bahan baku madu adalah nektar. Nektar adalah senyawa kompleks yang dihasilkan oleh kelenjar tanaman dalam bentuk larutan gula. Perubahan nektar menjadi madu dimulai ketika lebah pekerja membawa nektar ke sarangnya. Untuk menghasilkan 1 kg madu, lebah harus mengumpulkan 120.000-150.000 tetes nektar atau 3-4 kg nektar dengan menempuh jarak 360.000-450.000 Km (Sarwono 2001). Berdasarkan asal nektarnya, madu dapat digolongkan menjadi tiga golongan yaitu madu flora, madu ekstra flora dan madu embun. Madu flora adalah madu yang bahan bakunya berasal dari bunga. Disebut madu monoflora jika hanya berasal dari satu jenis bunga dan poliflora jika berasal dari berbagai macam bunga. Madu ekstraflora adalah madu yang berasal dari luar daun, misalnya batang, cabang atau daun tanaman. Sedangkan madu embun adalah madu yang dihasilkan dari hasil suksesi serangga yang kemudian eksudatnya diambil oleh lebah madu (Sarwono 2001). Sejak zaman mesir kuno 2600 SM madu sudah dikenal sebagai obat. Diantaranya madu digunakan sebagai salep antiseptik untuk mengobati luka oleh bangsa Yunani, Romawi, Assyiria, dan Cina kuno. Madu juga dapat mencegah pertumbuhan mikroba seperti Salmonella, Shigella, E. Coli dan V. cholerae yang dapat menyebabkan diare. Apabila kandungan gula pada madu dihilangkan, maka madu mempunyai khasiat yang sama dengan streptomycin dalam membunuh bakteri (Sarwono 2001). Selain itu, madu juga mempunyai efek anti aritmia akibat keracunan katekolamin. Efek anti aritmia ini berasal dari aktivitas hiperadrenergik yang dimiliki oleh madu (Hussein 2003). Madu juga mempunyai efek protektif terhadap hati. Pada suatu penelitian dibuktikan bahwa madu mempunyai efek protektif terhadap kerusakan hati yang disebabkan oleh karbon tetraklorida (CCl4). Kerusakan hati akibat CCl4 dapat menyebabkan penurunan berat badan, penurunan asupan makanan serta penurunan bobot hati dan ginjal (El Denshary et al. 2011). 10 Tabel 4. Komposisi Kimia Madu per 100 gr Komposisi Kalori Kadar Air Protein Karbohidrat Jumlah 328 kal 17,2 g 0,5 g 82,4 g Sumber: Suranto (2004) Selain memiliki kandungan gula, madu juga memiliki kandungan nutrisi lain yang penting bagi tubuh. Madu mengandung garam mineral, protein, lemak, dan vitamin A, vitamin B dan vitamin C. Dalam 100 gr madu terkandung 294 kalori, 9,5 g karbohidrat, 24 g air, 16 mg fosfor, 5 mg kalsium dan 4 mg vitamin C (Sarwono 2001). 2.3 Mencit Klasifikasi mencit putih Arrington (1972): Kingdom : Animalia Filum : Chordata Kelas : Mamalia Ordo : Rodentia Family : Muridae Genus : Mus Species : Mus musculus Mencit merupakan hewan jinak, lemah, mudah ditangani, takut cahaya dan aktif pada malam hari. Mencit yang dipelihara sendiri makannya lebih sedikit dan bobot badan lebih ringan daripada yang dipelihara bersama-sama dalam satu kandang. Beberapa mencit mempunyai sifat kanibal (Penn 1999). Mencit bersifat sosial, aktif, dan cerdas. Memiliki kemampuan beradaptasi, ukuran yang kecil, reproduksi cepat dan karakteristik genetik yang luas juga menambah nilai tikus dan mencit sebagai hewan percobaan. 11 Gambar 2. Mencit (Mus musculus) Sumber: Sancheti 2011 Banyak strain berbeda dari mencit laboratorium yang telah dikembangkan oleh ahli genetik, beberapa strain seperti swiss webster dikembangkan secara outbreed, sementara beberapa strain lain seperti DDY, Balb/c, DBA, dan BC dikembangkan secara inbreed dengan gen-gen yang homozigot (Penn 1999). Tabel 5. Data Dasar Fisiologis Mencit Berat Dewasa Jantan Betina Berat Lahir Masa Kebuntingan Masa Hidup Suhu Tubuh Konsumsi Pakan Konsumsi Air Hemoglobin Rataan Kisaran Hematokrit Eritrosit Rataan Kisaran Limfosit Rataan Kisaran Sumber: Arrington (1972) 20-40 gr 18-35 gr 1,0-1,5 gr 18-21 hari 1-2 tahun 37,4 0C 4-5 gr/100 gr BB/ hari 4-7 gr/ 100 gr BB/ hari 14,8 gr% 10-19 gr% 41,5 % 9,3 x 106/µL 7,7-12,5 x 106/µL 8 x 103/ µL 4-12 x 103/ µL Mencit mempunyai lama hidup sekitar satu hingga dua tahun. Bahkan beberapa bisa mencapai usia tiga tahun dengan lama masa produktif selama sembilan bulan. Mencit mencapai dewasa kelamin pada usia 35 hari dan setalah usia delapan minggu, mencit sudah dapat dikawinkan. Pencapaian pubertas dan 12 siklus estrus dipengaruhi oleh paparan pheromon. Lama kebuntingan mencit adalah 18-21 hari dengan jumlah anak rata-rata enam ekor. Kebuntingan dapat diketahui pada hari ke 14 dengan cara palpasi, peningkatan bobot badan, dan perkembangan kelenjar mamae. Bobot badan mencit jantan dewasa adalah 20-40 gr dan bobot badan mencit betina dewasa adalah 18-35 gr. Mencit dapat dipelihara pada kotak dengan berbagai macam bahan seperti plastik (polipropilen atau polikarbonat), aluminium atau baja tahan karat (Smith & Mangkoewidjaja 1988). Biasanya mencit jantan mempunyai ukuran yang lebih besar dibandingkan dengan betina. Mencit memiliki kelenjar Harderian yang memproduksi pigmen porfirin yang dapat teramati di sekitar mata ketika hewan mengalami stress atau sedang sakit. Mencit tidak bisa muntah dan tidak memiliki kantung empedu. Mencit albino mengalami degenerasi retina dan memiliki kemampuan penglihatan yang lemah (Kahn 2010). 2.4 Organ sistem pernafasan mencit 2.4.1 Saluran nafas Secara sederhana fungsi utama sistem pernafasan adalah membawa oksigen (O2) masuk ke dalam tubuh dan membuang karbon dioksida (CO2) keluar dari tubuh. Semua organ yang terkait dengan pernafasan mempunyai tugas untuk mendukung fungsi tersebut. Oksigen dibutuhkan untuk proses metabolisme tubuh. Sedangkan karbon dioksida merupakan limbah dari proses metabolisme tubuh. Proses pertukaran oksigen dan karbonsioksida disebut pernafasan. Pernafasan dapat dibagi menjadi pernafasan internal dan pernafasan eksternal. Pernafasan internal adalah pernafasan yang terjadi pada tingkat sel, sedangkan pernafasan eksternal adalah pernafasan yang terjadi pada paru-paru. Selain fungsi utama sebagai penyalur udara dan pertukaran gas, sistem respirasi juga memiliki fungsi tambahan yaitu menghasilkan suara, penciuman, pengaturan suhu tubuh, ekskresi, keseimbangan asam basa dan tekanan darah (Coville 2002). Struktur dari sistem pernafasan berdasarkan fungsinya dapat dibedakan menjadi tiga bagian yaitu komponen konduktif, komponen transisi dan komponen 13 pertukaran gas. Komponen konduktif memanjang dari rongga hidung sampai bronkhiol. Komponen konduktif mempunyai fungsi sebagai penyalur udara. Komponen transisi yaitu komponen yang berfungsi sebagai penyalur (konduksi) sekaligus sebagai tempat pertukaran gas. Komponen pertukaran gas sesuai dengan namanya mempunyai fungsi sebagai tempat bertukarnya gas oksigen dan karbon dioksida. Bagian-bagian yang termasuk dalam komponen pertukaran gas yaitu ductus alveolar, alveolar sac dan alveoli (Banks 1993). 2.4.1 Paru-paru Paru-paru mempunyai bentuk yang menyerupai kerucut. Umumnya pada hewan paru-paru terbagi pada beberapa bagian yang yang disebut lobus. Lobus ditandai dengan adanya percabangan bronkhus yang besar. Paru-paru merupakan organ yang ringan dan berbentuk seperti spons. Paru-paru belum berfungsi pada saat hewan masih berada dalam kandungan. Paru-paru fetus mempunyai konsistensi yang padat dan lebih mirip hati. Pada saat hewan dilahirkan dan melakukan pernafasan untuk pertama kalinya maka paru-paru akan mengembang. Surfaktan merupakan substansi yang dihasilkan oleh sel alveolar tipe II yang menjaga agar paru-paru tetap mengembang (Coville 2002). Paru-paru dapat digolongkan menjadi dua bagian besar, yang pertama adalah susunan bronkhial sedangkan yang kedua adalah alveoli. Susunan bronkhus terbentuk dari pertumbuhan dan diferensiasi usus depan, sedangkan alveolar terbentuk dari jaringan mesenkhim. Jaringan-jaringan ini sudah terbentuk sejak masa embrional (Coville 2002; Aspinall 2004) Fungsi utama paru-paru adalah pertukaran gas. Paru-paru bisa dikatakan sebagai gabungan dari kelenjar tubuloalveolar yang mengekskresikan CO2 dan menukarnya dengan O2. Pertukaran oksigen dan karbon dioksida pada paru-paru terjadi di alveoli. Alveoli berbentuk kantung dengan dinding yang tipis. Alveoli dikelilingi oleh jaring-jaring pembuluh darah kapiler. Dinding alveoli yang tipis serta dinding pembuluh darah kapiler yang juga tipis memungkinkan terjadinya pertukaran gas pada alveoli (Coville 2002). 14 2.4.2 Histologi Paru-paru Sel penyusun utama paru-paru adalah sel alveolar tipe I. Pada sel inilah terjadi pertukaran antara oksigen dan karbon dioksida. Sel ini merupakan sel yang berbentuk pipih. Inti dari sel alveolar tipe I menonjol ke dalam kantung alveol. Sel alveolar tipe I mempunyai fungsi sebagai tempat pertukaran oksigen dan karbon dioksida. Selain sel alveolar tipe I pada paru-paru juga terdapat sel alveolar tipe II dan otot polos. Sel alveolar tipe II merupakan sel sekretori. Pada mikroskop cahaya sel ini terlihat berbentuk bulat atau kubus. Sel alveolar tipe II mempunyai fungsi mengeluarkan sekreta yang disebut surfaktan. Surfaktan mempunyai fungsi untuk menjaga tegangan permukaan untuk mencegah kolapsnya paru-paru (Akers 2008). Gambar 3. Histologi normal paru-paru. BV menandakan pembuluh darah, AV menandakan saluran nafas dan EP menandakan Epitel. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber: Olmez et al. 2009) 2.4.3 Sistem Pertahanan pada Paru-paru Sistem pertahan pada paru-paru secara umum dapat dibagi menjadi sistem pertahanan spesifik dan sistem pertahanan non spesifik. Sistem pertahanan non spesifik terdiri silia, mukus yang dihasilkan, dan refleks batuk. Apabila sistem pertahanan non spesifik tidak mampu menangkal antigen yang masuk maka antigen akan berhadapan dengan sistem pertahanan spesifik. 15 Antibodi spesifik terdiri dari immunoglobulin yang dihasilkan oleh sel limfoid yang banyak tersebar pada saluran pernafasan. Sel-sel limfoid ini berupa limfosit yang tersebar secara acak. Pada saluran pernafasan bagian atas limfosit banyak menghasilkan IgA. Sedangkan pada bronkhiol dan alveoli sekreta yang dihasilkan lebih banyak mengandung IgG. IgA bertugas untuk mencegah penempelan antigen pada dinding saluran pernafasan sehingga antigen tidak bisa menimbulkan kerusakan yang lebih parah. Sedangkan IgG yang banyak dihasilkan pada alveoli dan bronkhioli bertugas ketika terjadi peradangan yang akut transudasi serum protein (Tizard 2008). Gambar 4. Mekanisme Sistem Pertahanan pada Paru-paru (Sumber: Bals 1999) Pada dinding alveol banyak sekali terdapat makrofag. Dalam menjalankan tugasnya makrofag bisa bersifat tetap (tidak berpindah tempat) atau bergerak. Karena makrofag dapat bergerak bebas maka makrofag bisa bekerja secara maksimal dalam membuang sisa antigen pada paru-paru. Makrofag yang bergerak ini dapat meninggalkan paru-paru karena terbawa oleh mukus ke arah laring atau menembus sel alveolar dan masuk ke dalam pembuluh limfe paru-paru (Akers 2008). Conrod (1989) dalam penelitiannya juga menyebutkan bahwa alveolar 16 makrofag merupakan sel yang utama yang melindungi paru-paru dari mikroba yang masuk ke dalam paru-paru. Alveolar makrofag membunuh mikroba baik dengan mekanisme oksidatif maupun non-oksidatif. Selain itu, alveolar makrofag juga mensekresikan faktor anti mikrobial termasuk lisozim, peptida dan transferrin yang memungkinkan alveolar makrofag membunuh mikroba secara ekstraselular. Selain berfungsi untuk membunuh mikroba yang masuk atau terhirup ke paru-paru, sekresi yang dikeluarkan alveolar makrofag juga berfungsi sebagai inisiasi proses peradangan untuk membasmi mikroba secara tuntas. Heitmann (1999) menggunakan mencit unuk mengamati karakteristik immunohistologi dari paru-paru mencit sehat dan melihat jenis sel radang pada paru-paru mencit saat peradangan akut terjadi. Dalam penelitiannya tersebut Heitmann menggunakan Haemophilus influenza tipe b (Hib) yang diberikan secara intratrakhea. Pada paru-paru mencit yang sehat populasi sel radang didominasi oleh sel T, dan sel CD4+. Saat peradangan akut terjadi, jumlah neutrofil pada jaringan parenkhim dan BALT meningkat. Peningkatan neutrofil terjadi pada satu jam pertama setelah infeksi bakteri dan kembali ke jumlah minimum dalam waktu satu minggu. 2.4.5 Perubahan Histopatologi Paru-Paru Pada Penderita Asma Asma didefiniskan sebagai peradangan kronis pada saluran pernafasan yang biasanya dihubungkan dengan kejadian peningkatan sel radang. Gejala klinis yang timbul adalah memendeknya nafas, batuk, sesak nafas, dan mengeluarkan bunyi yang khas saat bernafas (mengi) (Barrios et al. 2006). Olmez et al. 2009 dalam penelitiannya menyebutkan bahwa terjadi beberapa perubahan pada struktur histopatologi pada mencit yang digunakan sebagai model penyakit asma. Dalam penelitiannya tersebut Olmez et al. (2009) mengamati perubahan ketebalan membran basal, ketebalan otot polos subepitelial, ketebalan jaringan epitel, jumlah sel mast, dan jumlah sel goblet. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa pada mencit yang menderita asma terjadiperubahan ketebalan membran basal, ketebalan otot polos subepitelial, ketebalan jaringan epitel, jumlah sel mast, dan jumlah sel goblet. 17 Gambar 5. Perubahan yang terjadi pada jaringan paru-paru mencit model penyakit asma. Bagian yang ditunjuk oleh tanda panah adalah bagian epitel yang menebal. Bagian yang ditunjuk dengan tanda GC adalah peningkatan jumlah sel Goblet. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber Olmez et al. 2009) Gambar 6. Perubahan yang terjadi pada jaringan paru-paru mencit model penyakit asma. Bagian yang ditunjuk dengan tanda GC adalah peningkatan jumlah sel Goblet. Bagian yang ditandai dengan tanda elips menunjukkan infiltrasi sel mononuklear. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber Olmez et al. 2009). 18 Perubahan yang dapat diamati pada preparat histopatologi organ paru-paru yang menderita asma menurut Yamauchi (2006) terdapat pada beberapa bagian. Bagian yang pertama adalah bagian lumen saluran pernafasan. Pada penderita asma, saluran pernafasan akan berisi eksudat. Bagian yang kedua yang dapat diamati pada penderita asma adalah lapisan mukus pada bronkhus. Pada mukosa bronkhus juga terdapat eksudat. Selain eksudat juga terlihat kelainan sel-sel epitel pada mukosa bronkhus. Bagian terakhir adalah dinding bronkhus. Pada penderita asma, dinding bronkhus akan mengalami kelainan berupa hipertrofi otot polos. Emfisema dan asma biasanya dikelompokkan dalam satu kelompok yaitu chronic obstructive pulmonary dissease (COPD). Emfisema adalah perluasan ruangan alveol yang terjadi akibat kerusakan dinding alveol tetapi tanpa diikuti fibrosis. Berdasarkan lokasinya emfisema dapat dibedakan menjadi emfisema sentrilobular, emfisema pan-asinar dan emfisema lokal. Emfisema sentrilobular biasanya disebabkan oleh asap rokok. Emfisema jenis ini banyak sekali ditemui pada paru-paru perokok. Emfisema sentrilobular ditandai dengan emfisema yang terjadi di bronkhus terminal hingga ujung bronkhus. Berbeda dengan emfisema sentrilobular, pada emfisema pan-asinar, kerusakan dinding alveol tidak hanya terjadi di dekat bronkhus terminal, tetapi terjadi di seluruh bagian alveolar. Emfisema lokal adalah emfisema yang hanya terjadi pada daerah-daerah tertentu pada paru-paru, misalnya pada apeks paru-paru (Rubin 2009). 19 BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan. Pemeliharaan hewan coba dan pemberian perlakuan pada hewan coba dilakukan di fasilitas kandang hewan percobaan Bagian Patologi, departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Sedangkan pembuatan preparat Histopatologi dilakukan di Laboratorium Histopatologi, Bagian Patologi, departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Dua belas ekor mencit jantan usia empat minggu 2. Obat-obatan untuk persiapan hewan percobaan sebelum dilakukan perlakuan seperti obat anthelmintik (Albendazole 5%), antibiotik (Clavamox®) dan anti protozoa (Flagyl®). 3. Minyak jintan hitam dan kombinasi minyak jintan hitam dengan madu (sediaan komersial). 4. Kebutuhan mencit seperti pakan dan air minum. 5. Bahan-bahan yang dperlukan untuk keperluan nekropsi dan pengambilan sampel organ seperti kertas tisu, ether, buffered neutral formaline (BNF) 10%, xylol, alkohol, alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, parafin, Mayer’s hematoksilin, lithium karbonat, eosin, larutan albumin, air hangat dengan suhu 45°C, larutan periodic acid 1%, schiff reagent, sodium bisulfit 10%, 1 N HCl dan aquadest. 20 Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1. Alat yang dibutuhkan dalam pemeliharaan mencit berupa boks yang dimodifikasi menjadi kandang, timbangan digital, sonde lambung, dan syringe 1 ml. 2. Alat-alat nekropsi berupa skalpel, gunting pinset dan pot plastik. 3. Alat pembuatan preparat histologi seperti tissue basket, gelas objek, cover glass, spidol, label, tissue cassette, Sakura® automatic tissue processor, Sakura® tissue embedding console, inkubator, dan mikrotom. 4. Mikroskop cahaya dan digital electronic eyepiece camera serta satu unit komputer untuk pengambilan foto preparat histologi. 5. Perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows® untuk penghitungan sel. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Persiapan Hewan Coba Penelitian ini menggunakan dua belas ekor mencit jantan berusia empat minggu. Mencit dipelihara dalam sebuah boks plastik dengan alas kain selama dua bulan. Penggunaan kain dimaksudkan untuk mengurangi resiko yang ditimbulkan akibat debu apabila menggunakan alas sekam atau serbuk gergaji. Sebelum diberikan perlakuan terlebih dahulu dilakukan adaptasi dengan mengistirahatkan mencit selama dua hari. Setelah dilakukan adaptasi mencit diberikan antibiotik, antijamur dan obat cacing untuk menetralkan infeksi. Antibiotik yang digunakan adalah Clavamox® yang berisi kombinasi amoxicillin dan asam clavulanat. Dosis antibiotik yang diberikan adalah 250 mg/ kg BB. Obat cacing yang diberikan adalah obat cacing jenis albendazole dengan konsentrasi 5% dengan dosis 10 mg/ kg BB. Selain itu juga diberikan obat anti protozoa yaitu Flagyl® 500mg yang memmiliki kandungan bahan aktif metronidazole. Pemberian dilakukan selama lima hari berturut-turut dengan dosis pemberian 30 mg/ kg BB. Setelah pemberian obat-obatan selesai dilanjutkan dengan perlakuan yang berlangsung selama dua bulan. 21 3.3.2 Kandang Hewan Coba Hewan coba dipelihara dalam sebuah boks plastik. Pada boks tersebut diletakkan wadah pakan dan wadah minum. Setiap hari dilakukan desinfeksi pada boks, wadah pakan, dan wadah minum menggunakan cairan desinfektan (Bayclin®). Agar hewan coba merasa nyaman maka pada boks diletakkan potongan kain kecil-kecil yang juga didesinfeksi menggunakan Bayclin® setiap hari. A B Gambar 7 Kandang Hewan coba. A Pengelompokan mencit berdasarkan perlakuan B Kandang mencit yang menggunakan alas kain 3.3.3 Pakan dan Minum Pemberian pakan dilakukan satu kali dalam satu hari dengan jumlah 5 gr/ekor/hari. Jumlah tersebut sudah melebihi jumlah kebutuhan pakan untuk satu ekor mencit per hari (Arrington 1972). Pemberian jumlah pakan yang berlebih bertujuan untuk mengantisipasi pakan yang terbuang ketika hewan coba berebut pakan. Pakan yang diberikan merupakan pakan khusus untuk mencit. Air minum diberikan secara ad libitum. Air yang digunakan merupakan air layak minum. 3.3.4 Kelompok Perlakuan Penelitian Penelitian ini menggunakan 12 ekor mencit jantan. Mencit tersebut dibagi menjadi empat kelompok. Masing masing kelompok terdiri dari 3 ekor mencit jantan. Kelompok yang pertama merupakan kelompok kontrol negatif (dicekok air 22 minum) selanjutnya disebut dengan kelompok kontrol, kelompok kedua diberi perlakuan dengan dicekok ekstrak minyak jintan hitam dengan dosis 0,1 ml/ekor/hari selanjutnya disebut dengan kelompok HS 0.1. Kelompok ketiga diberi perlakuan dengan dicekok ekstrak minyak jintan hitam dengan dosis 0,2 ml/ekor/hari selanjutnya disebut dengan kelompok HS 0.2. Kelompok keempat diberi perlakuan dengan dicekok sediaan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dengan madu dengan perbandingan 1:20, selanjutnya disebut dengan kelompok HS-Madu. Dosis sediaan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dengan madu yang diberikan adalah 0,3 ml/ekor/hari (jumlah madu = 0,285 ml, jumlah ekstrak minyak jintan hitam = 0,015 ml). Dosis yang digunakan merupakan konversi dari dosis yang biasa digunakan pada manusia. Pemberian perlakuan ini dilakukan setiap hari selama dua bulan. 3.3.5 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ Setelah masa perlakuan selesai hewan coba dimatikan dengan cara dislokasio atlanto-occipitalis. Hewan kemudian dinekropsi untuk diambil sampel organ paru-parunya. Organ ini kemudian akan diproses menjadi preparat histopatologi yang kemudian akan diamati perubahan histopatologinya. Dari perubahan histopatologi organ tersebut dapat diketahui efek yang ditimbulkan oleh ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa). Segera setelah dilakukan pengambilan, sampel organ langsung difiksasi ke dalam Buffer Neutral Formalin (BNF) 10%. Fiksasi ini dimaksudkan untuk mencegah kerusakan jaringan karena proses pembusukan. 3.3.6 Pembuatan Sediaan Histopatologi Sampel organ yang telah difiksasi dalam cairan BNF 10% kemudian ditrimming dan dimasukkan dalam tissue basket dan kembali difiksasi dalam cairan BNF 10%. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan cara merendam sampel organ secara berturut-turut dalam larutan alkohol konsentrasi bertingkat 70%, 80%, 90%, alkohol absolut dua kali ulangan, silol dua kali ulangan, dan parafin dua kali ulangan. Perendaman pada masing-masing larutan dilakukan selama dua 23 jam. Perendaman dilakukan secara otomatis dengan menggunakan alat Sakura® tissue processor selama satu malam. Setelah melalui serangkaian proses di atas, potongan organ dimasukkan kedalam alat pencetak yang berisi parafin cair (Sakura® tissue embedding console). Letak potongan ditahan agar posisi potongan organ tetap berada di tengah. Setelah mulai membeku, kembali ditambahkan parafin hingga alat pencetak penuh lalu parafin dibiarkan mengeras dan diberi label. Selanjutnya blok parafin yang berisi potongan organ dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5µm. Hasil potongan akan berbentuk pita (ribbon). Untuk menghilangkan lipatan akibat pemotongan pada pita, pita diletakkan di atas permukaan air hangat (450C). Sediaan diangkat dari permukaan air dengan menggunakan gelas objek yang sebelumnya telah dilapisi dengan larutan albumin sebagai perekat. Selanjutnya sediaan dikeringkan pada suhu 600C selama satu malam. Selanjutnya preparat dimasukkan ke dalam larutan silol untuk dideparafinasi sebanyak dua kali. Setelah proses deparafinasi dilakukan proses rehidrasi. Proses rehidrasi diawali dengan mencelupkan preparat ke dalam larutan alkohol absolut sampai larutan alkohol 80%. Pencelupan pada masing-masing larutan dilakukan selama dua menit. Setelah melalui proses rehidrasi preparat dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 3.3.7 Pewarnaan Sediaan Histopatologi Proses selanjutnya adalah proses pewarnaan sediaan histopatologi. Pada penelitian ini dilakukan dua pewarnaan yaitu pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE) dan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS). Pewarnaan HE dilakukan agar perubahan-perubahan umum yang terjadi pada jaringan dapat diamati. Pewarnaan PAS dilakukan agar perubahan pada sel goblet dapat terlihat. Pewarnaan hematoksilin dilakukan lebih dulu dan dilanjutkan dengan pewarnaan eosin. Pewarnaan hematoksilin dilakukan dengan menggunakan pewarna Mayer’s Hematoksilin selama delapan menit, kemudian dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan 24 air, dan diwarnai dengan pewarna eosin selama 2 menit. Selanjutnya sediaan dicuci dengan menggunakan air mengalir untuk menghilangkan pewarna eosin yang berlebih sebelum akhirnya diangkat dan dikeringkan. Setelah sediaan kering, sediaan dicelupkan ke dalam alkohol 90% sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut I sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, silol dua kali ulangan masing-masing selama dua menit. Setelah itu sediaan ditetesi perekat permount dan kemudian ditutup dengan gelas penutup (cover glass) dan dibiarkan kering. Setelah itu sediaan dapat diamati dengan mikroskop cahaya. Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) merupakan pewarnaan khusus. Sediaan yang sudah dideparafinasi digenangi dengan periodic acid 1% selama 10 menit. Periodic acid 1% yang digunakan harus dalam keadaan segar atau baru dibuat. Setelah digenangi dengan periodic acid 1% sediaan dicuci dengan akuades. Sediaan digenangi kembali dengan Schiff reagent selama 20 menit kemudian dibilas dengan air sulfit sebanyak tiga kali. Setelah itu sediaan dicuci dengan air mengalir dan bilas menggunakan akuades. Setelah sediaan dibilas dengan akuades dilakukan proses dehidrasi dan sediaan ditutup dengan menggunakan cover glass dan diamati menggunakan mikroskop cahaya. 3.3.7 Pengamatan Sediaan Histopatologi Pengamatan sediaan histopatologi dilakukan dengan mikroskop cahaya dan dibantu dengan menggunakan alat digital electronic eyepiece camera yang terhubung dengan komputer. Pengamatan ini bertujuan untuk melihat perubahan histopatologi yang terjadi pada organ paru-paru. Pengamatan dilakukan baik terhadap saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru maupun jaringan parenkhim paru-paru. Pembesaran yang digunakan disesuaikan dengan keadaan preparat agar pengamatan dapat dilakukan dengan optimal. Pengamatan terhadap saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru dilakukan dengan menghitung jumlah saluran pernafasan (bronkhus dan bronkhioli) yang dapat terlihat pada lapang pandang 6,32 mm2 semua preparat histopatologi serta mengamati perubahan-perubahan yang terjadi. Perubahan pada 25 saluran nafas yang diamati adalah perubahan epitel dan hadirnya cairan pada saluran nafas serta penghitungan jumlah sel goblet sepanjang 1000 µm, pada 5 lapang pandang. Khusus untuk penghitungan sel goblet digunakan pewarnaan khusus yaitu pewarnaan PAS. Pengamatan keadaan bronkhus associate lymphoid tissue (BALT) pada saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru. Pengamatan meliputi jumlah, diameter dan kepadatan sel limfoid. Selain itu juga diamati perubahan ketebalan yang terjadi pada jaringan otot polos di sekitar saluran nafas (Pembesaran mikroskop yang digunakan pada pengamatan perubahan epitel pada saluran nafas serta penghitungan jumlah saluran pernafasan maupun pengamatan BALT adalah 4 X 10. Sedangkan untuk penghitungan sel goblet digunakan pembesaran 40 X 10. Perubahan jaringan parenkhim paru-paru yang diamati adalah emfisema, fokus-fokus radang, serta keadaan kongesti maupun hemoragi. Pembesaran yang digunakan pada pengamatan emphisema organ paru-paru adalah 40 X 10. Pengamatan terhadap fokus-fokus radang dilakukan dengan mengukur luas wilayah radang dibandingkan dengan luas lapang pandang. Selain luas wilayah radang juga diamati jenis-jenis sel radang yang terdapat pada fokus-fokus radang. Pengamatan terhadap fokus-fokus radang menggunakan pembesaran 40 X 10. Pengamatan keadaan kongesti dan hemoragi dilakukan dengan pembesaran 20 X 10. Pengamatan jaringan otot polos pada saluran pernafasan menggunakan pewarnaan HE dan diamati pada pembesaran 4 X 10. Pengamatan perubahanperubahan histopatologi yaitu ketebalan otot polos yang terjadi dibantu perangkat lunak ImageJ. Penggunaan perangkat lunak ini bertujuan untuk memudahkan pengamatan dan pengukuran. Hasil dari pengamatan ini merupakan indikator yang bisa menggambarkan efek yang ditimbulkan oleh jintan hitam serta kombinasi jintan hitam dan madu. 3.3.8 Analisis Statistik Hasil pengamatan berupa peruahan-perubahan yang terjadi pada saluran nafas, jumlah sel goblet pada saluran nafas, perubahan yang terjadi pada BALT, 26 jenis sel radang pada fokus-fokus radang, perubahan pada jaringan otot, dan perubahan-perubahan lain berupa emfisema, kongesti dan hemoragi. Hasil pengamatan kemudian dianalisa secara statistik menggunakan metode One Way ANOVA dan uji lanjut Duncan untuk melihat perbedaan yang nyata antar kelompok perlakuan. 27 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh pemberian ekstrak jintan hitam terhadap fungsi pernafasan dapat dipelajari dari gambaran histopatologi organ paru-paru dengan adanya perubahanperubahan yang terjadi pada jaringan organ tersebut. Perubahan pada paru-paru dilihat dengan mengamati sistem saluran pernafasan, bronkhus, bronkhiolus dan jaringan parenkhim paru-paru yaitu alveol. Pada penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap bronkhus dan bronkhiolus meliputi adanya eksudat pada saluran nafas, dan jumlah sel goblet pada bronkhiolus. Selain itu juga dilakukan pengamatan terhadap ketebalan otot polos di sekitar bronkhus. Pengamatan terhadap Bronchial Associated Lymphoid Tissue (BALT) meliputi luas fokus BALT pada bronkhus serta kepadatan sel BALT tersebut. Pengamatan terhadap jaringan parenkhim paru-paru meliputi pengamatan terhadap keadaan kongesti dan hemoragi serta pengamatan terhadap fokus-fokus radang. Selain itu juga dilakukan pengamatan terhadap emfisema. 4.1 Eksudat pada bronkhus dan bronkhiolus Pengamatan terhadap adanya eksudat di saluran nafas yaitu bronkhus dan bronkhiolus dilakukan pada perbesaran 10x10. Pengamatan dilakukan pada semua bronkhus dan bronkhiolus pada jaringan paru di seluruh sediaan. Perhitungan dilakukan dengan membagi jumlah bronkhus dan bronkhiolus yang lumennya berisi eksudat dengan jumlah bronkhus dan bronkhiolus yang ditemukan secara keseluruhan pada semua bidang sayatan sediaan. Hasil pengamatan terhadap bronkhus dan bronkhiolus disajikan pada tabel 8. Tabel 8 Persentase bronkhus dan bronkhiolus yang bereksudat pada mencit yang diberi perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Persentase bronkhus yang Persentase bronkhiolus bereksudat (%) yang bereksudat (%) a Kontrol 4.77±0.29 4.68±0.00a HS 0.1 4.74±0.23a 4.60±0.10a a HS 0.2 4.93±0.07 4.67± 0.00a HS-Madu 4.74±0.14a 4.60±0.13a Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan pada taraf p256 128 >256 >256 256 >512 256 32 >512 >512 64 4 2 8 4 8 1 16 4 8 16 8 32 32 64 256 >256 32 64 2 16 4 8 32 8 4 16 16 16 32 32 8 8 8 64 16 8 Minimum Inhibitory Concentration Minimum Bactericidal Concentration Sumber: Chaieb et al (2011) Selain memiliki aktivitas antimikroba, jintan hitam juga diketahui memiliki aktivitas antifungi dan antihelmintika. Biji jintan hitam berkhasiat sebagai obat cacing (Hutapea 1994). Ela (2002) meneliti tentang efek ekstrak jintan hitam terhadap tikus yang mengalami schistosomiasis. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa thymoquinone yang merupakan kandungan dari jintan hitam memberikan efek mencegah aberasi kromosom pada mencit yang diinfeksi schistomiasis. Thymoquinone yang merupakan bahan yang terdapat pada jintan hitam juga dilaporkan memiliki efek protektif terhadap aberasi kromosom. Ekstrak jintan hitam juga mempunyai efek inhibisi terhadap khamir patogen Candida albican (Salama 2010). Jintan hitam di Arab Saudi biasanya digunakan sebagai obat untuk penyakit asma (Salama 2010). Penelitian yang dilakukan oleh Boskabady et al. (2007) menunjukkan bahwa jintan hitam memiliki efek pencegahan pada pasien penderita asma. Efek protektif dan kuratif terhadap penyakit asma diduga berasal dari efek anti histamin yang dimiliki oleh jintan hitam. Dalam penelitian yang lain Boskabady et al. (2008) menyatakan bahwa jintan hitam juga memberikan efek 8 protektif pada paru-paru marmut yang dipapar gas berbahaya yaitu sulfur mustard. Ramadhan (2011) menggunakan mencit untuk menguji efek analgesik jintan hitam. Mencit jantan yang terlebih dahulu diberi minyak jintan hitam lebih tahan terhadap rasa sakit yang disebabkan oleh asam asetat dibandingkan mencit jantan pada kelompok kontrol. Mencit betina mempunyai mekanisme yang berbeda dengan mencit jantan dalam merespon rasa sakit yang ditimbulkan oleh asam asetat. Namun demikian pemberian minyak jintan hitam juga menunjukkan efek yang sama dengan yang ditimbulkan pada mencit jantan. Efek analgesik jintan hitam berasal dari kandungan aktif jintan hitam yaitu thymoquinone. Efek antiinflamasi juga ditunjukkan oleh jintan hitam. Borgou et al. (2010) menguji efek antiinflamasi jintan hitam dengan mengukur kemampuan jintan hitam dalam menghambat pembentukan NO (nitrat oksida). NO merupakan radikal bebas yang dihasilkan oleh jaringan tubuh. NO bisa dijadikan indikator keadaan patologis beberapa jenis inflamasi. Thymoquinone terbukti sebagai bahan aktif jintan hitam yang mampu menghambat pembentukan NO. Seperti yang disebutkan di atas, jintan hitam juga memiliki efek antioksidan. Antioksidan berfungsi dalam menangkal radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan pada sel. Jintan hitam terbukti dapat menurunkan produksi ROS (reactive oxygen species) yang dapat merusak sel. Efek antioksidan dari jintan hitam berasal dari thymoquinone (Borgou et al. 2010). Boskabady et al. (2007) dalam penelitiannya mengamati efek jintan terhadap pasien penyakit asma. Dalam penelitian tersebut disimpulkan bahwa jintan hitam memiliki efek preventif terhadap asma. Terjadi peningkatan nilai PFT (Pulmonary Function Test) pada kelompok pasien asma yang diberi jintan hitam. Respon alergi merupakan salah satu penyebab penyakit asma. Jintan hitam dilaporkan dalam beberapa uji in vivo dilaporkan tidak memiliki efek samping. Hal ini tentu sangat membantu pengobatan asma tanpa menimbulkan alergi. Selain itu jintan hitam juga diketahui memiliki efek hepatoprotektif yang akan mendukung proses penyembuhan penyakit asma (Boskabady et al. 2007). 9 2.2 Madu Madu merupakan zat manis alami yang dihasilkan oleh lebah. Bahan baku madu adalah nektar. Nektar adalah senyawa kompleks yang dihasilkan oleh kelenjar tanaman dalam bentuk larutan gula. Perubahan nektar menjadi madu dimulai ketika lebah pekerja membawa nektar ke sarangnya. Untuk menghasilkan 1 kg madu, lebah harus mengumpulkan 120.000-150.000 tetes nektar atau 3-4 kg nektar dengan menempuh jarak 360.000-450.000 Km (Sarwono 2001). Berdasarkan asal nektarnya, madu dapat digolongkan menjadi tiga golongan yaitu madu flora, madu ekstra flora dan madu embun. Madu flora adalah madu yang bahan bakunya berasal dari bunga. Disebut madu monoflora jika hanya berasal dari satu jenis bunga dan poliflora jika berasal dari berbagai macam bunga. Madu ekstraflora adalah madu yang berasal dari luar daun, misalnya batang, cabang atau daun tanaman. Sedangkan madu embun adalah madu yang dihasilkan dari hasil suksesi serangga yang kemudian eksudatnya diambil oleh lebah madu (Sarwono 2001). Sejak zaman mesir kuno 2600 SM madu sudah dikenal sebagai obat. Diantaranya madu digunakan sebagai salep antiseptik untuk mengobati luka oleh bangsa Yunani, Romawi, Assyiria, dan Cina kuno. Madu juga dapat mencegah pertumbuhan mikroba seperti Salmonella, Shigella, E. Coli dan V. cholerae yang dapat menyebabkan diare. Apabila kandungan gula pada madu dihilangkan, maka madu mempunyai khasiat yang sama dengan streptomycin dalam membunuh bakteri (Sarwono 2001). Selain itu, madu juga mempunyai efek anti aritmia akibat keracunan katekolamin. Efek anti aritmia ini berasal dari aktivitas hiperadrenergik yang dimiliki oleh madu (Hussein 2003). Madu juga mempunyai efek protektif terhadap hati. Pada suatu penelitian dibuktikan bahwa madu mempunyai efek protektif terhadap kerusakan hati yang disebabkan oleh karbon tetraklorida (CCl4). Kerusakan hati akibat CCl4 dapat menyebabkan penurunan berat badan, penurunan asupan makanan serta penurunan bobot hati dan ginjal (El Denshary et al. 2011). 10 Tabel 4. Komposisi Kimia Madu per 100 gr Komposisi Kalori Kadar Air Protein Karbohidrat Jumlah 328 kal 17,2 g 0,5 g 82,4 g Sumber: Suranto (2004) Selain memiliki kandungan gula, madu juga memiliki kandungan nutrisi lain yang penting bagi tubuh. Madu mengandung garam mineral, protein, lemak, dan vitamin A, vitamin B dan vitamin C. Dalam 100 gr madu terkandung 294 kalori, 9,5 g karbohidrat, 24 g air, 16 mg fosfor, 5 mg kalsium dan 4 mg vitamin C (Sarwono 2001). 2.3 Mencit Klasifikasi mencit putih Arrington (1972): Kingdom : Animalia Filum : Chordata Kelas : Mamalia Ordo : Rodentia Family : Muridae Genus : Mus Species : Mus musculus Mencit merupakan hewan jinak, lemah, mudah ditangani, takut cahaya dan aktif pada malam hari. Mencit yang dipelihara sendiri makannya lebih sedikit dan bobot badan lebih ringan daripada yang dipelihara bersama-sama dalam satu kandang. Beberapa mencit mempunyai sifat kanibal (Penn 1999). Mencit bersifat sosial, aktif, dan cerdas. Memiliki kemampuan beradaptasi, ukuran yang kecil, reproduksi cepat dan karakteristik genetik yang luas juga menambah nilai tikus dan mencit sebagai hewan percobaan. 11 Gambar 2. Mencit (Mus musculus) Sumber: Sancheti 2011 Banyak strain berbeda dari mencit laboratorium yang telah dikembangkan oleh ahli genetik, beberapa strain seperti swiss webster dikembangkan secara outbreed, sementara beberapa strain lain seperti DDY, Balb/c, DBA, dan BC dikembangkan secara inbreed dengan gen-gen yang homozigot (Penn 1999). Tabel 5. Data Dasar Fisiologis Mencit Berat Dewasa Jantan Betina Berat Lahir Masa Kebuntingan Masa Hidup Suhu Tubuh Konsumsi Pakan Konsumsi Air Hemoglobin Rataan Kisaran Hematokrit Eritrosit Rataan Kisaran Limfosit Rataan Kisaran Sumber: Arrington (1972) 20-40 gr 18-35 gr 1,0-1,5 gr 18-21 hari 1-2 tahun 37,4 0C 4-5 gr/100 gr BB/ hari 4-7 gr/ 100 gr BB/ hari 14,8 gr% 10-19 gr% 41,5 % 9,3 x 106/µL 7,7-12,5 x 106/µL 8 x 103/ µL 4-12 x 103/ µL Mencit mempunyai lama hidup sekitar satu hingga dua tahun. Bahkan beberapa bisa mencapai usia tiga tahun dengan lama masa produktif selama sembilan bulan. Mencit mencapai dewasa kelamin pada usia 35 hari dan setalah usia delapan minggu, mencit sudah dapat dikawinkan. Pencapaian pubertas dan 12 siklus estrus dipengaruhi oleh paparan pheromon. Lama kebuntingan mencit adalah 18-21 hari dengan jumlah anak rata-rata enam ekor. Kebuntingan dapat diketahui pada hari ke 14 dengan cara palpasi, peningkatan bobot badan, dan perkembangan kelenjar mamae. Bobot badan mencit jantan dewasa adalah 20-40 gr dan bobot badan mencit betina dewasa adalah 18-35 gr. Mencit dapat dipelihara pada kotak dengan berbagai macam bahan seperti plastik (polipropilen atau polikarbonat), aluminium atau baja tahan karat (Smith & Mangkoewidjaja 1988). Biasanya mencit jantan mempunyai ukuran yang lebih besar dibandingkan dengan betina. Mencit memiliki kelenjar Harderian yang memproduksi pigmen porfirin yang dapat teramati di sekitar mata ketika hewan mengalami stress atau sedang sakit. Mencit tidak bisa muntah dan tidak memiliki kantung empedu. Mencit albino mengalami degenerasi retina dan memiliki kemampuan penglihatan yang lemah (Kahn 2010). 2.4 Organ sistem pernafasan mencit 2.4.1 Saluran nafas Secara sederhana fungsi utama sistem pernafasan adalah membawa oksigen (O2) masuk ke dalam tubuh dan membuang karbon dioksida (CO2) keluar dari tubuh. Semua organ yang terkait dengan pernafasan mempunyai tugas untuk mendukung fungsi tersebut. Oksigen dibutuhkan untuk proses metabolisme tubuh. Sedangkan karbon dioksida merupakan limbah dari proses metabolisme tubuh. Proses pertukaran oksigen dan karbonsioksida disebut pernafasan. Pernafasan dapat dibagi menjadi pernafasan internal dan pernafasan eksternal. Pernafasan internal adalah pernafasan yang terjadi pada tingkat sel, sedangkan pernafasan eksternal adalah pernafasan yang terjadi pada paru-paru. Selain fungsi utama sebagai penyalur udara dan pertukaran gas, sistem respirasi juga memiliki fungsi tambahan yaitu menghasilkan suara, penciuman, pengaturan suhu tubuh, ekskresi, keseimbangan asam basa dan tekanan darah (Coville 2002). Struktur dari sistem pernafasan berdasarkan fungsinya dapat dibedakan menjadi tiga bagian yaitu komponen konduktif, komponen transisi dan komponen 13 pertukaran gas. Komponen konduktif memanjang dari rongga hidung sampai bronkhiol. Komponen konduktif mempunyai fungsi sebagai penyalur udara. Komponen transisi yaitu komponen yang berfungsi sebagai penyalur (konduksi) sekaligus sebagai tempat pertukaran gas. Komponen pertukaran gas sesuai dengan namanya mempunyai fungsi sebagai tempat bertukarnya gas oksigen dan karbon dioksida. Bagian-bagian yang termasuk dalam komponen pertukaran gas yaitu ductus alveolar, alveolar sac dan alveoli (Banks 1993). 2.4.1 Paru-paru Paru-paru mempunyai bentuk yang menyerupai kerucut. Umumnya pada hewan paru-paru terbagi pada beberapa bagian yang yang disebut lobus. Lobus ditandai dengan adanya percabangan bronkhus yang besar. Paru-paru merupakan organ yang ringan dan berbentuk seperti spons. Paru-paru belum berfungsi pada saat hewan masih berada dalam kandungan. Paru-paru fetus mempunyai konsistensi yang padat dan lebih mirip hati. Pada saat hewan dilahirkan dan melakukan pernafasan untuk pertama kalinya maka paru-paru akan mengembang. Surfaktan merupakan substansi yang dihasilkan oleh sel alveolar tipe II yang menjaga agar paru-paru tetap mengembang (Coville 2002). Paru-paru dapat digolongkan menjadi dua bagian besar, yang pertama adalah susunan bronkhial sedangkan yang kedua adalah alveoli. Susunan bronkhus terbentuk dari pertumbuhan dan diferensiasi usus depan, sedangkan alveolar terbentuk dari jaringan mesenkhim. Jaringan-jaringan ini sudah terbentuk sejak masa embrional (Coville 2002; Aspinall 2004) Fungsi utama paru-paru adalah pertukaran gas. Paru-paru bisa dikatakan sebagai gabungan dari kelenjar tubuloalveolar yang mengekskresikan CO2 dan menukarnya dengan O2. Pertukaran oksigen dan karbon dioksida pada paru-paru terjadi di alveoli. Alveoli berbentuk kantung dengan dinding yang tipis. Alveoli dikelilingi oleh jaring-jaring pembuluh darah kapiler. Dinding alveoli yang tipis serta dinding pembuluh darah kapiler yang juga tipis memungkinkan terjadinya pertukaran gas pada alveoli (Coville 2002). 14 2.4.2 Histologi Paru-paru Sel penyusun utama paru-paru adalah sel alveolar tipe I. Pada sel inilah terjadi pertukaran antara oksigen dan karbon dioksida. Sel ini merupakan sel yang berbentuk pipih. Inti dari sel alveolar tipe I menonjol ke dalam kantung alveol. Sel alveolar tipe I mempunyai fungsi sebagai tempat pertukaran oksigen dan karbon dioksida. Selain sel alveolar tipe I pada paru-paru juga terdapat sel alveolar tipe II dan otot polos. Sel alveolar tipe II merupakan sel sekretori. Pada mikroskop cahaya sel ini terlihat berbentuk bulat atau kubus. Sel alveolar tipe II mempunyai fungsi mengeluarkan sekreta yang disebut surfaktan. Surfaktan mempunyai fungsi untuk menjaga tegangan permukaan untuk mencegah kolapsnya paru-paru (Akers 2008). Gambar 3. Histologi normal paru-paru. BV menandakan pembuluh darah, AV menandakan saluran nafas dan EP menandakan Epitel. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber: Olmez et al. 2009) 2.4.3 Sistem Pertahanan pada Paru-paru Sistem pertahan pada paru-paru secara umum dapat dibagi menjadi sistem pertahanan spesifik dan sistem pertahanan non spesifik. Sistem pertahanan non spesifik terdiri silia, mukus yang dihasilkan, dan refleks batuk. Apabila sistem pertahanan non spesifik tidak mampu menangkal antigen yang masuk maka antigen akan berhadapan dengan sistem pertahanan spesifik. 15 Antibodi spesifik terdiri dari immunoglobulin yang dihasilkan oleh sel limfoid yang banyak tersebar pada saluran pernafasan. Sel-sel limfoid ini berupa limfosit yang tersebar secara acak. Pada saluran pernafasan bagian atas limfosit banyak menghasilkan IgA. Sedangkan pada bronkhiol dan alveoli sekreta yang dihasilkan lebih banyak mengandung IgG. IgA bertugas untuk mencegah penempelan antigen pada dinding saluran pernafasan sehingga antigen tidak bisa menimbulkan kerusakan yang lebih parah. Sedangkan IgG yang banyak dihasilkan pada alveoli dan bronkhioli bertugas ketika terjadi peradangan yang akut transudasi serum protein (Tizard 2008). Gambar 4. Mekanisme Sistem Pertahanan pada Paru-paru (Sumber: Bals 1999) Pada dinding alveol banyak sekali terdapat makrofag. Dalam menjalankan tugasnya makrofag bisa bersifat tetap (tidak berpindah tempat) atau bergerak. Karena makrofag dapat bergerak bebas maka makrofag bisa bekerja secara maksimal dalam membuang sisa antigen pada paru-paru. Makrofag yang bergerak ini dapat meninggalkan paru-paru karena terbawa oleh mukus ke arah laring atau menembus sel alveolar dan masuk ke dalam pembuluh limfe paru-paru (Akers 2008). Conrod (1989) dalam penelitiannya juga menyebutkan bahwa alveolar 16 makrofag merupakan sel yang utama yang melindungi paru-paru dari mikroba yang masuk ke dalam paru-paru. Alveolar makrofag membunuh mikroba baik dengan mekanisme oksidatif maupun non-oksidatif. Selain itu, alveolar makrofag juga mensekresikan faktor anti mikrobial termasuk lisozim, peptida dan transferrin yang memungkinkan alveolar makrofag membunuh mikroba secara ekstraselular. Selain berfungsi untuk membunuh mikroba yang masuk atau terhirup ke paru-paru, sekresi yang dikeluarkan alveolar makrofag juga berfungsi sebagai inisiasi proses peradangan untuk membasmi mikroba secara tuntas. Heitmann (1999) menggunakan mencit unuk mengamati karakteristik immunohistologi dari paru-paru mencit sehat dan melihat jenis sel radang pada paru-paru mencit saat peradangan akut terjadi. Dalam penelitiannya tersebut Heitmann menggunakan Haemophilus influenza tipe b (Hib) yang diberikan secara intratrakhea. Pada paru-paru mencit yang sehat populasi sel radang didominasi oleh sel T, dan sel CD4+. Saat peradangan akut terjadi, jumlah neutrofil pada jaringan parenkhim dan BALT meningkat. Peningkatan neutrofil terjadi pada satu jam pertama setelah infeksi bakteri dan kembali ke jumlah minimum dalam waktu satu minggu. 2.4.5 Perubahan Histopatologi Paru-Paru Pada Penderita Asma Asma didefiniskan sebagai peradangan kronis pada saluran pernafasan yang biasanya dihubungkan dengan kejadian peningkatan sel radang. Gejala klinis yang timbul adalah memendeknya nafas, batuk, sesak nafas, dan mengeluarkan bunyi yang khas saat bernafas (mengi) (Barrios et al. 2006). Olmez et al. 2009 dalam penelitiannya menyebutkan bahwa terjadi beberapa perubahan pada struktur histopatologi pada mencit yang digunakan sebagai model penyakit asma. Dalam penelitiannya tersebut Olmez et al. (2009) mengamati perubahan ketebalan membran basal, ketebalan otot polos subepitelial, ketebalan jaringan epitel, jumlah sel mast, dan jumlah sel goblet. Hasil dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa pada mencit yang menderita asma terjadiperubahan ketebalan membran basal, ketebalan otot polos subepitelial, ketebalan jaringan epitel, jumlah sel mast, dan jumlah sel goblet. 17 Gambar 5. Perubahan yang terjadi pada jaringan paru-paru mencit model penyakit asma. Bagian yang ditunjuk oleh tanda panah adalah bagian epitel yang menebal. Bagian yang ditunjuk dengan tanda GC adalah peningkatan jumlah sel Goblet. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber Olmez et al. 2009) Gambar 6. Perubahan yang terjadi pada jaringan paru-paru mencit model penyakit asma. Bagian yang ditunjuk dengan tanda GC adalah peningkatan jumlah sel Goblet. Bagian yang ditandai dengan tanda elips menunjukkan infiltrasi sel mononuklear. Gambar A menggunakan pewarnaan HE, Gambar B menggunakan pewarnaan PAS. (Sumber Olmez et al. 2009). 18 Perubahan yang dapat diamati pada preparat histopatologi organ paru-paru yang menderita asma menurut Yamauchi (2006) terdapat pada beberapa bagian. Bagian yang pertama adalah bagian lumen saluran pernafasan. Pada penderita asma, saluran pernafasan akan berisi eksudat. Bagian yang kedua yang dapat diamati pada penderita asma adalah lapisan mukus pada bronkhus. Pada mukosa bronkhus juga terdapat eksudat. Selain eksudat juga terlihat kelainan sel-sel epitel pada mukosa bronkhus. Bagian terakhir adalah dinding bronkhus. Pada penderita asma, dinding bronkhus akan mengalami kelainan berupa hipertrofi otot polos. Emfisema dan asma biasanya dikelompokkan dalam satu kelompok yaitu chronic obstructive pulmonary dissease (COPD). Emfisema adalah perluasan ruangan alveol yang terjadi akibat kerusakan dinding alveol tetapi tanpa diikuti fibrosis. Berdasarkan lokasinya emfisema dapat dibedakan menjadi emfisema sentrilobular, emfisema pan-asinar dan emfisema lokal. Emfisema sentrilobular biasanya disebabkan oleh asap rokok. Emfisema jenis ini banyak sekali ditemui pada paru-paru perokok. Emfisema sentrilobular ditandai dengan emfisema yang terjadi di bronkhus terminal hingga ujung bronkhus. Berbeda dengan emfisema sentrilobular, pada emfisema pan-asinar, kerusakan dinding alveol tidak hanya terjadi di dekat bronkhus terminal, tetapi terjadi di seluruh bagian alveolar. Emfisema lokal adalah emfisema yang hanya terjadi pada daerah-daerah tertentu pada paru-paru, misalnya pada apeks paru-paru (Rubin 2009). 19 BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan. Pemeliharaan hewan coba dan pemberian perlakuan pada hewan coba dilakukan di fasilitas kandang hewan percobaan Bagian Patologi, departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Sedangkan pembuatan preparat Histopatologi dilakukan di Laboratorium Histopatologi, Bagian Patologi, departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Dua belas ekor mencit jantan usia empat minggu 2. Obat-obatan untuk persiapan hewan percobaan sebelum dilakukan perlakuan seperti obat anthelmintik (Albendazole 5%), antibiotik (Clavamox®) dan anti protozoa (Flagyl®). 3. Minyak jintan hitam dan kombinasi minyak jintan hitam dengan madu (sediaan komersial). 4. Kebutuhan mencit seperti pakan dan air minum. 5. Bahan-bahan yang dperlukan untuk keperluan nekropsi dan pengambilan sampel organ seperti kertas tisu, ether, buffered neutral formaline (BNF) 10%, xylol, alkohol, alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, parafin, Mayer’s hematoksilin, lithium karbonat, eosin, larutan albumin, air hangat dengan suhu 45°C, larutan periodic acid 1%, schiff reagent, sodium bisulfit 10%, 1 N HCl dan aquadest. 20 Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1. Alat yang dibutuhkan dalam pemeliharaan mencit berupa boks yang dimodifikasi menjadi kandang, timbangan digital, sonde lambung, dan syringe 1 ml. 2. Alat-alat nekropsi berupa skalpel, gunting pinset dan pot plastik. 3. Alat pembuatan preparat histologi seperti tissue basket, gelas objek, cover glass, spidol, label, tissue cassette, Sakura® automatic tissue processor, Sakura® tissue embedding console, inkubator, dan mikrotom. 4. Mikroskop cahaya dan digital electronic eyepiece camera serta satu unit komputer untuk pengambilan foto preparat histologi. 5. Perangkat lunak Image J® for Microsoft® Windows® untuk penghitungan sel. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Persiapan Hewan Coba Penelitian ini menggunakan dua belas ekor mencit jantan berusia empat minggu. Mencit dipelihara dalam sebuah boks plastik dengan alas kain selama dua bulan. Penggunaan kain dimaksudkan untuk mengurangi resiko yang ditimbulkan akibat debu apabila menggunakan alas sekam atau serbuk gergaji. Sebelum diberikan perlakuan terlebih dahulu dilakukan adaptasi dengan mengistirahatkan mencit selama dua hari. Setelah dilakukan adaptasi mencit diberikan antibiotik, antijamur dan obat cacing untuk menetralkan infeksi. Antibiotik yang digunakan adalah Clavamox® yang berisi kombinasi amoxicillin dan asam clavulanat. Dosis antibiotik yang diberikan adalah 250 mg/ kg BB. Obat cacing yang diberikan adalah obat cacing jenis albendazole dengan konsentrasi 5% dengan dosis 10 mg/ kg BB. Selain itu juga diberikan obat anti protozoa yaitu Flagyl® 500mg yang memmiliki kandungan bahan aktif metronidazole. Pemberian dilakukan selama lima hari berturut-turut dengan dosis pemberian 30 mg/ kg BB. Setelah pemberian obat-obatan selesai dilanjutkan dengan perlakuan yang berlangsung selama dua bulan. 21 3.3.2 Kandang Hewan Coba Hewan coba dipelihara dalam sebuah boks plastik. Pada boks tersebut diletakkan wadah pakan dan wadah minum. Setiap hari dilakukan desinfeksi pada boks, wadah pakan, dan wadah minum menggunakan cairan desinfektan (Bayclin®). Agar hewan coba merasa nyaman maka pada boks diletakkan potongan kain kecil-kecil yang juga didesinfeksi menggunakan Bayclin® setiap hari. A B Gambar 7 Kandang Hewan coba. A Pengelompokan mencit berdasarkan perlakuan B Kandang mencit yang menggunakan alas kain 3.3.3 Pakan dan Minum Pemberian pakan dilakukan satu kali dalam satu hari dengan jumlah 5 gr/ekor/hari. Jumlah tersebut sudah melebihi jumlah kebutuhan pakan untuk satu ekor mencit per hari (Arrington 1972). Pemberian jumlah pakan yang berlebih bertujuan untuk mengantisipasi pakan yang terbuang ketika hewan coba berebut pakan. Pakan yang diberikan merupakan pakan khusus untuk mencit. Air minum diberikan secara ad libitum. Air yang digunakan merupakan air layak minum. 3.3.4 Kelompok Perlakuan Penelitian Penelitian ini menggunakan 12 ekor mencit jantan. Mencit tersebut dibagi menjadi empat kelompok. Masing masing kelompok terdiri dari 3 ekor mencit jantan. Kelompok yang pertama merupakan kelompok kontrol negatif (dicekok air 22 minum) selanjutnya disebut dengan kelompok kontrol, kelompok kedua diberi perlakuan dengan dicekok ekstrak minyak jintan hitam dengan dosis 0,1 ml/ekor/hari selanjutnya disebut dengan kelompok HS 0.1. Kelompok ketiga diberi perlakuan dengan dicekok ekstrak minyak jintan hitam dengan dosis 0,2 ml/ekor/hari selanjutnya disebut dengan kelompok HS 0.2. Kelompok keempat diberi perlakuan dengan dicekok sediaan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dengan madu dengan perbandingan 1:20, selanjutnya disebut dengan kelompok HS-Madu. Dosis sediaan kombinasi antara ekstrak minyak jintan hitam dengan madu yang diberikan adalah 0,3 ml/ekor/hari (jumlah madu = 0,285 ml, jumlah ekstrak minyak jintan hitam = 0,015 ml). Dosis yang digunakan merupakan konversi dari dosis yang biasa digunakan pada manusia. Pemberian perlakuan ini dilakukan setiap hari selama dua bulan. 3.3.5 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ Setelah masa perlakuan selesai hewan coba dimatikan dengan cara dislokasio atlanto-occipitalis. Hewan kemudian dinekropsi untuk diambil sampel organ paru-parunya. Organ ini kemudian akan diproses menjadi preparat histopatologi yang kemudian akan diamati perubahan histopatologinya. Dari perubahan histopatologi organ tersebut dapat diketahui efek yang ditimbulkan oleh ekstrak minyak jintan hitam (Nigella sativa). Segera setelah dilakukan pengambilan, sampel organ langsung difiksasi ke dalam Buffer Neutral Formalin (BNF) 10%. Fiksasi ini dimaksudkan untuk mencegah kerusakan jaringan karena proses pembusukan. 3.3.6 Pembuatan Sediaan Histopatologi Sampel organ yang telah difiksasi dalam cairan BNF 10% kemudian ditrimming dan dimasukkan dalam tissue basket dan kembali difiksasi dalam cairan BNF 10%. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan cara merendam sampel organ secara berturut-turut dalam larutan alkohol konsentrasi bertingkat 70%, 80%, 90%, alkohol absolut dua kali ulangan, silol dua kali ulangan, dan parafin dua kali ulangan. Perendaman pada masing-masing larutan dilakukan selama dua 23 jam. Perendaman dilakukan secara otomatis dengan menggunakan alat Sakura® tissue processor selama satu malam. Setelah melalui serangkaian proses di atas, potongan organ dimasukkan kedalam alat pencetak yang berisi parafin cair (Sakura® tissue embedding console). Letak potongan ditahan agar posisi potongan organ tetap berada di tengah. Setelah mulai membeku, kembali ditambahkan parafin hingga alat pencetak penuh lalu parafin dibiarkan mengeras dan diberi label. Selanjutnya blok parafin yang berisi potongan organ dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 5µm. Hasil potongan akan berbentuk pita (ribbon). Untuk menghilangkan lipatan akibat pemotongan pada pita, pita diletakkan di atas permukaan air hangat (450C). Sediaan diangkat dari permukaan air dengan menggunakan gelas objek yang sebelumnya telah dilapisi dengan larutan albumin sebagai perekat. Selanjutnya sediaan dikeringkan pada suhu 600C selama satu malam. Selanjutnya preparat dimasukkan ke dalam larutan silol untuk dideparafinasi sebanyak dua kali. Setelah proses deparafinasi dilakukan proses rehidrasi. Proses rehidrasi diawali dengan mencelupkan preparat ke dalam larutan alkohol absolut sampai larutan alkohol 80%. Pencelupan pada masing-masing larutan dilakukan selama dua menit. Setelah melalui proses rehidrasi preparat dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. 3.3.7 Pewarnaan Sediaan Histopatologi Proses selanjutnya adalah proses pewarnaan sediaan histopatologi. Pada penelitian ini dilakukan dua pewarnaan yaitu pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE) dan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS). Pewarnaan HE dilakukan agar perubahan-perubahan umum yang terjadi pada jaringan dapat diamati. Pewarnaan PAS dilakukan agar perubahan pada sel goblet dapat terlihat. Pewarnaan hematoksilin dilakukan lebih dulu dan dilanjutkan dengan pewarnaan eosin. Pewarnaan hematoksilin dilakukan dengan menggunakan pewarna Mayer’s Hematoksilin selama delapan menit, kemudian dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan 24 air, dan diwarnai dengan pewarna eosin selama 2 menit. Selanjutnya sediaan dicuci dengan menggunakan air mengalir untuk menghilangkan pewarna eosin yang berlebih sebelum akhirnya diangkat dan dikeringkan. Setelah sediaan kering, sediaan dicelupkan ke dalam alkohol 90% sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut I sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, silol dua kali ulangan masing-masing selama dua menit. Setelah itu sediaan ditetesi perekat permount dan kemudian ditutup dengan gelas penutup (cover glass) dan dibiarkan kering. Setelah itu sediaan dapat diamati dengan mikroskop cahaya. Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) merupakan pewarnaan khusus. Sediaan yang sudah dideparafinasi digenangi dengan periodic acid 1% selama 10 menit. Periodic acid 1% yang digunakan harus dalam keadaan segar atau baru dibuat. Setelah digenangi dengan periodic acid 1% sediaan dicuci dengan akuades. Sediaan digenangi kembali dengan Schiff reagent selama 20 menit kemudian dibilas dengan air sulfit sebanyak tiga kali. Setelah itu sediaan dicuci dengan air mengalir dan bilas menggunakan akuades. Setelah sediaan dibilas dengan akuades dilakukan proses dehidrasi dan sediaan ditutup dengan menggunakan cover glass dan diamati menggunakan mikroskop cahaya. 3.3.7 Pengamatan Sediaan Histopatologi Pengamatan sediaan histopatologi dilakukan dengan mikroskop cahaya dan dibantu dengan menggunakan alat digital electronic eyepiece camera yang terhubung dengan komputer. Pengamatan ini bertujuan untuk melihat perubahan histopatologi yang terjadi pada organ paru-paru. Pengamatan dilakukan baik terhadap saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru maupun jaringan parenkhim paru-paru. Pembesaran yang digunakan disesuaikan dengan keadaan preparat agar pengamatan dapat dilakukan dengan optimal. Pengamatan terhadap saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru dilakukan dengan menghitung jumlah saluran pernafasan (bronkhus dan bronkhioli) yang dapat terlihat pada lapang pandang 6,32 mm2 semua preparat histopatologi serta mengamati perubahan-perubahan yang terjadi. Perubahan pada 25 saluran nafas yang diamati adalah perubahan epitel dan hadirnya cairan pada saluran nafas serta penghitungan jumlah sel goblet sepanjang 1000 µm, pada 5 lapang pandang. Khusus untuk penghitungan sel goblet digunakan pewarnaan khusus yaitu pewarnaan PAS. Pengamatan keadaan bronkhus associate lymphoid tissue (BALT) pada saluran pernafasan yang terdapat di paru-paru. Pengamatan meliputi jumlah, diameter dan kepadatan sel limfoid. Selain itu juga diamati perubahan ketebalan yang terjadi pada jaringan otot polos di sekitar saluran nafas (Pembesaran mikroskop yang digunakan pada pengamatan perubahan epitel pada saluran nafas serta penghitungan jumlah saluran pernafasan maupun pengamatan BALT adalah 4 X 10. Sedangkan untuk penghitungan sel goblet digunakan pembesaran 40 X 10. Perubahan jaringan parenkhim paru-paru yang diamati adalah emfisema, fokus-fokus radang, serta keadaan kongesti maupun hemoragi. Pembesaran yang digunakan pada pengamatan emphisema organ paru-paru adalah 40 X 10. Pengamatan terhadap fokus-fokus radang dilakukan dengan mengukur luas wilayah radang dibandingkan dengan luas lapang pandang. Selain luas wilayah radang juga diamati jenis-jenis sel radang yang terdapat pada fokus-fokus radang. Pengamatan terhadap fokus-fokus radang menggunakan pembesaran 40 X 10. Pengamatan keadaan kongesti dan hemoragi dilakukan dengan pembesaran 20 X 10. Pengamatan jaringan otot polos pada saluran pernafasan menggunakan pewarnaan HE dan diamati pada pembesaran 4 X 10. Pengamatan perubahanperubahan histopatologi yaitu ketebalan otot polos yang terjadi dibantu perangkat lunak ImageJ. Penggunaan perangkat lunak ini bertujuan untuk memudahkan pengamatan dan pengukuran. Hasil dari pengamatan ini merupakan indikator yang bisa menggambarkan efek yang ditimbulkan oleh jintan hitam serta kombinasi jintan hitam dan madu. 3.3.8 Analisis Statistik Hasil pengamatan berupa peruahan-perubahan yang terjadi pada saluran nafas, jumlah sel goblet pada saluran nafas, perubahan yang terjadi pada BALT, 26 jenis sel radang pada fokus-fokus radang, perubahan pada jaringan otot, dan perubahan-perubahan lain berupa emfisema, kongesti dan hemoragi. Hasil pengamatan kemudian dianalisa secara statistik menggunakan metode One Way ANOVA dan uji lanjut Duncan untuk melihat perbedaan yang nyata antar kelompok perlakuan. 27 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh pemberian ekstrak jintan hitam terhadap fungsi pernafasan dapat dipelajari dari gambaran histopatologi organ paru-paru dengan adanya perubahanperubahan yang terjadi pada jaringan organ tersebut. Perubahan pada paru-paru dilihat dengan mengamati sistem saluran pernafasan, bronkhus, bronkhiolus dan jaringan parenkhim paru-paru yaitu alveol. Pada penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap bronkhus dan bronkhiolus meliputi adanya eksudat pada saluran nafas, dan jumlah sel goblet pada bronkhiolus. Selain itu juga dilakukan pengamatan terhadap ketebalan otot polos di sekitar bronkhus. Pengamatan terhadap Bronchial Associated Lymphoid Tissue (BALT) meliputi luas fokus BALT pada bronkhus serta kepadatan sel BALT tersebut. Pengamatan terhadap jaringan parenkhim paru-paru meliputi pengamatan terhadap keadaan kongesti dan hemoragi serta pengamatan terhadap fokus-fokus radang. Selain itu juga dilakukan pengamatan terhadap emfisema. 4.1 Eksudat pada bronkhus dan bronkhiolus Pengamatan terhadap adanya eksudat di saluran nafas yaitu bronkhus dan bronkhiolus dilakukan pada perbesaran 10x10. Pengamatan dilakukan pada semua bronkhus dan bronkhiolus pada jaringan paru di seluruh sediaan. Perhitungan dilakukan dengan membagi jumlah bronkhus dan bronkhiolus yang lumennya berisi eksudat dengan jumlah bronkhus dan bronkhiolus yang ditemukan secara keseluruhan pada semua bidang sayatan sediaan. Hasil pengamatan terhadap bronkhus dan bronkhiolus disajikan pada tabel 8. Tabel 8 Persentase bronkhus dan bronkhiolus yang bereksudat pada mencit yang diberi perlakuan Jintan Hitam Kelompok Perlakuan Persentase bronkhus yang Persentase bronkhiolus bereksudat (%) yang bereksudat (%) a Kontrol 4.77±0.29 4.68±0.00a HS 0.1 4.74±0.23a 4.60±0.10a a HS 0.2 4.93±0.07 4.67± 0.00a HS-Madu 4.74±0.14a 4.60±0.13a Keterangan: Huruf superscript yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan pada taraf p
Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jinten Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paruparu Mencit (Mus musculus) Eksudat pada bronkhus dan bronkhiolus Emfisema HASIL DAN PEMBAHASAN Fokus Radang HASIL DAN PEMBAHASAN Histologi Paru-paru Sistem Pertahanan pada Paru-paru Jintan Hitam TINJAUAN PUSTAKA Kelompok Perlakuan Penelitian Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ Pembuatan Sediaan Histopatologi Ketebalan Otot Polos HASIL DAN PEMBAHASAN Kongesti dan Hemoragi HASIL DAN PEMBAHASAN Pembahasan Umum HASIL DAN PEMBAHASAN Pengamatan Sediaan Histopatologi Metode Penelitian Persiapan Hewan Coba Kandang Hewan Coba Pakan dan Minum Perubahan Histopatologi Paru-Paru Pada Penderita Asma Pewarnaan Sediaan Histopatologi Metode Penelitian Saluran nafas Paru-paru Organ sistem pernafasan mencit Sel Goblet pada Bronkhiolus Waktu dan Tempat Bahan dan Alat
Aktifitas terbaru
Penulis
Dokumen yang terkait
Tags
Upload teratas

Pengaruh Pemberian Ekstrak Minyak Jinten Hitam (Nigella sativa) Terhadap Gambaran Mikroskopis Paruparu Mencit (Mus musculus)

Gratis