Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)

Gratis

1
8
66
2 years ago
Preview
Full text

KATA PENGANTAR

  Untuk kakak-kakak dan kakak-kakak iparku, Kak Yudhi, Kak Yogi dan Kak Riri,Kak Bobby dan Kak Rika, yang walaupun tidak memberikan bantuan secara langsung dalam penyelesaian skripsi ini, namun semangat, dorongan, dan candayang kalian berikan memotivasi penulis untuk selalu bersemangat. Kondisi PCR untuk amplifikasi DNA daging babi dengan primer babi dan DNA daging sapi dengan primer sapi ..............................

DAFTAR ISTILAH

BAB I PENDAHULUAN

Bp : Base pairsDNA : Deoxyribose-Nucleic Acid dNTP : Deoxynucleotide TriphosphatedATP : Deoxyadenoise Triphosphate dCTP : Deoxycytidine TriphosphatedGTP : Deoxyguanosine Triphosphate dTTP : Deoxythymidine TriphosphateEDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid ii-PCR : Insulated Isothermal Polymerase Chain ReactionPCR : Polymerase Chain ReactionRFLP : Restriction Fragment Length PolymorphismRNA : Ribose-Nucleic AcidSDS : Sodium Dodecyl SulfateTAE : TrisAcetate EDTATE : Tris - EDTA

1.1 Latar Belakang Kehidupan seorang muslim berkaitan erat dengan konsep halal dan haram

  Metode analisa dengan menggunakan DNA memiliki beberapa keuntungan, yaitu DNA dapat ditemukan di semua tipe sel pada suatu individu denganinformasi genetik yang identik, DNA merupakan molekul yang stabil dalam proses ekstraksi, dan analisa DNA sangat mungkin dikerjakan dari beberapa tipesampel yang berbeda (Jain, 2004). Ii-PCR bekerja dengan menggunakan suatu tube yang dirancang khusus untuk dapat melakukan amplikasi DNA dengan memanfaatkan fenomenakonveksi termal alami, yang lebih sederhana dan efektif daripada sistem pemanasan dan pendinginan secara mekanik yang digunakan dalam PCRkonvensional dan real-time PCR.

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Babi

  Babi adalah sejenis hewan ungulate yang bermancung panjang dan berhidung ceper pemakan daging maupun tumbuhan-tumbuhan dan merupakanhewan yang berasal dari Eurasia (Wijaya, 2009). Menurut penelitan kesehatan, lemak hewan pada babi lebih banyak dari lemak daging hewan lainnya dan lebih sulit untuk dicerna.

2.1.1. Hukum Babi menurut Syariah Islam

  Jauh sebelum penelitian mengenai babi dan penyakit yang dibawanya dilakukan, Allah swt telah melarang manusia untuk mengkonsumsi babi. Perbedaan utama antara kedua jenis sel itu adalah bahwa materigenetik (DNA) sel prokariotik tidak terletak dalam suatu struktur membran ganda yang disebut nukleus, sedangkan pada eukariotik, semua materi genetiknyaterdapat pada molekul DNA yang terdapat sebagai kromosom yang terletak di dalam nukleus (Purves et al., 2003; Stone, 2004; Stansfield et al., 2006).

2.3. Asam Nukleat

  Ada dua macam basa nitrogen yang menyusun asam nukleat, yaitu basa purin yang terdiri atas adenin (A) dan guanin (G), serta basapirimidin yang terdiri atas timin (T), sitosin (C), dan urasil (U). Suatu basa yang terikat pada satu gugus gula disebut nukleosida, sedangkan nukleotida adalah nukleosida yang berikatan dengan gugus fosfat.

2.3.1. Struktur DNA

  Pada tahun 1953, Watson dan Crick mengemukakan bahwa struktur molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yang mempunyai diameter yangsama dan memutar ke kanan berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins (Gaffar, 2007; Yuwono, 2009). DNA Mitokondria Mitokondria merupakan organel berbentuk tubular atau seperti sosis dengan ukuran hampir sama dengan bakteri dan ditemukan di semua sel eukariotik(Raven dan Johnson, 2002).

2.3.3. Isolasi DNA

  Secara umum, kualitas DNA dapat ditentukan oleh keberadaan kontaminasiRNA, protein, lipid, dan konstituen sel lainnya yang berhubungan dengan enzim restriksi, ligase, dan DNA termostabil. Selain analisis DNA, berkembang pesatnya kebutuhan di bidang diagnostik molelular dan filogeni molekular yang menuntut kecepatan, prosedur yangsederhana, hasil yang akurat dalam ekstraksi DNA dari berbagai jenis sampel, menciptakan pengembangan teknologi baru untuk pengektraksian DNA yangmudah dan lebih cepat dari sebelumnya.

2.4. PCR

  PCR digunakan untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen denganmolekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycle. PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA template, penempelan(annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase (Gaffar,2007).

2.4.1. Komponen PCR

  Ujung 5' primer tidak terlalu penting untuk annealing primer, sehingga memungkinkan untuk menambahkan sekuen Konsentrasi primer yang terlalu tinggi akan menyebabkan mispriming(penempelan pada tempat yang tidak spesifik) dan akumulasi produk non spesifik serta meningkatkan kemungkinan terbentuk primer-dimer, sebaliknya bilakonsentrasi primer terlalu sedikit maka PCR menjadi tidak efisien sehingga hasilnya rendah. Dalam perkembangannya, kini banyak digunakan enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi sehingga penambahan enzim tidak perludilakukan disetiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin (Gaffar, 2007).

2.4.2. Tahapan PCR

  Suhu denaturasi yang terlalutinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq polymerase. Waktu paruh aktivitas enzimtersebut adalah >2 jam pada suhu 92,5 C, 40 menit pada 95 C dan 5 menit pada 97,5 C (Muladno, 2010 dan Sulistyaningsih, 2007).

2. Annealing

  Primer yangtelah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3'nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template oleh DNA polymerase(Gaffar, 2007). Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72 C diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik, bergantung pada buffer,pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target.

2.5. Elektroforesis Gel

  Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100bp dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis akrilamid dapat memisahkan 1 bp dan dijalankan secara vertikal. Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan kedalam sumur-sumur yang terdapat dalam gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiriarus listrik dengan menggunkan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutub positif.

2.6. Insulated Isothermal PCR

  o Ketika pemanasan dengan suhu 95 C diaplikasikan pada bagian bawah dari R- tube, larutan yang panas menjadi ringan dan berpindah ke atas, dan larutan yang dingin yang lebih berat dan berpindah ke bawah. Buffer Insulated isothermal PCR menggunakan Buffer Uni-II yang mengandung reagen-reagen yang berfungsi untuk mengoptimasi laju konveksi termal, menstabilisasi gradien temperatur, mengurangi interaksi antara larutan dan R-tube, dan meningkatkan efisiensi DNA polymerase untuk keberhasilan reaksi iiPCR.

BAB 3 METODE PENELITIAN

  Proses isolasi DNA pada daging sapi dan daging babi adalah sebagai berikut: ditimbang sebanyak 500 mg daging yang telah dihaluskan, kemudiandimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 1,5 ml, ditambahkan 750 µl cell lysis buffer (Tris-EDTA pH 8 dan SDS 1% v/v) dan ditambahkan 3µL proteinase Ko lalu dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 55 C overnight (16 jam). Setelah itu supernatan yang terbentuk dipisahkan dan ditambahkan 20 µl o NaCl 5 M dan 5 µL RNAse, lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit.

3.5. Alur Penelitian

  Persiapan daging babi segar dan daging sapi segarIsolasi DNA Cek keberadaan DNA dengan elektroforesisDNA tidak ada DNA ada Cek konsentrasi DNAPCR 1. Uji spesifitas primer 3.

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi Genom

  Inkubasi campuran DNA dilakukan pada suhu -20 C karena suhu yang rendah mendukung flokulasi DNA untuk membentuk kompleks presipitat yanglebih besar, sehingga DNA dapat dengan mudah terbentuk pelet dengan sentrifugasi. Rasio absorban pada kedua panjang gelombang ini digunakan untukpengukuran kemurnian dari ekstraksi DNA dan protein, dimana rasio 1,8 Pada gambar 4 terlihat pita yang memisah pada bagian bawah dari semua lajur yang menandakan keberadaan RNA, namun dalam jumlah sedikit sehinggatidak perlu dilakukan pemurnian ulang.

4.2. Polymerase Chain Reaction

  Elektroforesis produk PCR konvensional hasil optimasi suhu annealing primer babi pada untai DNA daging babi dengan menggunakan metode gradien PCRPada gambar 5, hasil elektroforesis PCR untuk optimasi suhu annealing o primer babi menunjukkan pita yang sama tebal pada rentang suhu 50-58 C, annealing primer babi yang kemudian digunakan untuk proses PCR selanjutnyao adalah 51 C. Gambar 6 menunjukkan pita juga yang hampir sama tebal pada rentang suhu o o 50-58 C, dimana pada lajur 4 dengan suhu 56 C, pita terlihat sedikit lebih tebal dibandingkan dengan yang lainnya, sehingga suhu yang digunakan sebagai suhu annealing primer sapi untuk pengujian selanjutnya.

4.2.4. Uji Sensitivitas Primer Sapi dan Primer Babi

  Uji ini dilakukan dengan cara mengencerkan konsentrasi DNA daging sapi dan DNA daging babi menjadi seri konsentrasi sebagai berikut; 0.02 ng/ 25 µl, 0,2ng/ 25 µl, 2 ng/ 25 µl, 10 ng/ 25 µl, dan 20 ng/ 25 µl, yang kemudian diamplifikasi dengan PCR. menunjukkan kesensitivitasan primer babi dalam mendeteksiDNA daging babi sampai dengan konsentrasi 0,2 ng/ 25 µl, sedangkan primer sapi hanya sensitif terhadap keberadaan DNA daging sapi sampai dengan konsentrasi 2ng/ 25 µl.

4.3. Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction

  Pada penelitian ini, teknik iiPCR digunakan untuk mendeteksi DNA daging babi dan DNA daging sapi dengan menggunakan primer yang telah diujispesifitasnya dan sentivitasnya dengan PCR konvensional. Pada akhir amplifikasi yang berlangsung selama 58 menit, didapatkan hasil negatif pada mesin ii-PCR, namun adanya pita yang cukup tebal dan jelas denganukuran 141 bp menandakan DNA dapat teramplifikasi, tetapi tidak terdeteksi oleh mesin ii-PCR karena rasio intensitas fluoresensi sesudah reaksi dan sebelumreaksi yang dihasilkan adalah 1.0328 (Tabel 5).

B520 A520

  Konsentrasiprimer dan probe diperbesar menjadi 0,7 mM dan 0,2 mM dengan asumsi bahwa dengan konsentrasi 0,5 µM dan 0,15 µM, primer dan probe telah habis sebelumreaksi selesai. Probe yang tidak memenuhi kriteria memungkinkan kegagalan probe untuk berikatan pada target sebelum prosesekstensi primer terjadi, sehingga amplifikasi target berjalan tanpa adanya probe dan menampilkan tanda (-) pada layar pada akhir reaksi.

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

  Kesimpulan Optimasi reaksi ii-PCR dengan memvariasikan konsentrasi DNA template, primer, probe, dan buffer menghasilkan tanda (-) pada layar mesin ii-PCR denganrasio S/N di bawah 1,3 yang menunjukkan probe tidak bekerja dengan baik. Saran Perlu dilakukan optimasi lebih lanjut dan desain ulang probe untuk mendapatkan kondisi optimal untuk mendeteksi DNA sapi dan DNA babi,sehingga dapat dijadikan sebagai metode untuk pengujian kehalalan suatu produk makanan.

3 Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York

  Campuran reaksi master mix untuk PCR konvensionalKompisisi JumlahGo Taq Green 12, 5 µlPrimer Forward 2 µlPrimer Reverse 2 µlDNA template 2 µl Nuclease Free Water 16,5 µl Total 25 µl Lampiran 3 Kondisi PCR untuk amplifikasi DNA daging babi dengan primer babi dan DNA daging sapi dengan primer sapi. o o 94 C 94 C 25 siklus o o o 10 menit 15 detik 53 C 72 C 72 C o 1 menit 30 detik 7 menit 4 C ~ Kondisi PCR untuk amplifikasi DNA daging sapi dengan primer sapi.

2 X . 100 µM = 100 µL . 10 µM

  X == 10 µL Maka, 10 µL diambil dari masing- masing primer 100 µM dan di add 90µL ddH 3. Membuat larutan probe 5 µM dari larutan indukV .

2 X . 100 µM = 100 µL . 5 µM

  X == 5 µL Maka, 5 µL diambil dari masing-masing probe 100 µM dan di add 95 µL ddH 4. Rekomendasi konsentrasi untuk primer dipilih konsentrasi akhir 0,5 µM(Tsai, 2012) untuk tiap primer V 1 .

Dokumen baru

Tags

Halal Babi Ii Pcr Probe Polymerase Chain Reaction

Dokumen yang terkait

Analisa Aspergillus fumigatus dengan Menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Kultur Pada Sputum Penderita Batuk Kronis
2
79
88
Deteksi Dan Penentuan Virus Dengue Serotipe 3 Dari Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
1
39
65
Deteksi Dan Penentuan Serotipe Virus Dengue Tipe 1 Dari Nyamuk Aedes Aegypti Dengan Menggunakan Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Di Kota Medan
1
38
80
Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction)
2
12
82
Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)
1
62
90
Analisis Cemaran Daging Babi Pada Kornet Sapi di Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
2
14
72
Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)
1
8
66
Deteksi DNA Gelatin Sapi Dan Gelatin Babi Pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real -Time PCR Untuk Analisis Kehalalan
1
11
70
Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real- Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode Hydrolysis Probe.
1
50
86
Amplifikasi DNA Leptospira dengan menggunakan metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)
2
23
64
Analisis Kandungan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi pada Cangkang Kapsul Keras yang Mengandung Vitamin A Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction
0
12
80
Deteksi Mutasi Gen Gyrase A Porphyromonas Gingivalis Resisten terhadap Ciprofloxacin berdasarkan teknik Polymerase Chain Reaction Detection of Gyrase A Mutation of Porphyromonas Gingivalis gene resistant to Ciprofloxacin by using Polymerase Chain Reaction
0
0
10
Akurasi Polymerase Chain Reaction (PCR) Dibandingkan dengan Uji Tuberkulin untuk Diagnosis Tuberkulosis pada Anak
0
0
5
Perbandingan Metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real Time PCR
0
0
8
Analisa Aspergillus fumigatus dengan Menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Kultur Pada Sputum Penderita Batuk Kronis
0
0
15
Show more