PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-DIPHENYL-2-PIKRILHYDRAZIL) EKSTRAK METANOLIK UMBI BIDARA UPAS (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar S

Gratis

0
0
123
9 months ago
Preview
Full text
(1)PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-DIPHENYL-2-PIKRILHYDRAZIL) EKSTRAK METANOLIK UMBI BIDARA UPAS (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Desi Irwanta Kate NIM : 108114124 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014

(2) PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-DIPHENYL-2-PIKRILHYDRAZIL) EKSTRAK METANOLIK UMBI BIDARA UPAS (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Desi Irwanta Kate NIM : 108114124 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014 i

(3) ii

(4) iii

(5) HALAMAN PERSEMBAHAN Kupersembahkan skripsi ini untuk : Tuhan Yesus Kristus sumber dari segalanya yang ada dihidupku Mama dan Papa tercinta yang selalu mendukung dalam kondisi apapun My Lovely Sisters and Brothers Hernita, Mariani, Obet and Briand Almamaterku tercinta Segala Puji, Hormat, Kemuliaan hanya layak bagi-Mu, KAU mengatur hidupku dan memberiku kekuatan untuk selalu berkata “Aku bisa, Harus bisa dan Pasti bisa” iv

(6) v

(7) vi

(8) PRAKATA Puji Syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas semua anugerah, berkat, mujizat dan penyertaan-Nya menyelesaikan skripsi yang kepada berjudul penulis sehingga “PENETAPAN penulis dapat KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-DIPHENYL-2-PICRYHYDRAZYL) EKSTRAK METANOLIK UMBI BIDARA UPAS (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.)” ini dengan baik. Laporan akhir ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Strata 1 Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm.). Penulis mengalami banyak kesulitan dan masalah dalam menyelesaikan laporan ini. Tetapi dengan adanya bantuan dari berbagai pihak, akhirnya penulis dapat menyelesaikan laporan akhir ini. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis ingin mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada : 1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan serta bantuan selama rancangan, pengusulan skripsi, penelitian, hingga penyelesaian penulisan skripsi dengan penuh kesabaran. 3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus memberikan saran, kritik dan pengetahuan yang membangun bagi penulis. 4. Jeffry Julianus, M.Si., selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus memberikan saran dan kritik yang membangun bagi penulis. vii

(9) 5. C.M. Ratna Rini Nastiti, selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah mendidik dan memberi nasihat serta teladan selama penulis berkuliah. 6. Semua Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas bantuan yang telah diberikan selama penulis kuliah. 7. Segenap Laboran Universitas Sanata Dharma; Laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia (Pak Wagiran) dan Botani Dasar (Mas Sigit) atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian. 8. My best friend Meta Kartika Sari atas kebersamaan dalam suka maupun duka. Always be my best friend now and forever. 9. Priskila Agnes, Rotua Winata, Kelvin Nugroho, Yeny Lestari, Retno Pamungkas, Fanny Adriyani, Ega Mantyas atas doa, dukungan semangat dan segala bantuan yang kalian berikan buatku, kiranya Tuhan Yesus senantiasa memberkati kalian semua. 10. Segenap keluargaku di Team Tambourine GBI Keluarga Allah Jogja atas dukungan doa, semangat dan rema-rema yang luar biasa. 11. Francisca Devi atas bantuan pengurusan surat dan peminjaman laptop selama ujian. 12. Nessya Trivianni dan Eunike Yosefina sebagai tim DPPH atas bantuan, dukungan, doa, kritik dan saran selama penelitian di Laboratorium hingga selesainya ujian. 13. Semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu atas doa, dukungan dan bantuan mulai awal penelitian hingga diselesaikannya penulisan skripsi ini. viii

(10) ix

(11) DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL............................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................. iii HALAMAN PERSEMBAHAN.............................................................. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................. v LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ..... vi PRAKATA .............................................................................................. vii DAFTAR ISI ........................................................................................... x DAFTAR TABEL ................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR .............................................................................. xv DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xvi INTISARI................................................................................................ xvii ABSTRACT .............................................................................................. xviii BAB I PENGANTAR ............................................................................ 1 A. Latar Belakang .............................................................................. 1 1. Permasalahan ........................................................................... 4 2. Keaslian penelitian ................................................................... 4 3. Manfaat penelitan ..................................................................... 4 B. Tujuan Penelitian .......................................................................... 5 1. Tujuan umum ........................................................................... 5 2. Tujuan khusus .......................................................................... 5 x

(12) BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................ 6 A. Bidara Upas .................................................................................. 6 1. Klasifikasi tanaman .................................................................. 6 2. Sinonim .................................................................................... 6 3. Gambaran umum bidara upas .................................................. 7 4. Kandungan kimia dan manfaat ................................................ 8 B. Ekstraksi ....................................................................................... 8 C. Fenolik dan Flavonoid .................................................................. 10 D. Metode Folin-Ciocalteu ................................................................ 15 E. Radikal Bebas ............................................................................... 16 F. Oksidan dan Radikal Bebas .......................................................... 18 G. Antioksidan ................................................................................... 18 H. Metode DPPH ............................................................................... 23 I. Spektrofotometer Visibel .............................................................. 25 J. Landasan Teori ............................................................................. 27 K. Hipotesis ....................................................................................... 28 BAB III METODE PENELITIAN ......................................................... 29 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................... 29 B. Variabel Penelitian ........................................................................ 29 1. Variabel bebas .......................................................................... 29 2. Variabel tergantung .................................................................. 29 3. Variabel pengacau terkendali ................................................... 29 4. Variabel pengacau tidak terkendali .......................................... 29 xi

(13) C. Definisi Operasional ..................................................................... 29 D. Bahan dan Alat Penelitian ............................................................ 30 1. Bahan penelitian ....................................................................... 30 2. Alat penelitian .......................................................................... 30 E. Tata Cara Penelitian ...................................................................... 31 1. Determinasi tanaman ............................................................... 31 2. Pengumpulan bahan ................................................................. 31 3. Preparasi simplisia ................................................................... 31 4. Ekstraksi ................................................................................... 31 5. Pembuatan larutan pembanding dan uji ................................... 32 6. Uji pendahuluan ....................................................................... 33 7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total .............. 34 8. Penetapan kandungan fenolik total .......................................... 35 9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ............................... 35 10. Uji aktivitas antioksidan ........................................................ 36 F. Analisis Hasil ................................................................................ 37 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................... 38 A. Hasil Determinasi Tanaman ......................................................... 38 B. Hasil Pengumpulan Bahan ............................................................ 38 C. Hasil Preparasi Sampel ................................................................. 39 D. Ekstraksi Sampel .......................................................................... 39 E. Hasil Uji Pendahuluan .................................................................. 43 1. Uji pendahuluan senyawa fenolik ............................................ 43 xii

(14) 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ..................................... 44 F. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total .... 45 1. Penentuan Operating Time (OT) ............................................ 45 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λmaks).... 46 G. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total .................................... 47 H. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ..................... 50 1. Penentuan Operating Time (OT) ........................................... 50 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λmaks).... 52 I. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH .... 53 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................. 61 A. Kesimpulan .......................................................................... 61 B. Saran ..................................................................................... 61 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................ 62 LAMPIRAN ........................................................................................... 69 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................... 104 xiii

(15) DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH .... Tabel II. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum 25 asam galat yang direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu ................................................................ Tabel III. 46 Kadar asam galat dengan absorbansinya setelah direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu yang diukur pada panjang gelombang 760,5 nm.......................................... Tabel IV. Hasil penentuan jumlah fenolik total ekstrak metanolik umbi bidara upas ............................................................. Tabel V. 49 49 Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum larutan DPPH .................................................................. 53 Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH . 55 Tabel VII. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak metanolik umbi bidara upas dengan metode DPPH ............................................ Tabel VIII. Tabel IX. 56 Hasil perhitungan IC50rutin dan ekstrak metanolik umbi bidara upas ...................................................................... 57 Tingkat kekuatan antioksidan ......................................... 58 xiv

(16) DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Tanaman umbi bidara upas ............................................. 7 Gambar 2. Reaksi pembentukan dan penggabungan radikal fenoksil 11 Gambar 3. Struktur kimia dari berbagai flavonoid ........................... 12 Gambar 4. Oksidasi rutin .................................................................. 13 Gambar 5. Struktur asam galat ......................................................... 14 Gambar 6. Reaksi senyawa fenol dengan reagen Foiln-Ciocalteu ... 16 Gambar 7. Struktur DPPH ................................................................ 23 Gambar 8. Reduksi DPPH oleh senyawa antioksidan ...................... 24 Gambar 9. A = Kontrol positif, B = Larutan uji, C = Kontrol negatif 43 Gambar 10. A = Kontrol negatif, B = Kontrol positif, C = Larutan uji 44 Gambar 11. Grafik penentuan Operating Time asam galat ................ 45 Gambar 12. Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol ... 47 Gambar 13. Struktur asam galat ......................................................... 48 Gambar 14. Kurva baku terpilih untuk penetapan kadar fenolik total asam galat ....................................................................... 48 Gambar 15. Grafik penentuan OT rutin (Replikasi 2) ........................ 51 Gambar 16. Grafik penentuan OT ekstrak metanolik umbi bidara upas (Replikasi 1) ........................................................... 51 Gambar 17. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan rutin 55 Gambar 18. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak metanolik umbi bidara upas ............................................ xv 56

(17) DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Surat determinasi bidara upas ......................................... Lampiran 2. Gambar umbi bidara upas dari Kebun Tanaman Obat 69 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta ..... 70 Lampiran 3. Rendemen serbuk umbi bidara upas ...................................... 70 Lampiran 4. Rendemen ekstrak metanolik umbi bidara upas ..................... 70 Lampiran 5. Data penimbangan uji kandungan fenolik total ...................... 71 Lampiran 6. Scanning kontrol asam galat .................................................. 72 Lampiran 7. Optimasi penentuan kandungan fenolik total ......................... 72 Lampiran 8. Penetapan kandungan fenolik total ........................................ 76 Lampiran 9. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan ..... 79 Lampiran 10. Data konsentrasi bahan untuk uji aktivitas antioksidan .......... 80 Lampiran 11. Scanning larutan .................................................................... 84 Lampiran 12. Penentuan λ serapan maksimum dan Operating Time (OT) uji aktivitas antoksidan ................................................... 87 Lampiran 13. Uji aktivitas antioksidan dengan radikal DPPH ............. 96 Lampiran 14. Perhitungan IC50 rutin dan ekstrak metanolik umbi Bidara upas ..................................................................... Lampiran 15. Hasil uji statistik dengan program R 3.0.2 ..................... xvi 99 103

(18) INTISARI Radikal bebas dengan sifat sangat reaktif dapat menyebabkan terjadinya kerusakan sel yang berujung pada munculnya berbagai penyakit. Kerusakan sel tersebut dapat dicegah dengan antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menetralkan radikal bebas sehingga radikal tersebut tidak dapat menginduksi timbulnya suatu penyakit. Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang banyak terdapat pada tanaman. Umbi bidara upas (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.) dilaporkan memiliki kandungan senyawa fenolik. Tanaman dengan kandungan senyawa fenolik diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang kuat. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kandungan fenolik total dan mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak metanolik umbi bidara upas. Penetapan kandungan fenolik total menggunakan pereaksi FolinCiocalteu dan dinyatakan dengan nilai massa ekivalen asam galat per g ekstrak metanolik umbi bidara upas. Prinsip dari metode ini yaitu senyawa fenolik teroksidasi dan pereaksi Folin-Ciocalteu tereduksi menjadi larutan berwarna biru yang memiliki serapan maksimum 760 nm. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). Prinsip metode DPPH yaitu penurunan intensitas absorbansi larutan DPPH sebanding dengan kenaikan konsentrasi senyawa antioksidan yang dinyatakan dengan IC50. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak metanolik umbi bidara upas mempunyai kandungan fenolik total sebesar (1,96 ± 0,07) mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik umbi bidara upas dan IC50 sebesar (386,3 ± 3,7) µg/mL. Kata Kunci : Ekstrak metanolik umbi bidara upas (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.), kandungan fenolik total, aktivitas antioksidan, DPPH xvii

(19) ABSTRACT Free radicals are highly reactive by nature can cause cell damage that leads to the emergence of various diseases. The cell damage can be prevented by antioxidants. Antioxidants are compounds that can neutralize free radicals so that the radicals can not induce the onset of a disease. Phenolic compounds are a source of natural antioxidants found in many plants. Tuber bidara upas (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.) reported to contain phenolic compounds. Plants containing phenolic compounds are known to have strong antioxidant activity. Therefore, this study aimed to establish the total phenolic content and antioxidant activity of methanolic extracts know tuber bidara upas. Determination of total phenolic content using the Folin-Ciocalteu reagent and expressed as gallic acid equivalent mass value per g of methanolic extract of tuber bidara upas. The principle of this method is oxidized phenolic compounds and Folin-Ciocalteu reagent is reduced to a blue solution which the maksimum wave length at 760 nm. Testing antioxidant activity using DPPH radical (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl). The principle of the method is a decrease in the intensity of the absorbance of DPPH solution is proportional to the increase in the concentration of antioxidant compounds represented by IC50. The results showed that the methanolic extract tuber lote upas upas total phenolic content of (1,96 ± 0,07) mg of gallic acid equivalents per gram of tuber bidara upas methanolic extract and IC50 of (386,3 ± 3,7) mg/mL. Keywords : Methanolic extract of tuber bidara upas (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.), total phenolic content, antioxidant activity, DPPH xviii

(20) BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Radikal bebas merupakan molekul yang tidak stabil dan sangat reaktif. Sifat reaktif ini disebabkan karena adanya elektron tidak berpasangan yang terdapat pada orbit terluarnya, sehingga radikal bebas akan bereaksi dengan molekul disekitarnya untuk memperoleh pasangan elektronnya dan menjadi stabil. Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh maupun dari lingkungan luar. Radikal ini akan menyerang sel-sel tubuh dan mengakibatkan hilangnya fungsi sel-sel tersebut dan akhirnya menjadi rusak. Kerusakan sel karena adanya radikal bebas menjadi kontributor utama terjadinya proses penuaan dini dan berbagai penyakit seperti kanker, katarak, liver, jantung koroner, dan diabetes (Hernani dan Rahardjo, 2005). Kerusakan-kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas dapat dicegah atau dihambat oleh suatu senyawa antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghentikan reaksi berantai dari radikal bebas di dalam tubuh sehingga sel-sel tubuh dapat terhindar dari kerusakan akibat reaksi dari radikal bebas (Hernani dan Rahardjo, 2005) selain itu antioksidan dapat menyumbangkan elektronnya kepada radikal bebas dan menstabilkan radikal tersebut sehingga menjadi tidak reaktif lagi (Suhartono, 2002). Antioksidan dapat diperoleh secara alami maupun sintetik. Antioksidan alami seperti vitamin C, vitamin E dan flavonoid terbukti aman dikonsumsi oleh 1

(21) 2 manusia, sedangkan antioksidan sintetik seperti BHT (Butil Hidroksi Toluen) dan BHA (Butil Hidroksi Anisol) tidak digunakan lagi karena dapat menyebabkan karsinogenesis (Choi, Lo, dan Han, 2004). Hal inilah yang menyebabkan banyak peneliti mulai mengeksplorasi sumber antioksidan alami yang berasal dari tumbuhan. Salah satu sumber antioksidan alami yang terdapat dalam tumbuhan adalah senyawa fenolik. Diantara sekian banyak senyawa fenolik tumbuhan yang diketahui, golongan flavonoid merupakan golongan terbanyak yang bersifat sebagai antioksidan. Kemampuan flavonoid untuk menghambat radikal bebas terjadi karena adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Agil, Sugianto, Widyowati, dan Purwitasari (2010) telah diketahui adanya kandungan flavonoid pada umbi bidara upas (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.) dan senyawa kimia lain seperti damar, resin, pati, dan zat pahit, getah segar mengandung zat oksidase (Bangun, 2012). Oleh karena itu, peneliti ingin meneliti seberapa besar kemampuan senyawa dalam umbi bidara upas dapat menghambat aktivitas radikal bebas DPPH. Selain flavonoid, senyawa lain yang banyak terdapat dalam akar dan umbi adalah senyawa metoksi yang dapat diekstraksi dengan pelarut non polar maupun pelarut polar seperti etanol dan metanol (Rajendra, Magadum, Nadaf, Yashoda, dan Manjula 2011). Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl). Metode ini dipilih karena merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu

(22) 3 atau ekstrak tanaman (Koleva, van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002). Pada metode ini, DPPH berperan sebagai radikal bebas yang dihambat oleh antioksidan sehingga terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning yang dapat diukur dengan spektrofotometri sinar tampak, sehingga aktivitas penghambatan radikal bebas dapat ditentukan. Berdasarkan metode ini, kemampaun antioksidan suatu senyawa dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration (IC50). Serapan kuat DPPH akan terlihat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna ungu (Juniarti, Osmeli, dan Yuhernita, 2009). Tanaman dengan kandungan senyawa fenolik yang tinggi diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Hal inilah yang mendasari peneliti ingin melakukan penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan dalam umbi bidara upas. Metode yang dipilih untuk penentuan kandungan fenolik total adalah metode Folin-Ciocalteu. Metode ini merupakan metode yang umum digunakan sebagai standar penentuan kandungan fenolik total karena merupakan metode yang cepat dan sederhana yang dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat tiap mg sampel (Fu,Xu, Gan, Zhang, Xia, dan Li, 2011). Prinsip dari metode ini adalah reaksi oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin-Ciocalteu menghasilkan kompleks berwarna biru yang memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 760 nm. Peningkatan intensitas warna biru akan sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang ada dalam sampel (Blainski, Cristiny, dan de Mello, 2013).

(23) 4 1. Permasalahan a. Berapa kadar fenolik total ekstrak metanolik umbi bidara upas yang dinyatakan dengan nilai ekivalen asam galat ? b. Berapa nilai aktivitas antioksidan ekstrak metanolik umbi bidara upas dengan radikal DPPH yang dinyatakan dengan nilai IC50 ? 2. Keaslian penelitian Penelitian Purwanti (2002) melaporkan bahwa kualitas umbi bidara upas yang dijual di pasar sesuai dengan MMI, dan ekstrak etanol-air umbi bidara upas bersifat toksik dengan LC50 sebesar 921,085 µg/mL. Penelitian Agil et al., (2010) membuat ekstrak air, n-heksana dan metanol dari umbi bidara upas secara maserasi. Hasil skrining menunjukkan bahwa ekstrak air mengandung senyawa golongan polifenol, ekstrak n-heksana mengandung senyawa golongan triterpenoid dan terpenoid, sedangkan ekstrak metanol mengandung senyawa golongan polifenol dan flavonoid. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya yaitu pada penelitian ini dilakukan penentuan kandungan fenolik total dengan metode FolinCiocalteu dan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dari ekstrak metanolik umbi bidara upas. 3. Manfaat penelitian 1. Manfaat teoritis Mendapatkan kadar fenolik total serta nilai IC50 dari ekstrak metanolik umbi bidara upas.

(24) 5 2. Manfaat praktis Penelitian ini dapat memberikan informasi kepada masyarakat luas mengenai kemampuan umbi bidara upas sebagai antioksidan sehingga dapat dimanfaatkan dalam pemeliharaan kesehatan manusia. 3. Manfaat metodologis Penelitian ini dapat digunakan sebagai acuan untuk penelitian selanjutnya terkait kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan dari umbi bidara upas. B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Menetapkan kandungan fenolik total dan menguji aktivitas antioksidan dari ekstrak metanolik umbi bidara upas. 2. Tujuan khusus a. Mengetahui kadar fenolik total ekstrak metanolik umbi bidara upas menggunakan metode Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat. b. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak metanolik umbi bidara upas menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

(25) BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Bidara Upas Bidara upas merupakan jenis umbi-umbian yang banyak tumbuh liar di hutan-hutan dan perkebunan. Jenis ini berasal dari asia tropis. Di Indonesia, bidara upas dapat ditemukan di Jawa, Maluku, dan Sumatera (Suhono, 2009). 1. Klasifikasi tanaman Klasifikasi bidara upas menurut van Valkenburg dan Bunyapraphatsara (2001) adalah sebagai berikut : Kerajaan : Plantae Subkerajaan : Tracheobionta Superdivisio : Spermatophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Solanales Familia : Convolvulaceae Genus : Merremia Spesies : Merremia mammosa (Lour) Hallier f. 2. Sinonim : Convolvulus mammosus (Lour) Ipomea gomezii (van Valkenburg dan Bunyapraphatsara, 2001). 6

(26) 7 3. Gambaran umum bidara upas Bidara upas berupa perdu merambat dengan panjang batang 3-6 m. Batang agak licin, kecil dan berwarna merah keunguan. Daun tunggal, berbentuk jantung, tepi rata, ujung meruncing, berwarna hijau tua, dengan pertulangan daun menyirip. Bunga majemuk berbentuk payung menggarpu seperti lonceng dan berwarna putih keunguan, panjang 7-8 cm, dengan 4 helai kelopak (Haryanti, 2009). Umbi berada di dalam tanah, berbentuk bulat memanjang. Kulit umbi berwarna kuning kecoklatan, tebal, dan bergetah. Daging umbi berwarna putih. Perbanyakan dapat dilakukan dengan stek batang dan penanaman umbi (Haryanti, 2009). Gambar 1. Tanaman umbi bidara upas

(27) 8 4. Kandungan kimia dan manfaat Kandungan senyawa kimia dalam umbi bidara upas, yaitu damar, resin, pati, dan zat pahit, getah segar mengandung zat oksidase (Bangun, 2012). Selain itu juga mengandung zat antioksidan, yaitu flavonoid (Agil et al., 2010). Umbi bidara upas oleh masyarakat sering digunakan sebagai alternatif dalam pengobatan tradisional penyakit kencing manis, bronkitis, asma, tifus, demam berdarah, kanker payudara, radang tenggorokan, radang paru, radang usus buntu, tifoid, sembelit, muntah darah, keracunan, dan gigitan ular. Selain sebagai bahan obat tradisional, tanaman ini dapat juga dipakai sebagai tanaman hias (Suhono, 2009). B. Ekstraksi Ekstrak merupakan suatu sediaan kental yang diperoleh dengan cara mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai dan diuapkan hingga semua atau hampir semua pelarut menguap dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 2000a). Ekstraksi merupakan suatu proses penarikan kandungan kimia dari suatu bahan yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak umumnya memiliki senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, dan protein. Beberapa jenis senyawa aktif yang ada di dalam simplisia yaitu alkaloid, flavonoid, minyak atsiri, dan lain-lain. Struktur kimia yang berbeda-beda akan

(28) 9 mempengaruhi kelarutan serta stabilitas senyawa aktif yang ada dalam simplisia terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat dan derajat keasaman. Dengan diketahuinya senyawa aktif dalam suatu simplisia, maka pemilihan pelarut dan cara ekstraksi dapat dilakukan dengan cepat dan tepat (Depkes RI, 2000a). Tujuan ekstraksi bahan alam yaitu untuk menarik komponen kimia yang terdapat dalam suatu bahan alam yang didasarkan pada prinsip perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut dimulai dari lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut (Harborne, 1987). Pelarut yang baik adalah pelarut yang dapat melarutkan zat aktif dari ekstrak serta membebaskan ekstrak dari senyawa lain yang tidak diinginkan. Pelarut yang diperbolehkan yaitu air, etanol, campuran etanol air, metanol, kloroform, eter, dan heksan (Depkes RI, 2000a). Proses ekstraksi dipengaruhi oleh lama ekstraksi, suhu dan jenis pelarut yang digunakan. Semakin lama waktu yang digunakan dan semakin tinggi suhu maka semakin sempurna proses ekstraksi, semakin dekat tingkat kepolaran pelarut dengan komponen yang diekstrak, semakin sempurna proses ekstraksi. Metode ekstraksi dapat dibedakan menjadi: maserasi, perkolasi, infundasi dan ekstraksi berkesinambungan (Depkes RI, 1986). Maserasi adalah proses ekstraksi dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari sehingga cairan penyari menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif kemudian zat aktif tersebut akan terlarut, adanya perbedaan konsentrasi di dalam dan luar sel akan mengakibatkan terjadinya pendesakan larutan pekat ke luar sel (Depkes RI, 1986). Maserasi

(29) 10 termasuk ekstraksi dengan prinsip pencapaian kesetimbangan konsentrasi (Depkes RI, 2000a). Bahan yang akan digunakan pada proses ekstraksi biasanya ditempatkan dalam bejana bermulut lebar kemudian ditambahkan pelarut dan dikocok berulang-ulang selama 2-14 hari (Ansel, 1989). Keuntungan menggunakan metode maserasi adalah dapat diaplikasikan dalam sampel dengan jumlah sedikit, proses mudah dilakukan dan alat yang digunakan sederhana (List dan Schmidt, 2000). Kerugian metode maserasi yaitu pengerjaannya lama dan penyarian kurang efektif (Depkes RI, 1986). Metode maserasi dapat dimodifikasi menjadi metode remaserasi, yaitu cairan penyari dibagi menjadi dua kemudian seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, lalu serbuk diperas dan penyari pertama disimpan selanjutnya dilakukan maserasi kembali dengan cairan penyari yang kedua (Depkes RI,1986). C. Fenolik dan Flavonoid Senyawa fenolik adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus hidroksil yang menempel pada cincin aromatik. Senyawa fenolik terbentuk dari jalur metabolisme asam sikimat dan fenil propanoid (Proestos, Sereli, dan Komaitis, 2006). Senyawa fenolik dari tanaman mempunyai beberapa efek, yaitu antioksidan, antiinflamasi, antiproliferasi, antimutagenik, antimikrobial,

(30) 11 antikarsinogenik, dan pencegahan terhadap penyakit jantung (Ghosh dan Konishi, 2007). Mekanisme senyawa fenolik sebagai antioksidan dijelaskan oleh Janeiro dan Brett (2004) yaitu melalui kemampuan dari gugus fenol untuk mengikat radikal bebas dengan memberikan atom hidrogennya melalui proses transfer elektron, sehingga fenol berubah menjadi radikal fenoksil (Gambar 2). Radikal fenoksil yang terbentuk sebagai hasil reaksi fenol dengan radikal bebas kemudian akan menstabilkan diri melalui efek resonansi. Karena alasan ini maka derivat dari fenol merupakan donor hidrogen yang baik yang dapat menghambat reaksi yang terjadi oleh senyawa radikal. Senyawa fenol disebut juga sebagai inhibitor radikal (Togo, 2004). Gambar 2. Reaksi pembentukan dan penggabungan radikal fenoksil (Bruneton, 1999).

(31) 12 Contoh senyawa fenolik adalah asam fenolik, flavonoid, tanin terkondensasi, kumarin dan alkil resorsinol (Dykes dan Rooney, 2007). Senyawa fenolik dalam tanaman terdapat dalam bentuk glikosida atau esternya (Proestos et al., 2006). Golongan yang terbanyak dari senyawa fenolik adalah flavonoid (Markham, 1988). Penggolongan flavonoid didasarkan pada adanya substituen cincin heterosiklik yang mengandung oksigen dan perbedaan distribusi gugus hidroksi pada atom C3 (Gambar 3). Perbedaan di bagian atom C3 inilah yang menentukan sifat, khasiat dan golongan flavonoid (Markham, 1988). Menurut Robinson (1995), flavonoid dapat dibedakan berdasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu : flavonol, flavon, isoflavon, flavanon, flavanonol, katekin, leukoantosianidin, antosianin, khalkon, dan auron. Gambar 3. Struktur kimia dari berbagai flavonoid (Robinson, 1995).

(32) 13 Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksi yang tidak tersubstitusi atau tersubstitusi suatu gula. Oleh karena itu, umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, etil asetat, dimetilsulfoksida, dimetilformamid dan air (Markham, 1988). Pemilihan pelarut yang disarankan adalah campuran air dan metanol, etanol atau aseton (Waterman dan Mole, 1994). Aktivitas sebagai antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid karena adanya gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya (Cuvelier, Richard dan Besset, 1992). Rutin sebagai senyawa fenolik telah banyak digunakan dalam penelitian aktivitas antioksidan yang digunakan sebagai pembanding aktivitas antioksidan dari bahan tumbuhan (dos Santos, Mazo, dan Cavalheiro, 2008). Gambar 4. Oksidasi rutin (dos Santos et al., 2008). Rutin (3’,4’,5,7-tetrahidroksiflavon-3β-D-rutinosida) atau vitamin P termasuk dalam flavonoid. Gugus O-dihidroksi pada cincin B diasosiasikan

(33) 14 dengan aktivitas antioksidan rutin (Lopez, Martinez, Del-Valle, Ferrit, dan Luque, 2003). Aktivitas antioksidan rutin dilihat dari nilai IC50 yaitu sebesar 7,909 µg/mL (dos Santos et al., 2008) ; semakin kecil nilai IC50 suatu sampel uji maka semakin efektif sampel tersebut berperan sebagai antioksidan (Sunardi, 2007). Dalam keseharian, rutin biasa digunakan untuk mengobati tekanan darah tinggi serta penyakit lain yang berkaitan dengan vaskuler (dos Santos et al., 2008). Asam galat (asam 3,4,5-trihidroksibenzoat) merupakan senyawa fenolik yang bukan tergolong dalam flavonoid. Gugus fungsi dalam struktur asam galat yang bertanggung jawab memberikan aktivitas antioksidan adalah 3 gugus hidroksil (Lopez et al., 2003). Gambar 5. Struktur asam galat (Eko, 2003). Asam galat (Gambar 5) sering digunakan dalam banyak penelitian terkait penetapan kandungan fenolik total sebagai ekivalen terhadap kandungan fenolik total bahan tumbuhan yang diuji (Javanmardi, Stushnoff, Locke, dan Vivanco, 2003). Alasan penggunaan asam galat sebagai standar dalam penetapan kandungan fenolik total yaitu karena asam galat terbentuk dari 3-dehydroshikimic acid pada jalur sikimat yang melalui seragkaian tahapan reaksi kimia hingga diperoleh asam amino aromatik yaitu L-phenylalanine, L-tyrosine yang merupakan bentuk dari struktur dasar yang ditemukan pada cinamic acid,

(34) 15 coumarins, lignans dan flavonoids (Dewick, 2001). Asam galat termasuk dalam golongan antioksidan alami yang sering digunakan sebagai pengawet makanan (Lopez et al., 2003). D. Metode Folin-Ciocalteu Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat diukur secara kolorimetri dengan metode Folin-Cioacalteu dan dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat (Jasson, 2005). Pereaksi Folin-Ciocalteu merupakan suatu larutan kompleks yang terbentuk dari asam fosfomolibdat dan asam heteropoli fosfotungstat. Pereaksi ini terbuat dari air, natrium tungstat, natrium molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium, sulfat, dan bromin (Nurhayati, Siadi, dan Herjono, 2012). Prinsip dasar untuk metode ini adalah oksidasi gugus fenolik-hidroksil. Pereaksi Folin-Ciocalteu mengoksidasi fenolat serta mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks molybdeum-tungsten (Mo-W). Selama reaksi berlangsung, gugus fenolik-hidroksil akan bereaksi dengan pereaksi Folin-Ciocalteu membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru (Jasson, 2005). Warna biru yang dihasilkan dari reaksi ini akan semakin pekat setara dengan konsentrasi senyawa fenolik yang terdapat pada larutan uji dan memiliki serapan kuat pada panjang gelombang 760 nm (Blainski et al., 2013). Metode folin-Ciocalteu merupakan metode yang sederhana, sensitif dan teliti. Metode ini terjadi dalam suasana basa sehingga dalam penentuan kadar fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu digunakan natrium karbonat yang bertujuan untuk membentuk suasana basa (Prior, Wu, dan Schaich, 2005).

(35) 16 Gambar 6. Reaksi senyawa fenol dengan reagen Folin-Ciocalteu (Azlim, Ahmed, Syed, Mustafa, Aisyah dan Kamarul, 2010). E. Radikal Bebas Radikal bebas adalah molekul yang sangat reaktif karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dalam orbital luarnya (Wijaya, 1996). Radikal ini dapat berasal dari atom hidrogen, molekul oksigen, atau ion logam transisi (Yuwono, 2009). Sifat sangat reaktif yang dimiliki oleh radikal bebas menyebabkan radikal ini dapat bereaksi dengan protein, lipid, karbohidrat dan DNA untuk memperoleh kembali pasangan elektronnya dan menjadi stabil (Badarinath, Mallikarjuna, Chetty, Ramkanth, Rajan dan Gnanaprakash, 2010). Reaksi ini akan berlangsung terus menerus dalam tubuh dan bila tidak dihentikan dapat menyebabkan timbulnya berbagai penyakit seperti kanker, jantung, katarak, penuaan dini serta penyakit degeneratif lainnya (Andayani, Lisawati, dan Maimunah, 2008). Radikal bebas cenderung untuk mengadakan reaksi berantai. Reaksi berantai dapat terjadi ketika radikal bebas menyerang molekul stabil yang ada didekatnya kemudian mengambil elektron dari molekul tersebut dan molekul

(36) 17 yang telah kehilangan elektronnya akan menjadi radikal dan menyerang molekul stabil lainnya (Percival, 1998). Suatu radikal bebas umumnya dijumpai sebagai zat antara yang tidak dapat diisolasi, memiliki usia pendek, sangat reaktif dan memiliki energi yang tinggi (Fessenden dan Fessenden, 1995). Sebagai zat antara, radikal ini di dalam sel hidup dapat ditemukan pada membran plasma pada organel-organel seperti mitokondria, peroksisom, retikulum endoplasma, dan sitosol. Reaksi-reaksi enzimatik dalam proses fagositosis oleh sel-sel fagositik termasuk neutrofil, monosit, makrofag dan eusinofil akan menghasilkan suatu radikal bebas yaitu radikal hidroksil (Hidayat, 2000). Radikal bebas dalam jumlah yang normal bermanfaat bagi kesehatan misalnya, memerangi peradangan, membunuh bakteri, dan mengendalikan tonus otot polos, pembuluh darah, serta organ-organ dalam tubuh, sedangkan apabila radikal bebas berlebih dapat mengakibatkan stress oksidatif (Yuwono, 2009). Stress oksidatif terjadi karena proses metabolisme di mitokondria yang dilakukan oleh sel tubuh yang membutuhkan oksigen, sehingga dapat menghasilkan energi dalam bentuk adenosin triphosphate (ATP) dan senyawa Reactive Oxygen Species (ROS). ROS kemudian akan menyerang sel-sel dalam tubuh dan menyebabkan kerusakan serta mengubah fungsi lipid, protein dan DNA (Valko, Leibfritz, Mocol, Cronin, Mazur, dan Telser, 2006). Pada lipid, radikal bebas dapat menyebabkan peroksidasi. Pada protein, radikal bebas dapat menyebabkan fragmentasi dan cross linking, sehingga mempercepat terjadinya proteolisis, sedangkan pada DNA, radikal ini secara

(37) 18 perlahan akan memutus rantai DNA dan berperan dalam proses karsinogenik, mutagenik maupun sitotoksik (Gitawati, 1995). F. Oksidan dan Radikal Bebas Pengertian dari senyawa oksidan dan radikal bebas sering menjadi rancu karena keduanya memiliki sifat yang mirip dan aktivitas kedua senyawa ini sering menimbulkan akibat yang sama walaupun dengan proses yang berbeda. Oksidan merupakan senyawa penerima elektron yang dapat menarik elektron (Syahbana dan Bahalwan, 2002). Kemiripan sifat antara oksidan dan radikal bebas yaitu adanya sifat radikal bebas untuk menarik elektron disekitarnya (penerima elektron). Berdasarkan sifat ini, radikal bebas dianggap sama dengan oksidan. Tetapi perlu diketahui bahwa tidak semua oksidan merupakan radikal bebas dan radikal bebas lebih berbahaya dibandingkan dengan senyawa oksidan non radikal (Winarsi, 2007). G. Antioksidan Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat proses oksidasi, yaitu suatu reaksi kimia yang mentransfer elektron dari satu zat ke oksidator. Reaksi oksidasi dapat menghasilkan radikal bebas dan memicu reaksi rantai sehingga menyebabkan kerusakan sel tubuh dan ketengikan (Brown, 2000). Dalam arti khusus, antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi antioksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid (Pokorny, Yanishlieva, dan Gordon, 2001).

(38) 19 Aktivitas penghambatan antioksidan dalam reaksi oksidasi berdasarkan keseimbangan reaksi oksidasi reduksi. Molekul antioksidan akan bereaksi dengan radikal bebas (R*) dan membentuk molekul yang tidak reaktif (RH) sehingga reaksi berantai pembentukan radikal bebas dapat dihentikan (Belitz dan Groch, 1999). Mekanisme kerja antioksidan secara umum adalah menghambat oksidasi lemak. Oksidasi lemak terdiri dari tiga tahapan, yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi. Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal asam lemak yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif akibat hilangnya satu atom hidrogen (reaksi 1). Pada tahap propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi (reaksi 2). Selanjutnya, radikal peroksida akan menyerang asam lemak kemudian menghasilkan hidroperoksida dan radikal asam lemak baru (reaksi 3) (Pokorny et al., 2001). Inisiasi : RH →R*+H* (reaksi 1) Propagasi : R* + O2 → ROO* (reaksi 2) ROO* + RH → ROOH + R* (reaksi 3) Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi lebih lanjut untuk menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek seperti aldehida dan keton yang bertanggung jawab atas flavor makanan berlemak. Dengan adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan mengalami terminasi melalui reaksi antar radikal bebas membentuk kompleks bukan radikal (reaksi 4) Terminasi : ROO* + ROO*→ non radikal R* + ROO* → non radikal R* + R* → non radikal (reaksi 4) (Pokorny et al., 2001).

(39) 20 Antioksidan sangat beragam jenisnya. Secara umum antioksidan dapat digolongkan dengan dua cara, yaitu : 1. Berdasarkan fungsi : a. Antioksidan primer, yaitu antioksidan yang berperan dalam menghentikan reaksi rantai radikal bebas dengan berfungsi sebagai pendohor atom H atau elektron pada radikal bebas dan berdampak pada pembentukan produk yang lebih stabil. Antioksidan primer (AH) dapat memutuskan tahap inisiasi dengan cara bereaksi dengan sebuah radikal bebas atau menghambat reaksi propagasi dengan cara bereaksi dengan radikal peroksil atau alkoksida Contohnya tokoferol, flavonoid, dan asam askorbat (Halim, 2011). b. Antioksidan sekunder, yaitu antioksidan yang kerjanya menghambat kerja peroksidan dengan mekanisme reaksi berupa penyerapan sinar UV, deaktivasi ion logam (dengan pembentukan senyawa kompleks) (Pokorny et al., 2001). c. Antioksidan tersier, yaitu antioksidan yang berfungsi memperbaiki kerusakan sel dan jaringan yang disebabkan oleh radikal bebas. Contohnya enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase yang berperan dalam perbaikan biomolekul yang disebabkan oleh radikal bebas (Pribadi, 2009). 2. Berdasarkan sumbernya a. Antioksidan alami, yaitu antioksidan yang diperoleh dari bahan alam, merupakan senyawa metabolit sekunder tumbuhan seperti senyawa golongan alkaloid, fenolik, flavonoid (Mishra et al., 2007). Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon, flavonol,

(40) 21 isoflavon, kateksin, flavonol dan kalkon. Aktivitas antoksidan alami bergantung pada struktur kimia senyawa penyusunnya dan kemampuan senyawa tersebut untuk menangkap radikal kemudian menstabilkannya selama reaksi berlangsung (Pokorny et al., 2001). Antioksidan alami lebih banyak diminati sebagai antioksidan tambahan bagi tubuh dibandingkan antioksidan sintetik karena antioksidan sintetik dapat meningkatkan terjadinya efek karsinogenesis (Umemura, Kodama, Hioki, Inoue, Nomura, dan Kurokawa, 2001). b. Antioksidan sintetik, yaitu antioksidan alami yang telah diproduksi secara sintetis untuk tujuan komersial. Antioksidan sintetik yang paling sering digunakan adalah Propil Galat (PG), Butil Hidroksi Anisol (BHA), Butil Hidroksi Toluen (BHT) dan Tert-butil hidrokuinon (Bendra, 2012). Penggunaan antioksidan sintetik bagi kesehatan manusia tidak disarankan lagi karena dapat memberikan efek samping yang berbahaya yaitu karsinogenesis. Sebagai contoh BHA yang merupakan inhibitor lipid peroksidasi yang poten, tetapi ketika dikonsumsi berlebihan dapat menyebabkan terjadinya kanker, karena terjadi kerusakan oksidatif pada DNA sehingga memicu terjadinya mutasi (Amarowicz, Naczk, dan Fereiodon, 2000). 3. Berdasarkan sasaran a. Preventive antioxidant, yaitu antioksidan yang kerjanya mencegah terbentuknya oksidan dan mencegah tertimbunnya oksidan. Contoh antioksidan ini adalah enzim peroksidase (glutation peroksidase), senyawa

(41) 22 yang mengandung gugus sulfidril (glutation, sistein, kaptopril), superoksidan dismutase (SOD) dan katalase (Madhavi, Deshpande, dan Salunkhe, 1996). b. Chain-breaking antioxidant Mekanisme : L∙ + AH → LH + A∙ LO∙ + AH → LOH + A∙ LOO∙ + AH→ LOOH + A∙ Antioksidan (AH) akan mencegah terjadinya tahap inisiasi dan tahap propagasi. Tahapan inisiasi yaitu ketika radikal bereaksi dengan lipid (L∙) sedangkan tahap propagasi, yaitu ketika radikal bereaksi dengan alkoksi (LO∙) ataupun peroksil (LOO∙) (Madhavi et al., 1996). 4. Berdasarkan sifat fisiko-kimia, dibedakan menjadi dua, yaitu antioksidan hidrofilik yang merupakan antioksidan yang bekerja dalam sitosol dan cairan ekstrasel (contohnya vitamin C, asam urat, glutation, sistein, kreatinin); serta antioksidan lipofilik, merupakan antioksidan yang bekerja pada membran sel (contohnya vitamin E, B-karoten, bilirubin, protein pengikat logam (transferin, laktoferin, seruplasmin, dan albumin) (Himawati, 2001). Senyawa fenolik seperti flavonoid, asam fenolat dan diterpen fenolik memiliki efek antioksidan yang baik (Pokorny et al., 2001). Aktivitas senyawa fenoik khususnya flavonoid melputi tiga mekanisme, yaitu 1. Aktivitas penangkapan radikal seperti ROS atau radikal lain seperti radikal yang dihasilkan dari peroksidasi lipid (R’, RO’, ROO’) dengan proses transfer elektron melalui atom hidrogen.

(42) 23 2. Mencegah spesies senyawa reaktif memproduksi katalis transisi metal seperti reaksi melalui khelasi metal. 3. Interaksi dengan antioksidan lainnya (Niki dan Noguchi, 2000). Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan secara in-vitro dengan metode conjugated diene, metode penangkapan radikal hidroksil, metode Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP), dan metode Trapping Antioxidant Parameter (TRAP) (Shivaprasad, Mohan, Kharya, Shiradkar, dan Lakshman, 2005). H. Metode DPPH Metode DPPH merupakan metode analisis kapasitas antioksidan yang sederhana menggunakan senyawa pendeteksi yaitu DPPH (1,1-diphenyl-2pikrilhydrazil). Senyawa DPPH adalah senyawa radikal bebas stabil yang dapat bereaksi dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu senyawa antioksidan membentuk DPPH tereduksi (Kubo, Masuoka, Xiao, dan Haraguchi, 2002). Gambar 7. Struktur DPPH (Molyneux, 2004).

(43) 24 Kestabilan radikal DPPH disebabkan oleh adanya delokalisasi pasangan elektron secara menyeluruh (Sulistiyowati, Cahyono, dan Swastawati, 2013). Radikal DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. DPPH dapat memberikan serapan karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kimianya dan dengan adanya delokalisasi elektron pada DPPH akan memberikan warna violet (Dehpour, Ebrahimzadeh, dan Nabavi, 2009). Penangkapan radikal bebas oleh senyawa antioksidan menyebabkan elektron pada radikal DPPH menjadi berpasangan sehingga terjadi penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil. Adanya senyawa antioksidan menyebabkan perubahan warna larutan DPPH dari warna ungu gelap menjadi warna kuning (Dehpour et al., 2009). Makin kuat senyawa antioksidan untuk menangkal radikal DPPH, makin pudar warna yang teramati (Kuncahyo dan Sunardi, 2007). Gambar 8. Reduksi DPPH oleh senyawa antioksidan (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001).

(44) 25 Parameter untuk menunjukkan aktivitas antioksidan suatu senyawa adalah harga efficient concentration (EC50) atau harga Inhibition Concentration (IC50), yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat antioksidan yang memberikan % penghambatan 50% (Molyneux, 2004). Makin kecil harga IC50 menunjukkan makin besarnya kemampuan antioksidan suatu senyawa yang digunakan (Kristina, Ariviani, dan Khasanah, 2012). Tabel I. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH (Blois cit., Fidrianny, Darmawati, Sukrasno, 2014). Intensitas Sangat kuat Kuat Sedang Lemah IC50 < 50 µg/mL 50-100 µg/mL 101-150 µg/mL >150 µg/mL Kelebihan dari metode DPPH adalah metode ini merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva et al., 2002). I. Spektrofotometer Visibel Spektrofotometri visibel merupakan salah satu teknik analisis fisikakimia yang mengamati tentang atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang 380-780 nm (Mulja dan Suharman, 1995). Sedangkan sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm (Gandjar dan Rohman, 2007).

(45) 26 Instrumentasi spektrofotometer meliputi sumber tenaga radiasi yang stabil, sistem yang terdiri dari lensa-lensa; cermin; monokromator untuk mengubah radiasi, tempat cuplikan yang transparan dan detektor radiasi yang dihubungkan dengan pencatat (Sastrohamidjojo, 2001). Serapan maksimum suatu senyawa kimia dipengaruhi oleh adanya kromofor dan gugus auksokrom. Interaksi antara senyawa yang memiliki gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik pada daerah UV dan visibel akan menghasilkan transisi elektromagnetik dan spektra serapan elektromagnetik. Tiga hal yang mungkin terjadi ketika terjadi interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik adalah hamburan, absorpsi dan emisi (Mulja dan Suharman, 1995). Kromofor merupakan semua gugus atau gugusan atom berupa ikatan rangkap konjugasi (seperti benzena) yang mengabsorpsi radiasi UV-Vis, sedangkan auksokrom merupakan suatu gugus fungsional yang memiliki elektron bebas seperti –OH, -NH2 dan OCH3 yang memberikan transisi n-α* (Mulja dan Suharman, 1995). Menurut Sastrohamidjojo (2001) terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan meningkatkan absorbansinya dan menggeser puncak serapan ke panjang gelombang yang lebih panjang. Peningkatan intensitas absorpsi disebut efek hiperkromik sedangkan penurunan intensitas absorpsi disebut efek hipokromik. Pergeseran panjang gelombang dibedakan menjadi pergeseran batokromik, yaitu pergeseran serapan ke arah panjang gelombang yang lebih panjang yang disebabkan karena substitusi atau pengaruh pelarut, dan pergeseran

(46) 27 hipsokromik, yaitu pergeseran serapan ke arah panjang gelombang yang lebih pendek yang disebabkan karena substitusi atau pengaruh pelarut (pergeseran biru). Absorpsi cahaya UV-visibel mengakibatkan terjadinya transisi elektronik, yaitu promosi-promosi dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi yang berenergi lebih tinggi (Fessenden dan Fessenden, 1995). Spektrofotometer UV-Vis menjadi alat yang sering digunakan dalam analisis karena alat ini sederhana, prosesnya cepat serta sensitif (Mulja dan Suharman, 1995). J. Landasan Teori Radikal bebas adalah molekul yang memiliki satu atau lebih elektron tidak berpasangan sehingga sifatnya sangat reaktif dan tidak stabil. Radikal bebas akan bereaksi dalam berbagai cara untuk membentuk molekul yang stabil, reaksi tersebut terjadi di dalam tubuh dengan molekul atau senyawa seperti protein, lipid, karbohidrat serta DNA. Reaksi ini sangat berbahaya bagi tubuh karena akan menimbulkan berbagai penyakit seperti penuaan dini, kanker, dan banyak penyakit lainnya, sehingga dibutuhkan senyawa antioksidan untuk menghambat radikal bebas. Antioksidan dapat diperoleh secara alami maupun sintesis. Sebagian besar antioksidan alami dapat diperoleh dari berbagai tanaman seperti senyawasenyawa fenolik (tokoferol, karotenoid, asam askorbat, dan flavonoid). Karena banyak penelitian mengemukakan adanya efek samping berbahaya dari antioksidan sintesis, maka kini penelitian lebih banyak terarah pada antioksidan alami yang terbukti lebih aman.

(47) 28 Bidara upas adalah tanaman yang cukup banyak ditemukan di Indonesia, terutama daerah Jawa. Berdasarkan beberapa penelitian yang telah dilakukan, dilaporkan bahwa umbi bidara upas memiliki senyawa flavonoid yang berperan sebagai antioksidan. Flavonoid termasuk dalam senyawaan fenolik yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik diperoleh dengan cara penghambatan reaksi oksidasi yang menghasilkan radikal bebas. Penentuan kandungan fenolik total dilakukan dengan metode FolinCiocalteu. Adanya senyawa fenolik dalam sampel akan mereduksi asam fosfomolibdat-fosfotungstat menjadi senyawa berwarna biru. Intensitas warna biru yang teramati akan semakin pekat yang setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk. Metode DPPH dipilih untuk pengujian aktivitas antioksidan dengan sumber radikal bebas berupa DPPH (1,1-diphenyl-2-pikrylhydrazyl). Kelebihan dari metode ini, yaitu mudah, cepat, dan sensitif dengan prinsipnya didasarkan pada reaksi penangkapan atom hidrogen oleh DPPH dari senyawa antioksidan yang menyebabkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning. Parameter yang digunakan untuk penentuan besarnya aktivitas antioksidan adalah nilai IC50. Semakin kecil nilai IC50 yang didapat maka aktivitas antioksidan suatu senyawa semakin besar. K. Hipotesis 1. Ekstrak metanolik umbi bidara upas memiliki kandungan fenolik. 2. Ekstrak metanolik umbi bidara upas mempunyai nilai aktivitas antioksidan yang dinyatakan dengan IC50.

(48) BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap pola searah. B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas berupa konsentrasi ekstrak metanolik umbi bidara upas. 2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan (IC). 3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh, waktu pemanenan, dan cara pengeringan. 4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari dan curah hujan. C. Definisi Operasional 1. Ekstrak metanolik umbi bidara upas adalah ekstrak kental yang diperoleh dari hasil maserasi serbuk kering umbi bidara upas dengan metanol. 2. Persen Inhibition Concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan kemampuan ekstrak metanolik umbi bidara upas untuk menangkap radikal DPPH. 3. Inhibition Concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi ekstrak metanolik umbi bidara upas yang dapat menghambat 50% radikal bebas DPPH. 29

(49) 30 D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah umbi bidara upas (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.) yang diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Bahan kimia kualitas farmasetis berupa akuades (Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta); bahan kimia kualitas pro analitik (E.Merck) meliputi metanol; bahan kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA meliputi DPPH, rutin, reagen Folin-Ciocalteu, natrium karbonat dan asam galat; bahan kualitas teknis (CV. General Labora) meliputi metanol dan aluminium foil. 2. Alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa ayakan dengan nomor mesh 40, blender, vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Uv mini-1240 Shimadzu), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), waterbath (labo-tech, Heraeus), vacuum rotary evaporator (Buchi rotavorator R-3), pompa vacuum, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000 µL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, serta alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

(50) 31 E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Determinasi umbi bidara upas dilakukan di Laboratorium FarmakognosiFitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta menurut Backer, Bakhuizen van den Brink (1965). 2. Pengumpulan bahan Umbi bidara upas dipanen dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Pemanenan dilakukan pada bulan September 2013 dan dipilih umbi yang kondisinya paling baik yang kulitnya berwarna kuning kecoklatan. 3. Preparasi simplisia Sebanyak 3 kg umbi bidara upas dicuci bersih dengan air mengalir. Kemudian umbi dipotong kecil-kecil dan diiris tipis. Selanjutnya umbi dikeringkan dalam oven pada suhu 500 C hingga kering yang ditandai dengan umbi mudah untuk dihancurkan. Simplisia yang telah kering kemudian dihaluskan menggunakan mesin penyerbuk lalu diayak dengan ayakan nomor mesh 40 dan diperoleh bobot serbuk sebesar 427 g dengan rendemen sebesar 14,23 %. 4. Ekstraksi Sebanyak 300 g serbuk simplisia umbi bidara upas direndam dalam 1500 mL metanol dengan metode maserasi sambil digojog menggunakan shaker selama

(51) 32 satu hari pada temperatur kamar dan terlindung dari cahaya. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan kertas saring dengan bantuan corong Buchner dan pompa vaccum. Selanjutnya, ampas penyaringan diremaserasi dengan 1500 mL metanol selama satu hari dan disaring lagi menggunakan kertas saring dan bantuan corong Buchner dan pompa vaccum. Kemudian filtrat yang diperoleh dari hasil remaserasi dicampur dengan filtrat sebelumnya lalu diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator dan waterbath sehingga didapatkan ekstrak metanolik kental umbi bidara upas. Ekstrak kemudian ditutup dengan aluminium foil lalu disimpan dalam desikator untuk digunakan pada analisis selanjutnya. 5. Pembuatan larutan pembanding dan uji a. Pembuatan larutan DPPH. Sebanyak 15,8 mg DPPH dilarutkan dalam metanol p.a hingga 100 mL, sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru. b. Pembuatan larutan stok rutin. Sebanyak 2,5 mg rutin dilarutkan dengan metanol p.a hingga 10 mL. c. Pembuatan larutan pembanding. Larutan stok rutin diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5 mL kemudian diencerkan dengan metanol p.a hingga 25 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 5, 10, 15, 20, dan 25 µg/mL. d. Pembuatan larutan uji. i. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

(52) 33 Sebanyak 25,0 mg ekstrak metanolik ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a hingga 25 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga 10 mL, sehingga akan diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100, 200, 300, 400, dan 500 µg/mL. ii. Larutan uji untuk penetapan kandungan fenolik total Sebanyak 30 mg ekstrak metanolik ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a hingga 10 mL, sehingga akan diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 3000 µg/mL. e. Pembuatan larutan asam galat. Larutan asam galat dibuat dengan konsentrasi 500 µg/mL dalam akuades : metanol p.a (1:1). Larutan tersebut diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL kemudian ditambah dengan akuades : metanol p.a (1:1) hingga 10 mL dan diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL. 6. Uji pendahuluan a. Uji pendahuluan senyawa fenolik. Sebanyak 0,5 mL larutan uji dan larutan pembanding asam galat dengan konsentrasi 150,0 µg/mL masing-masing dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi, kemudian ditambah dengan 2,5 mL reagen Folin-Ciaocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Campuran didiamkan selama

(53) 34 10 menit kemudian ditambah dengan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Warna larutan tersebut diamati. b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan. Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan masing-masing ke dalam tiga tabung reaksi dan masing-masing ditambah dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding rutin 25 µg/mL, dan larutan uji 500,0 µg/mL. Campuran tersebut ditambah dengan 3 mL metanol p.a dan divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, warna pada larutan tersebut diamati. 7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total a. Penentuan Operating Time (OT). Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 100, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciaocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Kemudian dilakukan penambahan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 760 nm selama 30 menit. b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks). Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 100, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciaocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Kemudian dilakukan penambahan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M dan didiamkan selama OT. Kemudian dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum pada panjang gelombang 600-800 nm.

(54) 35 8. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan kurva baku asam galat. Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciaocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) dan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M. Larutan didiamkan selama OT. Serapan dibaca pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen FolinCiaocalteu, dan larutan natrium karbonat 1 M. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji. Larutan uji diambil sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian ditambah 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) dan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M. Diamkan selama OT. Selanjutnya baca absorbansi larutan pada panjang gelombang serapan maksimum. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g ekstrak metanolik). Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. 9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan Operating Time (OT). Tiga buah labu ukur 5 mL, masing-masing ditambah dengan 1 mL larutan DPPH, 1 mL larutan pembanding rutin 5, 15, dan 25 µg/mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30

(55) 36 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517 nm selama 1 jam. Perlakuan yang sama juga dilakukan pada larutan uji dengan konsentrasi 100, 300, dan 500 µg/mL. c. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks). Tiga buah labu ukur 10 mL, masing-masing ditambah dengan 0,5; 1,0; dan 1,5 mL larutan DPPH, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi DPPH 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan dimasukkan dalam tabung reaksi dan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT teoritis 30 menit. Dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. 10. Uji aktivitas antioksidan a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH. Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum. Pengerjaan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan pembanding dan larutan uji. b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji. Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai

(56) 37 seri konsentrasi yang telah dibuat, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Dilakukan pembacaan serapan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum. Pengerjaan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. c. Estimasi aktivitas antioksidan. Berdasarkan hasil dari prosedur 10 a dan b untuk rutin dan ekstrak metanolik umbi bidara upas kemudian dihitung nilai % IC dan IC50. F. Analisis Hasil Kandungan fenolik total dalam ekstrak metanolik umbi bidara upas dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per g ekstrak metanolik umbi bidara upas. Nilai absorbansi larutan uji dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku asam galat, sehingga diperoleh nilai ekivalensi larutan uji terhadap asam galat. Kandungan fenolik total diperoleh berdasarkan rumus : nilai ekivalensi larutan uji terhadap asam galat × volume larutan uji massa ekstrak yang ditimbang Aktivitas penangkapan radikal DPPH dihitung berdasarkan rumus : absorbansi larutan kontrol − absorbansi larutan pembanding atau larutan uji × 100 % absorbansi larutan kontrol Data aktivitas penangkapan radikal DPPH tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan regresi linear y = bx + a, di mana x merupakan konsentrasi larutan pembanding atau larutan uji dan y merupakan % IC. Data nilai IC50 dianalisis secara statistik R 3.0.2 untuk mengetahui ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara nilai IC50 larutan pembanding dan larutan uji.

(57) BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Determinasi Tanaman Determinasi tanaman merupakan langkah awal yang dilakukan dalam suatu penelitian yang menggunakan sampel berupa tanaman. Tujuan dilakukannya determinasi adalah untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas umbi bidara upas yang akan digunakan dalam penelitian ini serta untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan sampel umbi bidara upas. Dari hasil determinasi (Lampiran 1) telah dibuktikan bahwa memang benar umbi yang digunakan berasal dari tanaman Merremia mammosa (Lour) Hallier f. B. Hasil Pengumpulan Bahan Umbi bidara upas yang digunakan dalam penelitian diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma bulan September 2013 pada saat musim kemarau agar kandungan air dalam umbi tidak berlebihan. Pemanenan dilakukan pada satu tempat untuk menghindari adanya variasi kandungan senyawa aktif dalam umbi. Umbi dipanen pada pagi hari dengan tujuan agar didapat bahan yang masih segar dan senyawa fenolik yang terdapat pada umbi belum termetabolisme menjadi bentuk metabolit sekunder lain. Umbi bidara upas yang digunakan dipilih umbi dengan kondisi yang baik, masih segar dengan kulit umbi berwarna kuning kecoklatan pada usia sekitar 3-4 38

(58) 39 bulan. Penentuan waktu panen didasarkan atas umur tanaman. Jenis umbi-umbian biasa dipanen pada umur 3-4 bulan (Galati, McKay dan Tan, 2005). C. Hasil Preparasi Sampel Umbi bidara upas yang telah dipanen, dicuci bersih dengan air mengalir untuk menghilangkan pengotor yang menempel pada kulit umbi. Umbi yang telah bersih ini kemudian diangin-anginkan untuk menghilangkan sisa air dari proses pencucian. Selanjutnya umbi dipotong sekecil dan setipis mungkin untuk memudahkan dalam proses pengeringan. Pengeringan dilakukan di oven pada suhu 500C hingga didapatkan umbi yang mudah dihancurkan. Tujuan pengeringan secara umum adalah untuk mengurangi kandungan air karena jika masih terdapat kandungan air dalam simplisia, maka jamur dan mikroorganisme lain mudah tumbuh. Setelah itu, umbi dihaluskan dengan mesin penyerbuk. Serbuk yang didapat (427 g) kemudian dilewatkan pada ayakan dengan nomor mesh 40. Tujuan pembuatan serbuk adalah untuk mendapatkan ukuran partikel yang kecil sehingga luas permukaan simplisia yang bersentuhan dengan cairan penyari menjadi lebih besar dan mempermudah cairan penyari menembus simplisia. Luas permukaan yang besar akan mengoptimalkan pembasahan serbuk simplisia oleh cairan penyari sehingga hasil penyarian menjadi lebih optimal. D. Ekstraksi Sampel Ekstraksi senyawa fenolik dapat dilakukan dengan pelarut etanol, metanol, n-butanol, aseton, dimetilsulfoksidan, dimetilformamida dan juga air (Markham, 1988). Pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi pada penelitian

(59) 40 ini adalah metanol. Alasan pemilihan metanol adalah karena metanol mampu melarutkan senyawa metoksi dan flavonoid yang banyak terdapat dalam umbiumbian. Penelitian yang dilakukan oleh Agustina, Nurcahyanti, Lusiawati, dan Kris (2011) menyatakan bahwa ekstrak metanolik memiliki kadar total fenolik paling tinggi dan pelarut metanol dapat mengekstrak senyawa fenolik lebih baik dibandingkan dengan pelarut etil asetat, aseton dan kloroform. Selain itu, daya penetrasi metanol ke dalam sel-sel tanaman lebih kuat dibandingkan etanol ataupun pelarut lain (Depkes RI, 2000a) serta kepolaran metanol yaitu (6,6) lebih besar dibandingkan etanol (5,2) sehingga lebih mudah untuk berinteraksi dengan senyawa fenolik yang cenderung polar (like dissolve like). Menurut Pedriclli (2001) metanol memiliki viskositas 0,597 pada suhu 200C, sedangkan viskositas etanol adalah 1,2 pada suhu 200C, viskositas metanol yang lebih kecil ini menyebabkan metanol mudah untuk berdifusi menembus sel-sel tanaman. Pemilihan metanol juga didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Agil et al., (2010) yang menyatakan ekstraksi umbi bidara upas dengan pelarut metanol didapat senyawa fenolik, yaitu flavonoid. Hal ini dapat mendukung penelitian karena senyawa yang dituju adalah senyawa flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan. Metode ekstraksi dipilih berdasarkan sifat dari bahan, kepentingan dalam memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati sempurna, dan daya penyesuaian dengan tiap macam metode ekstraksi terhadap senyawa aktif (Fouad, 2005).

(60) 41 Metode ekstraksi yang dipilih pada penelitian ini adalah metode maserasi. Alasan pemilihan metode maserasi adalah karena menurut Bruneton (1999), umumnya senyawa aktif dalam tanaman tidak tahan terhadap pemanasan sehingga lebih dipilih ekstraksi cara dingin yang tidak merusak sampel dan stabilitas dari senyawa fenolik yang diekstraksi dapat terjaga. Metode perkolasi juga tidak menggunakan pemanasan, namun metode ini lebih tepat jika digunakan pada suatu bahan yang telah diketahui senyawa spesifiknya sehingga senyawa yang diinginkan akan lebih mudah untuk terlarut karena tidak terjadi kejenuhan. Keuntungan lain menggunakan metode maserasi, yaitu cukup sederhana, mudah dilakukan, jumlah pelarut yang digunakan lebih sedikit dan proses ekstraksinya lebih cepat dibandingkan metode perkolasi, sedangkan jika menggunakan metode infundasi maupun soxletasi yang menggunakan panas, kemungkinan dapat terjadi perubahan-perubahan sifat senyawa karena adanya pemanasan. Selain itu maserasi memiliki beberapa keunggulan yaitu, tanpa pemanasan, menguntungkan untuk isolasi senyawa bahan alam karena dengan perendaman ekstrak dapat menyebabkan pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan didalam dan luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada di sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna. Proses maserasi dilakukan dengan merendam 300 g serbuk umbi bidara upas dalam metanol selama satu hari pada temperatur kamar dan dilanjutkan dengan proses remaserasi selama satu hari. Remaserasi ditujukan untuk memaksimalkan proses penyarian terhadap senyawa-senyawa yang mungkin

(61) 42 belum tersari karena cairan penyari sudah jenuh. Selama proses maserasi digunakan tabung Erlenmeyer tertutup yang dibungkus dengan aluminium foil untuk mencegah kerusakan senyawa akibat sinar matahari langsung. Peneliti menggunakan alat bantu berupa shaker yang digunakan untuk membantu proses pengadukan agar lebih meningkatkan kontak antara cairan penyari dengan sampel sehingga proses penyarian lebih efektif. Filtrat dari proses maserasi dan remaserasi dikumpulkan kemudian disaring dengan corong Buchner yang didalamnya diletakkan kertas saring dan diintergasikan dengan pompa vakum sehingga proses penyaringan berlangsung lebih cepat. Hasil penyaringan filtrat kemudian diuapkan pelarutnya dengan vaccum rotary evaporator dengan tekanan rendah sehingga proses penguapan lebih cepat karena pelarut akan menguap pada suhu dibawah titik didihnya. Penguapan dilanjutkan dengan waterbath dan diperoleh bobot ekstrak metanolik umbi bidara upas sebesar 16,44 g dan rendemen sebesar 5,48 %. Ekstrak metanolik yang diperoleh selanjutnya dimasukkan dalam cawan porselen yang dibungkus dengan aluminium foil untuk mencegah kemungkinan adanya degradasi senyawa fenolik karena paparan sinar matahari. Ekstrak tersebut lalu disimpan dalam desikator untuk menghindari uap air di udara. Desikator ini sebelumnya telah diisi dengan silika gel. Hasil ekstrak metanolik umbi bidara upas selanjutnya digunakan untuk menetapkan kandungan fenolik total dan pengujian aktivitas antioksidan.

(62) 43 E. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan senyawa fenolik Tujuan uji ini adalah untuk mengetahui adanya kandungan senyawa fenolik dalam ekstrak metanolik umbi bidara upas yang dilakukan secara kualitatif. Pengujian dilakukan dengan penambahan pereaksi Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat dalam larutan uji. Adanya senyawa fenolik dapat dilihat dari perubahan warna larutan uji menjadi biru. Perubahan warna terjadi karena tereduksinya asam fosfomolibdat-fosfotungstat dalam pereaksi Folin-Ciocalteu oleh senyawa polifenol menjadi molybdeum blue membentuk kompleks warna biru. Semakin tinggi kadar fenolik dalam suatu sampel, maka semakin pekat warna biru yang terbentuk. Kontrol negatif yang digunakan dalam uji ini yaitu pereaksi Foiln-Ciocalteu dan kontrol positif yaitu pereaksi Folin-Ciocalteu yang ditambah asam galat. Asam galat merupakan senyawa fenolik yang digunakan sebagai pembanding. Hasil pengujian pada larutan uji menunjukkan hasil yang positif dengan terbentuknya warna biru (Gambar 9) yang menunjukkan ekstrak metanolik umbi bidara upas mengandung senyawa fenolik. Gambar 9. (A= Kontrol positif [Asam galat + Folin Ciocalteu], B= Larutan uji [ekstrak metanolik umbi bidara upas + Folin Ciocalteu], C= Kontrol negatif [Folin Ciocalteu])

(63) 44 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Tujuan dilakukannya uji ini adalah untuk menunjukkan adanya senyawa yang berpotensi memiliki aktivitas antioksidan dalam ekstrak metanolik umbi bidara upas yang dilakukan secara kualitatif. Pada Uji ini terjadi reaksi antara senyawa antioksidan dan radikal DPPH. Adanya senyawa antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. Kontrol negatif yang digunakan yaitu larutan DPPH untuk menunjukkan warna larutan apabila hasil negatif, sedangkan kontrol positif adalah larutan DPPH yang ditambahkan rutin untuk menunjukkan warna larutan jika hasil positif. Prosedur pengujian dilakukan dengan penambahan larutan DPPH pada larutan uji dan senyawa pembanding (rutin) kemudian diamati perubahan warna yang terjadi. Pengujian menunjukkan hasil positif dengan larutan uji berwarna kuning (Gambar 10). Hal ini menunjukkan adanya potensi ekstrak metanolik umbi bidara upas sebagai antioksidan. Gambar 10. (A=Kontrol negatif [blanko DPPH], B= Kontrol positif [Rutin + DPPH], C= Larutan uji [Ekstrak metanolik umbi bidara upas + DPPH])

(64) 45 F. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total 1. Penentuan Operating Time (OT) Tujuan penentuan Operating Time adalah untuk memperoleh waktu pengukuran absorbansi dengan nilai yang stabil dari suatu senyawa yang diukur. Penentuan OT dilakukan dengan mereaksikan asam galat dengan pereaksi FolinCiocalteu yang dilakukan tiap 5 menit pada rentang waktu 0-30 menit pada panjang gelombang serapan maksimum teoritis yaitu 760 nm. Reaksi antara asam galat dan pereaksi Folin-Ciocalteu akan membentuk kompleks molybdeum blue sehingga warna larutan menjadi biru. Absorbansi Penentuan Operating Time asam galat 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 0 5 10 15 20 25 30 Waktu (menit) Gambar 11. Grafik penentuan Operating Time asam galat Dari grafik (Gambar 11) terlihat pada menit ke 20 hingga menit ke 30, nilai absorbansi yang didapat telah stabil sehingga dapat disimpulkan secara praktis OT untuk pengukuran asam galat adalah 20 menit.

(65) 46 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum(λmaks) Panjang gelombang serapan maksimum merupakan panjang gelombang dimana terjadi eksitasi elektronik yang memberikan absorbansi maksimum. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dalam penelitian ini bertujuan untuk menentukan panjang gelombang dimana hasil reaksi antara asam galat dan pereaksi Folin-Ciocalteu mempunyai serapan yang maksimum. Menurut Blainski, Cristiny dan de Mello (2013), panjang gelombang serapan maksimum untuk pereaksi Folin-Ciocalteu yang direaksikan dengan senyawa fenolik adalah 760 nm. Pengukuran dilakukan pada tiga konsentrasi asam galat yang telah direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dengan konsentrasi berbeda yaitu 50 µg/mL, 100 µg/mL dan 150 µg/mL, kemudian dilakukan scanning dan diperoleh panjang gelombang serapan maksimum adalah 760,5 nm (Tabel II). Panjang gelombang yang diperoleh pada penelitian yaitu 760,5 nm memiliki perbedaan dengan panjang gelombang maksimum untuk pereaksi Folin-Ciocalteu yaitu 760 nm, namun berdasarkan ketentuan yang tercantum pada Farmakope Indonesia edisi IV, batas pergeseran yang diperbolehkan sebesar 2 nm sehingga panjang gelombang serapan maksimum yang didapat pada penelitian masih diperbolehkan untuk digunakan selanjutnya. Tabel II. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum asam galat yang direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu Konsentrasi larutan asam galat 50 µg/mL λ maksimum hasil scanning (nm) 760,5 λ maksimum yang digunakan λ maksimum teoritis 100 µg/mL 760,5 760,5 nm 760 nm 150 µg/mL 760,5

(66) 47 G. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total Menurut Duh, Tu, dan Yen (1999), senyawa fenolik memberikan kontribusi dalam aktivitas antioksidan. Potensi senyawa fenolik sebagai antioksidan disebabkan oleh keberadaan gugus hidroksil dalam senyawaan fenol. Gugus hidroksil dapat berfungsi sebagai penyumbang atom hidrogen ketika bereaksi dengan senyawa radikal melalui mekanisme transfer elektron sehingga proses oksidasi dapat dihambat. Oleh karena itu, estimasi kandungan fenolik total dimaksudkan untuk mengetahui jumlah senyawa fenolik dalam ekstrak metanolik umbi bidara upas yang memiliki aktivitas antioksidan. Estimasi kandungan fenolik total ini dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Senyawa fenolik akan mengalami oksidasi membentuk ion fenolat, sedangkan pereaksi Folin-Ciocalteu akan tereduksi membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat dan akhirnya membentuk kompleks molybdenum blue (Gambar 12) berwarna biru yang diukur secara spektrofotometri visibel pada OT dan panjang gelombang 760,5 nm. Semakin pekat warna biru yang terbentuk, semakin banyak kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat yang tereduksi. Keseluruhan reaksi ini berlangsung dalam suasana basa yang diperoleh dengan penambahan natrium karbonat. Gambar 12. Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa Fenol (Tursiman, Puji, Risa, 2012).

(67) 48 Kadar fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat. Asam galat (Gambar 13) dipilih sebagai senyawa fenolik standar karena menurut Dewick (2001), asam galat terbentuk dari 3-dehydroshikimic acid pada jalur sikimat yang melalui seragkaian tahapan reaksi kimia hingga diperoleh asam amino aromatik yaitu L-phenylalanine, L-tyrosine yang merupakan bentuk dari struktur dasar yang ditemukan pada cinamic acid, coumarins, lignans dan flavonoids. Selain itu asam galat merupakan senyawa fenolik dengan tiga gugus hidroksi fenolat yang sudah dikenal memiliki aktivitas antioksidan. Gambar 13. Struktur asam galat (Eko, 2003). Kurva Baku Asam Galat Absorbansi 1 y = 0,0048x + 0,0660 r = 0,9997 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Konsentrasi asam galat (µg/mL) Gambar 14. Kurva baku terpilih untuk penetapan kadar fenolik total asam galat

(68) 49 Tabel III. Kadar asam galat dengan absorbansinya setelah direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu yang diukur pada panjang gelombang 760,5 nm Replikasi 1 2 3 Konsentrasi asam galat (μg/mL) 48,4 72,6 96,8 121 145,2 48,4 72,6 96,8 121 145,2 50 75 100 125 150 Absorbansi 0,2967 0,4326 0,5385 0,6614 0,8079 0,3007 0,4142 0,5272 0,6406 0,7675 0,2957 0,4122 0,5465 0,6641 0,7789 Persamaan regresi linear y = 0,0052x + 0,0469 r = 0,9987 y = 0,0048x + 0,0660 r = 0,9997 y = 0,0049x + 0,0522 r = 0,9996 Tabel IV. Hasil penentuan jumlah fenolik total ekstrak metanolik umbi bidara upas Replikasi Absorbansi Kandungan fenolik (µg/mL) Kandungan fenolik total (mg) Replikasi 1 0,6333 118,18 1,9697 Replikasi 2 0,6517 122,02 2,0269 Replikasi 3 0,6072 112,75 1,8792 𝑥𝑥̅ ± SD 1,96 ± 0,07 Pembuatan kurva baku asam galat (Gambar 14) dibuat sebanyak tiga replikasi dengan berbagai konsentrasi berbeda (Tabel III) sehingga diperoleh tiga persamaan. Persamaan regresi linear yang digunakan adalah persamaan replikasi 2 y = 0,0048x + 0,0660 (r = 0,9997) dengan nilai r yang terbaik, sehingga diperoleh

(69) 50 rata-rata kandungan fenolik total ekstrak metanolik umbi bidara upas (Tabel IV) sebesar 1,96 ± 0,07 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik umbi bidara upas. H. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan Operating Time (OT) Tujuan penentuan Operating Time adalah untuk mendapatkan waktu pengukuran absorbansi dari reaksi antara larutan uji, larutan pembanding dengan radikal DPPH yang memberikan nilai absorbansi yang stabil. Jika nilai absorbansi stabil maka pengukuran bisa reprodusibel dan kesalahan analisis bisa diminimalkan. Larutan pembanding yang digunakan adalah larutan rutin, sedangkan larutan uji diperoleh dari ekstrak metanolik umbi bidara upas. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan mereaksikan larutan DPPH dengan larutan pembanding serta larutan uji pada tiga konsentrasi yang berbeda yaitu konsentrasi rendah, sedang dan tinggi (Gambar 15), pengukuran dilakukan tiap 5 menit dalam jangka waktu 60 menit menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum yang telah diperoleh pada pengujian sebelumnya yaitu 517 nm. Alasan pengukuran tiap 5 menit karena instrumen yang digunakan tidak dapat berfungsi melakukan pengukuran secara otomatis. Sedangkan pemilihan waktu 60 menit karena waktu ini dirasa cukup untuk memberikan nilai pengukuran yang stabil, karena jika waktu yang dipakai terlalu lama maka ada kemungkinan senyawa telah rusak.

(70) 51 Operating Time rutin 1 Absorbansi 0,8 0,6 5 µg/mL 0,4 15 µg/mL 0,2 25 µg/mL 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Waktu (menit) Gambar 15. Grafik penentuan OT rutin (Replikasi 2) Operating Time ekstrak metanolik 1 Absorbansi 0,8 0,6 100 µg/mL 0,4 300 µg/mL 0,2 500 µg/mL 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Waktu (menit) Gambar 16. Grafik penetuan OT ekstrak metanolik umbi bidara upas (Replikasi 1) Hasil penentuan OT rutin terlihat pada Gambar 15, yaitu pada menit ke 35 hingga menit ke 60, nilai absorbansi larutan rutin telah stabil sedangkan untuk larutan uji kestabilan mulai dicapai pada menit ke 30 (Gambar 16), maka dapat

(71) 52 disimpulkan bahwa pada menit ke 35 dan menit ke 30 reaksi antara DPPH dengan senyawa antioksidan dalam larutan rutin dan larutan uji semakin sempurna dan akhirnya berhenti. 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks) Menurut Molyneux (2004), panjang gelombang teoritis untuk pengukuran DPPH adalah 517 nm. Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk menentukan panjang gelombang dimana larutan DPPH menghasilkan serapan yang maksimum. DPPH dapat memberikan serapan karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kimianya dan dengan adanya delokalisasi elektron pada DPPH, maka DPPH akan memberikan warna ungu gelap. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum menggunakan larutan kontrol yaitu DPPH yang dilarutkan dalam metanol tanpa penambahan sampel dengan tujuan untuk mendapatkan panjang gelombang serapan maksimum DPPH tanpa gangguan senyawa lain yang ada dalam sampel. Dari hasil scanning yang dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm dengan tiga konsentrasi larutan DPPH yang berbeda (Tabel V) didapatkan hasil panjang gelombang maksimum pada penelitian ini yaitu 515 nm. Hasil yang didapat ini berbeda dengan panjang gelombang maksimum teoritis DPPH yaitu 517 nm. Namun berdasarkan ketentuan yang tercantum pada Farmakope Indonesia edisi IV, batas pergeseran yang diperbolehkan sebesar 2 nm sehingga panjang gelombang serapan maksimum yang didapat pada penelitian masih diperbolehkan untuk digunakan selanjutnya.

(72) 53 Tabel V. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum larutan DPPH Konsentrasi λ maksimum λ maksimum larutan DPPH hasil scanning yang digunakan 0,016 mM 514 nm 0,048 mM 514,5 nm 0,080 mM 516 nm 515 nm λ maksimum teoritis 517 nm I. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode DPPH. Metode ini dipilih karena memiliki beberapa kelebihan antara lain sederhana, mudah, cepat, peka, serta menggunakan sampel dalam jumlah sedikit. Metode ini merupakan suatu metode yang ditujukan untuk mengetahui seberapa besar aktivitas sampel sebagai antioksidan. DPPH merupakan radikal stabil berwarna ungu gelap yang memiliki absorbansi kuat pada panjang gelombang 517 nm. Warna ungu gelap ini terbentuk karena radikal DPPH mampu beresonansi sehingga terbentuk gugus kromofor yang panjang. Banyak metode lain yang bisa digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan, namun metode DPPH merupakan suatu metode skrining pengujian yang cukup cepat walaupun tidak langsung dapat menggambarkan sebagai antioksidan hanya sebagai free radical scavenging, namun metode ini sering digunakan sebagai pemodelan pengujian aktivitas antioksidan karena kelebihan-kelebihan di atas. Pemberian elektron oleh senyawa antioksidan kepada radikal bebas menyebabkan resonansi elektron terhenti dan mengakibatkan terjadinya pengurangan gugus kromofor sehingga terjadi penurunan intensitas warna DPPH

(73) 54 dari warna ungu gelap menjadi warna kuning. Pada pengukuran dengan spektrofotometri visibel, nilai absorbansi yang terbaca adalah nilai warna ungu DPPH yang tersisa. Menurut Molyneux (2004), penurunan warna DPPH ini diikuti juga oleh penurunan absorbansi DPPH sehingga aktivitas antioksidan penangkapan radikal dapat diketahui dengan menghitung rasio penurunan absorbansi DPPH. Makin kuat suatu senyawa antioksidan yang ada dalam senyawa uji dapat menyebabkan warna DPPH makin memudar. Pada penelitian ini digunakan rutin sebagai pembanding dalam pengujian aktivitas antioksidan ekstrak metanolik umbi bidara upas. Banyak penelitian yang telah dilakukan untuk uji aktivitas antioksidan dan dinyatakan bahwa rutin termasuk dalam golongan senyawa flavonoid yang mempunyai gugus OH fenolat dalam strukturnya sehingga dapat digunakan sebagai senyawa pembanding. Rutin menghambat radikal bebas hasil oksidasi lipid dengan cara menangkap radikal peroksi (ROO∙). Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan membuat lima konsentrasi rutin dan juga ekstrak metanolik yang berbeda-beda dan dilakukan tiga kali replikasi (Tabel VI dan VII). Jika dilihat dari kedua tabel tersebut, terlihat bahwa ada korelasi antara konsentrasi rutin maupun ekstrak metanolik dengan respon % IC. Semakin tinggi konsentrasi dari rutin (Gambar 17) dan ekstrak metanolik (Gambar 18), maka semakin besar pula % IC yang dihasilkan. Nilai % IC yang diperoleh digunakan untuk mendapatkan persamaan regresi linear.

(74) 55 Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH Replikasi 1 2 3 Konsentrasi rutin (µg/mL) 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 % IC 12,1614 22,0600 34,3774 44,8222 55,6571 13,4553 24,2887 36,5726 48,0531 59,8460 11,6155 24,1544 34,3680 45,8500 57,8994 Persamaan regresi linear y = 2,1951x + 0,8895 r = 0,9996 y = 2,3309x + 1,4794 r = 0,9999 y = 2,2853x + 0,4984 r = 0,9958 Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Rutin 80 y = 2,3309x + 1,4794 r = 0,9999 %IC 60 40 20 0 0 5 10 15 20 25 Konsentarsi rutin (µg/mL) Gambar 17. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan rutin 30

(75) 56 Tabel VII. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak metanolik umbi bidara upas dengan metode DPPH Konsentrasi ekstrak metanolik (µg/mL) 100 200 300 400 500 100 200 300 400 500 100 200 300 400 500 Replikasi 1 2 3 % IC 11,5563 25,1500 38,9021 52,3599 64,9576 11,7342 23,7956 38,6776 52,1832 66,3545 10,8581 23,0398 36,9153 51,7891 65,1598 Persamaan regresi linear y = 0,1340x - 1,6186 r = 0,9999 y = 0,1376x - 2,7394 r = 0,9996 y = 0,1374x - 3,653 r = 0,9995 %IC Kurva Persamaan Regresi Linear Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanolik 70 60 50 40 30 20 10 0 y = 0,1340x - 1,6186 r = 0,9999 0 100 200 300 400 500 600 Konsentrasi Ekstrak Metanolik (µg/mL) Gambar 18. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan ekstrak metanolik umbi bidara upas Parameter aktivitas antioksidan pada suatu senyawa dinyatakan dalam IC50. Menurut Zou, Lu, dan Wei (2004), IC50 adalah konsentrasi senyawa

(76) 57 antioksidan yang dibutuhkan untuk mengurangi radikal DPPH sebesar 50 % yang diperoleh dari suatu persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi ekstrak metanolik umbi bidara upas maupun rutin dengan % IC (Tabel VI dan VII). Semakin kecil nilai IC50 yang didapat maka aktivitas antioksidan suatu senyawa semakin besar. Tabel VIII. Hasil perhitungan IC50 rutin dan ekstrak metanolik umbi bidara upas Replikasi 1 2 3 Replikasi 1 2 3 Rutin IC50 (µg/mL) 22,3728 20,8163 21,6609 Ekstrak metanolik umbi bidara upas IC50 (µg/mL) 385,2134 383,2805 390,4905 � ± SD 𝒙𝒙 21,6 ± 0,7 � ± SD 𝒙𝒙 386,3 ± 3,7 Dari persamaan regresi linear (Tabel VI dan VII), diperoleh nilai rata-rata IC50 rutin sebesar (21,6 ± 0,7) µg/mL dan nilai rata-rata IC50 ekstrak metanolik umbi bidara upas sebesar (386,3 ± 3,7) µg/mL (Tabel VIII), hal ini berarti untuk menangkap radikal bebas sebesar 50% diperlukan konsentrasi rutin sebesar (21,6 ± 0,7) µg/mL, sedangkan konsentrasi ekstrak metanolik umbi bidara upas yang diperlukan sebesar (386,3 ± 3,7) µg/mL. Semakin kecil nilai IC50, maka sampel uji memiliki keefektifan sebagai antioksidan yang baik. Dari hasil nilai rata-rata IC50 rutin dan ekstrak umbi bidara upas yang diperoleh, maka dapat disimpulkan bahwa rutin memiliki aktivitas antioksidan yang lebih besar bila dibandingkan

(77) 58 dengan ekstrak metanolik umbi bidara upas. Berdasarkan tingkat kekuatan antioksidan (Tabel IX), rutin memiliki daya antioksidan yang sangat kuat sedangkan untuk ekstrak metanolik umbi bidara upas memiliki daya antioksidan yang lemah. Tabel IX. Tingkat kekuatan antioksidan (Blois cit., Fidrianny, Darmawati, Sukrasno, 2014). Intensitas Nilai IC50 Sangat kuat < 50 µg/mL Kuat 50-100 µg/mL Sedang 101-150 µg/mL Lemah >150 µg/mL Rutin Ekstrak metanolik Menurut Sivaci dan Duman (2014), terdapat korelasi positif antara kandungan fenolik total dengan aktivitas antioksidan (IC50), yaitu semakin banyak senyawa fenolik dalam suatu ekstrak, maka aktivitas antioksidan semakin tinggi (nilai IC50 semakin kecil). Hasil penetapan kandungan fenolik total dalam ekstrak metanolik umbi bidara upas adalah (1,96 ± 0,07 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak) dan nilai IC50 (386,3 ± 3,7 µg/mL), hal ini sudah sesuai dengan teori, aktivitas antioksidan dala ekstrak metanolik umbi bidara upas tergolong lemah karena senyawa fenolik yang terkandung hanya sedikit. Hasil nilai IC50 dari rutin dan ekstrak metanolik umbi bidara upas selanjutnya digunakan dalam analisis statistika dengan suatu software yaitu R 3.0.2. Uji pertama yang dilakukan adalah uji normalitas Shapiro-wilk pada rutin

(78) 59 dan senyawa uji yang dimaksudkan untuk mengetahui apakah data yang dihasilkan terdistribusi secara normal atau tidak normal. Uji normalitas data akan menentukan jenis uji selanjutnya yang akan digunakan apakah uji parametrik (terdistribusi normal) atau non-parametrik (terdistribusi tidak normal). Dipilih uji Shapiro-wilk karena data yang diolah hanya sedikit. Pada uji normalitas ini, data dikatakan terdistribusi normal apabila p-value > 0,05. Hasil yang diperoleh pada uji ini adalah p-value untuk rutin adalah 0,9061 dan untuk ekstrak 0,5003 (Lampiran 15), sehingga dapat disimpulkan bahwa rutin dan ekstrak memiliki distribusi data yang normal dan dapat dilanjutkan ke uji parametrik. Uji kedua yaitu uji variansi data. Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah dua data atau lebih kelompok data memiliki variansi yang sama atau tidak. Hasil yang diperoleh untuk uji variansi ini adalah p-value = 0,08354. Nilai p yang didapat > 0,05 (taraf kepercayaan 95%) sehingga dapat disimpulkan bahwa IC50 rutin dan IC50 ekstrak metanolik umbi bidara upas memiliki variansi data yang homogen. Uji ketiga yang dilakukan yaitu uji parametrik (uji t tidak berpasangan). Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah ada perbedaan antara IC50 rutin dan IC50 ekstrak metanolik umbi bidara upas. Hasil pengujian statistik diperoleh nilai p adalah 7,959e-09. Signifikansi nilai yang diperoleh ini lebih kecil daripada nilai yang telah ditentukan yaitu 0,05 dengan taraf kepercayaan 95%, sehingga dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan signifikan antara nilai IC50 rutin dan IC50 ekstrak metanolik umbi bidara upas. Jika dilihat dari nilai rata-rata IC50 yang diperoleh dari hasil perhitungan (Tabel VIII), didapat nilai rata-rata IC50 ekstrak

(79) 60 metanolik umbi bidara upas lebih besar dibanding nilai rata-rata IC50 rutin, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak metanolik umbi bidara upas memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kecil dibanding aktivitas antioksidan rutin.

(80) BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Kandungan fenolik total dalam ekstrak metanolik umbi bidara upas sebesar (1,96 ± 0,07) mg ekivalen asam galat per gram ekstrak. 2. Nilai IC50 ekstrak metanolik umbi bidara upas dengan menggunakan radikal bebas DPPH sebesar (386,3 ± 3,7) µg/mL. B. Saran 1. Perlu dilakukan pengujian aktivitas antioksidan terhadap daun bidara upas. 2. Perlu dilakukan pengujian aktivitas antioksidan menggunakan pelarut non polar. 61

(81) 62 DAFTAR PUSTAKA Agil, M., Sugianto.,Widyowati, R., dan Purwitasari, N., 2010, Uji Daya Hambat Mycobacterium Tuberculosis dari Umbi Bidara Upas (Merremia mammosa Hall), Tesis, Universitas Airlangga, Surabaya. Agustina, D.R., Nurcahyanti, Lusiawati, D.,dan Kris H., 2011, Aktivitas Antioksidan dan Antibakteri Ekstrak Polar dan Non Polar Biji Selasih, J. Teknol dan Industri Pangan, Vol. XXII, 3. Amarowicz, R., Naczk,M., dan Fereiodon, 2000, Antioxidants Activity of Crude Tannins of Canola and Repessed Hulls, JAOCS, 77, 957-961. Andayani, R., Lisawati, Y.,dan Maimunah, 2008, Penentuan Aktivitas Antioksidan Kadar Fenolat Total dan Likopen pada Buah Tomat http://ffarmasi.unand.ac.id/pub/JSTFeb2009%20_regina_.pdf,diakses pada 9 Oktober 2013 Ansel, C.H., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, edisi IV, UI Press, Jakarta, pp. 607-609. Azlim A.A., Ahmed J.K., Syed Z.I., Mustafa S.K., Aisyah M.R., dan Kamarul, R.K., 2010, Total Phenolic Content and Primary Antioxidant Activity of Methanolic and Ethanolic Extract of Aromatic Plants Leaves, International Food Research Journal, (17), 1077-1084. Badarinath, A.V., Mallikarjuna, K, Chetty, C.M., Ramkanth, S., Rajan, T.V., dan Gnanaprakash, K., 2010, A Review on In-vitro Antioxidant Methods: Comparison, Correlation and Considerations, Int. J. Pharm. Tech. Research, 2 (2), 1276-1285. Bangun, A., 2012, Ensiklopedia Tanaman Obat Indonesia, Indonesia Publishing House, Bandung, pp. 60. Belitz, H.D., dan Grosch, W., 1999, Food Chemistry, Springer Verlag , New York, pp. 466. Bendra, A., 2012, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Premna oblongata Miq. dengan Metode DPPH dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia dari Fraksi Teraktif, Skripsi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia, Depok Blainski, A., Cristiny G., dan de Mello J., 2013, Application and Analysis of the Folin Ciocalteu Method for the Determination of The Total Phenolic Content from Limonium Brasiliense L., J. Mdpi Molecules., 18 (6855).

(82) 63 Brown, A., 2000, Understanding Food: Principles and Preparation, Wadsworth Thomson Learning ,USA, pp. 675-677. Bruneton, J., 1999, Pharmacognosie, Phytochimie, Plantes Medicales, diterjemahkan oleh Hatton, C.K, Lavosie Publishing, Paris, pp. 2999. Choi, Y.W., LO, S.C, dan Han, S., 2004, Antioxidant Activity of Crude Exctract and Pure Compounds of Acer ginnata Max, Bull Korean Chem Soc, 25, 389-391. Cuvelier, M.E., Richard, H., dan Besset, C., 1992, Comparison of the Antioxidative of Some Acid Phenols : Structure-Activity Relationship, Biosci. Biotechnol. Biochem, 56 (2), 324-325. Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Nabavi, S.F., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60 (4), 405-412. Depkes RI, 1986, Sediaan Galenika, Jilid 2, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 11-12. Depkes RI, 2000a, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 10-11. Dewick, M.P., 2001, Medicinal Natural Products, John Wiley & Sons Ltd, England, pp. 121-125. Djamil, R., 2009, Penapisan Fitokimia, Uji BSLT, dan Uji Antioksidan Ekstrak Metanol beberapa Spesies Papilionacea, Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jakarta Selatan, Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 65-71. dos Santos, S, X., Mazo, L.H., dan Cavalheiro, E.T., 2008, The Use Ogf a Graphite-Silicone Rubber Composite Electrode in The Determination of Rutin in Pharmaceutical Formulation, J. Braz, Chem, Soc., 19 (8), 1603. Duh, P.D., Tu, dan Yen, 1999, Antioxidant Activity of Water Extract of Harng Jyur, Lebensmittel-Wissenschaft U Technol, 32 : 269-277. Dykes, L., dan Rooney, L.W., 2007, Phenolic Compounds in Cereal Grains and Their Health Benefits, Cereal Foods World, 52 (3), 105-111. Eko, U.H., 2003, Review : Ellagitanin; Biosintesis, Isolasi, dan Aktivitas Biologi, J.Biofarmasi , 1 (1), 25-38.

(83) 64 Fessenden, R.J., dan Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid I, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A.H., edisi ketiga, Penerbit Erlangga, Jakarta, pp. 436444. Fidrianny, I., Darmawati, A., Sukrasno, 2014, Antioxidant Capacities from Different Polarities Extracts of Cucurbitaceae Leaves Using FRAP, DPPH Assay and Corelation with Phenolic, Flavonoid, Carotenoid Content, Int. J. Pharm. Sci., Vol. 6, 858-862. Fouad, T., 2005, Antioxidant, Nature, and Chemistry, http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/article/antioxidant,diakses pada 2 Februari 2014 Fu, L., Xu, B.T., Gan, R.Y., Zhang, Y., Xu, X.R., Xia, E. Q., dan Li, H, B., 2011, Total Phenolic Contents and Antioxidant Capacities of Herbal and Tea Infusions, Int, J. Mol, Sci., 12, 2112-2124. Galati, A., McKay, A., dan Tan, S.C., 2005, Minimising Post-Harvest Losses of Carrots, Farmanote, 75, 95. Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 9-18,31-33,221-263. Gitawati, R., 1995, Radikal Bebas-Sifat dan Peran dalam Menimbulkan Kerusakan/Kematian Sel, Cermin Dunia Kedokteran, 102, 33-35. Ghosh, D., dan Konishi, T., 2007, Anthocyanins and Anthocyanin-Rich Extract : Role in Diabetes and Eye Function, Asia Pac, J. Clin Nutr, 16 (2), 200208. Halim F., 2011, Peran Senyawa Antioksidan dalam Permen Cokelat terhadap Pengaturan Tekanan Darah Manusia, Skripsi, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Katolik Widya Mandala, Surabaya. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, edisi 2, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung, pp. 6. Haryanti, S., 2009, Ensiklopedi Tanaman Obat Indonesia, PALMALL, Yogyakarta, pp. 71-73. Halliwel, B., and Gutteridge, J.M.C., 2000, Free Radical in Biology and Medicine, Oxford university Press, New York, pp. 1-231, 353-435. Hernani dan Rahardjo, M., 2005, Tanaman Berkhasiat Antioksidan, Penebar Swadaya, Jakarta, pp. 9, 16-20.

(84) 65 Hidayat, M.R., 2000, Daya Tangkap Radikal Oksida Nitrit Senyawa Pentagamavunon-0 dan Turunannya, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Himawati, E.R., 2001, Antioksidan dan Peredam Radikla Bebas Biologis, Majalah Farmasi Indonesia, 12 (1), 55-60. Janeiro, P., dan Brett, A., 2004, Cathecin Electrochemical Oxidation Mechanism, Anal, Chim, Acta, 58, 109-115. Jasson, N., 2005, The Determination of Total Phenolic Compounds in Green Tea, http://folinciocalteu/method/colorimetric, diakses pada 24 Januari 2014 Javanmardi, J., Stushnoff, C., Locke, E., dan Vivanco, J.M., 2003, Antoxidant Activity and Total Phenolic Content of Iranian Ocimum Accessions, Food Chemistry, 83, 547-550. Juniarti, Osmeli, D., dan Yuhernita, 2009, Kandungan Senyawa Kimia, Uji Toksisitas (BST) dan Antioksidan dari Ekstrak Daun Saga (Alena precatorius), J. M.Sci., Vol. 13 (1), 50-54. Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N., 2002, Screening of Plant Extract for Antioxidant Activity, A Comparative Study on Three Testing Methods, J.Phy. Anal., 13, 8-17. Kristina, H.D.,Ariviani, S., dan Khasanah, L.U.,2012, Ekstraksi Pigmen Antosianin Buah Sanggani (Melastoa malabathricum Auct. Non Linn) dengan Variasi Jenis Pelarut, J. Teknosains Pangan, 1(1), 105-109. Kubo, I., Masuoka, N., Xiao, P., dan Haraguchi,H., 2002, Antioxidant Capacity of Dodecyl Gallate, SNT, 1-9. Kuncahyo, I., dan Sunardi, 2007, Uji Aktivitas Ekstrak Belimbing Wuluh (Averhoa bilimbi, L.) terhadap DPPH, SNT, 1-9. Kurniawan, A., 2011, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1Difenil-2-Pikrihidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Herba Seledri (Apium graveolens L.,), skripsi, 63, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. List, P.H., dan Schmidt, P.C., 2000, Phytopharmaceutical Technology, CRC Press, USA, pp. 107,109.

(85) 66 Lopez, M., Martinez, F., Del-Valle, C., Ferrit, M., dan Luque, R., 2003, Study of Phenolic Compounds as Natural Antioxidants by a Fluorescence Method, J.Talanta, 60, 609-616. Madhavi, D. L., Deshpande, S.S., dan Salunkhe, D.K.,1996, Introduction Food Antioxidant: Technological, Toxicological, and Health Perspectives, Marcel Dekker, Inc, New York, pp. 1-4. Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoids Identification, diterjemahkan oleh Padwanita, K., Penerbit ITB, Bandung, pp. 1, 15, 103. Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity, Songklanakarin, J.Sci. Technol., 26 (2), 211-219. Mulja, M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga Unversity Press, Surabaya, pp. 7, 26-32. Niki, E., dan Noguchi, N., 2000, Evaluation of Antioxidant Capacity : What Capacity is Being Measured by Which Method, IUBMB Life, 50, 323329. Nurhayati, Siadi, K., dan Herjono, 2012, Pengaruh Konsentrasi Natrium Benzoat dan Lama Penyimpanan pada Kadar Fenolat Total Pasta Tomat, Indo. J.Chem. Sci., 1 (2), 158-163. Pedriclli, P., 2001, Antioxidant Mechanism of Flavonoid, Solvent Effect on Rate Constant For Chain Breaking Reaction of Quersetin and Epicatechinin Autooxidation of Methyl Linoleat, Agric Food Chem, 49. Percival, M., 1998, Antioxidant, Advanced Notrition Publication, Inc. Pokorny, J., Yanishlieva, N., dan Gordon, M., 2001, Antioxidant in Food; Practical Applications, Wood Publishing Limited, Cambrodge, England, pp. 1-123. Prakash, A., Rigelhof, F., dan Miller, E., 2001, Antioxidant Activity, Medallliaoan Laboratories, Vol 19 no : 2, 1-4. Pribadi, I., 2009, Uji Aktivitas Penangkap Radikal Buah Psidium guajava L., dengan Metode DPPH serta Penetapan Kadar Fenolik dan Flavonoid Totalnya https://etd.eprints.ums.ac.id/58931/1/K100050061.pdf, diakses pada 20 Desember 2013

(86) 67 Prior, R. L., Wu, X, dan Schaich, K., 2005, Standarized Methods for Determination of Antioxidants Capacity and Phenolics in Foods and Dietary Supplements, J. Agric. Food Chem, 55, 2698A-J. Proestos, C., Sereli, D., dan Komaitis, M., 2006, Determination of Phenolic Compounds in Aromatic Plants by RP-HPLC and GC-MS, J. Food Sci, 95, 44-52. Purwanti, S., 2002, Uji Identitas, Kualitas, dan Toksisitas Umbi Bidara Upas (Merremia mammosa Hall) dengan Metode BST, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Rajendra, Magadum, S.G., Nadaf, A.M., Yashoda, S.V., dan Manjula, M., 2011, Phytochemical Screening of The Rhizome of Kaempferia Galanga, Int. J. Pharm. Phy., 3 (3), 61-63. Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan oleh Kokasih Padmawinata, ITB, Bandung, pp. 47. Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta, pp. 39-42. Shivaprasad, H.N., Mohan,S., Kharya, M.D.,Shiradkar, M.R.,dan Lakshman, K., 2005, In-Vitro Models for Antioxidant Activity Evaluation: a review, http://www.pharmainfo.net/reviews/vitro-models-antioxidant-activityevaluation-review, diakses pada 20 Desember 2013 Sivaci A., Duman, S., 2014, Evaluation of Seasonal Antioxidant Activity and Total Phenolic Compounds in Stems and Leaves of Some Almond (Prunus amygdalus L.) Varieties, Biological Research, 47-48. Suhartono, E., Fujiati, Aflanie, I., 2002, Oygen Toxicity by Radiation and Effect of Glutamic Piruvat Transamine (GPT) Activity Rat Plasma After Vitamin C Treatment, Int. SOECT, 97. Suhono, B., 2009, Ensiklopedia Flora, PT. Kharisma Ilmu, Bogor. pp. 138-139. Sulistiyowati, Cahyono, B., dan Swastawati, F., 2013, Penentuan Total Senyawa Fenolat dan Aktivitas Antioksidan pada Asap Cair Ampas Tebu dan Kulit Tebu (Sacharum officinarum) serta Identifikasi Komponen penyusunnya, Chem, Info, 1 (1), 362-369. Sunardi, I.K., 2007, Uji Aktvitas Antioksidan Ekstrak Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi, L.,) terhadap 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), Seminar Nasional Teknologi, Teknologi Farmasi Fakultas Teknik Universitas Setia Budi, Yogyakarta.

(87) 68 Syahbana, D., dan Bahalwan, R.R., 2002, Seri Referensi Herbal: Pesona Tradisional dan Ilmiah Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.), Salemba Medika, Jakarta, pp. 5-20. Togo, H., 2004, Advanced Free Radical Reactions for Organic Synthesis, Chiba, Japan, pp.13 Tursiman, Puji, dan Risa, 2012, Total Fenol Fraksi Etil Asetat dari Buah Asam Kandis, Fakultas MIPA, Universitas Tanjungpura, JJK, 45-48. Umemura, T., Kodama, Y., Hioki, K., Inoue, T., Nomura T., dan Kurokawa Y., 2001, Butylhydroxytoluene (BHT) Increases Susceptibility of Transgenic ras H2 Mice to Lung Carcinogenesis, J. Cancer Res Clin Oncol, 127 (10), 583-590. Van Valkenburg, J.L.C., dan Bunyapraphatsara, N., 2001, Medicinal and Poisonous Plants, Backhuys Publihers, Leiden, The Netherlands, 12 (2). Valko, M., Leibfritz, D., Mocol, J., Cronin, M.T.D., Mazur, M., dan Telser, J., 2006, Free Radicals and Antioxidants in Normal Physiological Function and Human Disease, IJBCB, 39, 44-48. Waterman, W., dan Mole, S., 1994, Analysis of Phenolic Plants Metabolites, Blackwell Scientific, Oxford, pp. 42-45. Wijaya, A., 1996, Radikal Bebas dan Parameter Status Antioksidan, Forum Diagnosticum, Prodia Diagnostic Educational Servica, (1), 1-12. Winarsi, W., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Kanisius, Yogyakarta, pp. 13,77. Windono, T., Soediman, S., Yudawati, Ermawati, Srielita, dan Erowati, 2001, Uji Peredam Radikal Bebas Terhadap 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) dari Ekstrak Kulit Buah dan Biji Anggur (Vitis vinifera L.), Artocarpus, Surabaya, 1 (1), 34-43. Yuwono, A., 2009, Antioxidant and Health Disease, http://farmacology/specialistmedic/internist, diakses pada 14 November 2013 Zou, Y., Lu Y. dan Wei, D., 2004, Antioxidant activity of Flavonoid-rich extract of Hypericum perforratum L in vitro, J. Agric, Food Chem, 52, 50325039.

(88) 69 LAMPIRAN Lampiran 1. Surat determinasi bidara upas

(89) 70 Lampiran 2. Gambar umbi bidara upas dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta Lampiran 3. Rendemen serbuk umbi bidara upas Bobot umbi bidara upas yang dipanen = 3000 g Bobot serbuk yang diperoleh = 427 g Rendemen serbuk = = Bobot serbuk yang diperoleh Bobot bahan yang dipanen 427 g 3000 g x 100 % x 100 % = 14, 23 % Lampiran 4. Rendemen ekstrak metanolik umbi bidara upas Bobot umbi bidara upas yang digunakan Bobot cawan Bobot cawan + ekstrak Bobot ekstrak Total bobot ekstrak Cawan 1 (g) 60,45 66,02 5,57 Bobot ekstrak metanolik umbi bidara upas = 300 g Cawan 2 (g) 58,36 63,87 5,51 16,44 = 16,44 g Cawan 3 (g) 63,27 68,63 5,36

(90) 71 Rendemen ekstrak metanolik = = Bobot ekstrak yang didapat Bobot bahan yang digunakan 16,44 g 300 g x 100 % x 100 % = 5, 48 % Lampiran 5. Data penimbangan uji kandungan fenolik total 1. Penimbangan asam galat Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) 0,2473 0,2541 0,2466 0,2723 0,2791 0,2716 Bobot kertas + sisa 0,2481 0,2549 0,2466 Bobot asam galat 0,0242 0,0242 0,025 Bobot kertas Bobot kertas + asam galat 2. Penimbangan ekstrak metanolik umbi bidara upas Bobot gelas arloji Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) 14,2795 12,1807 13,1688 14,3095 12,2108 13,1988 14,2795 12,1807 13,1688 0,0300 0,0301 0,0300 Bobot gelas arloji + asam galat Bobot gelas arloji + sisa Bobot ekstrak metanolik

(91) 72 Lampiran 6. Scanning kontrol asam galat (600-800 nm) Lampiran 7. Optimasi penentuan kandungan fenolik total 1. Penentuan Operating Time asam galat Replikasi 1 Absorbansi konsentrasi replikasi 1 pada λ 760 nm Waktu (menit) 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,3544 0,4983 0,6986 10 0,2999 0,5273 0,7216 15 0,2980 0,5436 0,7377 20 0,3182 0,5719 0,7639 25 0,3186 0,5723 0,7651 30 0,3190 0,5737 0,7701 OT yang didapat 20 menit

(92) 73 Replikasi 2 Absorbansi konsentrasi replikasi 2 pada λ 760 nm Waktu (menit) 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,3036 0,4900 0,6884 10 0,3031 0,5292 0,7372 15 0,3093 0,5522 0,7595 20 0,3171 0,5543 0,7716 25 0,3174 0,5576 0,7748 30 0,3177 0,5653 0,7780 OT yang didapat 20 menit Replikasi 3 Absorbansi konsentrasi replikasi 3 pada λ 760 nm Waktu (menit) 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 5 0,3207 0,5331 0,6875 10 0,3101 0,5502 0,7300 15 0,3254 0,5597 0,7498 20 0,3260 0,5743 0,7683 25 0,3261 0,5787 0,7750 30 0,3263 0,5799 0,7763 OT yang didapat 20 menit

(93) 74 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (600-800 nm) a. Spektra asam galat 50 µg/mL b. Spektra asam galat 100 µg/mL

(94) 75 c. Spektra asam galat 150 µg/mL

(95) 76 Lampiran 8. Penetapan kandungan fenolik total 1. Konsentrasi asam galat Konsentrasi seri replikasi 1 Konsentrasi stok = 0,0242 g 50 mL = 484 µg/mL Seri 1 V1 . C1 = V2 . C2 1 mL . 484 µg/mL= 10 mL . C2 C2 = 48,4 µg/mL Seri 2 V1 . C1 = V2 . C2 1,5 mL . 484 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 72,6 µg/mL Seri 3 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 484 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 96,8 µg/mL Seri 4 V1 . C1 = V2 . C2 2,5 mL . 484 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 121 µg/mL Seri 5 V1 . C1 = V2 . C2 3 mL . 484 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 145,2 µg/mL Konsentrasi seri replikasi 2 Konsentrasi stok = 0,0242 g 50 mL = 484 µg/mL Seri 1 V1 . C1 = V2 . C2 1 mL . 484 µg/mL= 10 mL . C2 C2 = 48,4 µg/mL Seri 2 V1 . C1 = V2 . C2 1,5 mL . 484 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 72,6 µg/mL Seri 3 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 484 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 96,8 µg/mL Seri 4 V1 . C1 = V2 . C2 2,5 mL . 484 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 121 µg/mL Seri 5 V1 . C1 = V2 . C2 3 mL . 484 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 145,2 µg/mL

(96) 77 Konsentrasi seri replikasi 3 Konsentrasi stok = 0,0250 g 50 mL = 500 µg/mL Seri 1 V1 . C1 = V2 . C2 1 mL . 500 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 50 µg/mL Seri 2 V1 . C1 = V2 . C2 1,5 mL . 500 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 75 µg/mL Seri 3 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 500 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 100 µg/mL Seri 4 V1 . C1 = V2 . C2 2,5 mL . 500 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 125 µg/mL Seri 5 V1 . C1 = V2 . C2 3 mL . 500 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 150 µg/mL 2. Kurva baku asam galat Replikasi 1 2 3 Konsentrasi asam galat (μg/mL) 48,4 72,6 96,8 121 145,2 48,4 72,6 96,8 121 145,2 50 75 100 125 150 Absorbansi 0,2967 0,4326 0,5385 0,6614 0,8079 0,3007 0,4142 0,5272 0,6406 0,7675 0,2957 0,4122 0,5465 0,6641 0,7789 Persamaan Nilai r y = 0,0052x + 0,0469 0,9987 y = 0,0048x + 0,0660 0,9997 y = 0,0049x + 0,0522 0,9996 Persamaan yang digunakan adalah y = 0,0048x + 0,0660

(97) 78 Sampel 1 Bobot sampel = 0,0300 g Konsentrasi = Absorbansi sampel = 0,6333 0,0300 g 10 mL = 3000 µg/mL y = 0,0048x + 0,0660 0,6333 = 0,0048x + 0,0660 x = 118,18 µg/mL = 0,11818 mg/mL Kandungan fenolik total = x. v m = 0,11818 mg/mL . 0,5 mL 0,0300 g = 1,9697 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik Sampel 2 Bobot sampel = 0,0301 g Konsentrasi = Absorbansi sampel = 0,6517 0,0301 g 10 mL = 3010 µg/mL y = 0,0048x + 0,0660 0,6517 = 0,0048x + 0,0660 x = 122,02 µg/mL = 0,12202 mg/mL Kandungan fenolik total = x. v m = 0,12202 mg/mL . 0,5 mL 0,0301 g = 2,0269 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik

(98) 79 Sampel 3 Bobot sampel = 0,0300 g Konsentrasi = Absorbansi sampel = 0,6072 0,0300 g 10 mL = 3000 µg/mL y = 0,0048x + 0,0660 0,6072 = 0,0048x + 0,0660 x = 112,75 µg/mL = 0,11275 mg/mL Kandungan fenolik total =x. v m = 0,11275 mg/mL . 0,5 mL 0,0300 g = 1,8792 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik Kandungan Kandungan fenolik (µg/mL) fenolik total (mg) Replikasi 1 0,6333 118,18 1,9697 � ± SD 𝒙𝒙 Replikasi 2 0,6517 122,02 2,0269 1,96 ± 0,07 Replikasi 3 0,6072 112,75 1,8792 Absorbansi Lampiran 9. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan a. Penimbangan DPPH Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Bobot kertas 0,3302 0,3581 0,3259 Bobot kertas + DPPH 0,3461 0,3739 0,3419 Bobot kertas + sisa 0,3303 0,3581 0,3260 Bobot DPPH 0,0158 0,0158 0,0159

(99) 80 b. Penimbangan rutin Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Bobot kertas 0,3290 0,3147 0,3085 Bobot kertas + rutin 0,3315 0,3172 0,3110 Bobot kertas + sisa 0,3290 0,3147 0,3085 Bobot rutin 0,0025 0,0025 0,0025 c. Penimbangan ekstrak metanolik umbi bidara upas Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Bobot gelas arloji 14,2894 14,2572 14,7579 Bobot gelas arloji + ekstrak 14,3144 14,2822 14,7829 Bobot gelas arloji + sisa 14,2894 14,2572 14,7579 Bobot ekstrak 0,0250 0,0250 0,0250 Lampiran 10. Data konsentrasi bahan untuk uji aktivitas antioksidan a. Konsentrasi DPPH Replikasi 1 BM = 394,33 Mol = M = massa BM mol volume = = 15,8 mg 394,33 0,0401 mmol 0,1 L = 0,0401 mmol = 0,4010 mM

(100) 81 Replikasi 2 BM = 394,33 Mol = M = massa BM mol volume = = 15,8 mg = 0,0401 mmol 394,33 0,0401 mmol 0,1 L = 0,4010 mM Replikasi 3 BM = 394,33 Mol = M = massa BM mol volume = = 15,9 mg = 0,0403 mmol 394,33 0,0403 mmol 0,1 L = 0,4030 mM b. Konsentrasi rutin Konsentrasi larutan stok 0,0025 g 10 mL = 2,5 x 10-4 g/mL = 250 µg/mL Konsentrasi seri replikasi 1 Seri 1 Seri 4 V1 . C1 = V2 . C2 V1 . C1 = V2 . C2 0,5 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 2 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 5 µg/mL C2 = 20 µg/mL Seri 2 Seri 5 V1 . C1 = V2 . C2 V1 . C1 = V2 . C2 1 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 2,5 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 10 µg/mL C2 = 25 µg/mL Seri 3 V1 . C1 = V2 . C2 1,5 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 15 µg/mL

(101) 82 Konsentrasi larutan stok 0,0025 g 10 mL = 2,5 x 10-4 g/mL = 250 µg/mL Konsentrasi seri replikasi 2 Seri 1 V1 . C1 = V2 . C2 0,5 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 5 µg/mL Seri 2 V1 . C1 = V2 . C2 1 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 10 µg/mL Seri 3 V1 . C1 = V2 . C2 1,5 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 15 µg/mL Konsentrasi larutan stok 0,0025 g 10 mL Seri 4 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 20 µg/mL Seri 5 V1 . C1 = V2 . C2 2,5 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 25 µg/mL = 2,5 x 10-4 g/mL = 250 µg/mL Konsentrasi seri replikasi 3 Seri 1 V1 . C1 = V2 . C2 0,5 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 5 µg/mL Seri 2 V1 . C1 = V2 . C2 1 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 10 µg/mL Seri 3 V1 . C1 = V2 . C2 1,5 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 15 µg/mL Seri 4 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 20 µg/mL Seri 5 V1 . C1 = V2 . C2 2,5 mL . 250 µg/mL = 25 mL . C2 C2 = 25 µg/mL

(102) 83 c. Konsentrasi ekstrak metanolik umbi bidara upas Konsentrasi larutan stok = 0,0250 g 25 mL = 1 x 10-3 g/mL = 1000 µg/mL Konsentrasi seri replikasi 1 Seri 1 V1 . C1 = V2 . C2 1 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 100 µg/mL Seri 2 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 200 µg/mL Seri 3 V1 . C1 = V2 . C2 3 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 300 µg/mL Konsentrasi larutan stok = Seri 4 V1 . C1 = V2 . C2 4 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 400 µg/mL Seri 5 V1 . C1 = V2 . C2 5 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 500 µg/mL 0,0250 g 25 mL = 1 x 10-3 g/mL = 1000 µg/mL Konsentrasi seri replikasi 2 Seri 1 V1 . C1 = V2 . C2 1 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 100 µg/mL Seri 2 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 200 µg/mL Seri 3 V1 . C1 = V2 . C2 3 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 300 µg/mL Seri 4 V1 . C1 = V2 . C2 4 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 400 µg/mL Seri 5 V1 . C1 = V2 . C2 5 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 500 µg/mL

(103) 84 Konsentrasi larutan stok = 0,0250 g 25 mL = 1 x 10-3 g/mL = 1000 µg/mL Konsentrasi seri replikasi 3 Seri 1 V1 . C1 = V2 . C2 1 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 100 µg/mL Seri 2 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 200 µg/mL Seri 3 V1 . C1 = V2 . C2 3 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 300 µg/mL Lampiran 11. Scanning larutan a. Scanning pelarut metanol Seri 4 V1 . C1 = V2 . C2 4 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 400 µg/mL Seri 5 V1 . C1 = V2 . C2 5 mL . 1000 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 500 µg/mL

(104) 85 b. Scanning metanol air (1:1) c. Scanning rutin d. Scanning asam galat

(105) 86 e. Scanning ekstrak metanolik umbi bidara upas (λ 400-600 nm) f. Scanning ekstrak metanolik umbi bidara upas (λ 600-800 nm)

(106) 87 Lampiran 12. Penentuan λ serapan maksimum dan Operating Time (OT) uji aktivitas antioksidan 1. Penentuan λ serapan maksimum a. Spektra DPPH 0,020 mM

(107) 88 b. Spektra DPPH 0,040 mM

(108) 89 c. Spektra DPPH 0,060 mM

(109) 90 2. Penentuan Operating Time rutin (λ = 517 nm) Replikasi 1 Konsentrasi rutin (µg/mL) Waktu (menit) 5 15 25 5 0,8237 0,7518 0,5239 10 0,8211 0,6914 0,4462 15 0,8101 0,6593 0,4150 20 0,7864 0,6350 0,3972 25 0,7803 0,6167 0,3603 30 0,7745 0,5997 0,3493 35 0,7746 0,5891 0,3426 40 0,7744 0,5890 0,3428 45 0,7748 0,5889 0,3427 50 0,7746 0,5888 0,3430 55 0,7744 0,5890 0,3429 60 0,7745 0,5887 0,3431 OT yang didapat 35 menit

(110) 91 Replikasi 2 Konsentrasi rutin (µg/mL) Waktu (menit) 5 15 25 5 0,8140 0,7383 0,5271 10 0,8057 0,6849 0,4261 15 0,7998 0,6487 0,3967 20 0,7843 0,6275 0,3821 25 0,7619 0,6081 0,3512 30 0,7620 0,5865 0,3475 35 0,7620 0,5870 0,3347 40 0,7623 0,5869 0,3350 45 0,7621 0,5870 0,3351 50 0,7622 0,5867 0,3349 55 0,7620 0,5871 0,3349 60 0,7621 0,5872 0,3348 OT yang didapat 35 menit

(111) 92 Replikasi 3 Konsentrasi rutin (µg/mL) Waktu (menit) 5 15 25 5 0,8259 0,7533 0,5337 10 0,8163 0,7283 0,4523 15 0,8037 0,6799 0,4101 20 0,7982 0,6569 0,3749 25 0,7987 0,6001 0,3623 30 0,7989 0,5892 0,3469 35 0,7991 0,5899 0,3466 40 0,7994 0,5898 0,3465 45 0,7990 0,5898 0,3468 50 0,7988 0,5891 0,3464 55 0,7987 0,5889 0,3467 60 0,7989 0,5893 0,3466 OT yang didapat 35 menit

(112) 93 3. Penentuan Operating Time ekstrak metanolik umbi bidara upas (λ 517 nm) Replikasi 1 Konsentrasi ekstrak metanolik (µg/mL) Waktu (menit) 100 300 500 5 0,8588 0,6772 0,4145 10 0,8468 0,6508 0,4005 15 0,8301 0,6353 0,3867 20 0,8049 0,6214 0,3506 25 0,7942 0,6001 0,3187 30 0,7940 0,5897 0,2985 35 0,7939 0,5896 0,2985 40 0,7937 0,5895 0,2984 45 0,7937 0,5896 0,2895 50 0,7938 0,5895 0,2985 55 0.7939 0,5897 0,2985 60 0,7939 0,5897 0,2984 OT yang didapat 30 menit

(113) 94 Replikasi 2 Konsentrasi ekstrak metaolik (µg/mL) Waktu (menit) 100 300 500 5 0,8546 0,6693 0,4239 10 0,8330 0,6525 0,4117 15 0,8049 0,6463 0,4108 20 0,7874 0,6359 0,3336 25 0,7866 0,6172 0,2937 30 0,7867 0,5861 0,2934 35 0,7867 0,5859 0,2932 40 0,7865 0,5858 0,2932 45 0,7866 0,5857 0,2931 50 0,7866 0,5857 0,2933 55 0,7867 0,5858 0,2931 60 0,7867 0,5857 0,2931 OT yang didapat 30 menit

(114) 95 Replikasi 3 Konsentrasi ekstrak metanolik (µg/mL) Waktu (menit) 100 300 500 5 0,8842 0,6835 0,4337 10 0,8533 0,6632 0,3922 15 0,8496 0,6479 0,3900 20 0,8187 0,6394 0,3725 25 0,7983 0,6183 0,3251 30 0,7953 0,5980 0,3129 35 0,7953 0,5980 0,3130 40 0,7954 0,5979 0,3129 45 0,7955 0,5981 0,3128 50 0,7954 0,5981 0,3131 55 0,7952 0,5980 0,3130 60 0,7954 0,5981 0,3129 OT yang didapat 30 menit

(115) 96 Lampiran 13. Uji aktivitas antioksidan dengan radikal DPPH % IC = 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 (𝑙𝑙𝐴𝐴𝐴𝐴𝑙𝑙𝑙𝑙𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑘𝑘𝐴𝐴𝐴𝐴𝑙𝑙𝐴𝐴𝐴𝐴𝑙𝑙 )− 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 (𝐴𝐴𝐴𝐴𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑠𝑙𝑙 ) 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 (𝑙𝑙𝐴𝐴𝐴𝐴𝑙𝑙𝑙𝑙𝐴𝐴𝐴𝐴 𝑘𝑘𝐴𝐴𝐴𝐴𝑙𝑙𝐴𝐴𝐴𝐴𝑙𝑙 ) 1. Rutin Replikasi Konsentrasi rutin (μg/mL) 5 Absorbansi kontrol DPPH Absorbansi larutan pembanding 0,7880 12,1614 0,6992 22,0600 0,5887 34,3774 20 0,4950 44,8222 25 0,3978 55,6571 5 0,7757 13,4553 10 0,6786 24,2887 0,5685 36,5726 20 0,4656 48,0531 25 0,3599 59,8460 5 0,7944 11,6155 10 0,6817 24,1544 0,5899 34,3680 20 0,4867 45,8500 25 0,3784 57,8994 10 1 2 3 15 0,8971 15 0,8963 15 0,8988 Contoh perhitungan % IC replikasi 1 Konsentrasi 5 µg/mL % IC = x 100% 0,8971−0,7880 0,8971 x 100% Konsentrasi 10 µg/mL = 12,1614 % % IC

(116) 97 % IC = 0,8971−0,6992 0,8971 x 100% = 22,0600 % Konsentrasi 15 µg/mL % IC = 0,8971−0,5887 0,8971 x 100% = 34,3774 % Konsentrasi 20 µg/mL % IC = 0,8971−0,4950 0,8971 x 100% = 44,8222 % Konsentrasi 25 µg/mL % IC = 0,8971−0,3978 0,8971 x 100% = 55,6571 % 2. Ekstrak metanolik umbi bidara upas Replikasi Konsentrasi ekstrak (μg/mL) 100 Absorbansi Absorbansi kontrol DPPH 0,7814 11,5563 0,6613 25,1500 0,5398 38,9021 400 0,4209 52,3599 500 0,3096 64,9576 100 0,7823 11,7342 200 0,6754 23,7956 0,5435 38,6776 400 0,4238 52,1832 500 0,2982 66,3545 100 0,7947 10,8581 200 0,6861 23,0398 0,5624 36,9153 400 0,4298 51,7891 500 0,3106 65,1598 200 1 2 3 % IC 300 300 300 0,8835 0,8863 0,8915

(117) 98 Contoh perhitungan % IC replikasi 1 Konsentrasi 100 μg/mL % IC = 0,8835−0,7814 0,8835 x 100% = 11,5563 % Konsentrasi 200 μg/mL % IC = 0,8835−0,6613 0,8835 x 100% = 25,1500 % Konsentrasi 300 μg/mL % IC = 0,8835−0,5398 0,8835 x 100% = 38,9021 % Konsentrasi 400 μg/mL % IC = 0,8835−0,4209 0,8835 x 100% = 52,3599 % Konsentrasi 500 μg/mL % IC = 0,8835−0,3096 0,8835 x 100% = 64,9576 %

(118) 99 Lampiran 14. Perhitungan IC50 rutin dan ekstrak metanolik umbi bidara upas 1. Rutin Replikasi 1 2 3 Konsentrasi rutin (μg/mL) 5 12,1614 10 22,0600 15 34,3774 20 44,8222 25 55,6571 5 13,4553 10 24,2887 15 36,5726 20 48,0531 25 59,8460 5 11,6155 10 24,1544 15 34,3680 20 45,8500 25 57,8994 Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 2,1951x + 0,8895 50 = 2,1951x + 0,8895 x = 22,3728 µg/mL Nilai IC50 = 22,3728 µg/mL % IC Persamaan regresi linear y = 2,1951x + 0,8895 r = 0,9996 y = 2,3309x + 1,4794 r = 0,9999 y = 2,2853x + 0,4984 r = 0,9996

(119) 100 Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 2,3323x + 1,4794 50 = 2,3309x + 1,4794 x = 20,8163µg/mL Nilai IC50 = 20,8163 µg/mL Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 2,2853x + 0,4984 50 = 2,2853x + 0,4984 x = 21,6609 µg/mL Nilai IC50 = 21,6609 µg/mL SD 22,3728 � (µg/mL) 𝒙𝒙 � ± SD 𝒙𝒙 2 20,8163 21,6 0,7 21,6 ± 0,7 3 21,6609 Replikasi IC50 (µg/mL) 1

(120) 101 2. Ekstrak metanolik umbi bidara upas Konsentrasi Replikasi ekstrak % IC Persamaan regresi linear (μg/mL) 1 2 3 100 11,5563 200 25,1500 300 38,9021 400 52,3599 500 64,9576 100 11,7342 200 23,7956 300 38,6776 400 52,1832 500 66,3545 100 10,8581 200 23,0398 300 36,9153 400 51,7891 500 65,1598 Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 0,1340x - 1,6186 50 = 0,1340x - 1,6186 x = 385,2134 µg/mL Nilai IC50 = 385,2134 µg/mL y = 0,1340x - 1,6186 r = 0,9999 y = 0,1376x - 2,7394 r = 0,9996 y = 0,1374x - 3,6534 r = 0,9995

(121) 102 Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 0,1376x - 2,7394 50 = 0,1376x - 2,7394 x = 383,2805 µg/mL Nilai IC50 = 383,2805 µg/mL Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 0,1374x - 3,653 50 = 0,1374x - 3,653 x = 390,4905 µg/mL Nilai IC50 = 390,4905 µg/mL SD 385,2134 � (µg/mL) 𝒙𝒙 � ± SD 𝒙𝒙 2 383,2805 386,3 3,7 386,3 ± 3,7 3 390,4905 Replikasi IC50 (µg/mL) 1

(122) 103 Lampiran 15. Hasil uji statistik dengan program R 3.0.2 1. Uji normalitas 2. Uji varian data 3. Uji t-test

(123) 104 BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH (1,1-DIPHENYL-2-PICRYLHYDRAZYL) Ekstrak Metanolik Umbi Bidara Upas (Merremia mammosa (Lour) Hallier f.)” memiliki nama lengkap Desi Irwanta Kate. Penulis lahir pada tanggal 10 Desember 1991 di Wamena, Papua. Penulis merupakan anak keempat dari pasangan Bapak Yacob Kate dan Ibu Martha Pindan. Pendidikan formal yang telah ditempuh oleh penulis: SD Inpres Mulele Wamena (1999-2004), SMP Negeri 2 Wamena (2004-2007), SMA Bopkri 1 Yogyakarta (2007-2010). Penulis kemudian melanjutkan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta (2010-2014). Selama menjalani masa perkuliahan, penulis aktif dalam kegiatan organisasi seperti menjadi Bendahara dan anggota seksi Advokasi Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas (DPMF) serta anggota Herbal Garden Team (HGT), selain itu penulis juga terlibat dalam beberapa kegiatan kepanitiaan seperti: Co. Acara kegiatan Pelepasan Wisuda “You’ll Never Walk Alone” (2011); Co. Acara kegiatan Komisi Pemilihan Umum Gubernur BEMF & Ketua DPMF Farmasi (2012); Co. Acara kegiatan Aksi Hari Kesehatan dan Lingkungan Hidup SD Pangudi Luhur Yogyakarta (2012), Anggota tim kegiatan Pemeriksaan Kesehatan bagi Karyawan, Dosen dan Masyarakat pada Dies Natalis ke-56 USD Yogyakarta (2012); Sie. Dana dan Usaha kegiatan Pelepasan Wisuda “Mengukir Kenangan Menggapai Harapan”(2011); Sie. Pendamping Kota kegiatan Temu Alumni Akbar “Farmasiku, Farmasimu, Farmasi Kita Semua”(2012), Volunteer kegiatan Kampanye Informasi Obat”(2010) dan menjadi Asisten Dosen pada praktikum Botani Farmasi (2012,2013); praktikum Biofarmasetika (2014).

(124)

Dokumen baru

Tags

Dokumen yang terkait

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL UMBI BIDARA UPAS (Merremia mammosa Chois) TERHADAP Staphylococcus aureus DAN Escherichia coli SERTA BRINE SHRIMP LETHALITY TEST.
0
2
22
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar SARJANA PENDIDIKAN
0
0
14
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Pendidikan
0
1
15
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Pendidikan
0
1
26
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Pendidikan
0
0
14
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Pendidikan
0
0
16
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
0
165
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Ekonomi Program Studi Akuntansi
1
1
100
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
0
145
LOWONGAN KERJA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Teknik Informatika
0
0
168
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
0
92
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
1
187
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
0
148
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE DPPH (1,1- DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOLIK BAWANG DAUN ( Allium fistulosum L.)
0
0
107
SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Psikologi Program Studi Psikologi
0
0
159
Show more