Sintesis turunan arilamida-2 dan uji aktivitas in vitro terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) sebagai kandidat anti-kanker payudara - USD Repository

Gratis

0
0
47
2 weeks ago
Preview
Full text
(1)PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh: Benedictus Wisnu Putra Jati NIM: 158114102 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2019

(2) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI SINTESIS TURUNAN ARILAMIDA-2 DAN UJI AKTIVITAS IN VITRO TERHADAP MATRIX METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) SEBAGAI KANDIDAT ANTI-KANKER PAYUDARA SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh: Benedictus Wisnu Putra Jati NIM: 158114102 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2019 i

(3) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ii

(4) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI iii

(5) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN “Barangsiapa Ingin Mutiara Harus Berani Terjun di Lautan yang Dalam” (Ir. Soekarno) “Sesungguhnya aku ini adalah Hamba Tuhan, terjadilah padaku menurut perkataanMu itu” (St. Perawan Maria) (Lukas 1:38) Karya ini saya persembahkan kepada Tuhan Yesus Kristus Bapak, Ibu, dan Keluarga tercinta Teman-teman dan sahabat Teman-teman Farmasi Angkatan 2015 Dan Almamaterku Universitas Sanata Dharma iv

(6) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI v

(7) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI vi

(8) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji Syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat dan rahmat-Nya, skripsi yang berjudul Sintesis Turunan Arilamida-2 dan Uji Aktivitas In Vitro Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Maywan Hariono, Ph.D., Apt. yang didanai oleh Indonesian Toray Science Foundation (ITSF) 2017-2018 dengan judul “Synthesis, enzymatic assay, and molecular modelling of purine derivatives targeting hemopexin domain of matrix metalloproteinase-9 (PEX-9) in the discovery of novel anti-breast cancer”. Penulis juga ingin memberikan apresiasi yang besar kepada berbagai pihak yang telah memberikan dukungan, bimbingan, dan bantuan dalam penyelesaian naskah skripsi ini, tanpa mereka penulis tidak akan bisasampai pada tahap ini. Oleh karena itu, peneliti ingin mengucapkan terimakasih yang besar kepada: 1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 3. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing skripsi yang telah membimbing tim penelitian dengan sabar, selalu memberikan perhatian, semangat, dukungan, motivasi, kritik, dan saran dari awal hingga akhir penyusunan skripsi ini. 4. Ibu Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt. dan Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang selalu memberikan semangat, kritik, dan saran yang membangun untuk penulis menyelesaikan skripsi ini. 5. Bapak Christianus Heru Setiawan, M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing akademik yang selalu memberikan motivasi, semangat, dan perhatian untuk kemajuan penulis. vii

(9) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 6. Bapak Matius Abdullah Chaidir dan Ibu Gertruda Tri Teguh Rahayu, S.Pd. yang selalu memberikan dukungan, motivasi, semangat, dan doa untuk mendampingi penulis menyelesaikan skripsi ini. 7. Teman-teman seperjuangan penelitian “Skripsi Kok Analog” Kevin, Krisna, Ervan, Aldo, dan Sangga yang telah berjuang dan bekerja sama dengan penulis melewati suka dan duka dalam menyelesaikan penelitian ini. 8. Sahabat tercinta “Dolan Squad” dan “Quebec” Aldo, Krisna, Retha, Bulin, Inge, dan Masrud yang telah menjalani bersama masa suka dan duka dalam dunia perkuliahan dalam tiga setengah tahun ini. 9. Teman dan keluarga Drug Discovery Research Group terutama para senior Tito, Diana, dan Eko serta divisi penelitian dan pengembangan BEMF Farmasi 2017-2018 yang telah membantu penulis dalam penelitian ini. 10. Sahabat tercinta Almarhum Andreas Ardi Marwanto yang juga menjadi salah satu motivasi penulis untuk masuk dalam dunia penemuan obat khususnya kanker ini. 11. Aurel, Wanda, Laras, Rio, Echa, Dodo, Gilang, Ega, dan Vidan selaku sahabat terbaik sejak kecil yang juga selalu hadir dalam jalinan persahabatan bersama penulis. 12. Pak Parlan, Mas Kunto, Pak Wagiran, dan Mas Bimo selaku laboran yang selalu membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian. 13. Teman-teman kelas FSM C 2015 dan Angkatan 2015 yang memberikan dinamika dan kenangan yang indah selama masa perkuliahan di farmasi. 14. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu telah mendukung penyelesaian naskah skrripsi ini. Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam skripsi ini. Oleh karena itu penulis sangat mengharapkan kritik, saran, dan masukan yang membangun untuk perbaikan skripsi ini. Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat untuk pengembangan ilmu pengetahuan dan penelitian khususnya dalam bidang farmasi penemuan obat. Terimakasih. Yogyakarta, 30 januari 2019 Penulis viii

(10) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL....................................................................................... HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................. HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... HALAMAN PERSEMBAHAN ..................................................................... PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................................... PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ......................................................... PRAKATA ...................................................................................................... DAFTAR ISI ................................................................................................... DAFTAR TABEL ........................................................................................... DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... ABSTRAK ...................................................................................................... ABSTRACT .................................................................................................... PENDAHULUAN .......................................................................................... METODE PENELITIAN ................................................................................ HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... KESIMPULAN ............................................................................................... SARAN ........................................................................................................... UCAPAN TERIMAKASIH ............................................................................ DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... LAMPIRAN .................................................................................................... BIOGRAFI PENULIS .................................................................................... ix i ii iii iv v vi vii ix x xi xii xiii xiv 1 4 7 18 18 19 20 23 32

(11) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel I. Tabel II. Tabel III. Tabel IV. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2 ....................... Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2 ......................... Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2 ........................ Hasil uji aktivitas in vitro senyawa turunan arilamida-2............ x 10 11 14 18

(12) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour et al. 2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa arilamida-2 ................................................................................... Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai katalis nukleofil. .......................................................................... Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa turunan arilamida-2 .............. Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa turunan arilamida-2 ............. Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b) benzokain (diadaptasi dari Anderson et al., 2004) ........................ Gambar 6. Kromatogram (a) dan spektrum massa (b) turunan arilamida-2 .. xi 3 8 10 13 15 16

(13) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Dokumentasi hasil sintesis, dan profil KLT senyawa turunan arilamida-2 ................................................................................ Lampiran 2. Uji DAB-HCl ............................................................................ Lampiran 3. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen senyawa arilamida-2 ................................................................................ Lampiran 4. Perbesaran puncak pada spektrum 1H-NMR ............................ Lampiran 5. Usulan mekanisme fragmentasi molekul utuh dan base peak senyawa arilamida-2 pada spektrometri massa ........................ Lampiran 6. Desain well plate untuk uji aktivitas in vitro ............................ xii 23 25 26 27 30 31

(14) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRAK Enzim MMP-9 diekspresikan secara tinggi pada kanker payudara dengan permasalahan, inhibitor yang telah dirancang untuk enzim tersebut bersifat tidak selektif sehingga menyebabkan efek samping yang merugikan. Pada penelitian ini telah disintesis senyawa arilamida-2 sebagai penghambat MMP-9 yang dirancang lebih selektif dengan menghambat hemopexin domain MMP-9 (PEX-9). Senyawa arilamida-2 berhasil disintesis dengan mereaksikan benzokain dan 3bromopropionil klorida dengan katalisator piridin melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil. Senyawa hasil sintesis dilakukan uji organoleptis, kelarutan, titik lebur, dan warna dengan DAB-HCl. Produk yang terbentuk berupa serbuk berwarna putih, larut dalam etil asetat, kloroform, dan DMSO. Titik lebur senyawa hasil sintesis adalah 116-124oC yang bereaksi negatif terhadap DAB-HCl mengindikasikan gugus amina primer dari benzokain sudah tersubstitusi. Senyawa hasil sintesis dipastikan strukturnya dengan menggunakan 1H-NMR, 13C-NMR, FTIR, dan GC-MS. Spektrum 1H-NMR menunjukan proton etilen pada geseran kimia 2-4 ppm dan karbon etilen pada 20-40 ppm untuk 13C-NMR. Gugus karbonil amida dideteksi dengan FTIR muncul pada 1535 cm-1 sementara bobot molekul senyawa hasil sintesis dideteksi dengan MS sebesar m/z 299. Hasil uji aktivitas in vitro terhadap enzim MMP-9 menunjukan persentase penghambatan enzim MMP9 sebesar 36% yang berasosiasi dengan aktivitas rendah-sedang senyawa arilamida2 sebagai inhibitor MMP-9. Kata kunci : Arilamida-2, kanker payudara, MMP-9, PEX-9, uji aktivitas in vitro xiii

(15) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT MMP-9 is highly expressed in breast cancer with the major issue, the inhibitor which has been designed for the corresponding enzyme having nonselective properties, therefore this causes some adverse drug reactions. In this study, it has been synthesized arylamide-2 as MMP-9 inhibitor which is designed to be more selective by inhibiting hemopexin domain of MMP-9 (PEX-9). Arylamide-2 was successfully synthesized by reacting benzocaine and 3-bromopropionyl chloride using pyridine as the catalyst through the mechanism of acyl nucleophilic substitution reactions. Synthesized compound was carried out by an organoleptic, solubility, melting point, and color with DAB-HCl test. The product was formed as a white powder which is soluble in ethyl acetate, chloroform, and DMSO. The melting point of the synthetic product was measured at 116-124oC, while negatively reacting with DAB-HCl indicating that primary amine has been substituted. The synthesized compound structure was confirmed using 1H-NMR by showing ethylene proton at 2-4 ppm whereas the ethylene-carbon appears at 20-40 ppm as confirmed by 13C-NMR. The amide carbonyl group was indicated at 1535 cm-1 as confirmed by FTIR while the molecular weight was detected using GC-MS by showing m/z 299. The result showed that arylamide-2 was able to inhibit MMP-9 with percentage inhibition of 36% at 200 µg/ml concentration associating with its potency as weak to moderate inhibitor of MMP-9 in searching of anti-breast cancer candidate. Keyword: Arylamide-2, breast cancer, MMP-9, PEX-9, in vitro activity bioassay xiv

(16) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PENDAHULUAN Kanker merupakan penyakit kedua penyebab utama kematian di dunia. Pada tahun 2018, terdapat 18,1 juta kasus kanker baru di dunia. Kanker payudara merupakan kasus yang paling sering terjadi pada wanita (World Health Organization, 2018). Pada tahun 2013, kanker payudara merupakan salah satu kanker dengan prevalensi tertinggi di Indonesia yaitu sebesar 0,5%. Daerah Istimewa Yogyakarta merupakan provinsi dengan prevalensi kanker payudara tertinggi yaitu sebesar 2,4% (Kementrian Kesehatan RI, 2016). Menurut World Health Organization (2014), kematian akibat kanker payudara pada wanita di Indonesia cukup tinggi yaitu sebesar 21,4%. Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pertumbuhan sel yang tidak normal dan tidak teratur yang disebabkan oleh mutasi genetik serta dapat mengalami invasi dan penyebaran sel dari satu bagian tubuh ke bagian tubuh yang lain. Metastasis menjadi penyebab utama kematian pada penderita kanker (Pecorino, 2012). Menurut American Cancer Society (2018) metastasis sel kanker ke organ-organ viseral seperti pankreas, kolon, dan paru-paru merupakan hal yang paling membahayakan nyawa dengan memperpendek harapan hidup kurang dari 5 tahun pada 20% penderita kanker secara umum. Lebih daripada itu, metastasis menyebabkan kematian pada 90% penderita kanker (Alford, 2017). Pada tahun 2014, menurut penelitian yang dilakukan Yousef et al. (2014) enzim Matrix Metalloproteinase 9 (MMP-9) diekspresikan tinggi pada sel kanker payudara dibandingkan dengan sel payudara normal. Selain itu, ditemukan overexpression MMP-9 pada kanker payudara jenis triple-negative dan Human Epidermal Receptor Growth Factor Receptor 2 positive (HER 2-positive). Merdad et al., (2014) juga mengemukakan bahwa MMP-9 diekspresikan tinggi pada 97,5 % penderita kanker payudara Infiltrating Ductal Carcinoma (IDC), serta pada 5262% penderita kanker payudara Human Epidermal Receptor (HER). Enzim MMP-9 merupakan salah satu peptidase yang termasuk dalam subfamilia dari enzim matrix metalloproteinase (MMP). MMP merupakan enzim jenis zinc-dependent endopeptidase yang bekerja dengan mendegradasi protein extracellular matrix (ECM). Di dalam tubuh manusia terdapat 23 jenis enzim MMP 1

(17) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI yang diklasifikasikan kedalam 6 jenis subfamilia MMP berdasarkan spesifitasnya terhadap substrat (collagenases, gelatinases, stromelysins, matrilysins, enamelysin, membrane type MMPs) (Benson et al., 2013). MMP-9 tergolong ke dalam subfamilia MMP gelatinase B karena substratnya adalah gelatin. Degradasi ECM oleh MMP-9 sangat penting pada proses kanker untuk memicu proses angiogenesis dan metastasis sel kanker yang dapat bermigrasi ke daerah tubuh yang lain (Stankovic et al., 2010). Melihat pentingnya peran enzim MMP pada kanker, beberapa industri farmasi telah merancang beberapa obat yang memiliki sifat penghambatan pada MMP (MMP inhibitors) yang diharapkan mampu menjadi salah satu terapi kanker. Namun, sebagian besar obat tersebut gagal melewati uji klinis karena kurang selektif sehingga menimbulkan efek samping yang besar. Sebagai contoh, marimastat menimbulkan efek samping berupa nyeri muskoskeletal dan inflamasi (Cathcart et al., 2015). Sebagian besar MMP memiliki struktur genomik yang sama yaitu propeptide region, catalytic domain, linker peptide (hinge region), dan hemopexin domain (Nagase et al., 2006). Kegagalan MMP inhibitors tersebut karena sebagian besar obat yang telah dirancang sebagai MMP inhibitor memiliki spesifisitas yang rendah (Vandenbroucke dan Libert, 2014). Hal ini disebabkan obat-obat tersebut mentargetkan catalytic domain yang memiliki persamaan sekuens asam-asam amino (homologi) yang tinggi pada sebagian besar MMP (4365%) (Dufour et al., 2011). Hemopexin domain MMP-9 (PEX-9) memiliki perbedaan sekuens asam amino dengan MMP yang lain dengan homologi sebesar 25-35% (Dufour et al., 2011) yang menyebabkan masing-masing MMP spesifik terhadap substrat, sehingga dapat dijadikan target untuk merancang MMP inhibitor yang selektif (Piccard et al., 2007). Studi hemopexin domain pada MMP-9 (PEX-9) diperlukan untuk pengembangan senyawa-senyawa yang lebih selektif. Alford et al. (2017) telah melakukan penelitian terhadap PEX-9 dengan penemuan dan sintesis 14 senyawa aktif secara in silico dan in vitro. Senyawa yang paling aktif adalah senyawa 3c dengan Kd = 320 nM. Penelitian Alford et al. (2017) tersebut dilatarbelakangi oleh penelitian Dufour et al. (2011) yang sebelumnya telah 2

(18) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI melakukan penelitian tentang PEX-9 dan menemukan 5 senyawa aktif berdasarkan penapisan virtual dengan metode in silico, uji in vitro, dan uji in vivo pada tikus yang telah diinduksi dengan sel kanker MDA-MDB 435 sehingga mengalami karsinogenesis. Senyawa yang paling aktif adalah CID135415473 www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov yang dinamakan senyawa 2 dengan Kd = 2,2 μM. Senyawa tersebut memiliki struktur relatif sederhana untuk disintesis sehingga berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut. Gugus yang berperan dalam aktivitas penghambatan PEX-9 adalah cincin planar yang memiliki interaksi dengan pocket blade PEX-9 dan juga memiliki arilamida yang terhubung oleh rantai alkil untuk berinteraksi di daerah permukaan pocket. Gambar 1(a) dan 1(b) menunjukkan struktur senyawa 2 yang ditemukan oleh Dufour et al. (2011) dan Alford et al. (2011). Gugus arilamida Cincin planar Rantai alkil (a) Gugus difluorometoksi Gugus arilamida Rantai alkil Gugus Fluoro Cincin planar (b) Gugus ester etil benzoat Rantai alkil Gugus arilamida (c) Gambar 1. Struktur senyawa dan farmakofor penting (a) senyawa 2 (Dufour et al. 2011), (b) senyawa 3c (Alford et al. 2017), (c) senyawa arilamida-2. 3

(19) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Pada penelitian kali ini telah disintesis senyawa fragmen dari senyawa 2 dengan mengambil sebagian farmakofor yang penting, yang akan diberi nama turunan arilamida-2. Farmakofor yang diadaptasi untuk disintesis ialah gugus arilamida dan rantai alkil. Selain itu juga dilakukan modifikasi pada posisi para dari cincin arilamida yaitu berupa ester etil benzoat. Struktur senyawa turunan arilamida-2 dapat dilihat pada gambar 1(c). Senyawa akan disintesis dengan mereaksikan benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalis piridin melalui mekanisme reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA). Kemudian senyawa turunan arilamda-2 tersebut akan diuji aktivitasnya terhadap enzim MMP-9 secara in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat menambah jumlah senyawa penghambat PEX-9 yang diharapkan aktif dan selektif sebagai kandidat anti-kanker payudara. METODE PENELITIAN Bahan Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian kecuali dinyatakan lain bermutu analisis yang disuplai dari Sigma Aldrich dan Merck. Bahan-bahan untuk sintesis meliputi: benzokain mutu farmasetis (ethyl 4-aminobenzoate), 3bromopropionil klorida mutu pro analisis, piridin mutu pro analisis, natrium karbonat mutu teknis (Na2CO3), plat kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel GF254, pelarut organik sebagai fase gerak (n-heksana dan etil asetat) mutu pro analisis, dan 4-dimetilano benzaldehid HCl (DAB-HCl) mutu pro analisis. Bahan-bahan untuk elusidasi struktur meliputi: pellet kalium bromide mutu pro analisis untuk FTIR dan pelarut kloroform-D (CDCl3) pro analisis untuk NMR. Bahan-bahan untuk uji aktivitas in vitro bermutu pro analisis meliputi: Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim MMP-9 terliofilisasi, substrat peptide, dapar, peptida NNGH sebagai kontrol positif, gliserol untuk rekonstitusi enzim, dan dimetilsulfoksida (DMSO) sebagai pelarut sampel. Alat Pada tahap sintesis alat-alat yang digunakan meliputi: timbangan analitik (Mettler Toledo®), pompa vakum (GAST model DOA-P504-BN), oven (Memmert 4

(20) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI GmbH + Co.KG), labu alas bulat (pyrex), pengaduk magnetik, lempeng panas, drupple plate, seperangkat alat uji titik lebur (Mettler Toledo®), lampu UV254, dan alat gelas pada umumnya. Ala-alat yang digunakan pada elusidasi struktur meliputi: kromatografi gas-spektrofotometer inframerah (GC-MS-QP2010S SHIMADZU), spektrometer nuclear magnetic resonance (Bruker 700 MHz dan 176 MHz), dan spektrometer massa. Alat-alat untuk uji in vitro meliputi: pipet mikro (Eppendorf), micro well plate 96, pipet tips, inkubator, vortex, ELISA Tecan Infinite 200 PRO microplate reader fluorescence. Prosedur Penelitian Sintesis Senyawa Arilamida-2 (Diadaptasi dari Arifiyanto, 2001) Dalam labu alas bulat dimasukkan benzokain sebanyak 3,59 mmol (0,59 g) kemudian ditambahkan piridin sebagai katalisator sebanyak 3,59 mmol (0,28 g ; 0,29 mL). Campuran diaduk selama 10 menit pada suhu kamar. 3-bromopropionil klorida ditambahkan tetes demi tetes sebanyak sebanyak 4,00 mmol (0,41 mL). Campuran diaduk kembali selama 30 menit hingga tebentuk padatan. Padatan disaring kemudian dinetralkan dengan Na2CO3 10% dan dicuci dengan akuades untuk menghilangkan sisa piridin, NaCl, dan CO2 sebagai produk samping. Serbuk hasil sintesis kemudian dihitung rendemennya. Uji Organoleptis Senyawa hasil sintesis dideterminasi bentuk dan warnanya. Uji Kelarutan Senyawa hasil sintesis diletakkan pada tabung reaksi kemudian ditetesi perlahan-lahan dengan kloroform, etil asetat, DMSO, etanol, air, n-heksana, dan aseton hingga larut dan ditentukan kategori kelarutannya berdasarkan Farmakope Indonesia V. Rekristalisasi Senyawa hasil sintesis ditetesi perlahan-lahan hingga tepat larut menggunakan pelarut kloroform dan diuapkan perlahan-lahan hingga terbentuk kristal. 5

(21) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Uji Warna dengan DAB-HCl Senyawa hasil sintesis diletakan di drupple plate kemudian ditetesi DABHCl. Perubahan warna dilihat dan dibandingkan dengan benzokain. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Serbuk hasil sintesis diuji kemurniannya dengan KLT menggunakan tiga sistem fase gerak hasil orientasi yaitu n-heksana: etil asetat 1:3; 2:2; 3:1 (diadaptasi dari metode Adhipandito, 2017) dan didapat fase gerak dengan pemisahan terbaik yaitu n-heksana: etil asetat 3:1. Serbuk hasil sintesis dilarutkan dalam etil asetat dan ditotolkan pada fase diam plat silika gel GF254 kemudian dieluasi dengan fase gerak terpilih. Bercak dideteksi dibawah lampu UV254. Uji Titik Lebur Senyawa hasil sintesis dimasukan kedalam pipa kapiler kemudian dimasukan ke dalam alat pengukur titik lebur. Suhu diatur 85-150oC kemudian senyawa diamati suhu saat pertama kali melebur hingga semua habis. Jarak lebur didokumentasikan. Elusidasi Struktur Senyawa hasil sintesis dielusidasi strukturnya menggunakan NMR, FTIR, dan GC-MS yang dilakukan di Fakultas MIPA UGM, Sleman, DIY dan Institut Farmasetikal dan Nutrasetikal, Malaysia dengan metode standar yang sudah dilakukan di masing-masing tempat tersebut. Uji aktivitas in vitro Kit enzim MMP-9 terdiri dari enzim MMP-9 yang terliofilisasi, substrat fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based MMP-9, dapar uji MMP-9, dan NNGH inhibitor sebagai kontrol positif yang didapatkan dari Biovision. Enzim yang terliofilisasi direkonstitusi dengan 110 µ L gliserol 30% dalam deionised water. Enzim yang sudah terekonstitusi dilarutkan dalam 550 µL dapar dan siap digunakan untuk pengujian. Senyawa sampel disiapkan dengan cara dilarutkan dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 200 µ g/mL di dalam 96-microwell plate. Konsentrasi akhir DMSO dalam wellplate tidak lebih dari 2%. Setiap well berisi 44 µL dapar untuk uji senyawa hasil sintesis dan 45 µL dapar untuk kontrol negatif, 1 6

(22) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI µL senyawa hasil sintesis, 5 µL enzim, dan 50 µL substrat, desain well plate untuk uji in vitro dapat dilihat pada lampiran 6. Sampel dicampurkan dengan buffer dan enzim dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit. Substrat (40 µM) sebanyak 50 µL ditambahkan ke dalam campuran tersebut dan diinkubasi kembali pada suhu 37ºC selama 60 menit. Fluorosensi dibaca menggunakan ELISA Tecan Infinite 200 PRO microplate reader fluorescence dengan panjang gelombang eksitasi 325 nm dan emisi 393 nm dan dihitung persentase penghambatan enzim MMP-9 dengan rumus: 1− 𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑠𝑖𝑛𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 𝑥 100% 𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 HASIL DAN PEMBAHASAN Senyawa arilamida-2 disintesis dengan farmakofor cincin arilamida yang dihubungkan oleh rantai alkil. Penelitian ini akan mengeksplorasi gugus para cincin arilamida yaitu OCF2 pada senyawa 2 yang memiliki karakteristik electron donating group (EDG) pada gugus OC-R dan electron withdrawing group (EWG) pada gugus difluoro dengan penambahan gugus ester etil benzoat. Gugus ester etil bezoat mewakili karakter gugus electron withdrawing group (EWG). Sintesis Senyawa Arilamida-2 Metode sintesis senyawa arilamida-2 pada penelitian ini mengadaptasi dari metode Arifiyanto (2001). Bamane et al. (2011). White et al. (2012). Reaksi yang terjadi pada proses sintesis turunan arilamida-2 adalah substitusi nukleofilik asil antara benzokain dan 3-bromopropionil klorida dengan katalisator piridin (Montalbetti et al., 2005). Reaksi ini berlangsung antara gugus nukleofil NH2 pada benzokain menggantikan gugus pergi -Cl yang berikatan dengan gugus karbon asil pada 3-bromopropionil klorida (McMurry, 2016). Produk utama yaitu senyawa arilamida-2 dan produk samping reaksi berupa asam klorida (HCl). Mekanisme reaksi disajikan pada gambar 2. 7

(23) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Gambar 2. Reaksi substitusi asil nukleofilik antara benzokain dan 3bromopropionil klorida dengan menggunakan piridin sebagai katalis nukleofil. Reaksi berlangsung selama 30 menit hingga terbentuk produk yang diduga arilamida-2. Hal ini dibuktikan dengan nilai Rf pada profil KLT untuk benzokain sebesar 0,62 dan senyawa yang diduga arilamida-2 sebesar 0,36 dengan fase gerak n-heksana: etil asetat (3:1) yang disajikan pada Lampiran 1a menunjukkan hasil sintesis mempunyai noda yang berbeda dari bahan awal sintesis (benzokain). Produk awal hasil sintesis yang dihasilkan berupa padatan berwarna putih disajikan pada Lampiran 1b. Produk awal sintesis dinetralkan dan dilakukan pencucian dengan Na2CO3 dan akuades untuk menghilangkan NaCl, CO2 dan sisa piridin, pH yang diukur setelah pencucian adalah 7. Senyawa hasil sintesis setelah pencucian dan pengeringan berbentuk serbuk dan berwarna putih disajikan pada Lampiran 1c. Hasil rendemen dari senyawa arilamida-2 sebanyak 81,48%, yang perhitungan rendemennya disajikan pada lampiran 3. Rendemen yang dihasilkan cukup tinggi karena sebagian besar 3-bromopropionil klorida hampir habis bereaksi dengan benzokain. Hal ini dikarenakan gugus klorida pada 3-bromopropionil klorida merupakan gugus pergi yang baik (Zhang et al., 2009) dan piridin mampu mengkatalisis reaksi dengan baik (Montalbetti et al., 2005), sehingga memudahkan serangan nukleofilik yang dilakukan oleh benzokain. Rekristalisasi serbuk hasil sintesis menggunakan pelarut kloroform, namun dilakukan setelah pengujian titik lebur. Rekristalisasi pada senyawa hasil sintesis berhasil dilakukan karena 8

(24) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI kloroform memiliki titik didih yang rendah yaitu sebesar 62oC (Pubchem, 2019) sehingga mudah menguap sempurna (volatile). Uji warna dengan reagen DAB-HCl pada hasil sintesis ditujukan untuk memastikan senyawa arilamida-2 telah terbentuk. Senyawa dengan gugus amina primer akan bereaksi dengan DAB-HCl membentuk basa Schiff yang berwarna jingga, sedangkan yang tidak memiliki gugus amina primer tidak akan bereaksi (Adegoke, 2011). Senyawa arilamida-2 tidak bereaksi dengan DAB-HCl membentuk warna jingga karena gugus amina primernya sudah tersubstitusi menjadi amida. Mekanisme reaksi DAB-HCl dengan benzokain disajikan pada Lampiran 2a, sedangkan hasil uji warna berupa produk warna jingga disajikan pada Lampiran 2b. Senyawa arilamida-2 dilakukan uji titik lebur yang bertujuan untuk melihat kemurnian dengan membandingkan titik lebur dari senyawa hasil sintesis (produk) dan bahan awal (benzokain). Hasil yang diperoleh pada penelitian 3 kali replikasi yaitu pada rentang titik lebur di antara 119-127ºC, 114-124 ºC, dan 116-122 ºC dengan rata-rata 116-124oC. Senyawa dikatakan murni secara titik lebur jika memiliki rentang lebur sebesar 0,5-1,5oC (Mohrig et al., 2014). Hasil tersebut berbeda dengan benzokain yang memiliki titik lebur 88-90ºC (Sigma Aldrich, 2019). Hasil uji titik lebur menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis belum murni secara titik lebur. Hal ini dapat diatasi dengan pemurnian menggunakkan kromatografi kolom, KLT preparatif, dan rekristalisasi. Rekristalisasi sudah dilakukan namun karena keterbatasan alat uji titik lebur belum dapat dilakukan. Selain uji organoleptis, warna, dan titik lebur, uji kelarutan juga dilakukan terutama untuk menentukan pelarut yang akan digunakan dalam spektroskopi. Hasil uji kelarutan senyawa arilamida-2 ditunjukkan pada Tabel I. Berdasarkan hasil uji kelarutan, senyawa hasil sintesis larut dalam kloroform, etil asetat, dan DMSO sehingga memiliki sifat kelarutan semi polar. 9

(25) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel I. Hasil uji kelarutan senyawa turunan arilamida-2 Pelarut Senyawa Arilamida-2 Perbandingan Kategori Kelarutan FI V n-heksana Kloroform Etil asetat Aseton Etanol Air DMSO sangat sukar larut larut larut agak sukar larut agak sukar larut sangat sukar larut larut 1: 1000 1:30 1:20 1:60 1:100 1:1000 1:30 Elusidasi Struktur Spektrometri Resonansi Magnetik Inti Elusidasi struktur dilakukan dengan pelarut kloroform berdasarkan hasil uji kelarutan yang dilakukan terhadap senyawa hasil sintesis. Selain itu, kloroform juga tidak akan mengganggu pada pembacaan sinyal karena sinyal senyawa diprediksi berbeda dengan sinyal kloroform. Spektrum 1H-NMR disajikan pada Gambar 3. Y X Gambar 3. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2 10

(26) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel II. Hasil spektrum 1H-NMR senyawa arilamida-2 Proton Geseran kimia (ppm) Integrasi Splitting HA HB 1,39 2,85 dan 2,98 3 2 HC 3,71 dan 3,89 2 HD HE HF Pelarut (X) H2O (Y) 4,30 7,61 8,02 7,26 1,60 2 2 2 - triplet triplet of triplet triplet of triplet quartet doublet doublet singlet singlet J Coupling Constant (Hz) 7,7 6,3 dan 6,3 6,3 dan 6,3 7,7 7,7 7 - Sinyal pada geseran kimia 1,39 ppm (integrasi 3) (J = 7,7 Hz) merupakan sinyal dari proton HA. Integrasi menunjukkan jumlah proton pada atom yang dikenai gelombang radio. Integrasi yang muncul sudah sesuai dengan teori karena jumlah proton pada HA berjumlah 3. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan teori hukum pencacahan proton yaitu n+1 dengan n adalah jumlah proton tetangga yang tidak ekivalen secara kimia, sehingga sinyal yang muncul berupa triplet karena memiliki dua proton tetangga pada lingkungan kimia yang berbeda. Perbesaran sinyal HA disajikan pada Lampiran 4a. Sinyal pada geseran kimia 2,85 ppm (intergrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 2,98 (J= 6,3 Hz) ppm merupakan sinyal dari proton HB, sedangkan geseran kimia 3,71 ppm (integrasi 2) (J= 6,3 Hz) dan 3,89 ppm (J= 6,3 Hz) merupakan sinyal dari proton HC. Kedua sinyal tersebut menunjukkan proton pada rantai etilen yang fleksibel dan seharusnya muncul sebagai triplet. Namun, hasil percobaan berupa triplet of triplet. Hal ini dapat disebabkan oleh proton pada etilen bersifat free rotatable sehingga pada sudut tertentu proton yang terikat pada atom C yang sama memiliki lingkungan kimia yang berbeda, hal ini menyebabkan setiap proton mengenali tetangganya sebanyak dua kali sehingga muncul dua triplet. Kejadian ini dipastikan dengan jumlah integrasi dua triplet tersebut sebanding dengan 2 proton. Proton HC memiliki geseran kimia yang lebih jauh dari proton HB karena berdekatan dengan gugus halogen (Br) yang lebih bersifat elektronegatif (menarik elektron kulit 11

(27) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI terluarnya) daripada gugus karbonil amida yang berdekatan dengan HB sehingga membuat HC kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded) (Anderson, 2004). Perbesaran sinyal HB dan HC disajikan pada Lampiran 4b dan 4c. Sinyal pada geseran kimia sekitar 4,30 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz) merupakan sinyal dari proton HD. Sinyal yang muncul sudah sesuai berdasarkan teori yaitu muncul berupa quartet karena memiliki tiga proton tetangga pada lingkungan kimia yang berbeda. Geseran kimia proton HD bergeser pada ppm yang lebih jauh daripada proton HA yang merupakan proton tetangganya karena proton HD berikatan langsung dengan atom O yang elektronegatif sehingga cenderung menarik elektron atom C pada HD dan membuat HD kurang terlindungi dari medan magnet luar (de-shielded) serta mengubah orientasi spin-nya untuk bergeser pada ppm yang lebih jauh. Perbesaran sinyal HD disajikan pada Lampiran 4d. Sinyal pada geseran kimia 7,00 – 9,00 ppm merupakan daerah proton aromatik (Silverstein et al., 2005). Sinyal yang muncul pada geseran kimia tersebut adalah dua sinyal berbeda, yaitu pada geseran kimia sekitar 7,61 ppm dan 8,02 ppm. Perbesaran pada geseran kimia tersebut ditunjukkan pada Lampiran 4e dan 4f. Sinyal pada geseran kimia 7,61 ppm (integrasi 2) (J= 7,7 Hz) merupakan proton HE, sedangkan sinyal 8,02 ppm, (integrasi 2) (J= 7 Hz) merupakan proton HF. Proton HE lebih terlindungi (shielded) daripada proton HF karena berada di lingkungan kimia dekat dengan gugus NH yang memiliki elektronegativitas lebih rendah daripada gugus C=O karbonil yang dekat dengan proton HF (Anderson, 2004). Sinyal yang muncul pada kedua proton tersebut sudah sesuai dengan teori yaitu berupa sinyal doublet karena hanya memiliki satu proton tetangga pada lingkungan kimia berbeda. Pada geseran 7,26 pm merupakan sinyal X yaitu sinyal dari pelarut kloroform sedangkan sinyal Y geseran kimia 1,60 ppm yang merupakan sinyal H2O (Fulmer et al., 2010). Kemudian dilakukan juga uji 13C-NMR dan hasilnya disajikan pada Gambar 4. Hasil 13C-NMR memuat hanya informasi geseran kimia atom C dengan isotop 13 karena kelimpahan isotop 13 C yang rendah di alam (1,1%) (Anderson, 2004). Berdasarkan hasil percobaan, geseran kimia pada 20,0-40,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) menunjukan sinyal dari atom C alkil bromida, hal ini sudah sesuai 12

(28) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI dengan hasil penelitian yaitu pada daerah tersebut terdapat 1 sinyal pada geseran kimia 39,6 ppm menunjukkan atom CC pada rantai alkil (gugus etilen). Sementara atom CB pada geseran kimia 26,7 ppm merupakan C etilen (alkil sekunder) yang sesuai dengan hasil empiris terletak pada daerah geseran kimia 20,0-30,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CB lebih terlindungi daripada CC karena atom CC berikatan dengan atom Br yang merupakan penarik elektron yang lebih kuat daripada gugus karbonil (C=O) amida yang berikatan dengan atom CB. Geseran kimia pada 5,0-20,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) menunjukan sinyal dari atom C metil (alkil primer), hal ini sudah sesuai dengan hasil penelitian bahwa pada geseran kima tersebut muncul 1 sinyal yang menunjukan atom CA dari rantai etil ester pada 14,4 ppm. Sementara CD pada sinyal 60,9 ppm merupakan atom C yang berikatan langsung dengan atom O ester yang sesuai berdasarkan hasil empiris muncul pada geseran kimia 50,0-90,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014). Atom CA lebih terlindungi daripada atom CD karena atom CD berikatan langsung dengan atom O ester yang merupakan gugus penarik elektron. X Gambar 4. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2 Geseran kimia 110,0-160,0 ppm (Vollhardt dan Schore, 2014) adalah rentang atom-atom C pada cincin benzena. Hal ini sudah sesuai dengan hasil penelitian yang menunjukan geseran kimia pada rentang tersebut dengan munculnya 4 sinyal yaitu 118,9 ppm, 126,4 ppm, 130,9 ppm, dan 141,5 ppm yang berkorespondensi dengan atom CE, CF, CG, dan CH pada cincin arilamida. Atom CE 13

(29) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI lebih terlindungi daripada atom CG karena posisi CE lebih dekat pada gugus NH yang memiliki elektronegativitas lebih rendah daripada C=O ester yang dekat dengan atom CE (Anderson, 2004). Atom CH lebih tidak terlindung daripada CF diduga akibat CH berikatan langsung dengan NH dan C=O amida yang merupakan gugus elektronegatif, sedangkan CF tidak berikatan langsung dengan atom O karbonil yang elektronegatif sehingga masih terlindungi oleh ikatan dengan atom C karbonil (Anderson, 2004). Geseran kimia 150,0-180,0 ppm (Silverstein et al., 2005) ppm merupakan rentang dari atom C karbonil amida dan ester. Hasil penelitian menunjukan hasil yang sesuai yaitu terdapat dua sinyal atom CI ester dan CJ amida pada geseran kimia 166,1 ppm dan 167,9 ppm. Sinyal X pada geseran kimia 77,0 ppm merupakan sinyal dari pelarut kloroforom (Fulmer et al., 2010). Tabel III. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa arilamida-2 Karbon Geseran kimia (ppm) CA CB CC CD CE CF CG CH CI CJ Pelarut (X) 14,4 26,7 39,6 60,9 118,9 126,4 130,9 141,5 166,1 167,9 77 Spektrofotometri Inframerah Elusidasi struktur dilanjutkan dengan menggunakan instrumen spektrofotometer inframerah. Tujuan elusidasi struktur dengan spektrofotometer inframerah adalah untuk mengidentifikasi gugus-gugus fungsional pada senyawa hasil sintesis. Gugus fungsional yang memiliki momen dipol yang tinggi sangat efektif menyerap radiasi inframerah sehingga menyebabkan ikatannya bervibrasi baik secara mengulur (stretching) dan menekuk (bending) (Supratman, 2010). Hasil elusidasi struktur senyawa hasil sintesis serta perbandingannya dengan bahan awal (benzokain) dan keberadaan gugus fungsionalnya pada spektroskopi IR disajikan 14

(30) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI pada gambar 5. Berdasarkan spektrum inframerah yang dihasilkan, terdapat pita pada bilangan gelombang (ῡ) 1500 cm-1 yang menunjukan gugus C karbonil (C=O). C=O tersebut merupakan C=O amida pada 1535 cm-1, sedangkan pada 1689 cm-1 menunjukan C=O ester. Keberadaan gugus C=O amida tersebut diperkuat dengan adanya pita kembar yang satu ujungnya melebar pada daerah 3371 cm-1 dan 3464 cm-1 yang diduga merupakan gugus NH amida. Senyawa hasil sintesis diprediksi sudah terbentuk dengan dukungan daerah sidik jari pada 500-1500 cm-1 yang sudah berbeda dengan benzokain sebagai bahan awal sintesis. daerah sidik jari HN-C=O R-O-C=O C=O (a) daerah sidik jari (b) Gambar 5. Hasil spektrum inframerah (a) senyawa arilamida-2 (b) benzokain (diadaptasi dari Anderson et al., 2004) 15

(31) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Kromatografi Gas-Spektrometri Massa Senyawa dielusidasi struktur dengan menggunakan kromatografi gasspektrometer massa yang bertujuan untuk menentukan bobot molekul dari senyawa baru hasil sintesis (Anderson, 2004). Kromatografi gas bertujuan untuk memastikan kemurnian senyawa hasil sintesis, ditandai dengan hasil kromatogram satu puncak. Kromatografi gas dilakukan pada senyawa hasil sintesis karena berdasarkan sifat fisika kimia senyawa dari hasil uji titik lebur menunjukkan titik lebur senyawa hasil sintesis <200oC sehingga dapat diaplikasikan pada kromatografi gas dengan suhu detektor 300oC. Hasil percobaan menunjukan bahwa senyawa hasil sintesis sudah murni secara kromatografi gas ditunjukan dengan munculnya satu puncak pada kromatogram (Rt 37 menit). Hasil kromatografi gas disajikan pada gambar 6(a). (a) (b) Gambar 6. Kromatogram (a) dan spektrum massa (b) turunan arilamida-2 Pada gambar hasil spektrum massa (gambar 6(b)) terjadi perekaman senyawa utuh hasil sintesis dengan isotop atom Br 79 g/mol yaitu sebesar m/z 299 pada spektrum paling kanan. Pola fragmentasi base peak (pola fragmentasi tertinggi 16

(32) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI dan stabil) pada spektrum tersebut memiliki massa relatif per ion sebesar m/z 120. Mekanisme fragmentasi tersebut dapat dilihat pada lampiran 5a dan 5b. Uji Aktivitas In Vitro Pada uji aktivitas in vitro, MMP-9 direaksikan dengan substrat peptida untuk memutus ikatan peptidanya. Substrat merupakan peptida yang dihubungkan gugus fluorofor (Aminometil kumarin) (Niccoloti, 2012) yang akan diputus ikatan peptidanya oleh MMP-9 sehingga gugus fluorofornya terlepas dan terbaca fluoresensinya sebagai aktivitas enzim. Kontrol positif pada pengujian ini adalah peptida NNGH (Arg-Arg-Gly-His) (Biovision, 2019). Pengujian in vitro pada arilamida-2 menunjukan persentase penghambatan aktivitas enzim sebesar 36% pada konsentrasi 200 µg/mL. Pada konsentrasi ini, senyawa arilamida-2 termasuk dalam kategori aktivitas rendah-sedang (Aderogba et al., 2013) sehingga masih dapat dioptimasi konsentrasinya untuk mengetahui kemungkinan aktivitas yang lebih baik. Namun, akibat keterbatasan sumber daya (bahan baku) hal tersebut tidak dapat dilakukan dan disarankan untuk penelitian selanjutnya. Optimasi konsentrasi dapat dilakukan hingga ≤ 500 µM (batas aktivitas IC50) untuk memberikan aktivitas yang baik (Zu, et al., 2013), jika lebih dari itu maka dapat dilakukan optimasi kembali strukturnya. Aktivitas yang rendah-sedang dari senyawa arilamida-2 dapat disebabkan karena arilamida-2 hanya mengambil satu karakteristik gugus pada posisi para cincin arilamida senyawa 2 Dufour et al. 2011 yaitu EWG (ester etil benzoat). Aktivitas arilamida-2 secara strukturnya dapat ditingkatkan melalui optimasi struktur dengan penambahan gugus berkarakter EDG seperti -NH-R, -NH-Ph, dan -Ph (McMurry, 2016). Tabel hasil uji aktivitas in vitro disajikan pada tabel IV. 17

(33) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel IV. Hasil uji aktivitas in vitro Sampel Fluoresensi Rata- Aktivitas Penghambatan rata enzim enzim (%) (%) ±SD R1 R2 R3 Blanko 9683 9349 9217 9416 0 0 Kontrol 32989 33687 30321 32332 100 0 23807 25072 23946 24275 64 36±3,03 5946 5946 7898 6597 0 100±4,92 negatif Turunan arilamida-2 Kontrol positif (peptida NNGH) Aktivitas enzim = rata-rata/32332 x 100%, Penghambatan enzim = 100 – aktivitas enzim KESIMPULAN Senyawa turunan arilamida-2 dapat disintesis dari benzokain dan 3bromopropionil klorida melalui reaksi substitusi nukleofilik asil (SNA) dengan katalisator piridin berupa serbuk putih, larut dalam etil asetat, kloroform, dan DMSO, memiliki jarak lebur 116-124oC serta memiliki aktivitas penghambatan kategori rendah-sedang terhadap MMP-9 secara in vitro sebesar 36 % pada konsentrasi 200 µg/mL. SARAN Penelitian ini merupakan skrining awal untuk uji aktivitas in vitro sehingga konsentrasi sampel masih dapat dioptimasi lagi untuk mendapatkan nilai persentase penghambatan enzim yang lebih representatif. Optimasi konsentrasi sampel tidak lebih dari 500 µM. Jika lebih dari itu, untuk meningkatkan aktivitasnya struktur senyawa perlu dioptimasi dan didesain ulang dengan mempertimbangkan hubungan struktur dan aktivitas. 18

(34) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI UCAPAN TERIMA KASIH Penulis berterima kasih kepada Indonesia Toray Science Foundation (ITSF) 2017-2018 atas dukungan dana untuk penelitian ini. 19

(35) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Adegoke, O.A. 2011. Analytical, Biochemical, and Synthetic Application of paradimethylaminobenzaldedid. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 11(2):17-29. Aderogba, M.A., Ndhlala, A.R., Rengasamy, K.R.R., dan Staden J.V.S. 2013. Antimicrobial and Selected In Vitro Enzyme Inhibitory Effectsof Leaf Extracts, Flavonols and Indole Alkaloids Isolated from Croton menyharthii. Molecules.18:12633-12644. Adhipandito, C. F. 2017. Sintesis Analog Purin (FFUSD-001) dan Studi In Silico Terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Hemopexin Domain sebagai Kandidat Anti-Kanker Payudara. Skripsi. Universitas Sanata Dharma. Anderson, R.J., Bendell, D.J., dan Groundwater P.W., 2004. Organic Spectoscopic Analysis. Royal Society of Chemistry. London. United Kingdom. Arifiyanto, A. 2001. Pengaruh Penambahan Basa Natrium Hidroksida dan Piridin dalam Sintesis Benzoilanilida. Skripsi. Universitas Sanata Dharma. Alford, V.M., Kamath, A., Ren, X., Kumar, K., Gan, Q., Awwa, M. et al. 2017. Targeting the Hemopexin-like Domain of Latent Matrix Metalloproteinase-9 (proMMP-9) with a Small Molecule Inhibitor Prevents the Formation of Focal Adhesion Junctions. ACS Chemical Biology.12: 1 - 44. American Cancer Society. 2018. Global Cancer: Facts & Figures 2018. American Cancer Society Inc., Atlanta. Bamane, V., Rakholiya, V.K., Chitre, T.S. 2011. Application of schotten-baumann reaction: synthesis of sometetrahydroquinoline-3-carbohydrazide derivatives. Heterocyclic Letters. 1(3): 263-268. Benson, C.S., Babu, S.D., dan Radhakrishna, S. 2013. Expression of matrix metalloproteinases in human breast cancer tissues. Disease Markers. 34: 395 – 405. Biovision. 2019. MMP-1 Inhibitor Screening Kit (Fluorometric). https://www.biovision.com/mmp-1-inhibitor-screening-kitfluorometric.html. Diakses tanggal 12 Februari 2019. Dirjen POM. 2014. Farmakope Indonesia Edisi V. Jakarta, Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. Dufour, A., Sampson, N.S., Li, J., Kuscu, C., Rizzo, R.C., DeLeon, J.L. et al. 2011. Small-Molecule Anticancer Compounds Selectively Target the Hemopexin Domain of Matrix Metalloproteinase-9. Cancer Research. 71(14): 4977 - 4988. 20

(36) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Fulmer, G.R., Miller, A.J.M., Sherden, N.H. Gottlieb, H.E., Nudelman, A., Stoltz B. M., Bercaw J.E., dan Goldberg K.I. 2010. NMR Chemical Shifts of Trace Impurities: Common Laboratory Solvents, Organics, and Gases in Deuterated Solvents Relevant to the Organometallic Chemist. Organometallics. 29: 2176–2179. Kementerian Kesehatan RI. 2016. Infodatin (Pusat Data dan Informasi Kementerian Kesehatan RI): Stop Kanker. Jakarta, Kementerian Kesehatan RI. McMurry, J., 2016. Organic Chemistry, 9th Edition. Cengage Learning. Massachusetts. USA. Merdad, A., Karim, S., Schulten, H.J., Dallol, A., Buhmeida, A., Al-Thubaity, F. et al. 2014. Expression of Matrix Metalloproteinases (MMPs) in Primary Human Breast Cancer: MMP-9 as a Potential Biomarker for Cancer Invasion and Metastasis. Anticancer Research. 34: 1355 – 1366. Mohrig, J.R., Alberg, D.G., Hofmeister, G.E., Schatz, P.F., dan Hammond, C.N. 2014. Laboratory Techniques in Organic Chemistry: Supporting Inquiry-Driven Experiments, 4th Edition. W. H. Freeman and Company. New York. USA. Montalbetti, C.A.G.N., dan Falque, V., 2005. Amide bond formation and peptide coupling. Tetrahedron. 61: 10827 - 10852. Nagase, H., Visse, R., dan Murphy, G. 2006. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69: 562 573. Nicolotti, O., Catto, M., Giangreco, I., Barletta, M., Leonetti, F., Stefanachi, A. et al. 2012. Design, synthesis and biological evaluation of 5-hydroxy, 5substituted pyrimidine-2,4,6-triones as potent inhibitors of gelatinases MMP-2 and MMP-9. European Journal of Medicinal Chemistry. 58: 368-376. Pecorino, L. 2012. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and Therapeutics. 3rd Edition. Oxford University Press. Oxford. United Kingdom. Piccard, H., Van den Steen, P.E., dan Opdenakker, G., 2007. Hemopexin domains as multifunctional liganding modules in matrix metalloproteinases and other proteins. Journal of Leukocyte Biology. 81: 870 - 892. Pubchem.2019. Chloroform. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Diakses tanggal 12 Februari 2019. Pubchem.2019. CID135415473. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. tanggal 18 Januari 2019. 21 Diakses

(37) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Sigma Aldrich. 2019. Benzocaine. https://www.sigmaaldrich.com. Diakses tanggal 20 Januari 2019. Silverstein, R.M., Webster, F.X., dan Kiemle, D.J. 2005. Spectrometric Identification of Organic Compound. 7th Edition. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. USA. Stankovic, S., Konjevic, G., Gopcevic, K., Jovic, V., Inic, M., dan Jurisic, V., 2010. Activity of MMP-2 and MMP-9 in sera of breast cancer patients. Pathology - Research and Practice. 206 (4): 241 - 247. Supratman, U. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Widya Padjajaran. Bandung. Indonesia. Vandenbroucke, R.E., dan Libert, C., 2014. Is there new hope for therapeutic matrix metalloproteinase inhibition?. Nature Reviews Drug Discovery. AOP. Publikasi online 7 November 2014. Diakses tanggal 15 November 2018. Vollhardt, P., dan Schore, N. 2014. Organic Chemistry: Structure and Function. 7th Edition. W.H. Freeman and Company. New York. USA. White, T.D., Berglund, K.D., Groh, J.M., Johnson, M.D., Miller, R.D., dan Yates, M.H. 2012. Development of a Continuous Schotten−Baumann Route to an Acyl Sulfonamide. Org. Process Res. Dev.16: 939−957. World Health Organization. 2014. Cancer Country Profiles: Indonesia. Geneva, WHO Press. World Health Organization. 2018. Latest global cancer data: Cancer burden rises to 18.1 million new cases and 9.6 million cancer deaths in 2018. Geneva, WHO Press. Yousef, E.M., Tahir, M.R., St-Pierre, Y., dan Gaboury, L.A. 2014. MMP-9 expression varies according to molecular subtypes of breast cancer. BMC Cancer. 14 (609): 1 – 12. Zhang, L., Wang, X.J., Wang, J., Grinberg, N., Krishnamurthy, D.K., dan Senanayake, C.H. 2009. An improved method of amide synthesis using acyl chlorides. Tetrahedron Letters. 50 (24): 2964 - 2966. Zu, T., Cao, S., Su, P.C., Patel, R., Shah, D., Chokshi, H.B., Szukala, R. et al. 2013. Hit Identification and Optimization in Virtual Screening: Practical Recommendations Based Upon a Critical Literature Analysis. J. Med. Chem. 1: 1-55. 22

(38) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LAMPIRAN Lampiran 1. Dokumentasi hasil sintesis, dan profil KLT senyawa turunan arilamida-2 Lampiran 1a. Hasil KLT sintesis senyawa turunan arilamida-2 yang menunjukkan 2 noda yang berbeda, yaitu benzokain (A) dengan nilai Rf 1 0,62 dan senyawa arilamida-2 (B) dengan nilai Rf 2 0,36 . Fase gerak yang digunakan adalah n- heksana : etil asetat (3:1). Deteksi di lampu UV254. Rf 1 = 0,62 A Rf 2 = 0,36 B 1 2 Lampiran 1b. Foto dari tahap sintesis senyawa arilamida-2 setelah dilakukan proses pengadukan selama 30 menit. 23

(39) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 1c. Hasil sintesis senyawa arilamida-2 setelah dilakukan penetralan pH dan kemudian dikeringkan. 24

(40) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 2. Uji DAB-HCl Lampiran 2a. Mekanisme reaksi antara benzokain dengan DAB-HCl yang membentuk basa Schiff yang berwarna jingga. Lampiran 2b. Hasil uji DAB-HCl dengan benzokain (A) dan senyawa turunan arilamida-2 (B). Pembentukan basa Schiff ditandai dengan warna jingga. A B 25

(41) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 3. Perhitungan bahan sintesis dan hasil rendemen senyawa arilamida-2 Perhitungan bahan: 1. Benzokain digunakan 3,59 mmol = 0,00359 mol Berat molekul = 165 g/mol 0,00359 mol x 165 g/mol = 0,59 g 2. Piridin digunakan 3,59 mmol = 0,00359 mol Berat molekul = 79,1 g/mol Massa jenis = 0,982 g/mL 0,00359 mol x 79,1 g/mol = 0,284 g : 0,982 g/mL = 0,29 mL 3. 3-bromopropionil klorida digunakan 4 mmol = 0,004 mol Berat molekul = 171,418 g/mol Massa jenis = 1,701 g/mL 0,004 mol x 171,418 g/mol = 0,686 g : 1,701 g/mL = 0,41 mL Reaksi Stoikiometri: Benzokain + 3-bromopropionil klorida Arilamida-2 + HCl 3,59 mmol 4,00 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol 0,41 mmol 3,59 mmol 3,59 mmol Massa teoritis arilamida-2 = 3,59 mmol x 300 mmol/mg = 1077 mg =1,08 g Hasil rendemen: Senyawa arilamida-2 = 0,88 g 1,08 g x 100% = 81,48% 26

(42) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 4. Perbesaran puncak pada spektrum 1H-NMR Lampiran 4a. Perbesaran sinyal HA pada geseran kimia 1,39 ppm menunjukan splitting triplet dengan integrasi 3 dan nilai J coupling constant yaitu 7,7 Hz. Lampiran 4b. Perbesaran sinyal HB pada geseran kimia 2,85 ppm dan 2,98 ppm menunjukan splitting triplet of triplet dengan integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 6,3 Hz. 27

(43) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 4c. Perbesaran sinyal HC pada geseran kimia 3,71 ppm dan 3,89 ppm menunjukan splitting triplet of triplet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 6,3 Hz. Lampiran 4d. Perbesaran sinyal HD pada geseran kimia 4,36 ppm menunjukan splitting quartet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 7,7 Hz. 28

(44) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 4e. Perbesaran sinyal HE pada geseran kimia 7,61 ppm menunjukan splitting doublet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 7,7 Hz. Lampiran 4f. Perbesaran sinyal HF pada geseran kimia 8,02 ppm menunjukan splitting doublet integrasi 2 dan nilai J coupling constant yaitu 7 Hz. 29

(45) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 5. Usulan mekanisme fragmentasi molekul utuh dan base peak turunan arilamida-2 pada spektrometri massa Lampiran 5a. Usulan pola fragmentasi molekul utuh m/z 299 Lampiran 5b. Usulan pola fragmentasi base peak m/z 120 30

(46) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 6. Desain well plate untuk uji aktivitas in vitro A B C D E F 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B100 B100 B100 B45 B45 B45 B44 B44 B44 B44 B44 B44 E5 E5 E5 KP_1 KP_1 KP_1 C_1 C_1 C_1 S50 S50 S50 E5 E5 E5 E5 E5 E5 S50 S50 S50 S50 S50 S50 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 TA2_1 TA2_1 TA2_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 B44 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 C_1 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 E5 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 S50 Keterangan: B : dapar KP : senyawa kontrol positif (peptida NNGH) TA2 : turunan arilamida-2 C : senyawa lain E : enzim MMP-9 S : substrat enzim MMP-9 Angka : volume (mikroliter/µl) 31

(47) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi dengan judul “Sintesis Turunan Arilamida-2 dan Uji Aktivitas In Vitro terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Sebagai Kandidat AntiKanker Payudara” bernama lengkap Benedictus Wisnu Putra Jati. Penulis merupakan anak sulung dari pasangan Matius Abdullah Chaidir dan Gertruda Tri Teguh Rahayu. Penulis lahir di Sleman, 13 Nopember 1996. Pendidikan formal penulis diawali di TK Kanisius Sorowajan (2002-2003), SD Kanisius Sorowajan (20032009), SMP Pangudi Luhur 1 Yogyakarta (2009-2012), dan SMA Kolese De Britto (2012-2015). Pendidikan dilanjutkan hingga perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat dalam beberapa kegiatan organisasi dan kepanitiaaan, antara lain Bendahara Drug Discovery Research Group tahun 20172019, koordinator divisi Perlengkapan dan Ketua kegiatan DESA MITRA 2016 dan 2017, anggota dan koordinator divisi Konsumsi kegiatan TITRASI 2016 dan 2017, serta menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Organik (2018) dan Kimia Dasar (2018). Penulis juga terlibat dalam beberapa perlombaan tingkat nasional antara lain sebagai peserta PICS 2017 di Institut Teknologi Bandung dan peserta Poster Competition CADD 2018 di Bali. Penulis juga aktif mengikuti kegiatan Drug Discovery Research Group yang bergerak memfasilitasi mahasiswa/i Farmasi Sanata Dharma menekuni bidang penemuan obat baru. 32

(48)

Dokumen baru

Download (47 Halaman)
Gratis

Tags

Dokumen yang terkait

Tampilan Pulasan Imunohistokimia Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Pada Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud Dan Tipe Schmincke
0
55
103
Pengaruh ekstrak tempuyung (Sonchus arvensis) terhadap aktivitas xantin oksidase secara in vitro sebagai dasar uji kinetika
1
13
52
Sintesis dan uji sitotoksik in vitro senyawa 2-Hidroksinikotinil oktilamida terhadap sel kanker leukimia murin p388
0
2
9
Tampilan Pulasan Imunohistokimia Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Pada Undifferentiated Carcinoma Nasofaring Tipe Regaud dan Tipe Schmincke
0
1
5
Ekspresi Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) pada Nodul Hiperplastik, Adenoma Folikuler dan Karsinoma Folikuler Tiroid
0
0
7
Hubungan Kadar Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Serum dengan Derajat Stenosis Arteri Koronaria - UNS Institutional Repository
0
0
10
Sintesis o-(4-bromobenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
15
Sintesis O-(3,4-diklorobenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
15
Sintesis o-(4-metilbenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (Mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
15
Sintesis o-(4-nitrobenzoil)piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
14
Sintesis O-(4-fluorobenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (Mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
15
Sintesis O-(4-fluorobenzoil) piroksikam dan uji aktivitas analgesik terhadap mencit (Mus musculus) - Widya Mandala Catholic University Surabaya Repository
0
0
16
Sintesis turunan arilamida-1 dan uji aktivitas in vitro terhadap Enzim Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) sebagai kandidat anti-kanker payudara - USD Repository
0
0
41
Sintesis turunan arilamida-5 dan uji aktivitas in vitro terhadap enzim matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) sebagai kandidat anti-kanker payudara - USD Repository
0
0
46
Sintesis Arilamida-4 dan Uji Aktivitas in Vitro terhadap Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) sebagai kandidat anti kanker payudara - USD Repository
0
0
44
Show more