Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real- Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode Hydrolysis Probe.

Gratis

1
51
86
2 years ago
Preview
Full text

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

  Penelitian ini menganalisis cemaran babimenggunakan Real-Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe yang memiliki keunggulan dari segi spesifisitas DNA yang di amplifikasi. Isolat DNA dari 2kontrol positif, 2 kontrol negatif dan 8 sampel didapatkan menggunakan kit komersial dengan hasil konsentrasi dan kemurnian yang baik.

KATA PENGANTAR

  Jakarta, 24 Juni 2015Penulis Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR)dengan Metode Hydrolysis Probe untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu DigitalLibrary Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. 49 Maximum maupun Fit Point pada sampel dengan primer sapi 4.3.4 Perbandingan antara metode analisis baik Second Derivative 4.3.3.3 Perbandingan antara Analisis Second Derivative Maximum dan Fit Point pada primer sapi............................................

DAFTAR SINGKATAN

DAFTAR ISTILAH

BHQ-1 : Black Hole Quencher-1BLAST : Basic Logical Aligment Search Tool bp : Base pairCP : Crossing Point cyt b : Cytochrome bdATP : Deoxyadenosine Triphosphate dCTP : Deoxycytidine TriphosphatedGTP : Deoxyguanosine Triphosphate dNTP : Deoxyribonuleaside TriphosphatedTTP : Deoxythymidine TriphosphateDNA : Deoxyribonucleic AcidFAM : Fluorescein Amidite mtDNA : mitochondrial DNANCBI : National Center for Biotechnology InformationNTC : No Template ControlPCR : Polymerase Chain Reaction qPCR : Quantitative Polymerase Chain ReactionRE : Retikulum EndoplasmaRNA : Ribonucleic AcidTm : Temperature MeltingTa : Temperature Annealing BLAST : Basic Logical Aligment Search Tool merupakan program untuk menganalisis kesejajaran urutan basa query (DNAatau protein) dengan urutan basa DNA atau protein dari database NCBI Blastn : Nucleotide Blast atau biasa disebut blastn merupakan salah satu fasilitas dari program BLAST untuk menganalisiskesejajaran nukleotida yang dimasukkan pada query dengan nukleotida pada database NCBI CP : Crossing Point merupakan angka siklus yang menunjukkan awal permulaan akumulasi amplikon telah memasukipeningkatan log-linear Fit Point : Metode penentuan CP melalui pertemuan antara garis treshold dengan kurva amplifikasi Garis Treshold : Garis horizontal penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu saat sinyal fluorescent berada pada titik terendahNCBI : National Center for Biotechnology Information merupakan suatu institusi yang dimiliki United States National Library of Medicine yang berperan sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekuler. Dari situs NCBI dapat diakses database bioteknologi meliputi genebank, urutanbasa DNA atau protein juga publikasi-publikasi ilmiah. Second Derivative : Metode penentuan CP dalam instrumen LightCycler 480 dimana CP diperoleh berdasarkan saat kurva amplifikasi Maximum mengalami kenaikan yang tajam Query : Urutan basa yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk diketahui kesejajarannya dengan data yang tersediaTm : Temperature Melting atau suhu lebur adalah suhu saat dimana 50% bagian DNA seolah terbuka menjadi untaitunggal

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

  Sistem TaqMan Real-Time PCR dengan probe Minor Groove Binding (MGB) juga telah digunakan pada pendeteksian kuantifikasi DNA sapi, babi, domba, ayam, kalkun dan burung onta pada sampel yang kompleks (Lopez-Andreo et al, 2005). Bagaimana kondisi optimal amplifikasi DNA pada bakso menggunakan primer spesifik babi dan sapi dengan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis Probe?

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

  2.1 Bakso Bakso adalah makanan terbuat dari daging, udang, ikan yang dicincang dan dilumatkan bersama tepung kanji, biasanya bulat-bulat (KBBI, 2008)Bakso daging menurut SNI No: 01-3818-1995 adalah produk makanan berbentuk bulatan atau lain yang diperoleh dari campuran daging ternak(kadar daging tidak kurang dari 50 persen) dan pati atau serealia dengan atau tanpa bumbu BTP (bahan tambahan pangan) yang diizinkan. Apalagi terkait pengharaman daging babi secara jelas difirmankan oleh Allah kepada Rasulullah “Katakanlah:"Tidak kudapati di dalam apa yang diwahyukan kepadaku, sesuatu yang diharamkan memakannya bagi yang ingin memakannya, kecuali daginghewan yang mati (bangkai), darah yang mengalir, daging babi - karena semua itu kotor - atau hewan yang disembelih bukan atas (nama) Allah.

2.3 Sel

  Banyak organisme sel tunggal yang bereproduksi dengan membelah diri menjadi 2 salinan baru yang identik dari dirinya. Berikut adalah perbandingan antara prokariot dan eukariot menurut Koolman et al, (2005) dalam bukunya yang berjudul ”AtlasBerwarna dan Teks Biokimia”Tabel 1.

2.4 Asam Nukleat dan Protein

  Protein bertindak sebagai enzim yang menjadi katalis ratusan reaksi yang diperlukandalam kehidupan (Weaver, 2001) Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) yang berfungsi sebagai penyimpan informasi. DNA dan RNA dapat dibedakan dari jenis gulanya dan pada salah satu dari basanya(Koolman et al, 2005).

2.5 DNA

2.5.1 Pengertian DNA

  Struktur double helix DNA (Sumber: Brooks, 2003) DNA (Deoxyribonucleic Acid) merupakan polimer linear yang tersusun dari unit 12 Gambar 2.6 Susunan dan Replikasi DNA (Sumber: Purnomo, 2004) Apabila benang I (b1) direplikasi, maka dihasilkan benang tunggal (b2a) yang identik dengan benang II (b2), dan sebaliknya apabila benang II (b2)direplikasi maka akan dihasilkan benang tunggal (b1a) yang identik benang I(b1). (Purnomo, 2004) Sifat Fisika DNA adalah DNA akan terpisah dari rantai komplemennya(denaturasi) pada suhu mendekati titik didih dan pH ekstrim (pH < 3 atau pH> 10) dan bisa bergabung kembali (renaturasi) pada suhu ± 60 C (Watson et al,1988).

2.5.2 DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan organel sel yang berfungsi sebagai penghasil energi. Fungsi penting mitokondria adalah menerima substrat untukmetabolisme energi (asam lemak, piruvat, kerangka karbon dan asam amino) dari sitoplasma dan menghancurkan secara oksidatif bahan-bahan tersebutmenjadi CO 2 dan H

2 O dan menghasilkan adenosin trifosfat (ATP). Dengan

  Membran bagian dalam membentuk lipatan-lipatan yang disebutkristae dimana terdapat enzim-enzim oksidase Membran dalam juga memiliki permukaan yang besar yang mengelilingi ruang matriks. DNA mitokondria hewan secara umum memiliki jumlah dan jenis gen yang sama yaitu 13 daerah yang mengkode protein (URF1, URF2, URF3,URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrome Oxidase unit I, Cytochrome Oxidase unit II, Cytochrome Oxidase unit III, Cytochrome b dan ATPase 6); 2 gen pengkode rRNA yaitu 12S rRNA dan 16S rRNA; 22 gen pengkode tRNA (Solihin, 1994).

2.5.3 Isolasi DNA

  Kotoran sel yang ditimbulkan akibat pengrusakan oleh detergen tersebut dibersihkandengan cara sentrifugasi Kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protenase yang berfungsi untuk mendegragasi protein dan RNAse yangberfungsi untuk mendegragasi RNA, sehingga tertinggal hanyalah DNA. Namun, isolasi DNA kini lebih mudah dengan bantuan teknologi canggih yang menghasilkan isolat DNA dengan kemurnian tinggi, hasil yang cepat,dan penggunaan yang mudah (Saiyed, 2007).

2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR)

  PCR digunakan untuk menggadakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemendengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycle (Muladno, 2010). PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA Primer yang berada sebelum daerah target disebut primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse.

2.6.1 Komponen PCR

  Konsentrasi primer yang terlalu tinggiakan menyebabkan mispriming (penempelan pada tempat yang tidak spesifik) dan akumulasi produk non spesifik serta meningkatkankemungkinan terbentuk primer-dimer, sebaliknya bila konsentrasi primer terlalu sedikit maka PCR menjadi tidak efisien sehingga hasilnya rendah(Sulistyaningsih, 2007). Enzim polimerase Taq tahan terhadap pemanasan berulang-ulang karena akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyaistruktur sekunder (Yusuf, 2010) Enzim Taq DNA polymerase terdiri atas dua macam yaitu enzim alami yang diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzimrekombinan yang disintesis didalam sel bakteri Escherichia coli (Muladno, 2010).

2.6.2 Tahapan PCR

  Suhu dan lamaya waktu yang dibutuhkan untuk annealing primer tergantung pada komposisi basa, panjang, dan konsentrasi primer(Sulistyaningsih, 2007). Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 o o 36 C sampai dengan 72 C, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah o antara 50 C.

2.7 Real-time PCR

2.7.1 Prinsip Analisis

  Pada Real-Time PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara seketika sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan.

2.7.2 Analisis menggunakan Metode Hydrolysis Probe

  Semakin tinggi flurosens yang dipancarkan dari reportersecara langsung berkorelasi dengan akumulasi pelepasan molekul reporter dye (sekaligus menandakan jumlah produk PCR yang dihasilkan) 26 Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multipleks quantitative Real- Time PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan lebih dari satu dalam satu reaksi karena probe akan berikatan secara spesifik dengan beberapa DNA target yang berbeda (BioRad, 2006). Dalam penggunaannya dengan format deteksi monocolor biasa digunakan reporter FAM dengan nilai eksitasi dan emisi berturut-turut 483 dan 533,pewarna lainnya yang tersedia untuk deteksi multicolor antara lain Cyan 500,Hex, Red 610 dan Cy 5 dengan nilai eksitasi dan emisi dalam keadaan normal berturut turut 450 dan 500, 523 dan 568, 558 dan 610 serta 615 dan 670.

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

  3.1.1 Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisa Obat dan PanganHalal dan Laboratorium Penelitian II Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta. 3.1.2 Waktu Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan dari bulan Maret 2014 hingga Desember 2014.

3.2 Alat dan Bahan

  Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR 3.4 Prosedur Kerja 3.4.1 Pengumpulan sampel Pengumpulan sampel dilakukan terhadap 8 sampel bakso sapi dengan produsen berbeda yang beredar di wilayah Ciputat. 3.4.2 Isolasi DNA Isolasi DNA menggunakan kit isolasi High Pure PCR Template Preparation dengan protokol sesuai yang di anjurkan oleh produsen (lampiran 3).

3.4.2.1 Preparasi Sampel

  Proses ini dilakukan ditempat yang terpisah dan menggunakan alat yang berbeda bagi setiap sampel dengan menjaga kebersihan alat yang digunakan. Masukkan cairan yang telah bebas dari partikel tidak larut ke dalam filter tube yang telah dipasangkan dengan collection tube.

3.4.2.3 Proses Pemurnian dan Elusi DNA (Roche ,2012) Buang collection tube beserta cairan yang tertampung didalamnya

  3.4.3 Analisis Hasil Isolasi DNA dengan Spektrofotometer UV untuk DNA (BioDrop, 2015) Instrumen BioDrop DUO yang digunakan dalam analisis ini menggunakan sistem layar sentuh. 32Muncul ditampilan berupa data yang berisikan daftar spesies yang memiliki kemiripan dengan data yang diujikan.

3.4.5 Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode

  Hydrolysis Probe Langkah pertama pembuat larutan induk primer dan probe dibuat dengan konsentrasi 100 µM sesuai dengan instruksi yang terdapat dalamdokumen dari produsen, dari larutan induk tersebut diencerkan konsentrasinya menjadi 10 µM. Sebelum melakukan pencampuran dilakukan perhitungan (lampiran 4a), kemudiansetiap reaksi master mix dibuat dengan mencampurkan secara berurutan1,6 µl primer forward, 1,6 µl primer reverse, 1,4 µl aquadest, 0,4 µl probe dan 10 µl probe master.

C) Mode (hh:mm:ss) ( C/s) (per

  C) Preincubation 95 None 00:10:00 4,4 - Amplification 72 None 00:00:01 4,4 Cooling 40 None 00:00:10 - 1,5 o o Setelah campuran master mix dan program amplifikasi siap, terlebih dahulu masukkan 5 µl sampel atau DNA template pada multiwell platesesuai dengan pengaturan yang telah dibuat pada subset editor. Instrumen Real-Time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi dalam bentuk kurvaamplifikasi.

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini menganalisis cemaran daging babi pada produk bakso sapi

  menggunakan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis Probe. Cemaran daging babi dapat diketahui melalui amplifikasi DNA ditunjukkan dengan naiknya kurvaamplifikasi apabila terjadi kontaminasi daging babi dalam produk bakso sapi yang diuji.

4.1 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer UV

  Isolat DNA didapatkan dengan menggunakan prinsip memisahkan DNA yang terikat pada filter dari pengotorlalu mengelusinya, menyesuaikan dengan protokol dan fungsi dari reagen dalam kit tersebut (Lampiran 2 & 3). Sebaliknya, kemurnian yang baik namun tidak dibarengi puladengan konsentrasi yang baik menyebabkan tidak teramplifikasinya DNA sampel jika konsentarsinya rendah atau justru menghasilkan amplifikasi yangberlebihan jika konsentrasinya tinggi sehingga berakibat terjadinya kesulitan dalam menganalisis sampel yang di uji karena kurva amplifikasinya terlalucepat mencapai fase plateau.

4.2 Hasil Analisis Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI

  Uji spesifisitas primer dilakukan dengan memasukan urutan basa dari primer forward, probe dan pasangan dari primer reverse untuk kemudian dicari kemiripannya dengan urutan basa yang ada dalam database NCBI. (NCBI, 2015) Gambar 4.1 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe sapi dengan program BLAST pada laman NCBI Uji spesifisitas primer sapi digunakan DNA target dengan panjang amplifikasi 120 pasang basa yang diperoleh dari area sitokrom b mitokondriasusunan basa dna pada sapi.

4.3 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR

4.3.1 Penetapan Metode Amplifikasi Yang Optimal

  SuhuAmplifikasi disesuaikan berdasarkan perkiraan dari suhu Tm (lampiran 5) dan dikombinasikan dengan hasil optimasi menggunakan PCR gradien olehRahmawati (2012) sehingga ditetapkan suhu annealing yang digunakan oo adalah 61 C untuk sampel dengan primer sapi dan 60 C untuk sampel dengan primer babi selama 1 menit. B SR DB SB NTC 2nd Drv Max 18,27 - Fit Point (0,75) ▼ ▼ ▲ ▼ ▲ ▼ ▼ ▼ Analisis dilakukan dengan membandingkan hasil CP dari metode Second Derivative Maximum dan Hasil CP dari metode Fit Point yang dimodifikasi hingga memiliki 1 sampel yang mempunyai kesamaan CP dengan metode Second Derivative Maximum (treshold 0,75).

DB SB

  Metode Fit Point pada sampel yang di amplifikasi menggunakan primer babi menunjukkan hubungan yang sama sebagaimana yang terjadi saatmenganalisis sampel sapi yang di amplifikasi dengan primer sapi. Penetapan nilai CPsebesar 30,37 pada Sampel SB dengan menggunakan metode Second Derivative Maximum dan tidak mengidentifikasi ke sampel lainnya, ternyata memiliki nilai yang sama dengan nilai CP SB pada treshold 1,733.

4.3.4 Perbandingan antara metode analisis baik Second Derivative

  Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point dengan treshold 0,9 pada primer Sapi dan Babi P/S DB SB A F G I KI KO Mr. Penetapan CP menggunakan metode Second Derivative Maximum baik dalam sampel dengan primer sapi maupun primer babi sangat memudahkanpeneliti dalam mendapatkan nilai CP yang tepercaya.

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

  Real-Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe dapat mengamplifikasiDNA dari bakso menggunakan primer spesifik sapi dan babi, dengan suhu oo denaturasi 95 C selama 15 detik dan suhu annealing 61 C untuk primer oo sapi dan 60 C untuk primer babi selama 1 menit serta suhu ekstensi 72 C selama 1 detik, dilakukan sebanyak 40 siklus. Perlu di lakukan pencarian dan percobaan dengan primer baru dengan urutan basa yang lebih spesifik dan benar-benar tidak memiliki kesamaandengan spesies apapun selain spesies yang diharapkan.

DAFTAR PUSTAKA

  Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time PCR. Alur Penelitian Pengumpulan sampel bakso sapi secara stratified random sampling Isolasi DNA sampel dan DNA kontrolCek keberadaan DNA melalui Spektrofotometer UV untuk DNADNA tidak DNA terisolasi terisolasiOptimasi kondisi Amplifikasi DNA Real-Time PCR menggunakan Real-TimePCR Hasil AnalisisKesimpulan 56 Lampiran 2.

2. Membuat larutan primer dan probe 10 µM dari larutan induk

  10 µM X = 1000100 = 10 µL Maka, 10 µL diambil dari masing-masing primer 100 µM dan di add 90 µL Aqua PCR gradec 3. Rekomendasi konsentrasi untuk primer adalah 0.3-1 µM (Roche ), dipilih konsentrasi 0.8 µM untuk tiap primerV 1 .

2 O

  Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer sapi pada untai DNA sapi dengan metode gradien PCR o Suhu 61 C Gambar 2. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer babi pada untai DNA babi dengan metode gradien PCR 61 Lampiran 7.

Dokumen baru

Dokumen yang terkait

Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction)
2
12
82
Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)
1
64
90
Analisis Cemaran Daging Babi Pada Kornet Sapi di Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
3
15
72
Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)
1
9
66
Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan
1
11
70
Perbandingan antara metode SYBR green dan metode hydrolysis probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan menggunakan real time PCR
1
32
90
Analisis Kandungan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi pada Cangkang Kapsul Keras yang Mengandung Vitamin A Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction
0
12
80
Aplikasi Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Mendeteksi Pencemaran Bakso Oleh Daging Babi di Wilayah Bogor
0
8
62
Perbandingan metode KIT komersial dan SDS untuk isolasi DNA babi dan DNA sapi pada simulasi cangkang kapsul keras untuk deteksi kehalalan menggunakan real-time PCR (polymerase chain reaction)
0
12
82
DETEKSI DAGING BABI PADA PRODUK BAKSO YANG DIJAJAKAN DI PUSAT KOTA SALATIGA MENGGUNAKAN TEKNIK POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR).
0
1
2
Perbandingan Metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time PCR
0
0
8
ANALISIS KANDUNGAN BABI PADA KORNET DAGING SAPI DI WILAYAH PURWOKERTO DENGAN METODE REAL TIME PCR
0
0
13
IDENTIFIKASI DAGING BABI PADA BAKSO YANG BEREDAR DI PASAR WAGE PURWOKERTO MENGGUNAKAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) DAN ANALISIS RESTRIKSI MENGGUNAKAN ENZIM BamH1 DAN BseD1 SKRIPSI
0
0
14
IDENTIFIKASI KANDUNGAN DAGING BABI PADA DENDENG SAPI YANG BEREDAR DI SWALAYAN PURWOKERTO MENGGUNAKAN METODE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) - repository perpustakaan
0
0
15
HALAMAN PERSETUJUAN IDENTIFIKASI DAGING BABI DALAM DAGING KEBAB YANG BEREDAR DI PURWOKERTO MENGGUNAKAN METODE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) KHOTIMAH
0
0
17
Show more