Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ekstrak metanolik akar apu-apu (pistia stratiotes l.) - USD Repository

Gratis

0
0
120
9 months ago
Preview
Full text
(1)PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) EKSTRAK METANOLIK AKAR APU-APU (Pistia stratiotes L.) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi Oleh: Eunike Yosefina Kurniawan NIM : 108114133 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014

(2) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) EKSTRAK METANOLIK AKAR APU-APU (Pistia stratiotes L.) SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi Oleh: Eunike Yosefina Kurniawan NIM : 108114133 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014 i

(3) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Persetujuan Pembimbing PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) EKSTRAK METANOLIK AKAR APU-APU (Pistia stratiotes L.) Skripsi yang diajukan oleh: Eunike Yosefina Kurniawan NIM : 108114133 telah disetujui oleh : Pembimbing Utama (Yohanes Dwiatmaka, M.Si) 29 April 2014 ii

(4) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Pengesahan Skripsi Berjudul PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) EKSTRAK METANOLIK AKAR APU-APU (Pistia stratiotes L.) Oleh : Eunike Yosefina Kurniawan NIM : 108114133 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal : ........................... Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Dekan (Ipang Djunarko, M.Sc., Apt.) Panitia Penguji : Tanda tangan 1. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. ................................. 2. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt ................................. 3. Jeffry Julianus, M.Si. ................................ iii

(5) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN “Enjoy the little things, for one day you may look back and they were the big things.” (Robert Brault) “You’re better than others may think. Not as clever as pride suggest. Have more potential than you can imagine. Gifted by God’s design!” (Ps. Brian Houston) Lakukan segala sesuatu seperti untuk Tuhan, bukan untuk manusia Untuk segala sesuatu yang terjadi dalam hidupku, tidak ada alasan untuk mengatakan bahwa Tuhan Yesus tidak baik. Tuhan Yesus selalu baik dan sangat baik, sekalipun dalam keadaan terburukku. Tuhan Yesus mempunyai jalanNya sendiri untuk menyatakan kemuliaan dan keajaibanNya dalam hidupku. Kupersembahkan skripsi ini untuk : Tuhan Yesus Kristus ~ My Father, my Light, my Alpha and Omega, my Beginning and End, my Saviour, my Redeemer, my Baptiser, my Deliverer Papa Yusuf, Mama Anny, dan Adik Ellihu Yona Kurniawan ~ Satu-satunya intuisi yang ku tahu berhasil adalah keluarga. Hal lain bisa mengubahku, tapi aku bermula dan berakhir bersama keluarga. Semua keluarga besar dan sahabat-sahabat yang selalu mendukung, membantu, dan mendoakanku iv

(6) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PERNYATAAN KEASLIAN KARYA Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundangundangan yang berlaku. Yogyakarta, 28 April 2014 Penulis Eunike Yosefina Kurniawan v

(7) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Eunike Yosefina Kurniawan Nomor mahasiswa : 108114133 Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : “PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) EKSTRAK METANOLIK AKAR APU-APU (Pistia stratiotes L.)” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Dengan demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : Yang menyatakan (Eunike Yosefina Kurniawan) vi

(8) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa karena berkat dan kasih-Nya yang melimpah sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH (1,1-Diphenil-2-Picrylhydrazyl) Ekstrak Metanolik Akar Apu-apu (Pistia stratiotes L.)”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar sarjana farmasi (S.Farm) program studi Farmasi di Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Penulis menyadari bahwa selama penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari batuan dan dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada : 1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc.,Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Fakultas Sanata Dharma 2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan bantuan dan bimbingan selama rancangan, pengusulan skripsi, pelaksanaan penelitian, dan penulisan skripsi dengan penuh perhatian dan kesabaran. 3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang menguji serta memberi arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis. 4. Bapak Jeffry Julianus, M.Si., selaku Dosen Penguji yang menguji serta memberi arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis. xvii

(9) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5. Ibu C.M. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm., Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah mendidik , mengarahkan, dan memberi nasihat-nasihat positif. 6. Keluarga (Papa, Mama, adik tersayang) atas kasih sayang, pengorbanan, dukungan, bantuan, dan doa yang telah diberikan kepada penulis, baik secara moral maupun materil. 7. Segenap laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia (Mas Wagiran), Laboratorium Biokimia (Mas Kayat), dan Laboratorium Kebun Obat Fakultas Farmasi Sanata Dharma (Mas Andri) atas segala bantuan untuk penulis selama pelaksanaan penelitian. 8. Nessya Trivianni, sahabat sekaligus teman seperjuangan dalam penyelesaian skripsi atas semangat,dukungan, masukan, kritik, canda tawanya, dan kesediaan untuk berbagi. 9. Desi Irwanta Kate, atas kesediaannya untuk saling membantu selama pelaksanaan skripsi hingga skripsi ini terselesaikan dengan baik. 10. Eliza Telamiana, Chrisilia Cahyani, dan Baktiman Ande, atas semangat, dukungan, masukan, canda tawa, dan doanya, terutama selama empat tahun ini. 11. Teman-teman FST B 2010, atas kerjasama, kekompakan, canda tawa, semangat, kritik, saran, dan doanya. 12. Teman-teman kos Amakusa (Tante Hertil, Seruni, Rina, Ratri, Indah, Friesca) atas semangatnya, bantuannya, canda tawanya, dan doanya. xviii

(10) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 13. Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak kesalahan dan kekurangan dan jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir kata, penulis berharap agar skripsi ini dapat berguna bagi pembaca dan pengembangan ilmu pengetahuan, khususnya di bidang farmasi. Yogyakarta, 28 April 2014 Penulis xix

(11) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL..................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................... v LEMBAR PERNYATAAN .......................................................................... vi PRAKATA .................................................................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................. x DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xvi INTISARI...................................................................................................... xvii ABSTRACT .................................................................................................... xviii BAB I PENGANTAR ................................................................................... 1 A. Latar Belakang .................................................................................. 1 1. Permasalahan............................................................................... 5 2. Keaslian penelitian ...................................................................... 5 3. Manfaat penelitian ....................................................................... 5 B. Tujuan Penelitian .............................................................................. 6 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA............................................................ 7 A. Apu-apu ............................................................................................. 7 xx

(12) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 1. Taksonomi ................................................................................... 7 2. Nama daerah................................................................................ 7 3. Morfologi .................................................................................... 7 4. Deskripsi habitat.......................................................................... 8 5. Kegunaan..................................................................................... 8 6. Kandungan kimia ........................................................................ 9 B. Senyawa Fenolik ............................................................................... 9 C. Penyarian ........................................................................................... 10 D. Metode Folin Ciocalteu ..................................................................... 11 E. Radikal Bebas.................................................................................... 12 F. Antioksidan ....................................................................................... 12 1. Definisi ........................................................................................ 12 2. Uji aktivitas antioksidan.............................................................. 13 G. Metode DPPH ................................................................................... 14 H. Landasan Teori .................................................................................. 15 I. Hipotesis............................................................................................ 16 BAB III METODOLOGI PENELITIAN...................................................... 17 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................ 17 B. Variabel dan Definisi Operasional .................................................... 17 1. Variabel ....................................................................................... 17 2. Definisi operasional .................................................................... 18 C. Bahan Penelitian................................................................................ 19 D. Alat Penelitian ................................................................................... 19 xxi

(13) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI E. Tata Cara Penelitian .......................................................................... 20 1. Determinasi tanaman ................................................................... 20 2. Pengumpulan bahan .................................................................... 20 3. Preparasi akar apu-apu ................................................................ 20 4. Pembuatan larutan pembanding dan uji ...................................... 21 5. Uji pendahuluan .......................................................................... 22 6. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ................. 23 7. Penetapan kandungan fenolik total ............................................. 24 8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan .................................. 24 9. Uji aktivitas antioksidan.............................................................. 25 F. Analisis Hasil .................................................................................... 26 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 28 A. Hasil Determinasi Tanaman .............................................................. 28 B. Hasil Pengumpulan Bahan ................................................................ 28 C. Hasil Pembuatan Ekstrak Metanolik Akar Apu-apu ......................... 29 D. Hasil Uji Pendahuluan Akar Apu-apu .............................................. 33 1. Uji pendahuluan senyawa fenolik ............................................... 33 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ........................................ 35 E. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total .......... 36 1. Penentuan operating time (OT) ................................................... 36 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum .................... 38 F. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total ....................................... 39 G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ........................... 44 xxii

(14) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 1. Penentuan operating time (OT) ................................................... 44 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum .................... 46 H. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan ........................................................ 47 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 58 A. Kesimpulan ....................................................................................... 58 B. Saran .................................................................................................. 58 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 59 LAMPIRAN .................................................................................................. 64 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 101 xxiii

(15) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum asam galat yang direaksikandengan reagen Folin-Ciocalteu .............................................................. 39 Tabel II. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang telah direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu ............. 42 Tabel III. Hasil penetapan kandungan fenolik total ekstrak metanolik akar apu-apu ................................................. 43 Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang maksimum DPPH ............. 47 Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan menggunakan metode DPPH ............................................................................ 51 Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak metanolik akar apu-apu dengan menggunakan metode DPPH ........................................ 53 Tabel VII. Hasil perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu ............................................................................... 54 Tabel VIII. Penggolongan kekuatan aktivitas antioksidan rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu dengan metode DPPH...... 55 xxiv

(16) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Hasil uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik ................... 34 Gambar 2. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan ................................ 36 Gambar 3. Grafik penentuan OT asam galat replikasi 2 ............................... 38 Gambar 4. Struktur asam galat ...................................................................... 40 Gambar 5. Reaksi asam galat dengan senyawa molybdenum dari reagen Folin-Ciocalteu ......................................................... 41 Gambar 6. Kurva persamaan regresi linear asam galat replikasi 2 ............... 43 Gambar 7. Grafik penentuan OT rutin replikasi 1 ........................................ 45 Gambar 8. Grafik penentuan OT ekstrak metanolik akar apu-apu replikasi 3 .............................................................. 45 Gambar 9. Struktur rutin ............................................................................... 49 Gambar 10. Reaksi antara rutin dengan senyawa radikal DPPH .................. 49 Gambar 11. Kurva persamaan regresi linear rutin replikasi 2 ...................... 50 Gambar 12. Kurva persamaan regresi linear ekstrak metanolik akar apu-apu replikasi 1 ............................................................. 52 Gambar 13. Histogram perbandingan IC50 rutin dengan ekstrak metanolik akar apu-apu ............................................................. 56 xxv

(17) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman apu-apu (Pistia stratiotes L.) ................................................................. 64 Lampiran 2. Gambar tanaman apu-apu di Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.......................... 65 Lampiran 3. Perhitungan rendemen .............................................................. 66 Lampiran 4. Penimbangan penetapan kadar fenolik total ............................. 67 Lampiran 5. Scanning kontrol asam galat ..................................................... 68 Lampiran 6. Data optimasi penetapan kandungan fenolik total .................... 69 Lampiran 7. Penetapan kandungan fenolik total ........................................... 72 Lampiran 8. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan ....... 78 Lampiran 9. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji ......................................... 79 Lampiran 10. Scanning absorbansi larutan pengkoreksi............................... 84 Lampiran 11. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan.............................. 86 Lampiran 12. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH .......... 91 Lampiran 13. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu ............................................................................ 95 Lampiran 14. Uji statistik.............................................................................. 98 xxvi

(18) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI INTISARI Antioksidan merupakan senyawa yang dapat memutus jalannya reaksi radikal bebas. Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh maupun lingkungan. Salah satu tanaman yang diketahui mengandung senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan adalah apu-apu (Pistia stratiotes L.). Bagian tananman yang digunakan adalah bagian akarnya. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kadar fenolik total dan aktivitas antioksidan dari ekstrak metanolik akar apu-apu. Penetapan kadar fenolik total dilakukan dengan menggunakan pereaksi FolinCiocalteu yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g ekstrak metanolik akar apu-apu). Prinsip metode ini adalah reaksi reduksi oksidasi. Senyawa fenolik akan teroksidasi sedangkan perekasi Folinciocalteu akan tereduksi sehingga terbentuk kompleks berwarna biru. Larutan tersebut dapat diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer visibel pada λ 760,5 nm. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan radikal 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Nilai aktivitas antioksidan dinyatakan dalam Inhibition Concentration 50 (IC50) yang menyatakan konsentrasi senyawa antioksidan yang dibutuhkan untuk menetralkan 50% senyawa radikal bebas. Aktivitas senyawa antioksidan yaitu menyumbang elektronnya pada senyawa radikal DPPH yang menyebabkan perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak metanolik akar apu-apu memiliki kandungan fenolik total sebesar (0,3023 ± 0,0094) mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik akar apu-apu, serta aktivitas antioksidan yang tergolong lemah dengan nilai IC50 sebesar (433,0627 ± 2,6777) µg/ml. Kata kunci: antioksidan, Pistia stratiotes L., ekstrak metanolik akar apu-apu, DPPH, kadar fenolik total, IC50 xxvii

(19) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ABSTRACT Antioxidant is a chemical compound that can break free radical reaction. Free radical can come from our body or environment. One of plants which is known has potential antioxidant activity is water lettuce (Pistia stratiotes L.) root. This research was conducted to determine the total phenolic content and antioxidant activity of methanolic extract of water lettuce root. Determination of total phenolic content used Folin-Ciocalteu reagent that expressed as equivalent mass of Gallic acid. The principle of this method is reduction and oxidation reaction. Phenolic compounds would be oxidated and the Folin-Ciocalteu reagent would be reduced made a blue complex solution. The solution could be measured by visible spectrophotometer at λ 760.5 nm. Test of antioxidant activity used a radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Antioxidant activity was expressed as Inhibition Concentration 50 (IC50) that showed the amount of antioxidant compound to neutralize 50% of free radical compound. Antioxidant will give its electron for free radical compound DPPH and caused discolouration from violet become yellow. The result showed that the methanolic extract of water lettuce root has total phenolic content of (0.3023 ± 0.0094) mg galic acid equivalent per gram of methanolic extract of water lettuce root and a weak antioxidant activity with IC50 of (433.0627 ± 2.6777) µg/ml. Keywords: antioxidant, Pistia stratiotes L., methanolic extract of water lettuce root, DPPH, total phenolic content, IC50. xxviii

(20) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Dewasa ini polusi dan keadaan lingkungan yang semakin memburuk juga memberikan efek yang buruk bagi tubuh kita. Efek buruk lingkungan dan polusi mudah untuk berinteraksi dengan bagian tubuh terutama kulit yang merupakan bagian terluar tubuh. Padahal polutan yang ada banyak mengandung senyawa radikal bebas. Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron bebas yang tidak berpasangan. Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh maupun dari lingkungan. Radikal bebas dari dalam tubuh dihasilkan melalui proses metabolisme, fagositosis yang terjadi dalam mitokondria, retikulum endoplasma, dan sitosol. Radikal bebas reaktif melakukan reaksi oksidasi patogenik terhadap sel atau komponennya, sehingga dapat menyebabkan disfungsi atau mutasi yang berakibat pada timbulnya penyakit degeneratif, seperti kanker, penyakit kardiovaskular, kerusakan hati, dan penuaan dini (Winarsi, 2007). Senyawa radikal dapat mengoksidasi lemak dalam tubuh. Bila lemak yang teroksidasi ada dalam jumlah yang banyak dapat menyebabkan terbentuknya plak pada sel-sel penyusun sistem kardiovaskular. Plak tersebut juga menjadi gejala aterosklerosis. Bila yang teroksidasi adalah LDL dapat bersifat sitotoksis dan merusak sel endotelial (Lobo, et al., 2010). 1

(21) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2 Selain menyebabkan penyakit kardiovaskular, jenis radikal bebas Reactive Oxygen Species (ROS) dan Reactive Nitrogen Species (RNS) juga dapat menyebabkan terjadinya karsinogenesis. Baik ROS maupun RNS dapat menyebaban kerusakan DNA dengan cara memutus double strand DNA melalui modifikasi pada basa DNA dan DNA protein cross-link. Senyawa radikal biasanya akan menambahkan basa pirimidin dan mengganggu gugus gula pada DNA sehingga dapat menyebabkan mutagenesis sel dan karsinogenesis lemak peroksida (Lobo, et al., 2010). Efek buruk lainnya dari radikal bebas yaitu terjadinya aging atau penuaan dini. Penuaan dini sendiri sebenarnya disebabkan oleh semakin banyaknya penyakit atau kelainan fungsional pada tubuh. Akumulasi dari kerusakan seluler atau fungsional serta kerusakan pada DNA. Pada umumnya kerusakan yang terjadi pada DNA disebabkan karena adanya oksidasi pada asam amino penyusun DNA. Oksidasi pada asam-asam amino penyusun DNA menyebakan terjadinya modifikasi protein DNA. Protein DNA yang rusak dapat mengandung gugus yang reaktif yang dapat menyebabkan terjadinya kerusakan pada membran sel dan fungsi sel lainnya (Lobo, et al., 2010). Radikal bebas yang terdapat di dalam tubuh dapat dihentikan reaksinya dengan suatu senyawa, yaitu antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat memutus jalannya reaksi radikal bebas, sehingga dapat mencegah agar selsel tubuh yang masih sehat tidak menjadi rusak (Hernani dan Rahardjo, 2005). Antioksidan banyak terdapat di alam dalam berbagai jenis tanaman.

(22) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3 Apu-apu merupakan salah satu jenis tanaman air. Sering juga disebut sebagai kol air atau kiapu. Dalam bahasa Inggris sering disebut water lettuce karena memiliki kemiripan dengan lettuce. Bentuknya menyerupai kol yang mengapung di atas air. Apu-apu termasuk salah satu floating plant yang banyak ditanam untuk penyemarak bagian tengah kolam atau sebagai cover ground. Tanaman ini berwarna hijau dengan akar yang tenggelam di bawah permukaan air (Emir, 2000). Tanaman apu-apu menurut Tripathi, et al. (2010), apu-apu mengandung glikosida, alkaloid, flavonoid, dan steroid Menurut Karim, et al. (2014), apu-apu mengandung tanin, flavonoid, glikosida, dan alkaloid. Penetapan kadar fenolik total dalam akar apu-apu dilakukan dalam penelitian ini karena kandungan senyawa-senyawa fenolik pada tanaman apu-apu hanya dijelaskan secara keseluruhan bagian tanaman, tidak spesifik pada bagian akar saja. Senyawa flavonoid dan tanin tersebut juga memiliki potensi sebagai senyawa antioksidan, sehingga perlu dilakukan uji aktivitas senyawa antioksidan untuk mengetahui tanaman apu-apu memiliki aktivitas antioksidan atau tidak. Pada umumnya, senyawa flavonoid, tanin, dan polifenol banyak terkandung pada bagian daun. Menurut Ho (2011), daun apu-apu telah terbukti memiliki aktivitas antioksidan dengan IC50 yang cukup besar yaitu >2000 µg/mL. Menurut Jha (2010), daun apu-apu juga memiliki aktivitas antioksidan terhadap radikal superoksid anion dengan IC50 sebesar 26 µg/mL. Oleh karena itu, pada penelitian ini ingin mengetahui apakah akar juga mengandung senyawa fenolik dan mampu memberikan aktivitas antioksidan.

(23) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 4 Prinsip penetapan kandungan fenolik total yaitu reaksi oksidasi-reduksi pada suasana basa menggunakan reagen Folin-Ciocalteu yang akan direduksi oleh ion fenolat dari sampel, sedangkan metode uji aktivitas antiokasidan yang digunakan yaitu metode DPPH (1,1 Diphenyl-2-picrylhidrazyl). DPPH berfungsi sebagai senyawa radikal bebas, di mana bila elektron bebasnya tertangkap dan berikatan akan menyebabkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning. Parameter uji aktivitas antioksidan dilihat melalui nilai IC50, yaitu konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% konsentrasi DPPH atau radikal bebas mulamula (Sunarni, 2005). Metode DPPH memiliki beberapa macam keuntungan, antara lain pengerjaannya yang memakan waktu lebih singkat dan lebih sederhana dibandingkan dengan metode lainnya. Selain itu, menurut Atanassova, Georgieva, dan Ivancheva (2011), metode DPPH telah terbukti reprodusibilitasnya. Radikal DPPH yang digunakan juga tidak memerlukan preparasi khusus dan risiko degradasi thermal cukup kecil. Menurut Apak, et al. (2013), reaksi yang terjadi antara senyawa antioksidan dengan radikal DPPH berjalan cukup lambat sehingga dapat diamati untuk penelitian eksperimental melalui perubahan absorbansi dan warna. Senyawa-senyawa yang terkandung dalam apu-apu masih belum diketahui secara pasti persentasenya secara spesifik, maka penetapan kadar fenolik total dan uji aktivitas antioksidan dilakukan pada ekstrak metanolik akar apu-apu. Metanol dipilih sebagai cairan penyari karena tergolong pelarut yang

(24) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5 memiliki sifat polar sehingga diharapkan mampu melarutkan sebagian besar senyawa fenolik dalam akar apu-apu yang juga bersifat polar. 1. Permasalahan a. Berapa kandungan fenolik total pada ekstrak metanolik akar apu-apu? b. Berapa nilai aktivitas antioksidan yang dinyatakan dalam nilai IC50 dari ekstrak metanolik akar apu-apu menggunakan metode DPPH? 2. Keaslian penelitian Sejauh penelusuran penulis, telah dilakukan penelitian tentang tanaman apu-apu, antara lain uji aktivitas antioksidan dan penetapan kandungan fenolik pada daun aou-apu terhadap DPPH secara in vitro oleh Ho, et al. (2011), evaluasi aktivitas antioksidan pada daun apu-apu oleh Jha, Ganesh, dan Sharma (2010). Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH dan penetapan kadar fenolik total pada akar tanaman apu-apu belum pernah dilakukan. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Hasil penelitian diharapkan mampu memberi tambahan ilmu pengetahuan tentang nilai IC50 akar apu-apu yang menunjukkan aktivitas antioksidan akar apu-apu dengan metode DPPH.

(25) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 6 b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat mengenai penggunaan akar apu-apu sebagai salah satu antioksidan. B. Tujuan Penelitian 1. Mengetahui kandungan fenolik total ekstrak metanolik akar apu-apu. 2. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak metanolik akar apu-apu yang dinyatakan dalam nilai IC50 dengan metode DPPH.

(26) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Apu-apu 1. Taksonomi Klasifikasi tanaman apu-apu menurut ITIS (2014) sebagai berikut : Kerajaan : Plantae Sub kerajaan : Tracheobionta Super divisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Ordo : Arales Famili : Araceae Genus : Pistia Spesies : Pistia stratiotes L. 2. Nama daerah Indonesia : apu-apu, kiapu, kol air 3. Morfologi Tanaman apu-apu memiliki bentuk yang menyerupai kol yang mengapung di permukaan air. Daunnya berwarna hijau, tidak berbau, dan memiliki rasa yang pahit. Panjang daunnya berkisar antara 13-17cm. Helai daunnya berbentuk kipas. Tinggi tanaman berkisar antara 5-10 cm (Tripathi, et al., 2010). 7

(27) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 8 Akar apu-apu menjuntai panjang. Bentuknya menyerupai rambut, berwarna coklat atau putih kotor, dan menggantug di bawah permukaan air. Saat umur tanaman cukup dewasa, muncul batang kecil dari ketiak daun yang tumbuh menjulur panjang. Pada ujungnya akan tumbuh anak apu-apu atau sering disbut runner. Anak apu-apu memiliki akar sendiri dan tumbuh sebagai tanaman baru (Emir, 2000). 4. Deskripsi habitat Tanaman apu-apu biasanya dapat ditemukan pada ketinggian 5-800m di atas permukaan laut. Apu-apu hidup pada perairan segar seperti danau dan sungai yang memiliki aliran air. Apu-apu dapat hidup pada suhu yang cukup ekstrim yaitu 15°C dan 35°C, namun tumbuh secara optimal pada suhu 22°C sampai 30°C (Rivers, 2002). 5. Kegunaan Apu-apu umum digunakan dalam pengobatan Ayurveda. Bagian tanaman yang banyak digunakan adalah bagian daunnya. Apu-apu dapat digunakan sebagai antiseptik, antituberkular, antidisentri, obat anemia, hematuria, dan penyakit ginjal. Selain itu, sari daun apu-apu juga dapat digunakan dalam pengobatan penyakit kulit. Akar apu-apu juga diketahui bersifat laksatif, dapat berperan sebagai emolien, dan diuretik (Tripathi, et al., 2010).

(28) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 9 6. Kandungan kimia Menurut Tripathi, et al. (2010), tanaman apu-apu mengandung glikosida, alkaloid, flavonoid, dan steroid Menurut Karim, et al. (2014), apu-apu mengandung tanin, flavonoid, glikosida, dan alkaloid. B. Senyawa Fenolik Senyawa fenolik dikenal sebagai salah satu senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan alami yang aman untuk digunakan. Hampir seluruh senyawa dalam golongan fenolik memiliki aktivitas antioksidan. Aktivitas antioksidan ini dapat terlihat dari kemampuan senyawa fenolik dalam mereduksi radikal bebas yang awalnya memiliki elektron bebas tak berpasangan menjadi stabil (Marxen, 2007). Senyawa fenolik sebenarnya merupakan metabolit sekunder yang mempunyai cincin aromatik yang berikatan dengan satu atau lebih substituent gugus hidroksi (OH) yang terbentuk melalui jalur metabolisme asam sikimat-fenil propanoid dan jalur asetat-polimalonat. Beberapa senyawa yang termasuk dalam kelompok fenolik adalah fenol sederhana, kumarin, tanin, saponin, flavonoid, dan masih ada lagi. Senyawa-senyawa tersebut biasanya berada dalam bentuk glikosida atau ester pada tanaman (Proestos, 2006). Golongan senyawa fenolik yang paling sering ditemui adalah flavonoid. Flavonoid merupakan senyawa polar karena memiliki sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih, atau suatu gula. Umumnya flavonoid larut dalam pelarut polar seperti air, etanol, metanol, aseton, dimetilsulfoksida, dan dimetilformamida. Gula

(29) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 10 yang terikat pada flavonoid (bentuk umum yang ditemukan) dapat membantu meningkatkan kelarutan flavonoid dalam air, sehingga dengan menggunakan campuran pelarut air dengan beberapa contoh pelarut polar lainnya yang disebutkan di atas dapat menjadi pelarut yang lebih baik untuk flavonoid khususnya glikosida. Sebaliknya, aglikon bersifat kurang polar seperti isoflavon, flavon, dan flavonol yang termetoksilasi. Mereka akan cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988). Golongan senyawa fenolik lainnya antara lain, asam fenolik, kumarin, dan flavonol. Asam fenolik yang sering ditemukan antara lain asam hydroxylbenzoic, dan yang tergolong di dalamnya antara lain asam galat, asam salisilat, dan asam vanillic. Kumarin merupakan senyawa fenolik dengan ranti C6-C3. lavonKumarin juga memiliki peranan dalam proses toleransi sinar UV yang masuk ke dalam tubuh. Flavonol juga merupakan senyawa fenolik, biasanya juga disebut dengan dihidroflavonol. Pada umumnya flavonol banyak ditemukan bersama tannin pada struktur kayu di tanaman (Vermerris dan Nicholson, 2008). C. Penyarian Penyarian merupakan proses pemisahan bahan baik secara fisika maupun kimia dari suatu campuran dengan menggunakan pelarut cair dengan menarik suatu zat atau beberapa zat yang terlarut dalam bahan yang tidak dapat terlarut dalam pelarut cair. Penyarian sering juga disebut sebagai ekstraksi. Hasil dari proses penyarian disebut ekstrak. Ekstrak yang diperoleh dari proses penyarian kemudian dipisahkan dari cairan pelarut disebut micella. Micella ini dapat

(30) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 11 digunakan dalam pembuatan bentuk sediaan jadi, atau dapat juga diubah menjadi bentuk siap pakai, seperti ekstrak cair, tinktura, atau bisa juga diproses lebih lanjut untuk dijadikan ekstrak kering (Agoes, 2009). Ada beberapa jenis penyarian, antara lain maserasi, perkolasi, infundasi, dan penyarian berkesinambungan. Penyari yang sering digunakan antara lain air, metanol, etanol, ataupun eter. Penyarian dengan metanol dan etanol biasanya menggunakan metode maserasi. Maserasi merupakan salah satu metode penyarian simplisia yang menggunakan berbagai macam pelarut yang dijaga agar selalu baru sampai seluruh bahan aktif terekstraksi secara keseluruhan (Agoes, 2009). D. Metode Folin Ciocalteu Metode Folin-Ciocalteu menggunakan reagen fenol Folin-Ciocalteu. Prinsip dari metode ini yaitu reaksi oksidasi gugus fenolik hidroksil. Pereaksi Folin Ciocalteu akan mengoksidasi senyawa fenolat serta akan mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks molybdenum-tungsten (Mo-W). Fenolat hanya terdapat dalam suatu basa, namun peraksi Folin-Ciocalteu ini tidak stabil dalam suasana basa (Verru, Kishor, dan Meenakshi, 2009). Metode Folin-Ciocalteu merupakan metode yang tidak spesifik untuk salah satu senyawa fenolik saja karena dapat mengukur keseluruhan kandungan fenolik dalam ekstrak. Folin Cioclateu merupakan reagen yang tidak stabil, sehingga mudah terdekomposisi dalam suasana basa alkali, oleh karena itu dalam metode Folin-Ciocalteu digunakan garam lithium atau garam karbonat untuk

(31) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 12 mencegah terjadinya dekomposisi reagen Folin Ciocalteu (Blainski, Lopes, dan Mello, 2013). E. Radikal Bebas Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang memiliki elektron bebas yang tak berpasangan (unpaired electron). Hal ini dapat dilihat misalnya pada air (H2O). Ikatan atom oksigen dengan hidrogen pada air merupakan ikatan kovalen, yaitu ikatan kimia yang timbul karena sepasang elektron dimiliki bersama (share) oleh dua atom (Suryohudoyo, 2013). Elektron yang tidak memiliki pasangan cenderung akan menarik elektron dari senyawa lainnya, sehingga elektron tersebut akan dimiliki bersama oleh dua atom atau senyawa dan terbentuk suatu senyawa radikal bebas baru yang lebih reaktif. Reaktivitas yang meningkat tersebut menyebabkan senyawa radikal bebas menjadi lebih mudah untuk menyerang sel-sel sehat dalam tubuh. Jika pertahanan tubuh lemah maka sel-sel tersebut menjadi sakit atau rusak (Hernani dan Rahardjo, 2005). Radikal bebas tersebut memiliki 2 sifat yaitu : 1. Reaktivitasnya yang tinggi karena akan cenderung menarik elektron dari senyawa yang lainnya lagi 2. Memiliki kemampuan untuk mengubah suatu molekul, atom, atau senyawa untuk menjadi suatu radikal baru (Sjabana dan Jovanovic, 2002).

(32) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 13 F. Antioksidan 1. Definisi Antioksidan merupakan senyawa yang memiliki pasangan elektron bebas yang dapat memutus jalannya reaksi dari radikal bebas dengan cara menyumbang elektronnya pada senyawa radikal bebas. Senyawa antioksidan dapat mencegah rusaknya sel normal, protein, dan lemak. Antioksidan dapat dibagi menjadi antioksidan endogen yang berasal dari dalam tubuh dan antioksidan eksogen berasal dari luar tubuh (Kumalaningsih, 2007). 2. Uji aktivitas antioksidan Uji aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan beberapa metode, baik secara kuantitaif maupun kualitatif. Uji aktivitas antioksidan secara kualitatif dilakukan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari suatu senyawa yang sering dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) atau dengan kromatografi kertas. Selain menggunakan metode tersebut, uji aktivitas antioksidan secara kuantitaif dapat pula dilakukan dengan menggunakan metode DPPH (Davidek, 1997). Prinsip pengukuran aktivitas antioksidan metode ini yaitu penangkapan elektron bebas dari senyawa radikal yang menyebabkan perubahan warna radikal DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Metode lain yang sering digunakan antara lain, metode Ferric-reducing antioxidant power (FRAP), Cupric ion reducing antioxidant capacity (CUPRAC), dan Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) (Badarinath, et al., 2010).

(33) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 14 Metode FRAP merupakan metode uji kolorimetri. Prinsip metode ini yaitu mengukur kemampuan antioksidan dalam plasma untuk mereduksi komplek ferric tripiridiltriazin atau bentuk Fe3+ yang berwarna biru menjadi bentuk Fe2+. Reduksi tersebut akan menyebabkan perubahan absorbansinya. Metode ini merupakan metode yang sederhana, cepat, dan tidak mahal, namun tidak dapat mendeteksi penstabilan radikal dengan transfer atom H (Badarinath, et al., 2010). Metode CUPRAC merupakan metode uji aktivitas antioksidan untuk antioksidan yang larut air. Prinsip metode ini yaitu reduksi reagen Cu (II)neucuproine oleh gugus –OH dari senyawa antioksidan. Metode ini membutuhkan waktu yang singkat, namun alat-alt yang digunakan mahal (Badarinath, et al., 2010). Metode TEAC juga merupakan salah satu metode uji aktivitas antioksidan. Prinsip dari metode ini yaitu mengukur kemampuan senyawa antioksidan untuk menangkal radikal 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiozoline-6sulfonic acid). Senyawa pembanding yang digunakan yaitu Trolox yang merupakan analog vitamin E larut air. Metode ini jarang digunakan karena tingkat reprodusibilitasnya yang rendah pada plasma (Badarinath, et al., 2010). G. Metode DPPH Metode DPPH merupakan salah satu metode yang paling sering dilakukan untuk uji aktivitas antioksidan suatu tanaman obat. Metode DPPH menggunakan radikal bebas 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Shivaprasad, et, al., 2005). DPPH merupakan suatu senyawa radikal nitrogen yang tidak stabil

(34) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 15 karena memiliki elektron yang tidak berpasangan yang menyebabkan DPPH memiliki sifat reaktif. DPPH akan mengalami reduksi melalui proses donasi hidrogen atau elektron sehingga warna DPPH dapat mengalami perubahan warna dari ungu menjadi kuning (Halliwell dan Gutteridge, 2000). Metode ini bertujuan untuk mengetahui parameter yang menunjukkan aktivitas antioksidan yaitu parameter konsekuensi yang ekuivalen dapat memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Parameter IC50 dapat diketahui dengan mengintepretasikan hasil uji dalam suatu data eksperimental (Molyneux, 2004). H. Landasan Teori Tanaman apu-apu memiliki bentuk yang menyerupai kol yang mengapung di permukaan air. Selain sebagai tanaman hias, apu-apu juga dapat digunakan sebagai tanaman obat herbal. Menurut Tripathi, et al. (2010), tanaman apu-apu mengandung glikosida, alkaloid, flavonoid, dan steroid Menurut Karim, et al. (2014), apu-apu mengandung tanin, flavonoid, glikosida, dan alkaloid. Metanol merupakan pelarut yang memiliki kepolaran yang lebih besar dibandingkan etanol sehingga dapat menarik senyawa-senyawa fenolik yang cenderung lebih polar. Oleh karena itu, ekstrak yang digunakan adalah ekstrak metanolik. Penetapan kandungan fenolik total tanaman apu-apu dilakukan dengan menggunakan reagen Folin-Ciocalteu yang akan mengoksidasi senyawa fenolat menjadi suatu kompleks molybdenum-tungsten (Verru, Kishor, dan Meenakshi, 2009).

(35) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 16 Senyawa radikal bebas merupakan senyawa yang memiliki elektron tidak berpasangan. Reaktifitas senyawa radikal bebas yang memiliki elektron yang tidak berpasangan akan meningkat, sehingga menyebabkan senyawa radikal bebas menjadi lebih mudah untuk menyerang sel-sel sehat dalam tubuh. Jika pertahanan tubuh lemah maka sel-sel tersebut menjadi sakit atau rusak (Hernani dan Rahardjo, 2005). Senyawa-senyawa fenolik memiliki potensi sebagai antioksidan. Antioksidan merupakan suatu senyawa yang memiliki pasangan elektron bebas yang dapat memutus jalannya reaksi dari radikal bebas dengan menyumbang elektronnya pada senyawa radikal bebas. Senyawa fenolik mempunyai cincin aromatik yang berikatan dengan satu atau lebih substituent gugus hidroksi (OH), di mana gugus OH tersebut mampu memberikan elektronya sehingga dapat menstabilkan senyawa radikal (Proestos, 2006). Oleh karena itu saat ini banyak dilakukan penelitian tentang tanaman yang dapat memberikan aktivitas antioksidan yang dapat memutus reaksi dari radikal bebas. Apu-apu merupakan salah satu tanaman yang perlu diteliti karena kandungan senyawa di dalamnya berpotensi memiliki aktivitas antioksidan. I. Hipotesis 1. Ekstrak metanolik akar apu-apu memiliki kandungan senyawa fenolik 2. Ekstrak metanolik akar apu-apu memiliki aktivitas antioksidan yang dinyatakan dalam nilai IC50.

(36) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap pola searah. Jenis penelititan adalah eksperimental karena penelititan ini mencari hubungan sebab akibat dari ekstrak metanolik akar apu-apu yang digunakan dengan nilai IC50 yang ditimbulkan. Rancangan acak yaitu pengambilan sampel akar apu-apu dilakukan secara acak, tidak ada proses pemilihan khusus. Penelitian ini juga menggunakan rancangan lengkap karena terdapat kontrol positif, kontrol negatif, dan kelompok perlakuan. Pola searah yaitu perlakuan yang diberikan sama pada semua kelompok, baik kelompok kontrol positif, kontrol negatif, dan kelompok perlakuan. B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel utama a. Variabel bebas : Variabel bebas dari penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak metanolik akar apu-apu. b. Variabel tergantung : Variabel tergantung dari penelitian ini adalah aktivitas antioksidan (IC50). 2. Variabel pengacau a. Variabel pengacau terkendali : cahaya matahari, karena pemanenan masih dapat dilakukan pagi hari sebelum matahari terlalu terik. 17

(37) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 18 b. Variabel pengacau tak terkendali : umur akar yang dipanen, karena apu-apu yang dipanen merupakan tanaman liar di kolam yang tidak diketahui waktu penanaman atau budidayanya. 3. Definisi operasional a. Akar apu-apu merupakan akar dari tanaman apu-apu yang dipanen dari kolam di Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, dengan jenis akar serabut, berwarna coklat, dengan panjang akar sekitar 27 cm. b. Ekstrak metanolik akar apu-apu adalah ekstrak kental hasil maserasi akar apu-apu segar yang dihaluskan menggunakan blender, dengan menggunakan metanol selama 48 jam, lalu diuapkan pelarutnya hingga membentuk suatu cairan kental berwarna coklat. c. Persen inhibition concentration (%IC) adalah suatu nilai yang dinyatakan dalam bentuk persen yang menyatakan kemampuan ekstrak metanolik akar apu-apu dalam menangkap radikal bebas DPPH. d. Inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi ekstrak metanolik akar apu-apu yang dapat menangkap 50% radikal bebas 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH).

(38) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 19 C. Bahan Penelitian 1. Bahan utama Bahan utama dalam penelitian ini yaitu akar apu-apu yang diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Senyawa uji yang digunakan, yaitu DPPH. 2. Bahan kimia Bahan kimia kualitas farmasetis yang digunakan dalam penelitian ini yaitu akuades (Farmasi Sanata Dharma); bahan kimia kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA berupa rutin, reagen Folin-Ciaocalteu, dan asam galat; bahan kimia kualitas pro analitik E.Merck berupa metanol; serta bahan kimia kualitas teknis CV. General Labora berupa metanol. D. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain : blender (Maspion), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV mini-1240 UV-Vis Spektrofotometer), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), waterbath (labo-tech, Heraeus), vacuum rotary evaporator (BUCHI Rotavator R3), corong Buchner, pompa vacuum (GAST manufacturing inc. DOA-P604-BN), mikropipet 10-1000 µl, 1-10 ml (Acura 825, Socorex), tabung reaksi berpenutup, serta alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium (Pyrex-Germany dan Iwaki).

(39) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 20 E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Determinasi tanaman apu-apu yang diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta berdasarkan USDA (2014) dengan mencocokkan karakteristik tanaman apu-apu yang digunakan dengan gambar, taksonomi, dan keterangan kelompok tumbuhan, seperti monokotil dan dikotil, dari USDA (2014). 2. Pengumpulan bahan Bahan uji yang digunakan adalah akar apu-apu yang diperoleh dari kolam di Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada Januari 2014. Pemanenan dilakukan saat pagi hari untuk mengcegah kandungan metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman apu-apu agar tidak diolah menjadi metabolit lainnya dalam proses fotosintesis yang melibatkan cahaya matahari. 3. Preparasi akar apu-apu Akar apu-apu sebanyak 600 gram dibersihkan dari pengotor-pengotor dengan cara dicuci dengan air mengalir, kemudian diangin-anginkan. Akar apuapu yang telah cukup kering dihaluskan menggunakan blender dengan bantuan sedikit metanol sebagai cairan penyari. Akar yang telah halus dituang ke dalam bejana maserasi, lalu ditambahkan metanol hingga terendam sempurna. Maserasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruang. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan corong Buchner yang disambungkan dengan pompa vacuum.

(40) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 21 Ampas hasil maserasi pertama diremaserasi kembali selama 24 jam, lalu dilakukan penyaringan kembali. Filtrat hasil maserasi diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator, lalu dipekatkan di atas waterbath, dan oven pada suhu 40◦ C hingga diperoleh ekstrak metanol akar apu-apu dengan bobot tetap. Ekstrak metanolik akar apu-apu digunakan untuk analisis selanjutnya. 4. Pembuatan larutan pembanding dan uji a. Pembuatan larutan DPPH Sebanyak 15,8 mg DPPH dilarutkan hingga 100,0 mL dengan metanol, sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan ditutup dengan alumunium foil dan selalu dibuat baru. b. Pembuatan larutan stok rutin Sebanyak 2,5 mg rutin dilarutkan dengan metanol hingga 10,0 mL. c. Pembuatan larutan pembanding Larutan stok rutin diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5 mL kemudian metanol p.a ditambahkan hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 5; 10; 15; 20; dan 25 µg/mL. d. Pembuatan larutan uji i. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan. Sebanyak 25,0 mg ekstrak metanolik ditimbang, lalu metanol p.a ditambahkan hingga 25 mL. Larutan tersebut kemudian diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL, lalu ditambah dengan metanol hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100, 200, 300, 400 dan 500 µg/mL.

(41) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 22 ii. Larutan uji untuk penetapan kandungan fenolik total. Sebanyak 200 mg ekstrak metanolik ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 20000 µg/mL. e. Pembuatan larutan asam galat Larutan asam galat dibuat dengan konsentrasi 500 µg/mL dalam akuades dan metanol p.a dengan perbandingan 1:1 v/v. Larutan tersebut diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL, lalu ditambah dengan akuades : metanol p.a (1:1) ad hingga 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL. 5. Uji pendahuluan a. Uji fenolik Sebanyak 0,5 ml larutan uji dan larutan pembanding asam galat dengan konsentrasi 150,0 µg/mL masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan 2,5 mL reagen FolinCiaocalteu yang telah diencerkan dengan akuades dengan perbandingan 1:10 v/v dalam tabung reaksi. Campuran didiamkan selama 10 menit, lalu ditambah dengan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Warna larutan diamati secara visual dengan mata. b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing- masing tiga tabung reaksi, kemudian ke dalam masing-masing tabung

(42) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 23 reaksi ditambahkan 1,0 mL metanol p.a, larutan pembanding rutin 25 µg/mL, dan larutan uji 500,0 µg/mL. Campuran tersebut ditambah dengan 3 mL metanol p.a, lalu divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, warna larutan tersebut diamati secara visual dengan mata. 6. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total a. Penentuan operating time (OT) Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dengan konsentrasi 50, 100, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciaocalteu yang telah diencerkan dengan akuades dengan perbandingan 1:10 v/v. Setelah itu, 4,0 mL larutan natrium karbonat 1M ditambahkan dan dibaca serapannya menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 760 nm selama 30 menit. b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dengan konsentrasi 50, 100, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciaocalteu yang telah diencerkan dengan air dengan perbandingan 1:10 v/v. Setelah itu, sebanyak 4,0 mL larutan natrium karbonat 1M ditambahkan dan didiamkan selama operating time. Scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin Ciocalteu dilakukan pada rentang panjang gelombang 600-800 nm, di mana panjang gelombang teoritisnya yaitu 760 nm, sehingga masuk dalam rentang tersebut.

(43) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 24 7. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dengan konsentrasi 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciaocalteu yang telah diencerkan dengan air dengan perbandingan 1:10 v/v. Setelah itu, 4,0 mL larutan natrium karbonat 1M ditambahkan dan didiamkan selama operating time. Serapan dibaca pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri dari akuades dan metanol p.a dengan perbandingan 1:1 v/v, reagen Folin-Ciaocalteu, dan larutan natrium karbonat 1M. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Larutan uji diambil sebanyak 0,5 mL, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian diberi perlakuan seperti pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g ekstrak metanolik). Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. 8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan operating time (OT) Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH, 1 mL larutan pembanding rutin 5; 15; dan 25 µg/mL masing-masing dimasukkan ke dalam tiga buah labu ukur 5 mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517 nm

(44) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 25 selama 60 menit. Pada larutan uji 100, 200, dan 300 µg/mL juga dilakukan perlakuan yang sama. b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Sebanyak 0,5; 1,0; dan 1,5 ml larutan DPPH masing-masing dimasukkan ke dalam tiga buah labu ukur 10 mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi DPPH 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama operating time teoritis 30 menit. Setelah itu dilakukan scanning panjang gelombang maksimum dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. 9. Uji aktivitas antioksidan a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum yang didapatkan dari scanning panjang gelombang maksimum, setelah operating time. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke labu ukur 10 mL, kemudian ditambah dengan 2,0 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat. Setelah itu, metanol p.a ditambahkan hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik dan

(45) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 26 didiamkan selama operating time (OT), kemudian dilakukan pembacaan serapan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. c. Estimasi aktivitas antioksidan Penghitungan nilai %IC dan IC50 dilakukan berdasarkan hasil dari prosedur 9 a dan b untuk rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu. F. Analisis Hasil Kandungan fenolik total ekstrak metanolik akar apu-apu dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per g ekstrak metanolik akar apu-apu. Nilai absorbansi larutan uji yang telah didapatkan dimasukkan ke dalam persamaan kurva persamaan regresi linear asam galat, sehingga diperoleh nilai ekivalensi larutan uji terhadap asam galat. Kandungan fenolik total diperoleh berdasarkan rumus : konsentrasi ekstrak metanolik akar apu − apu × volume larutan uji massa ekstrak yang ditimbang Aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH (%IC) dihitung berdasarkan rumus : absorbansi larutan kontrol − absorbansi larutan pembanding atau larutan uji × 100 % absorbansi larutan kontrol Data aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan regresi linear y = bx + a, di mana x merupakan konsentrasi larutan pembanding atau larutan uji (µg/mL) dan y merupakan %IC. Data nilai IC50 dianalisis secara statistik, sehingga dapat diketahui ada atau tidak

(46) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 27 adanya perbedaan bermakna antara nilai IC50 larutan pembanding dengan larutan uji.

(47) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Determinasi Tanaman Determinasi dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman uji yang digunakan adalah tanaman Pistia stratiotes L. Masyarakat biasa mengenalnya dengan nama kol air atau kiapu. Bagian tanaman yang digunakan untuk determinasi adalah daun dan akar. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan karakteristik tanaman dengan USDA (2014). Determinasi dilakukan sampai kategori spesies dan dari hasil yang diperoleh, dibuktikan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Pistia stratiotes L. Pembuktian dikuatkan dengan surat determinasi (lampiran 1) yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. B. Hasil Pengumpulan Bahan Akar tanaman apu-apu diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Pemanenan dilakukan pada bulan Januari 2014 dengan kriteria pemanenan menurut Mutiarawati (2009) yaitu daun berwarna hijau segar, tidak ada bagian yang kering atau berwarna kuning kecoklatan. 28

(48) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 29 Ukuran tanaman apu-apu yang digunakan, yaitu daunnya sekitar 12 cm dan akarnya sekitar 27 cm. Setelah proses pemanenan dilakukan preparasi lebih lanjut pada akar tanaman yang masih segar. Selain itu, pemanenan pada pagi hari juga menjaga kandungan metabolit sekunder pada akar apu-apu yang berfungsi sebagai senyawa antioksidan, serta untuk menjaga agar metabolit sekunder dari tanaman tersebut tidak diolah menjadi senyawa metabolit lainnya saat mengalami fotosintesis (World Health Organization, 2003). Senyawa antioksidan dalam tanaman digunakan oleh tanaman itu sendiri untuk melawan radiasi sinar ultraviolet dari matahari (Andayani, Lisawati dan Maimunah, 2008). Oleh karena itu, pemanenan dilakukan pada pagi hari saat sinar matahari belum menyengat. Oksidasi senyawa polifenol disebabkan oleh aktivitas dari enzim polifenol oksidase yang akan mendegradasi senyawa-senyawa polifenol dan menyebabkan warna tanaman uji menjadi lebih gelap (Prawoto, 2008). Oleh karena itu, tanaman apu-apu yang telah dipanen segera dicuci dan dipisahkan antara daun dengan akarnya. Akar apu-apu yang telah bersih segera dipreparasi untuk menghindari terjadi oksidasi senyawa polifenol yang ada pada akar apuapu. C. Hasil Pembuatan Ekstrak Metanolik Akar Apu-apu Akar apu-apu yang digunakan sebelumnya telah dilakukan pencucian untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang ikut terbawa sehingga dapat mempengaruhi hasil ekstraksi. Pengeringan dilakukan dengan meletakkan akar apu-apu di ruangan terbuka dan diangin-anginkan. Tujuannya adalah untuk

(49) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 30 menghindari akar dari paparan langsung radiasi sinar matahari yang dapat menurunkan aktivitas senyawa antioksidan yang terdapat dalam akar. Akar apu-apu yang telah kering dihaluskan menggunakan blender untuk mendapatkan ukuran partikel yang lebih kecil. Ukuran partikel yang lebih kecil membuat luas permukaan sampel yang mengalami kontak dengan pelarut semakin besar. Kontak dengan pelarut yang semakin besar dapat meningkatkan proses penarikan senyawa kimia yang diinginkan, dengan kata lain, jarak zat terlarut untuk berdifusi ke dalam cairan penyari semakin kecil (Rahayu, 2009). Adanya kontak antar penyari dengan sampel memberi kesempatan penyari untuk masuk menembus membran sel dan menarik senyawa kimia yang diinginkan. Penyari yang digunakan adalah metanol karena metanol merupakan pelarut universal yang dapat melarutkan berbagai senyawa yang terkandung dalam sampel. Metanol juga dipilih berdasarkan sifat polaritasnya dilihat dari deret elutropik. Menurut Synder (1997), metanol memiliki kepolaran yang lebih besar dibandingkan etanol (metanol = 6,6 dan etanol = 5,2), sehingga dapat menarik senyawa fenolik yang cenderung lebih polar, seperti teori like dissolve like menurut Wagner (2013), di mana senyawa yang bersifat polar cenderung akan lebih menarik senyawa yang bersifat polar juga, dan sebaliknya. Selain itu, metanol memiliki jumlah atom C yang lebih sedikit dilihat dari struktur molekulnya CH3OH, dibandingkan dengan etanol dengan struktur molekul C2H5O. Atom C bersifat non polar, sehingga etanol yang memiliki jumlah atom C lebih banyak bersifat lebih non polar, dan metanol bersifat lebih polar. Menurut RCChem Learning Center (2012), gugus OH bersifat polar sehingga akan

(50) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 31 mempermudah masuknya metanol yang memiliki gugus OH ke dalam sel untuk menarik senyawa fenolik yang juga cenderung bersifat polar. Metanol juga dipilih karena menurut Busby, Ackermann, dan Crespi (1998), metanol memiliki daya inhibisi yang rendah terhadap enzim sitokrom P450 dalam tubuh dibandingkan dengan etanol. Etanol dengan konsentrasi rendah yaitu 0,1% dapat menginhibisi enzim sitokrom P-450 secara signifikan. Metode ekstraksi yang dipilih yaitu maserasi. Kelebihan dari maserasi yaitu proses pengerjaannya yang sederhana dan memungkinkan adanya waktu kontak yang cukup antara penyari dengan sampel (Agoes, 2006). Maserasi juga tidak menggunakan panas atau temperatur tinggi dalam proses ekstraksinya. Temperatur yang tinggi dapat menurunkan stabilitas senyawa antioksidan dengan mendegradasi senyawa fenolik sehingga menyebabkan turunnya kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan. Jika dibandingkan dengan metode perkolasi, metode ini juga mudah dilakukan, tidak menggunakan temperatur yang tinggi, proses difusi cairan penyari bergantung pada kecepatan perkolasi, namun metode perkolasi menggunakan pelarut yang selalu diperbaharui, sehingga jumlah pelarut yang digunakan lebih banyak dibandingkan maserasi. Proses maserasi dilakukan selama 24 jam, selanjutnya dilakukan remaserasi terhadap ampas hasil maserasi awal sebanyak 2 kali dengan menggunakan penyari yang baru. Remaserasi dengan penyari baru dilakukan untuk menarik senyawa-senyawa kimia yang masih terdapat dalam sampel yang tidak ikut tertarik oleh penyari saat maserasi awal karena kejenuhan cairan penyari. Selama proses maserasi terjadi pemecahan membran sel dan dinding sel

(51) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 32 akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga senyawa metabolik dapat tertarik ke luar oleh penyari (Fouad, 2005). Cairan penyari akan masuk menembus dinding sel dan akan menarik senyawa kimia yang terlarut. Jika cairan penyari sudah pekat atau jenuh maka cairan penyari akan berdifusi keluar dari dalam rongga sel. Proses itu terjadi terus menerus selama maserasi sampai terjadi keseimbangan tekanan antara di dalam dan di luar sel. Proses maserasi dibantu dengan pengadukan menggunakan shaker. Pengadukan ini bertujuan untuk meningkatkan kontak antara cairan penyari dengan partikel-partikel sampel, serta meratakan kontak antara cairan penyari dengan partikel sampel sehingga ekstraksi dapat berlangsung lebih efektif (Tanjung dan Utami, 2008). Setelah proses maserasi, dilakukan proses penyaringan untuk memisahkan filtrat dengan ampas. Penyaringan dilakukan menggunakan kertas saring yang diletakkan dalam corong Buchner yang disambungkan dengan pompa vacuum untuk mempercepat proses penyaringan. Selanjutnya, dilakukan proses penguapan cairan penyari dengan menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu dan tekanan rendah. Suhu dijaga pada 40-50°C karena jika suhu terlalu tinggi senyawa fenolik dalam filtrat yang memiliki titik uap di bawah 4050°C ikut teruapkan bersama cairan penyari. Tekanan rendah akan mempercepat proses penguapan karena cairan penyari akan menguap di bawah titik didihnya dan dapat menjaga senyawa aktif dari kerusakan akibat panas berlebih. Setelah sebagian besar metanol teruapkan, sampel diletakkan di atas waterbath dan dilanjutkan dengan penguapan menggunakan oven pada suhu 40°C untuk

(52) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 33 mendapatkan ekstrak kental metanol. Penguapan dilakukan hingga didapatkan bobot tetap ekstrak kental metanol. Bobot tetap menurut Farmakope Indonesia (1979), yaitu dua kali penimbangan berturut-turut berbeda tidak lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang. Bobot ekstrak metanolik akar apu-apu yang didapatkan yaitu 6,07 gram. Rendemen yang didapat yaitu 1,0017%. Pada penelitian ini tidak dilakukan fraksinasi ekstrak karena belum diketahui secara pasti jenis senyawa-senyawa yang terkandung di dalam akar apu-apu, sehingga hanya digunakan ekstrak metanolik akar apu-apu. D. Hasil Uji Pendahuluan Akar Apu-apu 1. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik Uji pendahuluan senyawa fenolik bertujuan untuk mengetahui keberadaan senyawa fenolik pada akar apu-apu. Uji pendahuluan senyawa fenolik merupakan uji kualitatif yang menjadi dasar untuk uji kuantitatif penetapan kandungan fenolik total. Uji ini menggunakan prinsip reaksi oksidasi-reduksi pada suasana basa. Uji kualitatif keberadaan senyawa fenolik menggunakan reagen Folin-Ciocalteu yang terdiri dari asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstad (Nunes, et al., 2012). Asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstad tersebut akan direduksi oleh ion fenolat dari sampel sehingga membentuk kompleks berwarna biru (Savitree, Isara, Nittaya, dan Worapan, 2004). Semakin tinggi kandungan fenolik dalam sampel maka intensitas warna biru juga semakin meningkat.

(53) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 34 Uji pendahuluan senyawa fenolik menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif yang digunakan yaitu reagen Folin-Ciocalteu yang direaksikan dengan asam galat untuk menunjukkan warna larutan jika hasilnya positif (Gambar 1A). Kontrol negatif yang digunakan yaitu reagen FolinCiocalteu yang dicampur dengan metanol : air (1:1) untuk menunjukkan jika hasilnya negatif (Gambar 1C). Asam galat digunakan sebagai senyawa pembanding karena asam galat merupakan suatu asam fenolik yang banyak ditemukan pada tanaman dan biasa digunakan untuk mendeterminasi kandungan fenol dalam tanaman melalui uji Folin-Ciocalteu (Fiuza, 2004). Uji pendahuluan ini memberikan hasil positif dilihat dari terbentuknya warna biru pada campuran reagen Folin-Ciocalteu dengan larutan sampel (Gambar 1B). Jadi, dapat disimpulkan bahwa akar apu-apu mengandung senyawa fenolik. A B C Gambar 1. Hasil uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik (A = Kontrol positif Folin-Ciocalteu + Asam galat, B = Folin-Ciocalteu + Ekstrak metanolik akar apu-apu, C = Kontrol negatif Folin Ciocalteu + metanol:air (1:1))

(54) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 35 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Uji pendahuluan aktivitas antioksidan bertujuan untuk mengetahui keberadaan senyawa pada ekstrak metanolik akar apu-apu yang berperan sebagai senyawa antioksidan. Uji ini juga merupakan uji kualitatif yang menjadi dasar uji kuantitatif aktivitas antioksidan ekstrak metanolik akar apu-apu. Prinsip uji pendahuluan aktivitas antioksidan yaitu reaksi antara 1,1-difenil-2-pikrihidrazil (DPPH) dengan ekstrak metanolik akar apu-apu. Senyawa antioksidan yang terkandung di dalam ekstrak akan merubah warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Senyawa antioksidan memiliki elektron bebas yang tidak berpasangan sehingga dapat mengikat elektron bebas dari senyawa radikal. Jika elektron tersebut telah menjadi suatu pasangan elektron, maka secara stokiometri absorbansi akan menurun sebanding dengan jumlah elektron senyawa antioksidan yang diambil (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Uji pendahuluan aktivitas antioksidan menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif yang digunakan adalah DPPH yang direaksikan dengan rutin untuk menunjukkan hasil positif (Gambar 2B). Kontrol negatif yang digunakan adalah DPPH untuk menunjukkan hasil negatif (Gambar 2A). Rutin dipilih menjadi senyawa pembanding karena menurut Yang, Guo, dan Yuan (2007) telah terbukti memiliki aktivitas antioksidan terhadap radikal DPPH. Uji pendahuluan ini memberikan hasil positif dilihat dari perubahan warna menjadi kuning pada DPPH yang ditambahkan ekstrak metanolik akar apu-apu (Gambar 2C). Jadi, dapat disimpulkan bahwa akar apu-apu mengandung senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan.

(55) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 36 Uji pendahuluan aktivitas antioksidan tidak menggunakan metode KLT dan pereaksi semprot. Metode uji pendahuluan dengan mereaksikan ekstrak metanolik akar apu-apu dengan radikal DPPH dipilih karena dengan metode ini langsung dapat melihat perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning secara visual menggunakan mata. A B C Gambar 2. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = Kontrol negatif DPPH, B = Kontrol positif DPPH + rutin, C = DPPH + ekstrak metanolik akar apu-apu) E. Hasil Optimasi Penetapan Kandungan Fenolik Total 1. Penentuan Operating Time (OT) Penentuan OT bertujuan untuk mendapatkan rentang waktu pengukuran absorbansi sampel yang tepat, di mana reaksi antara senyawa baku pembanding (asam galat) dan senyawa uji (ekstrak metanolik akar apu-apu) telah berjalan secara optimal dengan reagen Folin-Ciocalteu. Penentuan OT dilakukan untuk asam galat sebagai senyawa pembanding. Asam galat digunakan sebagai standar

(56) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 37 karena asam galat merupakan senyawa analog dari senyawa-senyawa fenolik dan memiliki aktivitas antioksidan juga (Fiuza, 2004). Selain itu menurut Dewick (2001), asam galat juga merupakan senyawa fenolik yang terbentuk melalui jalur metabolisme asam sikimat. Hasil dari jalur metabolisme asam sikimat yaitu asam amino fenilalanin dan tirosin akan membentuk struktur dasar C6C3 pada senyawasenyawa seperti kumarin, asam sinamat, lignin, flavonoid, serta asam galat. Asam galat dan ekstrak metanolik akar apu-apu yang secara masingmasing direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu akan membentuk kompleks warna biru yang disebut molybdenum blue, kemudian diukur absorbansinnya pada panjang gelombang teoritis yaitu 760 nm menggunakan spektrofotometer visibel (Blainski, Lopes, dan Mello, 2013). Penentuan OT dilakukan pada 3 konsentrasi yang berbeda. Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum teoritis, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan merepresentasikan OT pada masing-masing konsentrasinya. Konsentrasi yang digunakan yaitu 50 µg/ml, 100 µg/ml, dan 150 µg/ml. Rentang waktu yang digunakan untuk penetuan OT asam galat adalah 30 menit. Selang waktu yang digunakan yaitu 5 menit untuk melihat perubahan absorbansi yang mungkin terjadi dalam selang waktu yang cukup singkat.

(57) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 38 Absorbansi Penentuan Operating Time Asam Galat 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 50 μg/ml 100 μg/ml 150 μg/ml 0 10 20 30 40 Waktu (menit) Gambar 3. Grafik penentuan OT asam galat replikasi 2 Dari hasil yang ditampilkan melalui grafik (Gambar 3) didapatkan OT asam galat yaitu 20 menit. Hal ini ditunjukkan dengan absorbansi yang stabil mulai menit ke 20. 2. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum (λ maks) Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk menentukan panjang gelombang yang dapat memberikan absorbansi maksimum dari hasil reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan asam galat. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi yang berbeda. Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan merepresentasikan panjang gelombang maksimum pada masing-masing konsentrasinya. Konsentrasi yang digunakan yaitu 50 µg/ml, 100 µg/ml, dan 150 µg/ml. Scanning panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 600 nm – 800 nm, di

(58) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 39 mana panjang gelombang teoritisnya yaitu 760 nm, sehingga masuk dalam rentang tersebut. Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum asam galat yang direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu Konsentrasi larutan asam galat (µg/ml) λ maksimum hasil scanning (nm) 50 760,5 100 760,5 150 760,4 λ maksimum teoritis (nm) λ maksimum yang digunakan (nm) 760 760,5 Dari tabel I dapat dilihat bahwa panjang gelombang maksimum yang didapatkan adalah 760,5 nm. Panjang gelombang maksimum yang didapatkan berbeda 0,5 nm dengan panjang gelombang teoritis, namun hal ini masih diperbolehkan menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995) bahwa pergeseran panjang gelombang maksimum yang diperbolehkan yaitu 2 nm dari panjang gelombang yang ditentukan. Scanning juga dilakukan pada asam galat yang tidak direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu untuk mengetahui ada atau tidaknya pengganggu pada pembacaan absorbansi. Hasil scanning menunjukkan bahwa tidak ada serapan yang terbaca untuk kontrol asam galat (Lampiran 5). F. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total Senyawa fenolik banyak tersebar di bagian-bagian tanaman, oleh karena itu, penetapan kandungan fenolik total dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa fenolik yang terkandung di dalam ekstrak metanolik akar apu-apu.

(59) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 40 Menurut Verru, Kishor, dan Meenakshi (2009), jumlah kandungan senyawa fenolik dalam suatu senyawa uji berkaitan dengan besarnya aktivitas antioksidan. Prinsip penetapan kandungan fenolik total ini yaitu reaksi oksidasireduksi pada suasana basa di mana reagen Folin-Ciocalteu yang terdiri dari asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstad akan direduksi oleh ion fenolat dari sampel sehingga membentuk kompleks berwarna biru (Singleton dan Rossi, 1965). Suasana basa pada reaksi ini didapatkan dari suatu senyawa alkali. Senyawa alkali yang digunakan adalah natrium karbonat. Menurut Mohamed, Abdelhady, Motaal, dan Beerhues (2011) nilai yang didapatkan dari hasil oksidasi fenol berbanding lurus dengan jumlah ion fenolat yang terkandung dalam suatu senyawa uji. Asam galat (Gambar 4) digunakan sebagi senyawa pembanding karena asam galat memiliki gugus hidroksi fenolat yang dioksidasi oleh pereaksi. Gambar 4. Struktur asam galat (National Center for Biotechnology Information, 2014) Asam galat meruapakan asam heteropoli yang memiliki 3 gugus hidroksi fenolat. Gugus hidroksi fenolat tersebut yang akan dioksidasi oleh reagen FolinCiocalteu dalam suasana basa. Reagen Folin-Ciocalteu akan mengoksidasi asam galat pada gugus hidroksi fenolatnya membentuk kompleks molibdenum-tungsten yang memiliki warna biru (Alfian dan Susanti, 2012). Warna biru yang terbentuk

(60) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 41 akan semakin pekat menunjukkan bahwa semakin banyak kandungan senyawa fenolik pada senyawa uji, yang berarti bahwa semakin banyak pula ion fenolat yang teroksidasi oleh reagen Folin-Ciocalteu dan semakin banyak reagen FolinCiocalteu yang tereduksi (Singleton dan Rossi, 1965). Gambar 5. Reaksi asam galat dengan senyawa molybdenum dari reagen Folin-Ciocalteu (Nunes, et al., 2012) Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum yang telah didapatkan sebelumnya yaitu 760,5 nm. Kurva regresi linear asam galat dilakukan sebanyak 3 kali untuk mendapatkan nilai r yang terbaik, kemudian persamaan regresi linear dengan nilai r terbaik digunakan untuk menghitung kandungan fenolik total dalam senyawa uji. Dari tabel II dapat dilihat bahwa nilai absorbansi hasil pengukuran memiliki korelasi berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi, sehingga dari perbandingan masing-masing konsentrasi dengan absorbansi hasil pengukuran didapatkan persamaan regresi linear. Dari tabel II dapat dilihat bahwa replikasi 2 memiliki nilai r yang paling baik yaitu 0,9997. Nilai r yang baik menunjukkan koefisien korelasi yang baik

(61) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 42 juga, ditunjukkan dari semakin mendekatinya titik-titik hasil perbandingan antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi asam galat terhadap garis lurus yang terbentuk (Gambar 6). Persamaan regresi linear yang digunakan untuk penetapan kandungan fenolik total adalah y = 0,0048x + 0,0660. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekivalen asam galat. Perhitungan kandungan fenolik total dilakukan 3 kali replikasi untuk melihat konsistensi data yang dihasilkan. Hasil perhitungan kandungan fenolik total pada ketiga replikasi ditunjukkan pada Tabel III. Rata-rata kandungan fenolik total pada sampel uji yaitu 0,3023 ± 0,0094 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik akar apu-apu. Tabel II. Hasil pengkuran absorbansi asam galat yang telah direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu pada λ 760,5 nm Persamaan regresi Replikasi Konsentrasi (μg/ml) Absorbansi linear 48,4 0,2967 72,6 0,4326 y = 0,0052x + 0,0469 1 96,8 0,5385 r = 0,9987 121 0,6614 145,2 0,8079 48,4 0,3007 72,6 0,4142 y = 0,0048x + 0,0660 2 96,8 0,5272 r = 0,9997 121 0,6406 3 145,2 50 75 100 125 150 0,7675 0,2957 0,4122 0,5465 0,6641 0,7789 y = 0,0049x + 0,0522 r = 0,9996

(62) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 43 Kurva Baku Asam Galat vs Absorbansi Absorbansi 1 0,8 0,6 0,4 y = 0,0048x + 0,0660 0,2 r = 0,9997 0 0 50 100 150 200 Konsentrasi asam galat (µg/ml) Gambar 6. Kurva baku asam galat untuk penetapan kandungan fenolik total Tabel III. Hasil penetapan kandungan fenolik total ekstrak metanolik akar apu-apu kandungan fenolik total Replikasi 𝑥 ± SD (mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik akar apu-apu) 1 0,2915 2 0,3079 3 0,3075 0,3023 ± 0,0094 Kandungan fenolik total pada ekstrak metanolik akar apu-apu cukup kecil, yaitu 0,3023 ± 0,0094 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik akar apu-apu. Kandungan fenolik total pada daun yang telah diteliti pada ekstrak metanolik daun apu-apu menurut Ho, et al. (2011) adalah 51,79 ± 1,12 µg ekivalen katekin per mg bobot kering daun apu-apu yang digunakan, dengan senyawa standar yang berbeda yaitu katekin. Hasil tersebut juga menunjukkan

(63) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 44 kandungan fenolik yang cukup kecil, sehingga jika dilihat dari hasil kandungan fenolik total antara daun dan akar apu-apu dapat dikatakan bahwa kandungan senyawa fenolik pada tanaman apu-apu tidak terlalu besar. G. Hasil Optimasi Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan Operating Time (OT) Penentuan OT bertujuan untuk mendapatkan rentang waktu pengukuran absorbansi sampel yang tepat, di mana reaksi antara senyawa uji dengan radikal DPPH telah berlangsung secara optimal sehingga dapat memberikan absorbansi yang stabil. DPPH dapat memberikan serapan karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom, serta adanya delokalisasi elektron sehingga menghasilkan warna ungu. Penentuan operating time dilakukan untuk rutin sebagai senyawa baku pembanding dan ekstrak metanolik akar apu-apu. Penentuan OT dilakukan pada 3 konsentrasi yang berbeda. Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan merepresentasikan operating time pada masing-masing konsentrasinya. Konsentrasi rutin yang digunakan yaitu 5 µg/ml, 15 µg/ml, dan 25 µg/ml. Konsentrasi ekstrak metanolik akar apu-apu yang digunakan yaitu 100 µg/ml, 300 µg/ml, dan 500 µg/ml. Pengukuran operating time dilakukan pada panjang gelombang maksimum teoritis yaitu antara 515-520 nm (Molyneux, 2004). Rentang waktu yang digunakan untuk penentuan operating time rutin yaitu

(64) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 45 60 menit dengan selang waktu 5 menit, sedangkan rentang waktu untuk ekstrak metanolik akar apu-apu yaitu 50 menit dengan selang waktu 5 menit. Penentuan Operating Time Rutin 1 Absorbansi 0,8 0,6 5 μg/ml 0,4 15 μg/ml 25 μg/ml 0,2 0 0 20 40 60 80 Waktu (menit) Gambar 7. Grafik penentuan OT rutin replikasi 1 Penentuan Operating Time Ekstrak Metanolik Akar Apu-apu Absorbansi 1 0,8 0,6 100 μg/ml 0,4 300 μg/ml 0,2 500 μg/ml 0 0 10 20 30 40 50 60 Waktu (menit) Gambar 8. Grafik penentuan OT ekstrak metanolik akar apu-apu replikasi 3 Dari hasil yang ditampilkan melalui grafik (Gambar 7) didapatkan operating time rutin yaitu 35 menit. Hal ini ditunjukkan dengan absorbansi yang stabil mulai menit ke 35. Dari gambar 8 dapat dilihat bahwa hasil penentuan

(65) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 46 operating time untuk ekstrak metanolik akar apu-apu adalah 30 menit. Hal ini ditunjukkan dengan absorbansi yang stabil mulai menit ke 30. Operating time rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu tidak sama, hal ini dikarenakan masingmasing senyawa memiliki waktu optimumnya dari hasil reaksi dengan radikal DPPH yang dapat memberikan nilai serapan yang stabil. Nilai serapan yang stabil berarti nilai serapan yang dihasilkan pada rentang waktu tertentu memiliki selisih yang kecil. 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks) Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk menentukan panjang gelombang yang dapat memberikan absorbansi optimal dengan adanya sedikit perubahan konsentrasi dari hasil reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa uji. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi DPPH yang berbeda yaitu 0,020 mM, 0,040 mM, 0,060 mM. Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang serapan maksimum, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan merepresentasikan panjang gelombang maksimum pada masing-masing konsentrasinya. Scanning panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 400 nm – 600 nm. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum menggunakan larutan DPPH replikasi 1.

(66) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 47 Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang maksimum DPPH Konsentrasi larutan DPPH (mM) λ maksimum hasil scanning (nm) 0,020 514 0,040 514,5 0,060 516 λ maksimum teoritis (nm) λ maksimum yang digunakan (nm) 517 515 Dari tabel IV dapat dilihat bahwa panjang gelombang serapan maksimum yang didapatkan adalah 515 nm yang merupakan rata-rata dari ketiga panjang gelombang dari 3 konsentrasi yang berbeda. Panjang gelombang maksimum yang didapatkan berbeda 2 nm dengan panjang gelombang teoritis yaitu 517, namun hal ini masih diperbolehkan menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995) bahwa pergeseran panjang gelombang maksimum yang diperbolehkan yaitu 2 nm dari panjang gelombang yang ditentukan. Scanning juga dilakukan pada metanol yang digunakan sebagai pelarut DPPH untuk mengetahui ada atau tidaknya pengganggu pada pembacaan absorbansi. Hasil scanning menunjukkan bahwa tidak ada serapan yang terbaca (Lampiran 10a). H. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan ekstrak metanolik akar apu-apu dilakukan dengan menggunakan metode penangkapan radikal bebas 1,1-difenil-2pikrihidrazil (DPPH). Prinsip pengukuran aktivitas antioksidan metode ini yaitu

(67) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 48 penangkapan elektron bebas dari senyawa radikal yang menyebabkan berkurangnya intensitas warna radikal DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Metode uji aktivitas antioksidan lainnya yaitu metode deoksiribosa, namun metode ini tidak digunakan karena prosesnya lebih panjang yang membutuhkan reaksi fenton (Fe3+ / askorbat/ EDTA/ H2O2) untuk membentuk radikal hidroksil (Sambada, 2011). DPPH merupakan suatu senyawa radikal nitrogen yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan yang menyebabkan DPPH memiliki sifat reaktif. DPPH mengalami reduksi melalui proses donasi hidrogen atau elektron sehingga warna DPPH dapat mengalami perubahan dari ungu menjadi kuning (Halliwell dan Gutteridge, 2000). Menurut Sulistiyowati, Cahyono, dan Swastawati (2013), DPPH yang direaksikan dengan suatu senyawa antioksidan, dalam penelitian ini adalah senyawa fenolik dalam akar apu-apu, akan mengikat atom H dari senyawa antioksidan sehingga menyebabkan terjadinya delokalisasi elektron. Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan jika mampu mendonorkan elektronnya sehingga membuat DPPH menjadi stabil. Peristiwa tersebut menyebabkan penurunan intensitas warna DPPH dari ungu menjadi kuning yang berarti sifat DPPH sebagai radikal bebas juga menurun atau bahkan hilang. Senyawa yang digunakan sebagai senyawa pembanding kontrol psitif yaitu rutin. Rutin merupakan senyawa golongan flavonoid yang telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Rutin memiliki gugus –OH fenolat di dalam strukturnya (Gambar 9). Gugus –OH fenolat bertanggung jawab pada aktivitas

(68) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 49 antioksidan rutin dengan mereduksi DPPH sehingga terjadi penurunan intensitas warna ungu menjadi kuning. Gambar 9. Struktur rutin (National Center for Biotechnology Information, 2014) Reaksi antara rutin dengan senyawa radikal DPPH ditunjukkan pada gambar 10. Gambar 10. Reaksi antara rutin dengan senyawa radikal DPPH (Li, Xu, dan Chen, 2012)

(69) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 50 Elektron bebas pada DPPH akan mengikat satu atom H dari senyawa antioksidan, dalam hal ini rutin dan senyawa dalam sampel, sehingga tidak terjadi delokalisasi elektron pada radikal DPPH. Hal ini menyebabkan perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning. Perubahan warna tersebut sebanding dengan jumlah radikal bebas DPPH yang ditangkap oleh senyawa antioksidan. Parameter pengukuran aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH adalah IC50. IC50 merupakan konsentrasi senyawa uji yang diperlukan untuk menghambat senyawa radikal sebesar 50%. Nilai IC50 didapatkan dari persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi senyawa uji dengan persen aktivitas antioksidan yang ditimbulkan (Zou, Lu, dan Wei, 2004). Semakin kecil nilai IC50 senyawa uji menunjukkan bahwa semakin besar aktivitas antioksidan dari senyawa uji tersebut. Jadi, nilai IC50 dan aktivitas antioksidan memiliki korelasi berbanding terbalik. Absorbansi Kurva Konsentrasi vs %IC 70 60 50 40 30 20 10 0 y = 2,3309x + 1,4794 r = 0,9999 0 5 10 15 20 25 30 Konsentrasi (µg/ml) Gambar 11. Kurva persamaan regresi linear rutin replikasi 2

(70) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 51 Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan menggunakan metode DPPH Replikasi 1 2 3 Absorbansi larutan pembanding %IC 5 0,7880 12,1614 10 0,6992 22,0600 0,5887 34,3774 y= 2,1951x + 0,8895 20 0,4950 44,8222 r = 0,9996 25 0,3978 55,6571 5 0,7757 13,4553 10 0,6786 24,2887 0,5685 36,5726 y= 2,3309x + 1,4794 20 0,4950 48,0531 r = 0,9999 25 0,3599 59,8460 5 0,7944 11,6155 10 0,6817 24,1544 0,5899 34,3680 y= 2,2853x + 0,4984 20 0,4867 45,8500 r = 0,9996 25 0,3784 57,8994 Konsentrasi (μg/ml) 15 15 15 Absrobansi kontrol DPPH 0,8971 0,8963 0,8988 Persamaan regresi linear Dari tabel V dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi rutin yang digunakan sebanding dengan besarnya persen aktivitas antioksidan yang

(71) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 52 ditimbulkan. Hal ini disebabkan karena semakin banyak pula pendonor atom untuk radikal DPPH, sehingga radikal DPPH menjadi lebih stabil. Dari gambar 11 dapat dilihat bahwa replikasi 2 memiliki persamaan regresi linear dengan nilai r paling baik yaitu 0,9999. Semakin baik nilai r menunjukkan bahwa semakin baik pula koefisien korelasi regresi linear yang ditunjukkan dari semakin mendekatinya titik-titik hasil perbandingan antara konsentrasi rutin dengan %IC rutin, terhadap garis lurus yang terbentuk. Hal tersebut juga menunjukkan korelasi berbanding lurus antara konsentrasi rutin dengan persen aktivitas antioksidan yang dihasilkan. Persamaan regresi linear yang didapatkan kemudian digunakan untuk menghitung nilai IC50. Kurva Konsentrasi vs %IC 70 Absorbansi 60 50 40 30 20 10 0 0 100 200 y = 0,1160x + 0,0427 r400 = 0,9998 500 300 600 Konsentrasi (µg/ml) Gambar 12. Kurva persamaan regresi linear ekstrak metanolik akar apuapu replikasi 1

(72) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 53 Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak metanolik akar apu-apu dengan menggunakan metode DPPH Absorbansi ekstrak Absrobansi Persamaan Konsentrasi Replikasi %IC kontrol metanolik regresi (μg/ml) akar apuDPPH linear apu 100 0,7845 11,5658 y= 200 0,6817 23,5821 0,1160x + 1 0,8871 300 0,6453 34,6973 0,0427 400 0,5381 46,1053 r = 0,9998 500 0,3872 58,3249 100 0,7860 11,1764 y= 200 0,6835 22,7596 0,1164x – 2 0,8849 300 0,6431 34,6593 0,3503 400 0,5416 46,9884 r = 0,9993 500 0,3882 57,2607 100 0,7864 11,7693 y= 200 0,6791 23,8079 0,1129x + 3 0,8913 300 0,6502 34,8816 0,7809 400 0,5423 45,3270 r = 0,9994 500 0,3892 57,4554 Persamaan regresi linear dan perhitungan %IC ekstrak metanolik akar apu-apu ditunjukkan pada tabel VI. Kurva persamaaan regresi linear rutin ditunjukkan pada gambar 12. Dari tabel VI dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak metanolik akar apu-apu yang digunakan sebanding dengan besarnya persen aktivitas antioksidan yang ditimbulkan. Konsentrasi ekstrak metanolik akar apuapu yang digunakan lebih tinggi dari konsentrasi rutin. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan nilai absorbansi yang masuk dalam rentang 0,2-0,8. Dari tabel VI dapat dilihat bahwa replikasi 1 memiliki persamaan regresi linear dengan nilai r paling baik yaitu 0,9998. Semakin baik nilai r menunjukkan

(73) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 54 bahwa semakin baik pula koefisien korelasi regresi linear yang ditunjukkan dari semakin mendekatinya titik-titik hasil perbandingan antara konsentrasi ekstrak metanolik akar apu-apu dengan %IC ekstrak metanolik akar apu-apu, terhadap garis lurus yang terbentuk (Gambar 12). Hal tersebut juga menunjukkan korelasi berbanding lurus yaitu semakin besar konsentrasi ekstrak metanolik akar apu-apu yang maka semakin besar pula nilai %IC yang dihasilkan. Persamaan regresi linear yang telah didapatkan digunakan untuk menghitung nilai IC50 dari masing-masing replikasi. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu ditunjukkan pada tabel VII. Tabel VII. Hasil perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu Rutin Replikasi IC50 (µg/mL) 1 22,3728 2 20,8162 3 21,6609 Rerata ± SD 21,6166 ± Ekstrak Metanolik Akar Apu-apu Replikasi IC50 (µg/mL) 1 430,6663 2 432,5687 3 435,9530 Rerata ± SD 433,0627 ± 2,6777 Berdasarkan kategori tingkat kekuatan antioksidan, rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu dapat digolongkan seperti pada tabel VIII.

(74) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 55 Tabel VIII. Penggolongan kekuatan aktivitas antioksidan rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu dengan metode DPPH (Blois cit., Fidrianny, Darmawati and Sukrasno, 2014) Tingkat aktivitas antioksidan (nilai IC50) dengan metode DPPH Sampel IC50 Rutin 21,6166 Ekstrak metanolik akar apuapu 433,0627 Sangat kuat (< 50 µg/ml) Kuat (50100 µg/ml) Sedang (101-150 µg/ml) Lemah (>150 µg/ml)   Nilai IC50 ekstrak metanolik akar apu-apu besar sehingga aktivitas antioksidannya tergolong lemah. Jika dibandingkan dengan nilai IC50 ekstrak metanolik daun apu-apu menurut Ho, et al. (2011), yaitu sebesar >2000 µg/ml, maka aktivitas antoksidan ekstrak metanolik daun apu-apu juga tergolong lemah. Nilai IC50 Rutin vs Ekstrak Metanolik Akar Apu-apu Nilai IC50 (µg/mL) 500 433,0627µg/mL ± 2,6777 400 300 200 100 21,6166 µg/mL ± 0,7792 0 Rutin Ekstrak metanolik akar apu-apu Gambar 13. Histogram perbandingan IC50 rutin dengan ekstrak metanolik akar apu-apu

(75) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 56 Berdasarkan histogram pada gambar 13 dapat dilihat bahwa nilai IC50 rutin jauh lebih rendah dibandingkan ekstrak metanolik akar apu-apu. Jadi, dapat disimpulkan bahwa aktivitas antioksidan rutin lebih besar daripada ekstrak metanolik akar apu-apu. Uji statistik dilakukan setelah mendapatkan nilai IC50. Uji secara statistik dilakukan untuk memastikan kebermaknaan nilai IC50 rutin dengan IC50 ekstrak metanolik akar apu-apu. Uji statistik dilakukan dengan menggunakan software R seri i386 3.0.2. Uji pertama yang dilakukan adalah uji normalitas data. Uji normalitas data bertujuan untuk melihat apakah data terdistribusi secara normal atau tidak. Jika jumlah data kurang dari 50 maka digunakan uji normalitas Shapiro-Wilk (Dahlan, 2012). Uji normalitas data ini menentukan jenis uji yang akan dilakukan selanjutnya. Hasil uji statistik menunjukkan nilai p-value untuk IC50 rutin adalah 0,9061 dan p-value untuk IC50 ekstrak metanolik akar apu-apu adalah 0,6936. Kedua data IC50 memiliki nilai p-value lebih besar dari 0,05 (taraf kepercayaan 95%), dengan kata lain nilai signifikansi yang dihasilkan lebih besar daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Jadi, dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu terdistribusi secara normal. Uji selanjutnya yang dilakukan adalah uji parametrik karena data terdistribusi secara normal. Uji parametrik yang dilakukan adalah uji t tidak berpasangan untuk menguji perbedaan antara dua kelompok data dengan objek yang berbeda yaitu rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu, dilihat dari adanya perbedaan rata-ratanya. Hasil perhitungan dengan program R menunjukkan nilai

(76) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 57 p-value yang didapat adalah 1.407e-09. Nilai signifikansi yang didapatkan lebih kecil daripada nilai signifikansi yang telah ditentukan yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%). Jadi, dapat disimpulkan bahwa nilai rata-rata IC50 rutin dengan ekstrak metanolik akar apu-apu berbeda bermakna, di mana rutin memiliki nilai IC50 rendah dengan aktivitas antioksidan lebih besar dibanding ekstrak metanolik akar apu-apu.

(77) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB V KESIMPULAN A. Kesimpulan 1. Kandungan fenolik total ekstrak metanolik akar apu-apu sebesar (0,3023 ± 0,0094) mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik akar apuapu. 2. Nilai aktivitas antioksidan ekstrak metanolik akar apu-apu dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan sebagai IC50 sebesar (433,0627 ± 2,6777) µg/ml (taraf kepercayaan 95%) dan tergolong lemah. B. Saran 1. Perlu dilakukan uji aktivitas antioksidan terhadap bagian tanaman lainnya selain daun dan akar, seperti stolon dan bunga. 2. Perlu dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan penyari selain metanol untuk mengetahui nilai aktivitas antioksidan dari ekstrak akar apu-apu. 58

(78) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 59 DAFTAR PUSTAKA Agoes, G., 2006, Teknologi Bahan Alam (Serial Farmasi Industri-2), edisi revisi, Penertbit ITB, Bandung, hal. 31,32,37, 41,43. Alfian, R., dan Susanti, H., 2012, Penetapan Kadar Fenolik Total Ekstrak Metanol Kelopak Bunga Rosella Merah (Hibicus sabdariffa Linn) dengan Variasi Tempat Tumbuh Secara Spektrofotometri, Jurnal Ilmiah Kefarmasian, Vol.2 (1), pp. 73-80. Andayani, R., Lisawati Y., dan Maimunah, 2008, Penentuan Aktivitas Antioksidan Kadar Fenolat Total dan Likopen Pada Buah Tomat (Solanum Lycopersicum L.), Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, 2007, Vol.7(1), pp. 83-87. Apak, R., et al., 2013, Methode of Measurement and Evaluatioon of Natural Antioxidant Capacity/Activity (IUPAC Technical Report), Pure Appl. Chem, Vol. 85, No.5, pp. 957-998. Atanassova, M., Georgieva, S., dan Ivancheva, K., 2011, Total Phenolic and Total Flavonoid Content, Antioxidant Capacity and Biological Contaminants in Medicinal Herbs, Journal of The University of Chemical Technology and Metallurgy, 46,1, pp. 81-88. Badarinath, A.V., et al., A Review on In Vitro Antioxidant Methods: Comparisons, Correlation, and Considerations, International Journal of Pharm Tech Research, USA, Vol.2, No.2, pp. 1276-1285. Blainski, A., Lopes, G.C., dan Mello, J.C.P., 2013, Application and Analysis of The Folin Ciocalteu Method for The Determination of The Phenolic Content from Limonium Brasiliense L., Molecules (18), pp. 6852-6865. Busby, W.F., Ackermann, J.M., dan Crespi, C.L., 1998, Effect of Methanol, Ethanol, Dimethyl Sulfoxide, and Acetonitrile on In Vitro Activities of cDNA-Expressed Human Cytochromes P-450, The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, USA, Vol.27, No.2, pp. 246-249. Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., dan Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412. Dahlan, 2012, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika, Jakarta, hal. 17. Depkes RI a, 1979, Farmakope Indonesia, edisi 3, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. XXXIII.

(79) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 60 Depkes RI b, 1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 1006, 1036, 1066. Dewick, P.M., 2001, Medicinal Natural Product, a Biosynthetic Approach, second edition, John Wiley Sons Ltd., Inggris, pp. 121-122. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 2-10,13. Emir, T., Don, W.S., dan Cherry, H., 2000, Tanaman Air, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, hal. 16. Fidrianny, I., Darmawati, A., dan Sukrasno, 2014, Antioxidant Capacities From Different Polarities Extracts of Cucurbitaceae Leaves Using FRAP, DPPH Assays and Corelation With Phenolic, Flavonoid, Carotenoid Content, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, 6(2), 852-862. Fiuza, S.M., 2004, Phenolic Acid Derivates With Potential Anticancer Properties, A Structure Activity Relationship Study, Part 1: Methyl, Propyl and Octyl Esters of Caffeic and Gallic Acids, Elsevier, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 12(2004), pp. 3581-3589. Fouad, T., 2005, Antioxidant, Nature, and Chemistry, http://www. thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidant, diakses tanggal 5 Maret 2014. Halliwell, B., dan Gutteridge, J.M.C., 2000, Free Radical in Biology and Medicine, Oxford University Press, New York. Hernani dan Rahardjo, M., 2005, Tanaman Berkhasiat Antioksidan, Penebar Swadaya, Jakarta, hal. 9, 16-20. Ho, Y.L., et al., 2011, In Vitro Antioxidant Propeties and Total Phenolic Contents of Wetland Medicinal Plants in Taiwan, Botanical Studies 53:55-66. ITIS, 2014, Standard Report Page: Pistia stratiotes L., http://www.itis.gov/ servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=42542, diakses pada tanggal, 19 Mei 2014. Jha, M., Ganesh, N., dan Sharma, V., 2010, In Vitro Evaluation of Free Radical Scavenging Activity of Pistia stratiotes L. Karim, M. F. B., et al., 2014, Phytochemical and Pharmacological Investigation of Pistia stratiotes L., IJIPSR, Malaysia, 2(3), pp. 640-652. Kumalaningsih, 2007, Antioksidan Alami, http://repository .ipb. ac. id/bitstream/handle/123456789/48301/BAB%20II%20Tinjauan%20Pusta ka_%20G11hwi.pdf? sequence=5, diakses pada tanggal 16 Maret 2013.

(80) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 61 Li, X., Xu, M., dan Chen, D., 2012, Protective Effect Against Hydroxyl-Induced DNA Damage and Antioxidant Activity of Radic bupleuri In Vitro, Spatula DD, 2(4), pp. 219-227. Lobo, V., et al., 2010, Free Radicals, Antioxidant, and Functional Foods: Impact on Human Health, Pharmacognosy Review, 4(8), pp. 118-126. Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung, hal. 15. Marxen, K., et al., 2007, Determination of DPPH Radical Oxidation caused by Methanolic Extract of Some Microalgal Species by Linear Regression Analysis of Spectrofotometric Measurement, Sensors, Jerman, pp. 7(2007), 2080-2095. Mohamed, I.S., Abdelhady, Motaal, A.A., dan Beerhues, L., 2011, Total Phenolic Content and Antioxidant Activity of Standardized Extract from Leaves and Cell Cultures of Three Callistemon Species, American Journal of Plants Sciences, pp. 847-850. Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazil (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26(2), 211-219. Mutiarawati, 2009, Penanganan Pasca Panen Hasil Pertanian, Universitas Padjadjaran, Bandung. National Center for Biotechnology Information, 2014, http://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/summary/summary. cgi?cid=370, diakses tanggal 20 Maret 2014. National Center for Biotechnology Information a, 2014, http://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5280805&loc=ec_rcs, diakses tanggal 20 Maret 2014. Nishizawa, M., et al., 2005, Non-reductive Scavenging of 1,1-diphenil-2picryllhidrazil (DPPH) by Peroxyradical: A Useful Methode for Quantitative Analysis and Peroxiradical, J.Chem, Pharm, pp. 53, 714716. Nunes, X.P., et al., 2012, Biological Oxidation and Antioxidant Activity of Natural Products, University Federal Sao Fransisco, Brazil, pp. 1-20. Prawoto, A.A., 2008, Panduan Lengkap Kakao Manajemen Agribisnis dari Hulu Hingga Hilir, Penebar Swadaya, Jakarta, hal. 209. Proestos, C., Sereli, D., dan Komaitis, M., 2006, Determination of Phenolic Compounds in Aromatic Plant by RP-HPLC and GC-MS, Food J. Sci., 95:44-52.

(81) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 62 Rahayu, S.S., 2009, Merawat Peralatan Ekstraksi, http://www.chem-istry.org/materi_kimia/kimia-industri/teknologi-proses/merawat-peralatan ekstraksi/, diakses tanggal 18 Maret 2014. RCChem Learning Center, 2012, Gugus Fungsional, http://www. rcchem. co.id/rcchem/article/153, diakses tanggal 19 Maret 2014. Rivers, L., 2002, Pistia stratiotes (aquatic plant), Global Invasive Species, Invasive Species Specialist Group, Itali. Sambada, D.L.E., 2011, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal DPPH dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Air Ekstrak Etanolik Daun Selasih, Skripsi, Universitas Santa Dharma, Yogyakarta. Savitree, M., Isra, P., Nittaya,S.L., dan Worapan, S., 2004, Radical Scavenging Activity and Total Phenolic Content of Medicinal Plants Used in Primary Health Care, Journal of Pharm. Sci., Vol.9(1), pp.32-35. Shivaprasad, H.N., Mohan, S., Kharya, M.D., Shiradkar, M.R., dan Lakshman, K., 2005, In-vitro Models for Antioxidant Activity Evaluation : a Riview, http://www.pharmainfo.net/reviews/vitro-models-antioxidant-activityevaluation-review, diakses tanggal 23 Maret 2013. Singleton, V.L., and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolic with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147. Sjabana, M.G., dan Jovanovic, J.V., 2002, Seri Referensi Herbal : Pesona Tradisional dan Ilmiah Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L.), Salemba Medika, Jakarta, hal. 5-20. Sulistiyowati, Cahyono, B., dan Swastawati, F., 2013, Penentuan Total Senyawa Fenolat dan Aktivitas Antioksidan Pada Asap Cair Ampas Tebu dan Kulit Tebu (Sacharm officinarum) Serta Identifikasi Komponen Penyusunnya, Chem. Info,1(1), pp. 273-290. Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa Kecambah dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, Jurnal Farmasi Indonesia 2 (2), Jakarta, hal. 53-61. Suryohudoyo, P., 2013, Oksidan, Antioksidan, dan Radikal Bebas, http://mhanafi123.files.wordpress.com/2012/07/oksidan-anti-oksidandan-radikal-bebas.pdf, diakses pada 21 Februari 2013. Synder, L.R., dan Kirland, J.J., 1997, Practical HPLC Methode Development, second edition, John Wiley and sons. Tanjung, B.L.M., dan Utami, F.H., 2008, Pengaruh pH dan Kecepatan Pengadukan Pada Ekstraksi Protein dai Tulang Ayam dengan Solvent

(82) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 63 Larutan NaOH, Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Diponegoro, Semarang. Tripathi, P., et al., 2010, Pistia stratiotes (Jalkumbhi), Pharmacognosy Review, 4(8), pp. 153-160. USDA, 2014, Natural Resources Conservation Service, Plants Database, http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=PIST2, diakses tanggal 9 Februari 2014. Vermerris, W., dan Nicholson, R. L., 2008, Phenolic Compound Biochemistry, Springer, USA, pp. 2-4, 6. Verru, P., Kishor, M.P., dan Meenakshi, M., 2009, Screening of Medical Plant Extract for Antioxidant Activity, JMPR, 3 (8). 608-612. Wagner, K.M., 2013, Like Dissolves Like, Princeton University Chemistry Department, pp. 1-5. Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Potensi dan Aplikasinya dalam Kesehatan, Kanisius, Yogyakarta, hal. 273-274. World Health Organization, 2003, WHO Guidelines on Good Agricultural and Collection Practices (GACP) for Medicinal Plants, Government of the Grand Duchy of Luxembourg, 11-15. Yang, J., Guo, J., dan Yuan, J., 2007, In Vitro Antioxidant Properties of Rutin, Swiss Society of Food Science and Technology. Zou, Y., Lu, Y., dan Wei, D., 2004, Antioxidant Activity of Flavonoid, Rich Extract of Hypericum Perforatum L., In Vitro, J. Agric, Food Chem, 52, pp. 5032-5039.

(83) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 64 LAMPIRAN Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman apu-apu (Pistia stratiotes L.)

(84) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 65 Lampiran 2. Gambar tanaman apu-apu di Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

(85) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 66 Lampiran 3. Perhitungan rendemen Bobot akar apu-apu yang digunakan adalah 600 gram cawan 1 (g) cawan 2 (g) cawan 3 (g) cawan 4 (g) Berat cawan 73,28 53,68 43,71 55,08 Berat cawan + ekstrak 75,55 54,38 44,44 55,71 Berat ekstrak 2,27 0,7 0,73 0,63 cawan 5 (g) cawan 6 (g) cawan 7 (g) Berat cawan 33,62 55,01 39,90 Berat cawan + ekstrak 34,19 55,57 40,51 Berat ekstrak 0,57 0,56 0,61 Total berat ekstrak akar apu-apu = 2,27 g + 0,70 g + 0,73 g + 0,63 g + 0,57 g + 0,56 g + 0,61 g = 6,07 g Rendemen ekstrak metanolik akar apu-apu = = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎 ℎ𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛 6,07 𝑔𝑟𝑎𝑚 600 𝑔𝑟𝑎𝑚 = 1,0017% x 100% x 100%

(86) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 67 Lampiran 4. Penimbangan pentapan kadar fenolik total a. Data penimbangan asam galat Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Berat kertas 0,2473 0,2541 0,2466 Berat kertas + asam galat 0,2723 0,2791 0,2716 Berat kertas + sisa 0,2481 0,2549 0,2466 Berat asam galat 0,0242 0,0242 0,0250 b. Data penimbangan ekstrak metanolik akar apu-apu Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Berat gelas arloji 13,8003 14,6840 13,9936 Berat gelas arloji + ekstrak 14,0264 14,8981 14,1936 Berat gelas arloji + sisa 13,8259 14,6979 13,9936 Berat ekstrak 0,2005 0,2002 0,2000

(87) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 68 Lampiran 5. Scanning kontrol asam galat

(88) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 69 Lampiran 6. Data optimasi penetapan kandungan fenolik total a. Penentuan operating time (OT) asam galat pada λ = 760 nm Absorbansi konsentrasi 50 μg/ml Waktu (menit) replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 5 0,3544 0,3036 0,3207 0,33 10 0,2999 0,3031 0,3101 0,30 15 0,2980 0,3093 0,3254 0,31 20 0,3128 0,3171 0,3260 0,32 25 0,3186 0,3174 0,3261 0,32 30 0,3190 0,3177 0,3236 0,32 Rata-rata OT yang diperoleh 20 menit Absorbansi konsentrasi 100 μg/ml Waktu (menit) replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 5 0,4983 0,4900 0,5331 0,51 10 0,5273 0,5292 0,5502 0,53 15 0,5436 0,5522 0,5597 0,55 20 0,5719 0,5543 0,5743 0,57 25 0,5723 0,5576 0,5787 0,57 30 0,5737 0,5653 0,5799 0,57 Rata-rata OT yang diperoleh 20 menit 150 μg/ml Waktu (menit) replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 5 0,6986 0,6884 0,6875 0,69 10 0,7216 0,7372 0,7300 0,73 15 0,7377 0,7595 0,7498 0,75 20 0,7639 0,7716 0,7683 0,77 25 0,7651 0,7748 0,7750 0,77 30 0,7701 0,7780 0,7763 0,77 OT yang diperoleh 20 menit Rata-rata

(89) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 70 b. Penentuan λ maksimum asam galat 1. Spektra asam galat 50 μg/mL 2. Spektra asam galat 100 μg/mL

(90) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 71 3. Spektra asam galat 150 μg/mL

(91) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 72 Lampiran 7. Penetapan kandungan fenolik total a. Konsentrasi asam galat 1. Konsentrasi larutan induk asam galat Replikasi 1 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 24,2 𝑚𝑔 50 𝑚𝑙 = 484 μg/ml Replikasi 2 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 24,2 𝑚𝑔 50 𝑚𝑙 = 484 μg/ml Replikasi 3 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 25 𝑚𝑔 50 𝑚𝑙 = 500 μg/ml 2. Konsentrasi seri larutan asam galat Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan asam galat replikasi 1 : Seri 1 C1 . V1 = C2 . V2 484 μg/ml . 1 ml = C2 . 10 ml C2 = 48,4 μg/ml Seri 2 C1 . V1 = C2 . V2 484 μg/ml . 1,5 ml = C2 . 10 ml C2 = 72,6 μg/ml

(92) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 73 Seri 3 C1 . V1 = C2 . V2 484 μg/ml . 2 ml = C2 . 10 ml = 96,8 μg/ml C2 Seri 4 C1 . V1 = C2 . V2 484 μg/ml . 2,5 ml = C2 . 10 ml = 121 μg/ml C2 Seri 5 C1 . V1 = C2 . V2 484 μg/ml . 3 ml = C2 . 10 ml = 145,2 μg/ml C2 Perhitungan konsentrasi seri larutan asam galat : replikasi 1 2 3 V1 1 1,5 2 2,5 3 1 1,5 2 2,5 3 1 1,5 2 2,5 3 C1 484 484 484 484 484 484 484 484 484 484 484 484 484 484 484 V2 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 C2 48,4 72,6 96,8 121 145,2 48,4 72,6 96,8 121 145,2 50 75 100 125 150

(93) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 74 b. Kurva baku asam galat Replikasi Konsentrasi (μg/ml) Absorbansi 48,4 0,2967 72,6 0,4326 96,8 0,5385 121 0,6614 145,2 0,8079 48,4 0,3007 72,6 0,4142 96,8 0,5272 121 0,6406 145,2 0,7675 50 0,2957 75 0,4122 100 0,5465 125 0,6641 1 2 3 Persamaan regresi linear y = 0,0052x + 0,0469 r = 0,9987 y = 0,0048x + 0,0660 r = 0,9997 y = 0,0049x + 0,0522 r = 0,9996 150 0,7789 Persamaan regresi linear yang digunakan adalah y = 0,0048x + 0,0660 c. Penetapan kandungan fenolik total larutan uji 1. Konsentrasi ekstrak metanolik akar apu-apu Replikasi 1 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 200,5 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙 = 20050 μg/ml Replikasi 2 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 200,2 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙 = 20020 μg/ml

(94) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 75 Replikasi 3 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 200,0 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙 = 20000 μg/ml 2. Absorbansi ekstrak metanolik akar apu-apu Replikasi Absorbansi 1 0,627 2 0,658 3 0,657 3. Konsentrasi ekstrak metanolik akar apu-apu Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 0,0048x + 0,0660 0,627 = 0,0048x + 0,0660 x = 116,875 μg/ml Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 0,0048x + 0,0660 0,658 = 0,0048x + 0,0660 x = 123,333 μg/ml

(95) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 76 Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 0,0048x + 0,0660 0,657 = 0,0048x + 0,0660 x = 123,125 μg/ml 4. Kandungan fenolik total ekstrak metanolik akar apu-apu Kandungan fenolik total = konsentrasi ekstrak metanolik . Replikasi 1 Kandungan fenolik total = 0,1169 mg/ml . 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 0,5 0,2005 = 0,2915 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak Replikasi 2 Kandungan fenolik total = 0,1233 mg/ml . 0,5 0,2002 = 0,3079 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak Replikasi 3 Kandungan fenolik total = 0,1231 mg/ml . 0,5 0,2000 = 0,3075 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak

(96) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 77 kandungan fenolik total replikasi x volume massa (mg/ml) (ml) (gram) x ± SD (mg ekivalen asam galat per gram ekstrak metanolik akar apu-apu) 1 0,1169 0,5 0,2005 0,2915 2 0,1233 0,5 0,2002 0,3079 3 0,1231 0,5 0,2000 0,3075 0,3023 ± 0,0094

(97) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 78 Lampiran 8. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan a. Penimbangan DPPH Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Berat kertas 0,3302 0,3581 0,3259 Berat kertas + DPPH 0,3461 0,3739 0,3419 Berat kertas + sisa 0,3303 0,3581 0,3260 Berat DPPH 0,0158 0,0158 0,0159 Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Berat kertas 0,3290 0,3147 0,3085 Berat kertas + rutin 0,3315 0,3172 0,3110 Berat kertas + sisa 0,3290 0,3147 0,3085 Berat rutin 0,0025 0,0025 0,0025 b. Penimbangan rutin c. Data penimbangan ekstrat metanolik akar apu-apu Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g) Berat gelas arloji 13,1549 13,8638 14,7448 Berat gelas arloji + ekstrak 13,1709 13,8888 14,7698 Berat gelas arloji + sisa 13,1549 13,8638 14,7448 Berat ekstrak 0,0250 0,0250 0,0250

(98) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 79 Lampiran 9. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji a. Konsentrasi DPPH 1. Replikasi 1 BM = 394,33 Mol = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 M= 𝑚𝑜𝑙 = 𝐵𝑀 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 15,8 𝑚𝑔 394,33 = 0,0401 mmol 0,0401 𝑚𝑚𝑜𝑙 0,1 𝐿 2. Replikasi 2 = 0,4010 mM BM = 394,33 Mol = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 M= 𝑚𝑜𝑙 = 𝐵𝑀 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 15,8 𝑚𝑔 394,33 = 0,0401 mmol 0,0401 𝑚𝑚𝑜𝑙 0,1 𝐿 3. Replikasi 3 = 0,4010 mM BM = 394,33 Mol = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 M= 𝑚𝑜𝑙 𝐵𝑀 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = = 15,9 𝑚𝑔 394,33 = 0,0403 mmol 0,0403 𝑚𝑚𝑜𝑙 b. Konsentrasi rutin 0,1 𝐿 = 0,4030 mM 1. Konsentrasi larutan induk Replikasi 1 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 2,5 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙 = 250 μg/ml

(99) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 80 Replikasi 2 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 2,5 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙 = 250 μg/ml Replikasi 3 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 2,5 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙 = 250 μg/ml 2. Konsentrasi seri larutan baku rutin Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan baku rutin replikasi 1 : Seri 1 C1 . V1 = C2 . V2 250 μg/ml . 0,5 ml = C2 . 25 ml C2 = 5 μg/ml Seri 2 C1 . V1 = C2 . V2 250 μg/ml . 1 ml = C2 . 25 ml C2 = 10 μg/ml Seri 3 C1 . V1 = C2 . V2 250 μg/ml . 1,5 ml = C2 . 25 ml C2 = 15 μg/ml Seri 4 C1 . V1 = C2 . V2 250 μg/ml . 2 ml = C2 . 25 ml C2 = 20 μg/ml

(100) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 81 Seri 5 C1 . V1 = C2 . V2 250 μg/ml . 2,5 ml = C2 . 25 ml = 25 μg/ml C2 Perhitungan konsentrasi larutan seri : replikasi 1 2 3 V1 C1 V2 C2 satuan 0,5 250 25 5 μg/ml 1 250 25 10 μg/ml 1,5 250 25 15 μg/ml 2 250 25 20 μg/ml 2,5 250 25 25 μg/ml 0,5 250 25 5 μg/ml 1 250 25 10 μg/ml 1,5 250 25 15 μg/ml 2 250 25 20 μg/ml 2,5 250 25 25 μg/ml 0,5 250 25 5 μg/ml 1 250 25 10 μg/ml 1,5 250 25 15 μg/ml 2 250 25 20 μg/ml 2,5 250 25 25 μg/ml c. Konsentrasi ekstrak metanolik akar apu-apu 1. Konsentrasi larutan induk Replikasi 1 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 25 𝑚𝑔 25 𝑚𝑙 = 1000 μg/ml

(101) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 82 Replikasi 2 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 25 𝑚𝑔 25 𝑚𝑙 = 1000 μg/ml Replikasi 3 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 = 25 𝑚𝑔 25 𝑚𝑙 = 1000 μg/ml 2. Konsentrasi seri larutan uji Contoh perhitungan konsentrasi seri larutan baku rutin replikasi 1 : Seri 1 C1 . V1 = C2 . V2 1000 μg/ml . 1 ml = C2 . 10 ml C2 = 100 μg/ml Seri 2 C1 . V1 = C2 . V2 1000 μg/ml . 2 ml = C2 . 10 ml C2 = 200 μg/ml Seri 3 C1 . V1 = C2 . V2 1000 μg/ml . 3 ml = C2 . 10 ml C2 = 300 μg/ml Seri 4 C1 . V1 = C2 . V2 1000 μg/ml . 4 ml = C2 . 10 ml C2 = 400 μg/ml

(102) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 83 Seri 5 C1 . V1 = C2 . V2 1000 μg/ml . 5 ml = C2 . 10 ml = 500 μg/ml C2 Perhitungan konsentrasi seri larutan uji Replikasi 1 2 3 V1 C1 V2 C2 satuan 1 1000 10 100 μg/ml 2 1000 10 200 μg/ml 3 1000 10 300 μg/ml 4 1000 10 400 μg/ml 5 1000 10 500 μg/ml 1 1000 10 100 μg/ml 2 1000 10 200 μg/ml 3 1000 10 300 μg/ml 4 1000 10 400 μg/ml 5 1000 10 500 μg/ml 1 1000 10 100 μg/ml 2 1000 10 200 μg/ml 3 1000 10 300 μg/ml 4 1000 10 400 μg/ml 5 1000 10 500 μg/ml

(103) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 84 Lampiran 10. Scanning absorbansi larutan pengkoreksi a. Scannning absorbansi metanol b. Scanning absorbansi metanol : air (1 : 1) c. Scanning absorbansi rutin

(104) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 85 d. Scanning absorbansi ekstrak metanolik akar apu-apu (λ= 400-600 nm) e. Scanning absorbansi ekstrak metanolik akar apu-apu (λ= 600-800 nm)

(105) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 86 Lampiran 11. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan λ maksimum 1. Spektra DPPH 0,020 mM 2. Spektra DPPH 0,040 mM

(106) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 87 3. Spektra DPPH 0,060 mM

(107) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 88 b. Penentuan operating time (OT) 1. Penentuan OT rutin pada λ = 517 nm Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi 5 μg/ml replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 5 0,8237 10 0,8211 15 0,8101 20 0,7864 25 0,7803 30 0,7745 35 0,7746 40 0,7744 45 0,7748 50 0,7746 55 0,7744 60 0,7745 OT yang diperoleh 35 meni Waktu (menit) 0,8140 0,8057 0,7998 0,7843 0,7691 0,7620 0,7620 0,7623 0,7621 0,7622 0,7620 0,7621 0,8259 0,8163 0,8037 0,7982 0,7987 0,7989 0,7991 0,7994 0,7990 0,7988 0,7987 0,7989 Absorbansi konsentrasi 15 μg/ml replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 5 0,7518 10 0,6914 15 0,6593 20 0,6350 25 0,6167 30 0,5997 35 0,5891 40 0,5890 45 0,5889 50 0,5888 55 0,5890 60 0,5887 OT yang diperoleh 35 menit 0,7383 0,6849 0,6487 0,6275 0,6081 0,5865 0,5870 0,5869 0,5870 0,5867 0,5871 0,5872 0,7533 0,7283 0,6799 0,6569 0,6001 0,5892 0,5899 0,5898 0,5898 0,5891 0,5889 0,5893 rata-rata 0,82 0,81 0,80 0,79 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78 0,78 rata-rata 0,75 0,70 0,66 0,64 0,61 0,59 0,59 0,59 0,59 0,59 0,59 0,59

(108) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 89 Waktu (menit) Absorbansi konsentrasi 25 μg/ml replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 5 0,5239 10 0,4462 15 0,4150 20 0,3972 25 0,3603 30 0,3493 35 0,3426 40 0,3428 45 0,3427 50 0,3430 55 0,3429 60 0,3431 OT yang diperoleh 35 menit 0,5271 0,4261 0,3967 0,3821 0,3512 0,3475 0,3347 0,3350 0,3351 0,3349 0,3349 0,3348 0,5337 0,4523 0,4104 0,3749 0,3623 0,3469 0,3466 0,3465 0,3468 0,3464 0,3467 0,3466 2. Penentuan OT ekstrak metanolik akar apu-apu Konsentrasi 100 μg/ml pada λ = 517 nm Absorbansi konsentrasi 100 μg/ml Waktu (menit) replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 5 0,8968 0,8864 0,8803 10 0,8676 0,8634 0,8695 15 0,8587 0,8372 0,8377 20 0,8275 0,8197 0,8014 25 0,7964 0,7968 0,7896 30 0,7893 0,7891 0,7892 35 0,7881 0,7884 0,7885 40 0,7875 0,7880 0,7883 45 0,7876 0,7879 0,7881 50 0,7875 0,7876 0,7883 OT yang diperoleh 30 menit rata-rata 0,53 0,44 0,41 0,38 0,36 0,35 0,34 0,34 0,34 0,34 0,34 0,34

(109) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 90 Konsentrasi 300 μg/ml Absorbansi konsentrasi 300 μg/ml Waktu (menit) replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 5 0,7441 0,7421 0,7398 10 0,7172 0,7267 0,7183 15 0,7013 0,6845 0,6894 20 0,6698 0,6564 0,6579 25 0,6458 0,6491 0,6493 30 0,6389 0,6488 0,6490 35 0,6387 0,6487 0,6488 40 0,6385 0,6486 0,6486 45 0,6388 0,6484 0,6484 0,6484 0,6485 50 0,6386 OT yang diperoleh 30 menit Konsentrasi 500 μg/ml 500 μg/ml Waktu (menit) replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3 5 0,5183 0,5038 0,4998 10 0,5019 0,4999 0,4835 15 0,4931 0,4632 0,4540 20 0,4531 0,4386 0,4093 25 0,4293 0,4094 0,3946 30 0,3898 0,3897 0,3897 35 0,3896 0,3896 0,3896 40 0,3897 0,3894 0,3895 45 0,3896 0,3895 0,3895 0,3894 0,3893 50 0,3895 OT yang diperoleh 30 menit

(110) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 91 Lampiran 12. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH %IC = Absorbansi larutan kontrol – Absorbansi sampel 1. Rutin Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 Absorbansi larutan pembanding %IC 5 0,7880 12,1614 10 0,6992 22,0600 0,5887 34,3774 20 0,4950 44,8222 25 0,3978 55,6571 Absorbansi larutan pembanding %IC 5 0,7757 13,4553 10 0,6786 24,2887 0,5685 36,5726 20 0,4950 48,0531 25 0,3599 59,8460 Konsentrasi (μg/ml) 15 Konsentrasi (μg/ml) 15 Absrobansi kontrol DPPH x 100% 0,8971 Absrobansi kontrol DPPH 0,8963 Absorbansi larutan pembanding %IC 5 0,7944 11,6155 10 0,6817 24,1544 0,5899 34,3680 20 0,4867 45,8500 25 0,3784 57,8994 Konsentrasi (μg/ml) 15 Absrobansi kontrol DPPH 0,8988 Persamaan regresi linear y= 2,1951x + 0,8895 r = 0,9996 Persamaan regresi linear y= 2,3309x + 1,4794 r = 0,9999 Persamaan regresi linear y= 2,2853x + 0,4984 r = 0,9996

(111) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 92 Contoh perhitungan %IC replikasi 1 : a. Konsentrasi 5 μg/mL %IC = 0,8971 – 0,7880 0,8971 x 100% %IC = 12,1614 % b. Konsentrasi 10 μg/mL %𝐼𝐶 = 0,8971 − 0,6992 × 100% 0,8971 %IC = 22,0600 % c. Konsentrasi 15 μg/mL %𝐼𝐶 = 0,8971 − 0,5887 × 100% 0,8971 %IC = 34,3774% d. Konsentrasi 20 μg/mL %𝐼𝐶 = 0,8971 − 0,4950 × 100% 0,8971 %IC = 44,8222% e. Konsentrasi 25 μg/mL %𝐼𝐶 = 0,8971 − 0,3978 × 100% 0,8971 %IC = 55,6571%

(112) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 93 2. Ekstrak metanolik akar apu-apu Replikasi 1 Replikasi 2 Absorbansi ekstrak metanolik akar apu-apu %IC 100 0,7845 11,5658 200 0,6817 23,5821 0,6453 34,6973 400 0,5381 46,1053 500 0,3872 58,3249 Absorbansi ekstrak metanolik akar apu-apu %IC 100 0,7860 11,1764 200 300 0,6835 0,6431 22,7596 34,6593 y= 0,1164x – 0,3503 0,5416 0,3882 46,9884 57,2607 r = 0,9993 Absorbansi ekstrak metanolik akar apu-apu %IC Persamaan regresi linear 0,7864 0,6791 11,7693 23,8079 0,6502 34,8816 0,5423 0,3892 45,3270 57,4554 Konsentrasi (μg/ml) 300 Konsentrasi (μg/ml) Absrobansi kontrol DPPH 0,8871 Absrobansi kontrol DPPH 0,8849 400 500 Replikasi Konsentrasi (μg/ml) Absrobansi kontrol DPPH 100 200 3 300 400 500 0,8913 Persamaan regresi linear y= 0,1160x + 0,0427 r = 0,9998 Persamaan regresi linear y= 0,1129x + 0,7809 r = 0,9994

(113) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 94 Contoh perhitungan %IC replikasi 1 : a. Konsentrasi 100 μg/mL %IC = 0,8871 – 0,7845 0,8871 x 100% %IC = 11,5658 % b. Konsentrasi 200 μg/mL %IC = 0,8871 – 0,6817 0,8871 x 100% %IC = 23,5821 % c. Konsentrasi 300 μg/mL %IC = 0,8871 – 0,6453 0,8871 x 100% %IC = 34,6973% d. Konsentrasi 400 μg/mL %IC = 0,8871 – 0,5381 0,8871 x 100% %IC = 46,1053% e. Konsentrasi 500 μg/mL %IC = 0,8871 – 0,3872 0,8871 %IC = 58,3249% x 100%

(114) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 95 Lampiran 13. Perhitungan nilai IC50 rutin dan ekstrak metanolik akar apuapu 1. Rutin Replikasi Persamaan regresi linear y IC50 x (nilai IC50) μg/ml 1 y = 2,1951x + 0,8895 50 22,3728 2 y = 2,3309x + 1,4794 50 20,8162 3 y = 2,2853x + 0,4984 50 21,6609 Replikasi IC50 1 22,3728 2 20,8162 3 21,6609 Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 2,1951x + 0,8895 50 = 2,1951x + 0,8895 x = 22,3728 μg/ml Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 2,3309x + 1,4794 50 = 2,3309x + 1,4794 x = 20,8162 μg/ml SD 𝑥 (μg/ml) 𝑥 ± SD 0,7792 21,6166 21,6166 ± 0,7792

(115) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 96 Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 2,2853x + 0,4984 50 = 2,2853x + 0,4984 x = 21,6609 μg/ml 2. Ekstrak metanolik akar apu-apu Replikasi Persamaan regresi linear y IC50 x (IC50) μg/ml 1 y = 0,1160x + 0,0427 50 430,6663 2 y = 0,1164x – 0,3503 50 432,5687 3 y = 0,1129x + 0,7809 50 435,9530 Replikasi IC50 1 430,6663 2 432,5687 3 435,9530 Replikasi 1 Persamaan regresi linear y = 0,1160x + 0,0427 50 = 0,1160x + 0,0427 x = 430,6663 μg/ml SD 𝑥 (μg/ml) 𝑥 ± SD 2,6777 433,0627 433,0627 ± 2,6777

(116) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 97 Replikasi 2 Persamaan regresi linear y = 0,1164x – 0,3503 50 = 0,1164x – 0,3503 x = 432,5687 μg/ml Replikasi 3 Persamaan regresi linear y = 0,1129x + 0,7809 50 = 0,1129x + 0,7809 x = 435,9530 μg/ml

(117) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 98 Lampiran 14. Uji statistik

(118) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 99 a. Uji normalitas (Uji Shapiro-Wilk) Hipotesis null (H0) = data terdistribusi normal Hipotesis alternatif (H1) = data tidak terdistribusi normal Taraf kepercayaan 95% Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak H1 diterima. Jika p-value kurang dari 0,05 maka H1 ditolak H0 diterima. Data IC50 rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu terdistribusi normal karena p-value rutin = 0,9061 dan p-value ekstrak metanolik akar apu-apu = 0,6936. Jadi, H1 ditolak dan H0 diterima. Kesimpulannya, data terdistribusi normal.

(119) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 100 b. Uji varian data H0 = varian data tidak berbeda signifikan (homogen) H1 = varian data berbeda secara signifikan (tidak homogen) Taraf kepercayaan 95% Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak, H1 diterima Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak, H0 diterima Varian data IC50 rutin dan ekstrak metanolik homogen, karena p-value tidak kurang dari dari 0,05. c. Uji t two-sample (independen) H0 = data tidak berbeda H1 = data berbeda secara signifikan Taraf kepercayaan 95% Jika p-value kurang dari 0,05 maka H0 ditolak, H1 diterima Jika p-value tidak kurang dari 0,05 maka H1 ditolak, H0 diterima IC50 rutin dan ekstrak metanolik akar apu-apu berbeda secara signifikan, karena p-value kurang dari 0,05.

(120) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 101 BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picryhydrazyl) Ekstrak Metanolik Akar Apu-apu (Pistia stratiotes L.)” memiliki nama lengkap Eunike Yosefina Kurniawan. Penulis lahir di Salatiga, 28 Maret 1993, merupakan anak pertama dari pasangan Yusuf dan Anny Widarwati. Penulis telah menyelesaikan pendidikan formalnya di TK Kristen 03 Salatiga pada tahun 1995-1998, SD Kristen 03 Salatiga pada tahun 19982004, SMP Kristen Satya Wacana Salatiga pada tahun 2004-2007, dan SMA Kristen Satya Wacana Salatiga pada tahun 2007-2010. Penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi S1 di Fakultas Farmasi. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis pernah menjadi asisten dosen untuk mata kuliah Praktikum Botani Farmasi (2013). Penulis cukup aktif dalam organisasi, kegiatan ,dan kepanitiaan mahasiswa antara lain menjadi koordinator Divisi Kaderisasi ISMAFARSI periode 20112012, Anggota PKM-M lolos seleksi dana hibah Dikti tahun 2012, Panitia Seminar Nasional Pemberdayaan Pasien dalam Self Management Diabetes Melitus untuk Meningkatkan Kualitas Hidup tahun 2011, dan Asisten Dosen Praktikum Botani Farmasi tahun 2013.

(121)

Dokumen baru

Tags

Dokumen yang terkait

Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu (Piper sarmentosum Roxb.).
1
2
56
Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada (Piper nigrum L.).
0
0
63
Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun cabe Jawa (Piper retrofractum Vahl.).
0
0
69
Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus (Piper cubeba L.).
0
0
55
Penetapan kadar fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun adas (foeniculum vulgare mill.) menggunakan metode dpph.
0
5
88
Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.).
3
18
115
Penetapan kandungan senyawa fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air (nasturtium officinale r.br.) dengan menggunakan metode DPPH.
1
7
122
Penetapan kadar fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun adas (foeniculum vulgare mill.) menggunakan metode dpph
1
1
86
Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun dudu
0
0
54
Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total fraksi air ekstrak metanolik buah labu siam (Sechium edule Jacq. Swartz.) - USD Repository
0
0
130
Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etilasetat ekstrak metanolik daun apel beludru (Diospyros blancoi A.DC.) - USD Repository
0
0
105
Penetapan kandungan senyawa fenolik total dan uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air (nasturtium officinale r.br.) dengan menggunakan metode DPPH - USD Repository
0
7
120
Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep (Erythrina subumbrans (Hassk.) Merr.) - USD Repository
0
0
113
Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1 Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etilasetat ekstrak metanolik kulit batang apel beludru (Diospyros blancoi A.DC.) - USD Repository
0
0
107
Penetapan kandungan fenolik total dan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ekstrak metanolik daun Apu-Apu (Pistia stratiotes L.) - USD Repository
0
2
111
Show more