Analisa Aspergillus fumigatus dengan Menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Kultur Pada Sputum Penderita Batuk Kronis

KATA PENGANTAR

  P(K) sebagai komisi pembimbing, yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah mengorbankan waktu untuk memberikan dorongan, bimbingan,semangat, bantuan serta saran-saran yang bermanfaat kepada Penulis mulai dari persiapan penelitian sampai pada penyelesaian tesis ini. Terimakasih yang sebesar-besarnya kepada kakanda tersayang SariAgustien, SE dan Vinny Dwi Astuty, SE (Ak) serta adinda Putri Anggraini, Ak dan keponakan-keponakan yang selalu memberikan semangat dan dorongan untuksegera menyelesaikan tesis ini.

DAFTAR SINGKATAN

  Tujuan penelitian ini adalahuntuk menganalisa Aspergillus fumigatus dengan menggunakan PCR dan kultur pada sputum penderita batuk kronis. Kesimpulan dari hasil penelitian ini lebih banyak ditemukan DNA Aspergillus fumigatus pada penderita batuk kronis dengan menggunakan PCR daripada kultur, maka penyakit jamur tidak bisa dianggap remeh.

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

  Diketahui adabeberapa spesies yang dapat menginfeksi manusia namun penyebab infeksi paru- paru 90% adalah Aspergilus fumigatus.(Shahid dan Bhargava, 2001) Aspergillus fumigatus telah dilaporkan dijumpai pada sekitar 10% penderita dengan bronkhitis dan pada persentase yang lebih banyak lagi dijumpai pada penderita asma. (Hood,1994) Aspergillus fumigatus merupakan jamur saprotrophik yang menjadi pathogen dengan alasan biologi yang sederhana, yaitu karena jamur ini terdapat di athmosfir dengan konsentrasi yang tinggi, tumbuh dengan cepat dibandingkanjamur airborne lainnya pada suhu 40 ⁰C, dapat menjadi lawan bagi tubuh bukan karena mekanisme virulensi yang spesifik, namun karena kegagalan responimmune tubuh itu sendiri.

1.4 Manfaat Penelitian 1

Memberikan informasi ilmiah kepada para klinisi umum dan klinisi ilmu penyakit paru mengenai kemungkinan penderita batuk kronis mengalamiinfeksi jamur paru.

2. Dapat di aplikasikan dan menjadi pilihan metode dalam mendeteksi infeksi jamur dengan cepat dan tepat bila fasilitas mendukung

  3. Memberikan motivasi untuk peneliti lain untuk meneliti mengenai infeksi jamur di Indonesia mengingat kawasan Indonesia merupakan daerahtropis.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikosis Paru

  Mikosis yang mempunyai insiden paling tinggi adalah kandidiasis dan dermatofitosis disebabkan oleh jamur yang merupakan anggota flora mikrobanormal atau yang dapat bertahan hidup pada pejamu manusia. Sinusitis jamur merupakan mikosis sistemik pada salurannapas atas yang paling banyak dilaporkan, sedangkan pada saluran napas bawah adalah mikosis paru.

2.1.1 Mikosis oportunistik

  Pasien dengan gangguan pertahanan pejamu, rentan terhadap jamur yang terdapat di mana-mana, tetapi orang sehat yang terpajan biasanya resisten. (Mitchell, 2007) Sebagian besar pasien yang mengalami infeksi oportunistik menderita penyakit penyebab yang serius dan mempunyai daya tahan tubuh yang terganggu.

2.1.2 Patogenesis

  Meskipun dikemukakan bahwa diagnosa patologik ditegakkandengan isolasi organisme jamur dari jaringan yang terlibat, namun ini masih mempunyai problem yaitu bahwa beberapa jamur seperti Histoplasma Capsulatum, Sporothricum Schenkii, Torulapsis glabrata, Blastomyces dan Coccidioides mempunyai sel-sel berbentuk mirip ragi (Yeast like cells) yang secara histologik sukar dibedakan satu dengan lainnya. Bola jamur bisa terdapat pada ronggakista atau kavitas yang disebut aspergiloma, biasanya terdapat pada lobus atas paru dengan diameter beberapa sentimeter dan dapat terlihat pada foto dada.

2.1.3 Diagnosa Mikosis Paru

  Kendala lain ialah meskipunbanyak terdapat laboratorium klinik, jarang yang melakukan pemeriksaan untuk mikosis sistemik, Mungkin ini disebabkan oleh tidak terdapatnya tenaga Menurut Jan Susilo diagnosa infeksi jamur dapat tercapai bila kemungkinan infeksi jamur difikirkan, pengambilan bahan klinik tepat, carapengiriman bahan klinik tepat, bahan klinik sampai dilaboratorium dalam keadaan baik dan perlakuan bahan klinik tersebut dilaboratorium dilakukan dengan baikdan tepat. Keberhasilandiagnosis dan terapi dari infeksi jamur pada pasien-pasien dengan keadaan umum yang lemah sangat tergantung pada kerjasama dari team work antara lain ahlimikrobiologi, onkologis, histopatologis, ahli penyakit infeksi dan staff laboratorium.

2.1.4 Tehnik pengambilan bahan untuk pemeriksaan jamur

  Pemeriksaan SputumSputum merupakan bahan yang paling sering digunakan untuk pemeriksaan mikrobiologik karena cara pengambilan yang mudah dan non invasif. Merupakan tehnik yang invasif dalam usaha mendapatkan bahan pemeriksaan penyebab infeksi saluran napas bawah yang bebas kontaminasi flora kumanyang hidup di orofaring.

2.2 Aspergillosis

  Adalah saprofit yang terdapat di tanah, air dantumbuhan yang mengalami pembusukan dan aspergilosis terdapat diseluruh dunia. Lebih dari 200 spesies Aspergilus telah di identifikasi dan A.

2.2.1 Morfologi dan identifikasi

  Aspergillus adalah jamur yang distribusinya tersebar luas di atmosfir dan memegang peranan dalam mendaur ulang karbon dan nitrogen. Jamur inimemiliki siklus biologikal yang sederhana dengan karakteristik sporulasi yang tinggi, yaitu dapat menghasilkan konidia dengan konsentrasi yang tinggi (1 – 100 3 konidia / m ) di udara.

2.2.2 Pathogenesis

  Makrofag dapat memfagosit dan menghancurkan conidia aspergilus sedangkan polymorphonuclear (PMN) leukosit dan monosit (MNC)dapat merusak hypha aspergillus melalui mekanisme oxidative dan non-oxidatif. Makrofag dan neutrofil merupakan pertahanan tetap pada paru dalam melawan spesies Aspergillus.

2.2.3 Mikotoksin

  Metabolit sekunder yang paling sering ditemukan antara lain adalah Fumagillin, fumitoxin, fumigaclavines, fumigatin, fumitremorgins,gliotoxin, monotrypacidin, tryptoquivaline, helvolic acid, dan dua metabolit chromophore families uncharacterized chemically (FUA dan FUB). (Dumasari, 2008) Mikotoksin yang dihasilkandapat menimbulkan berbagai gejala dan tanda, tergantung pada organ yang terkena, dosis dan jenis mikotoksin yang dihasilkan.

1. Non-invasif aspergilosis a

  Bentuk alergi (allergic bronchopulmonary aspergillosis / ABPA)Pada beberapa individu yang atopic, pembentukan antibody IgE terhadap antigen permukaan konidia aspergilus menghasilkan reaksi asmatik segera pada Allergic bronchopulmonary aspergillosis dilaporkan dijumpai pada asma yang tergantung dengan steroid sekitar 14% dan pada pasien dengan kolonisasiaspergilus seperti cystic fibrosis dijumpai sebanyak 7%. Pasien yang beresiko adalah mereka yang menderita leukemia mielogenosa atau Faktor resiko terjadinya Aspergillosis paru invasive adalah pada pasien immunocompromised yang disebabkan terutama oleh keadaan neutropenia,haematopoietic stem-cell dan transplantasi organ padat, penggunaan obat kortikosteroid yang lama dan dengan dosis tinggi, keganasan haematologi, terapicytotoxic, AIDS, dan chronic granulomatous disease (CGD).(Zmeili dan Soubani,2007) 3.

2.2.5 Uji diagnostic laboratorium a

  Pemeriksaan KulturSpecimen kultur berasal dari sputum, bilasan bronchial dan aspirasi tracheal di inokulasi pada agar Sabouroud dextrose dengan antibiotic dan tanpacycloheximide pada temperature 25 ⁰C dan 37⁰C. Pemeriksaan immunodiffusioan mudah dilaksanakan dan pengendapaan dapat dideteksi lebih dari 70% penderita dengan allergic bronchopulmonaryaspergillosis dan lebih dari 90% pada penderita pulmonary aspergilloma atau kronik necrotizing pulmonary aspergillosis.

2.2.6 Pengobatan

  Penyakit paru nekrotikan kronik yang lebih ringan dapat diobati dengan vorikonazol atau itrakonazol. (Garbino, 2004) Prognosis pasien dengan invasive aspergillosis mengalami perbaikan dengan penggunaan klinis terapi anti jamur golongan azole, terutamavoriconazole.

2.2.7 Epidemiologi dan Pengendalian

  Primer terdiri dari 18 - 24 deret basa nukleotidapengode DNA [adenin(A), guanin (G), sitosin (C), dan timin (T)] yang disintesis secara artifisial dan biasanya dapat dipasangkan dengan DNA yangakan dideteksi. Pada proses ini deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), yang sebelumnya telah ditambahkan dalam pereaksi, menyebabkan primer yang tadinya hanya 18 sampai 24 deretbasa nukleotida akan memperoleh tambahan basa nukleotida yang terdapat di o optimum pada suhu 72 C.

2.4 Elektroforesis

  Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dalam bufer dengan pemanasan dan kemudian dituangkan pada cetakan serta didiamkan sampai dingin. Setelahmengeras, diberikan medan listrik pada kedua ujungnya, maka DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak ke anoda.

BAB II I METODE PENELITIAN

  3.3 Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1 Populasi Penelitian Populasi pada penelitian ini adalah penderita batuk kronis yang datang berobat ke poliklinik paru Rumah Sakit Haji Adam Malik Medan. penderita batuk yang lebih dari tiga minggu 2.penderita batuk yang disertai dahak 3.penderita yang berusia 17 tahun ke atas 4.penderita batuk kronis yang telah mendapatkan pengobatan anti mikroba maupun yang belum.

2. Penderita batuk kronis yang mendapatkan pengobatan anti jamur sistemik 3

  Penderita batuk kronis yang tidak dapat mengeluarkan dahak. 3.5 Kerangka Konsep (KOH)Tes Kulit TrachealDarah Biopsi BronkusAspirasi SpesimenSputum Bilasan Deteksi Aspergillus fumigatusKultur Serologis PCR AspergillosisBatuk Kronis PositifNegatif Tes KulitHasil Mikroskopik(KOH) JaringanMikroskopik Gambar 3.1 Kerangka Konsep TrachealDarah Biopsi BronkusAspirasi SputumBilasan Kultur Serologis PCRSpesimen Batuk KronisDeteksi Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus 2.

3.7 Defenisi operasional 1

  Aspergillus fumigatus adalah jenis jamur eksogen yang banyak terdapat di lingkungan yang dapat menginfeksi manusia bila terhirup konidianyasehingga menyebabkan penyakit aspergillosis pada paru. Sputum penderita batuk kronis adalah sekret kental yang berasal dari saluran pernapasan bagian bawah dari pasien yang menderita batuk terus-menerus selama lebih dari tiga minggu.

4. Kultur adalah suatu metode untuk menlihat pertumbuhan jamur

  Aspergillus fumigatus dengan menggunakan media miring Sabaroud Dextrose Agar dan di inkubasi pada suhu 26°C - 28°C selama ± 10 hari. Hasilnya positif terdapat jamur Aspergillus fumigatus bila dijumpai hifa bersepta(konidiopora) dan membentuk konidia (spora) yang khas pada Aspergillus fumigatus .

3.8 Alat dan Bahan

Bahan penelitian adalah sputum pagi hari penderita batuk kronis yang datang ke poliklinik Penyakit Paru Rumah Sakit Haji Adam Malik Kota Medan,Alat dan bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah : Alat penelitian: Bahan penelitian:

3.9 Prosedur Penelitian

3.9.1 Pengambilan sampel (

  Dengan ukuran fragmen 405 bp, dan target PCR kedua dengan menggunakan pasangan primer AFU5Sdan AFU5AS yang akan menghasilkan produk DNA dengan ukuran fragmen internal 236 bp. PCR menggunakan metodeThermal Cycler (Perkin-Elmer Catus), dengan urutan: PCR pertama, prosesnya 2 menit pada suhu 94 ⁰C kemudian dilakukan sebanyak 35 siklus selama 40 detik pada suhu 94⁰C, 1 menit pada 60⁰C, dan 1 menit pada 72 ⁰C, dengan langkah terakhir 5 menit pada 72⁰C dan kemudian hasilnya ⁰C, 1 menit pada suhu 60 ⁰C, dan 1 menit pada suhu 72⁰C, dan langkah terakhir 5 menit pada72 ⁰C dan kemudian hasilnya disimpan pada suhu 4⁰C.

3.9.7 Kultur Sampel (Brooks, 2004, Olds, 1975)

  Alat dan Bahan : Koloni jamur dipelajari dengan mengamati pertumbuhannya pada media miring Sabouraud dextrose agar. Interpretasi hasil koloni Aspergillus fumigatus jika pada permukaan media dijumpai pertumbuhan filament putih yang kemudian memproduksi sporaseperti beledru dengan warna putih keabu-abuan.

BAB IV HASIL PENELITIAN

4.1 Hasil Penelitian

  Tabel 4.1 Distribusi Hasil PCR pada pemeriksaan sputum Hasil PCR Jumlah (orang) Persentase (%)Positif 35 68,62 Negatif 16 31,37Jumlah 51 100 4.1.3 Hasil PCR yang di analisa dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa Seluruh sampel yang diperiksa dengan menggunakan tekhnik two stepPCR untuk mendeteksi adanya DNA jamur Aspergillus fumigatus. Pada gambar 4.2 tampak bahwa dari 12 sampel yang dijalankan di gel agarosa, ada 9 sampel yang hasilnya positif adalah sampel A5, A6, A7, A9, A11,A12, A14, A15 dan A16.

4.1.4 Hasil pemeriksaan Sputum dengan menggunakan kultur

  Pada penelitian ini, dilakukan juga kultur pada semua sampel sebagai gold standard pemeriksaan jamur. Kultur dilakukan di Laboratorium MikrobiologiFakultas Kedokteran Universitas Islam Sumatera Utara dengan menggunakan media Sabaroud Dextrose Agar selama ± 2 minggu.

4.2 Pembahasan

  Hasil penelitianSuryatenggara dkk (1995) yang dilakukan di Bagian Paru RS Husada Jakarta, dimana dari 66 penderita yang dicurigai terinfeksi jamur dilakukan pemeriksaanjamur dengan kultur pada bilasan bronkusnya diperoleh 30 penderita (45%) positif Hasil pemeriksaan sputum yang positif mengandung jamur Aspergillus fumigatus lebih banyak ditemukan dengan menggunakan metode PCR dibandingkan dengan metode kultur. Dengan banyaknya ditemukan pada penelitian ini sputum yang mengandung jamur Aspergillus fumigatus baik dengan PCR maupun kultur, makapenyakit akibat jamur tidak bisa dianggap remeh dan menjadi perhatian para klinisi.

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

  Dari 51 sampel sputum yang dilakukan kultur sebagai gold standard pemeriksaan jamur didapatkan 29 sampel (56,86%) mengandung jamur Aspergillus fumigatus . Dengan banyaknya dideteksi jamur Aspergillus fumigatus pada sputum penderita batuk kronis baik dengan PCR (68,62%) ataupun kultur(56,86%) maka penyakit yang disebabkan oleh jamur harus tetap menjadi pertimbangan klinisi dalam menegakkan diagnosa.

5. Dari 51 sampel hasil PCR yang dijalankan di gel agarosa ditemukan 3 sampel memiliki pita bukan di urutan 236bp

5.2 Saran 1

  Hal ini untuk dapatmendeteksi lebih dini infeksi jamur pada penyakit-penyakit yang beresiko seperti HIV/AIDS, penyakit imunokompromis, dan lain-lain. Perlu dilakukan penelitian lanjutan pada kelompok penyakit tertentu misalnya pada penderita penyakit COPD, Tb paru, infeksi paru non Tb,penyakit paru non infeksi, penyakit keganasan, HIV/AIDS, ataupun penyakit lain yang beresiko terinfeksi jamur.

DAFTAR PUSTAKA

  vyas, David Zieve,Aspergillosis, Pubmed Health Bansod S dan Rai M, 2008, Emerging of Mycotic Infection in Patients Infected with Mycobacterium tuberculosis, World Journal of Medical Sciences 3(2): 74-80 Bansod S, Gupta I, Rai M, 2008, Specific Detection of Aspergillus fumigates inSputum sample of Pulmonary tuberculosis patients by two-step PCR,African Journal of Biotechnology Vol. Susilo J, 1995, Peran jamur dalam Infeksi Nososkomial dan Penanggulangannya, Simposium Infeksi Nosokomial, JakartaSudjadi, 2008, Biotekhnologi Kesehatan, Yogyakarta, Penerbit KanisiusTanjung A, Anwar A, Nasution K, 1983, Penelitian Jamur Dari Dahak Penderita Selama 3 Tahun (1980-1982), Kumpulan Naskah Kongres Nasional Ke III, Ikatan Dokter Paru Indonesia, 178-81.

RIWAYAT HIDUP 1

  Tempat/tanggal lahir : Medan /18 April 1985 3. Pendidikan SDN 060984 : tamat tahun 1996SLTPN 7 Medan : tamat tahun 1999SMAN 4 Medan : tamat tahun 2002S1 Fakultas Kedokteran UISU Medan : tamat tahun 2008 9.

LEMBAR PENJELASAN KEPADA CALON SUBJEK PENELITIAN

  Saya sedang melakukanpenelitian yang berjudul ” Deteksi Aspergillus fumigatus dengan menggunakan metode polymerase Chain Reaction (PCR) pada Sputum Penderita Batuk Kronis”. Aspergillus fumigatus adalah suatu jamur yang dapat menyebabkan penyakit aspergillosis pada manusia.

INFORMED CONCENT)

  Saya yang bertandatangan di bawah ini :Nama :Umur :Alamat :Telp/ HP :Setelah mendapat penjelasan dari peneliti tentang penelitian ” DeteksiAspergillus fumigatus dengan menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction(PCR) Pada Sputum Penderita Batuk Kronis”, maka dengan ini saya secara sukarela tanpa paksaan menyatakan bersedia ikut serta dalam penelitian tersebut. Reagensia yang digunakan untuk Gambar 4.