Teknik PCR-.

Gratis

0
1
6
2 years ago
Preview
Full text
TEKMKPCR oleh Drs. Agus Hery Susanto, M.S. staf pengajar Fakultas Biologi Unsoed Pendahuluan Teknik PCR (polymerase chain reaction) digunakan untuk menggandakan fragmen DNA (urutan basa nukleotida) tertentu secara in vitro melalui reaksi polimerisasi DNA secara berulang-ulnng selama beberapa siklus reaksi. Teknik yang ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1987 ini telah mengalami berbagai macam modifikasi dan penggunaannya meliputi ruang lingkup yang begitu luas. Komponen PCR Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (templat), molekul oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 3'-OH bebas yang berflrngsi sebagai prekursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dan enzim DNA polimerase. DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence). Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul primer. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggat yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salatr satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membuhrhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95"C). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah berasal dari bakteri lag DNA polimerase, Ymg termofilik Thermus aquaticus. bio.unsoed.ac.id Tahapan PCR Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat, penempelan primer, dan polimerisasi primer, yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95'C, 50oC, dan 70'C. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada khap selaqiutny4 masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggat DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer ma}u (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari 5' DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalandariujung 5'ke 3'atantberarti dariujung i'l@ 5'untaitemplatnyo). Dengan tempat penempelannya hingga ujung jika demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA. Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi temptat pada putaran reaksi berikutrnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2" - 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifrkasi). Bisa dibayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 220 *2.20 = 1.048576 - 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saj4 maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak. bio.unsoed.ac.id urutan tareet 5' ^. ----Lr 5', nNe templat awal berupa DNA untai ganda (te|'c) fr"o,urosi i 5', 5' primer ft soil U*r*oetan primer maju 5' -t' ) 3' <# primermundur 5' (Y7o $r,**isasiprimer a) J. 5 Gambar 1. Putaran Pertama PCR Perancangan Primer penempelan primer' Sepasang Tahapan PCR yang paling menentukan adalah yang akan dipolimerisasi primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) pada kedua ujung fragmen masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya atau setidakyang akan diamplifikasi. untuk itu urutan basanya harus komplementer basa kedua daerah ujung tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan mengetahui dengan pasti urutan fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum tertentu untuk merancang urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara basa kedua primer yang akan digunakan' bio.unsoed.ac.id mempunyai kemiripan Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga urutan serupa dari sejumlah dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah sebagai contoh, spesies/strain organisme rainnya yang terah diketahui/dipublikasikan. dapat mengamplifikasi sebagian gen untuk merancang sepasang primer yang diharapkan gen dapat digunakan informasi urutan basa lipase pada isolat Bacillustermofilik tertentu P' mendocina ' dan sebagainya' yang lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescenso sebelumnya telah diketahui' strain tersebut kemudian urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai yang memperlihatkan homologi tinggi antara dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih daerah testari (conserved area)' satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan lestari inilah yang akan menjadi urutan basa Sebagiadseluruh urutan basa pada daerah primer. metalui penjajaran urutan asam sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan ini kemudian diturunkan ke urutan basa amino pada tingkat protein. Urutan asam amino akan diperoleh lebih dari satu urutan DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin disandi oteh lebih dari satu triplet kodon' basa DNA karena setiap asam amino dapat yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa Dengan demikian, urutan basa primer ini dinamakan primer degenerate' kemungkinan. Primer dengan urulan basa semacam penjajaran urutan basa DNA pun dapat selain itu, primer yang disusun melalui pun basa pada daerah lestari di tingkat DNA merupakan primer degeneratekarena urutan tidakselamanyamemperlihatkanhomologisempurna(100%). Urutanbasapasanganprimeryangtelahdisusunkemudiandianalisis kemungkinan terjadinya primermenggunakan program komputer untuk mengetahui atau homologi silang (cross-homologt)' dimer akibat homologi sendiri (setf-homologt) salah tempel (mispriming)' yaitu Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya juga dilakukan untuk mengetahui titik penempelan primer di luar sekuens target. Analisis GC-nya. Sepasang primer yang baik leleh (I,,|) masing-masing primer dan kandungan harusmempunyaiT.Yw|relatifsamadengankandunganGCyangcukuptlnggi. bio.unsoed.ac.id 5', 3', 5o pendek yang diinginkan Fgnen J 5o 3' --31 5', J J 5' 3', 5', *5' fragmen pendek fang diinginkan 3', Gambar 2. Hasil PCR putaran kedua dan ketiga Penutup dalam Melatui teknik PCR dapat diperoleh sejumtah besar fragmen DNA tertentu waktu yang relatif singkat. Namun, keberhasilan amplifikasi dengan teknik PCR yang ditentukan oleh berbagai faktor terutama kompatibilitas primer oligonukleotida digrurakan. Daftar Pustaka Molecular Alberts,8., Johnson, A., Lewis, J., Rafr, M., Roberts, K., and walter, P.2007' Biology of the Cell 5tr Ed. Garland Science, New York' Ed' oxford Elliott, W.H. and Elliott, D.c. 2001. Biochemistry and Molecular Biology 2nd bio.unsoed.ac.id University Press, Oxford. Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C.A., Krieger, M., Sco$, M.P., Bretscher, A., Ploegh, H., and Matsudara.2OOT.Molecular Cell Biology 6m Ed. W.H. Freemarq New York. Watson, J.D., Baker, T.A., Bell, S.P., Gann, A.A.F., Levine, M., and Losick, R.M. 2007. Molecular Biology of the Gene 6n Ed. Benjamin cummings, New York. bio.unsoed.ac.id

Dokumen baru

Dokumen yang terkait

Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction)
2
12
82
Analisis Cemaran Daging Babi Pada Kornet Sapi di Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
3
16
72
Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)
1
9
66
Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real- Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode Hydrolysis Probe.
1
51
86
Amplifikasi DNA Leptospira dengan menggunakan metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)
2
24
64
Bacterial Diversity in Subbituminous Coal and Soil from Coal Mine of South Sumatra, Indonesia
0
17
8
Skrining Single Nucleotide Polymorphysm rs855791 (C>T) pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta untuk Mengetahui Kemungkinan Menderita Iron Refractory Deficiency Anemia dengan Menggunakan Teknik R
4
38
101
Perbandingan Teknik Ekstraksi DNA dan Optimalisasi Metode Analisis Molekuler Padi Transgenik dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)
0
11
37
Analisis Keragaman Genetik Kura-Kura Daun (Cyclemys Dentata) Dengan Teknik PCR-RFLP
0
6
29
Teknik RAPD Kelapa dengan Metode Ekstraksi DNA dan Kit PCR yang Berbeda
0
10
3
Perbandingan metode KIT komersial dan SDS untuk isolasi DNA babi dan DNA sapi pada simulasi cangkang kapsul keras untuk deteksi kehalalan menggunakan real-time PCR (polymerase chain reaction)
0
12
82
Peranan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Terhadap Perkembangan Ilmu Pengetahuan
0
0
23
TAP.COM - : TEKNIK ISOLASI DNA DAN ANALISIS PCR GEN PINII PADA GENOM ...
0
0
8
Analisis Multidrug Resistensi Terhadap Antibiotik Pada Salmonella typhi Dengan Teknik Multiplex PCR
0
0
10
Amplifikasi DNA dengan teknik PCR
0
0
7
Show more