Identifikasi Kemiripan Genetik Beberapa Genotipe Saccharum spp.Sumatera Utara denganVarietas Tebu Toleran Kekeringan (PS 864 dan PSJT 941) Menggunakan Penanda Random Amplified Polymorphism DNA

Full text

(1)

TOLERAN KEKERINGAN (PS 864 DAN PSJT 941) MENGGUNAKAN PENANDA RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHISM DNA

T E S I S

O l e h :

RAMOTI ULI AGNES SAMOSIR 127001002/AGROEKOTEKNOLOGI

PROGRAM MAGISTER AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA M E D A N

2015

(2)

TOLERAN KEKERINGAN (PS 864 DAN PSJT 941) MENGGUNAKAN PENANDA RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHISM DNA

T E S I S

O l e h:

RAMOTI ULI AGNES SAMOSIR 127001002/AGROEKOTEKNOLOGI

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Master Pertanian di Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara

PROGRAM MAGISTER AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA M E D A N

2015

(3)

Judul Tesis : IDENTIFIKASI KEMIRIPAN GENETIK

BEBERAPA GENOTIPE Saccharum

spp.SUMATERA UTARA DENGAN VARIETAS TEBU TOLERAN KEKERINGAN (PS 864 DAN PSJT 941) MENGGUNAKAN PENANDA RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHISM DNA

Nama : Ramoti Uli Agnes Samosir

N I M : 127001002

Program Studi : Agroekoteknologi

Disetujui oleh, Komisi Pembimbing

Ketua

Dr. Ir. Lollie Agustina P. Putri, MSi Luthfi A.M Siregar,SP,MSc,PhD Anggota

.

Diketahui oleh, Ketua Program Studi

Prof. Dr. Ir. Abdul Rauf, MP

Dekan Fakultas Pertanian

Prof. Dr. Ir. Darma Bakti, MS

Tanggal Lulus: 27 Januari 2015

(4)

Tanggal: 27 Januri 2015

PANITIA PENGUJI TESIS:

Ketua : Dr. Ir. Lollie Agustina P.Putri, MSi Anggota : Luthfi A.M Siregar,SP,MSc,PhD

Prof. Dr. Drs. Dwi Suryanto, MSc Prof. Dr. Ir. Rosmayati, MS Dr. Diana Sofia, SP, MP

(5)

RAMOTI ULI AGNES SAMOSIR. Identifikasi Kemiripan Genetik Beberapa Genotipe Saccharum spp.Sumatera UtaraDenganVarietas Tebu Toleran Kekeringan (PS 864 dan PSJT 941) Menggunakan Penanda Random Amplified Polymorphism DNA. Dibimbing oleh LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI dan LUTHFI A.M SIREGAR. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui kemiripan genetik beberapa aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara dengan varietas tebu toleran kekeringan (PS 864 dan PSJT 941). Sebanyak 30 aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara dianalisis kemiripan genetiknya menggunakan penanda RAPD. Dari 14 primer yang di skrining, 10 primer mampu mengamplifikasi template DNA yang menghasilkan fragmen DNA yang reproduktif. Sebanyak 70 pita polimorfik diskoring dari 10 primer yang digunakan. Jumlah produk amplifikasi per primer berkisar 5 (OPN 03) - 9 (OPA 04, OPC 18, OPD 03). Ukuran produk amplifikasi 196-1973 bp. Rataan persentase polimorphik dan Polymorphic Information Content (PIC) ke-10 primer yang digunakan adalah 98,75% dan 0,454. Jarak genetik dan pembentukan dendogram dianalisis dengan bantuan Software Darwin 5.05. Koefisien kemiripan Dice digunakan untuk membentuk dendogram. Dari hasil analisis jarak genetik dan dendogram, 30 aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara dikelompokkan menjadi 3 kelompok. Koefisien jarak genetik berkisar 0,067 (Gambas Hamparan Perak/Gambas Sunggal)-0,783 (Gelagah Medan Helvetia/Berastagi Sibolangit). PS 864 dan PSJT 941 terdapat pada kelompok yang sama. Aksesi yang mempunyai kemiripan genetik paling dekat dengan PS 864 adalah PS 882 dan PSJT 941 adalah Kidang Kencana. Koefisien kemiripan 0,828 dan 0,787.

Kata Kunci: Saccharum spp, toleran kekeringan, RAPD, DNA, primer dan kemiripan genetik

(6)

RAMOTI ULI AGNES SAMOSIR. Genetic Similarity Identification of North SumatraSaccharum spp. Genotypes withSugarcane Drought-Tolerant Varieties(PS 864 and PSJT 941) Using Random Amplified Polymorphism DNA Marker. Supervised by LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI andLUTHFI A.M SIREGAR. The objectiveof this research was to determine thegenetic similarity ofNorth SumatraSaccharum spp.accessions withsugarcane drought-tolerantvarieties(PS 864andPSJT941).A total of30accessionsof North SumatraSaccharum spp.has been analyzedfor similarity usingRAPDmarker. Fourteendecamer primerswerescreened and tenprimerswere able to amplify DNA template that could producereproductiveDNA fragments. A total 70 polymorphic bands were scored with 10 primers. The number of amplification products per primer ranged from 5(OPN03)to 9(OPA 04, OPC 18, OPD03). Size the amplification products ranged from 196 to 1973 bp. Meanpercentagepolymorphic and PolymorphicInformationContentof10 primers usedwas98,75% and 0,443.Genetic distanceand dendogram formationwere analyzedusing Darwin5.05software. Dicesimilarity coefficientwas usedtoconstruct thedendogram. Based on analysisof geneticdistanceanddendogram,30accessions ofSaccharum spp.North Sumatragroupedinto 3clusters. Genetic distancecoefficients ranged from0,067 (Gambas Hamparan Perak/Gambas Sunggal) to 0,783 (Gelagah Medan Helvetia/Berastagi Sibolangit). PS864andPSJT 941wasin the same cluster. Genetic similarity accession closest with PS 864 was PS 882 and PSJT 941 was Kidang Kencana. The similarity coefficient is 0,828 and 0,787.

Keywords: Saccharum spp, drought tolerant, RAPD, DNA, primer and genetic similarity

(7)

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa atas rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis dan program studi Agroekoteknologi, Program Pascasarjana Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada:

1. Ibu Dr. Ir. Lollie Agustina P.Putri, M.Si selaku ketua komisi pembimbing dan Bapak Luthfi A.M Siregar,SP,M.Sc,Ph.D selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan motivasi, masukan, bimbingan dan saran baik sewaktu penelitian maupun saat penyelesaian tesis ini.

2. Bapak Prof. Dr. Drs. Dwi Suryanto, M.Sc, Ibu Prof. Dr. Ir. Rosmayati, MS dan Ibu Dr. Diana Sofia, SP, MP selaku komisi penguji pada ujian akhir tesis, serta dosen Program Studi Agroekoteknologi atas ilmu dan pengetahuan yang diberikan selama menempuh pendidikan.

3. Rektor Universitas Sumatera Utara Bapak Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTM&H,M.Sc (CTM),SP.A (K)., Direktur Pasca Sarjana USU Bapak Prof. Dr. Ir. A. Rahim Matondang, MSIE, Dekan Fakultas Pertanian USU Bapak Prof. Dr. Ir. Darma Bakti, MS dan Ketua Program Studi Agroekoteknologi Bapak Prof. Dr. Ir. Abdul Rauf, MP atas kesempatan yang diberikan untuk mengikuti program pasca Sarjana Pertanian di USU.

4. Kementerian Pertanian selaku sponsor biaya pendidikan melalui Program Beasiswa Pascasarjana 2012-2014 yang telah memberikan bantuan biaya pendidikan.

(8)

kesempatan yang diberikan untuk menempuh pendidikan di USU.

6. PT. Perkebunan Nusantara II Riset Pengembangan Tebu Sei Semayang atas izin untuk pengambilan sampel bahan tanaman di Kebun Koleksi Sei Semayang dan Tanjung Jati.

7. Ibu dr Tetty Aman Nasution selaku Kepala Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran USU beserta staf (Bu Mardiyah, Pak Indra, Bu Eli) yang telah memberikan izin serta bantuan didalam pelaksanaan penelitian

8. Ayahanda K. Samosir dan Ibunda R. Pakpahan atas limpahan doa, kasih sayang dan motivasi, serta adik-adik dan keponakan saya yang menjadi penyemangat selama ini.

9. Teman-teman AET angkatan 2012 (Retta, Dame, Ariani, Deden, Nani, Makruf) dan semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian pendidikan, penelitian dan penulisan tesis ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Kiranya tesis ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan dan pengembangan tebu di Sumatera Utara.

Medan, Maret 2015

Penulis

(9)

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas kehendakNya penulis dapat menyelesaikan tesis ini yang berjudul “Identifikasi Kemiripan Genetik Beberapa Genotipe Saccharum spp Sumatera Utara Dengan Varietas Tebu Toleran Kekeringan (PS 864 dan PSJT 941) Menggunakan Penanda Random Amplified Polymorphism DNA” yang merupakan salah satu syarat untuk

memperoleh gelar magister pada Program Pascasarjana Agroekoteknologi di Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Ir. Lollie Agustina P. Putri, M.Si selaku ketua komisi pembimbing dan Bapak Luthfi A.M Siregar, SP, M.Sc.Ph.D, selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan dan pengarahan selama melakukan penelitian dan penyusunan tesis ini.

Karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna, untuk itu penulis menerima kritik dan saran yang membangun. Akhir kata penulis mengucapkan terima kasih, semoga karya ilmiah ini bermanfaat dan dapat memberikan sumbangan bagi kemajuan ilmu dan teknologi.

Medan, Maret 2015

Penulis

(10)

Ramoti Uli Agnes Samosir, dilahirkan di Samosir pada tanggal 3 Agustus 1975, merupakan anak pertama dari enam bersaudara dari pasangan Bapak K. Samosir dan Ibu R. Pakpahan.

Penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar (SD) di SD RK Santo Paulus Onanrunggu pada tahun 1987 dan Sekolah Menengah Pertama di SMP RK Bakti Mulia Onanrunggu pada tahun 1990. Pada tahun 1990, penulis melanjutkan pendidikan Sekolah Menengah Umum di SMU RK Budi Mulia Pematang Siantar. Selanjutnya pada tahun 1993 melanjutkan kuliah di Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dan selesai pada tahun 1998.

Pada tahun 2005 penulis diterima sebagai staf Pengawas Benih Tanaman di Direktorat Jenderal Perkebunan, Kementerian Pertanian dan ditempatkan di Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Medan hingga berkesempatan melanjutkan pendidikan Pasca Sarjana di Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara pada bulan September 2012.

(11)

Halaman

ABSTRAK... i

ABSTRACT... ii

UCAPAN TERIMAKASIH... iii

KATA PENGANTAR... v

RIWAYAT HIDUP... vi

DAFTAR ISI... vii

DAFTAR TABEL……….. ix

DAFTAR GAMBAR………. x

DAFTAR LAMPIRAN……….. xi

PENDAHULUAN... 1

Latar Belakang... 1

Perumusan Masalah... 3

Tujuan Penelitian... 4

Hipotesis... 4

Manfaat Penelitian... 4

TINJAUAN PUSTAKA... 6

Asal Usul, Taksonomi dan Genetik... 6

Morfologi Umum Saccharum spp... 9

Genotipe Saccharum spp di Sumatera Utara... 13

Varietas Tebu Toleran Kekeringan... 14

Penanda Random Amplified Polimorphism DNA (RAPD)………... Keuntungan penggunaan penanda RAPD……….. Prinsip analisa DNA dengan RAPD……….. 14 15 16 Penggunaan Penanda RAPD Pada Saccharum spp... 17

BAHAN DAN METODE... 19

Tempat dan Waktu... 19 Bahan dan Alat……… Bahan tanaman... Bahan kimia... Alat...

19 19 20 20 Pelaksanaan Penelitian... Pengambilan sampel daun... Isolasi dan pemurnian DNA...

21 21 21

(12)

Amplifikasi PCR... Elektroforesis... Analisis Data RAPD...

25 25 26

HASIL DAN PEMBAHASAN... 28

Hasil... Kualitas DNA ... Amplifikasi PCR dan elektroforesis... Identifikasi Penanda Genotip Spesifik Berdasarkan Analisis RAPD... Analisis kemiripan berdasarkan jarak genetik dan pola pengelompokan………...……… Analisis kemiripan berdasarkan pola pita dan jumlah fragmen DNA……… Analisis faktorial... 28 28 28 32 33 37 41 Pembahasan... Kualitas DNA dan kesesuaian primer……… Polimorpisme 10 primer RAPD, PIC dan penanda genotipe spesifik pada 30 aksesi Saccharum sppSumatera Utara……….. Pengelompokan aksesi dan kemiripan genetik………... Analisis Faktorial……… 41 41 42 43 50 KESIMPULAN DAN SARAN... 51

Kesimpulan... 51

Saran... 51

DAFTAR PUSTAKA... 52

LAMPIRAN………... 56

(13)

No Teks Halaman 1. Varietas yang sedang ditanam dan dikembangkan di PT.Perkebunan

Nusantara II Sumatera Utara………. 13 2. Bahan tanamandan lokasi pengambilan sampel……….………... 19 3. Daftar primer RAPD yang digunakan untuk genotyping 30 aksesi

Saccharum sppSumatera Utara………... 24

4. DaftarprimerRAPDdenganjumlahpitaperaksesi,

jumlahpitamonomorfikda npolimorphik, persentase polimorphisme, rentang ukuranpitaDNA dan tingkat keinformatifan masing-masing primer pada30 genotipeSaccharum spp Sumatera Utara………...

29

5. Identifikasi aksesi dengan penanda genotipe spesifik………... 33 6. Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk kombinasi pasangan 30

aksesi Saccharum spp Sumatera Utara………. 34 7. Kemiripan pita DNA varietas PS 864 dengan aksesi yang berada pada

cabang yang sama dalam sub kelompok ……….. 38 8. Kemiripan pita DNA varietas PSJT 941 dengan aksesi yang berada pada

cabang yang sama dalam sub kelompok ……….. 39

(14)

No Teks Halaman 1. Bagan alir penelitian identifikasi kemiripan genetik beberapa genotipe

tebu (Saccharum spp.) Sumatera Utaradengan varietas PS 864 dan PSJT

941 toleran kekeringan menggunakanRAPD ………. 5

2. Bagian batang(daun diklentek) ……….………... 9

3. Bagiandaun(dilepasdari batang)…...……….. 10

4. Perangkat dan tunas akar………... 10

5. Diagram propagul Saccharum spp……….. 11

6. Profil uji kualitas DNA 30 aksesi Saccharum spp dari beberapa lokasi di Sumatera Utara…..……… 28

7. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPB 10………..…………... 30

8. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPB 18………..……….. 31

9. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPC 04…………..……….. 31

10. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPC 19………..……….. 32

11. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPD 03…………..………... 32

12. Dendogram 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching………...………... 35

13. Profil radial neighbour-joining tree 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara berdasarkan analisis Matrix Dissimilarity Simple Matching…….... 36

14. Perbandingan pola pita dan jumlah fragmen DNA pada varietas PS 864 dan PSJT 941 dengan menggunakan 10 primer RAPD……… 37

15. Perbandingan pola pita dan jumlah fragmen DNA pada varietas BZ 134 dengan menggunakan 10 primer RAPD……… 38

16. Hubungan genetik 30 aksesi Saccharum spp berdasarkan analisis faktorial, aksis 1 (horizontal), aksis 2 ( vertikal)………... 41

(15)

No Teks Halaman 1. Deskripsi pembuatan larutan stok dan larutan buffer (larutan kerja)……. 56 2. Hasil visualisasi pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera

Utara pada 9 primer………...………. 58 3. Profil pita spesifik beberapa aksesi pada 4 primer RAPD…….………… 61 4. Tabel Rekapitulasi Ukuran Pita DNA 30 Aksesi Saccharum spp

Sumatera Utara Dengan Menggunakan 10 Primer RAPD………. 63 5. Peta Sebaran Titik Lokasi Pengambilan Sampel……… 67 6. Profil dan deskripsi 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara…………. 68

(16)

RAMOTI ULI AGNES SAMOSIR. Identifikasi Kemiripan Genetik Beberapa Genotipe Saccharum spp.Sumatera UtaraDenganVarietas Tebu Toleran Kekeringan (PS 864 dan PSJT 941) Menggunakan Penanda Random Amplified Polymorphism DNA. Dibimbing oleh LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI dan LUTHFI A.M SIREGAR. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui kemiripan genetik beberapa aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara dengan varietas tebu toleran kekeringan (PS 864 dan PSJT 941). Sebanyak 30 aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara dianalisis kemiripan genetiknya menggunakan penanda RAPD. Dari 14 primer yang di skrining, 10 primer mampu mengamplifikasi template DNA yang menghasilkan fragmen DNA yang reproduktif. Sebanyak 70 pita polimorfik diskoring dari 10 primer yang digunakan. Jumlah produk amplifikasi per primer berkisar 5 (OPN 03) - 9 (OPA 04, OPC 18, OPD 03). Ukuran produk amplifikasi 196-1973 bp. Rataan persentase polimorphik dan Polymorphic Information Content (PIC) ke-10 primer yang digunakan adalah 98,75% dan 0,454. Jarak genetik dan pembentukan dendogram dianalisis dengan bantuan Software Darwin 5.05. Koefisien kemiripan Dice digunakan untuk membentuk dendogram. Dari hasil analisis jarak genetik dan dendogram, 30 aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara dikelompokkan menjadi 3 kelompok. Koefisien jarak genetik berkisar 0,067 (Gambas Hamparan Perak/Gambas Sunggal)-0,783 (Gelagah Medan Helvetia/Berastagi Sibolangit). PS 864 dan PSJT 941 terdapat pada kelompok yang sama. Aksesi yang mempunyai kemiripan genetik paling dekat dengan PS 864 adalah PS 882 dan PSJT 941 adalah Kidang Kencana. Koefisien kemiripan 0,828 dan 0,787.

Kata Kunci: Saccharum spp, toleran kekeringan, RAPD, DNA, primer dan kemiripan genetik

(17)

RAMOTI ULI AGNES SAMOSIR. Genetic Similarity Identification of North SumatraSaccharum spp. Genotypes withSugarcane Drought-Tolerant Varieties(PS 864 and PSJT 941) Using Random Amplified Polymorphism DNA Marker. Supervised by LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI andLUTHFI A.M SIREGAR. The objectiveof this research was to determine thegenetic similarity ofNorth SumatraSaccharum spp.accessions withsugarcane drought-tolerantvarieties(PS 864andPSJT941).A total of30accessionsof North SumatraSaccharum spp.has been analyzedfor similarity usingRAPDmarker. Fourteendecamer primerswerescreened and tenprimerswere able to amplify DNA template that could producereproductiveDNA fragments. A total 70 polymorphic bands were scored with 10 primers. The number of amplification products per primer ranged from 5(OPN03)to 9(OPA 04, OPC 18, OPD03). Size the amplification products ranged from 196 to 1973 bp. Meanpercentagepolymorphic and PolymorphicInformationContentof10 primers usedwas98,75% and 0,443.Genetic distanceand dendogram formationwere analyzedusing Darwin5.05software. Dicesimilarity coefficientwas usedtoconstruct thedendogram. Based on analysisof geneticdistanceanddendogram,30accessions ofSaccharum spp.North Sumatragroupedinto 3clusters. Genetic distancecoefficients ranged from0,067 (Gambas Hamparan Perak/Gambas Sunggal) to 0,783 (Gelagah Medan Helvetia/Berastagi Sibolangit). PS864andPSJT 941wasin the same cluster. Genetic similarity accession closest with PS 864 was PS 882 and PSJT 941 was Kidang Kencana. The similarity coefficient is 0,828 and 0,787.

Keywords: Saccharum spp, drought tolerant, RAPD, DNA, primer and genetic similarity

(18)

PENDAHULUAN Latar Belakang

Tebu (Saccharum officinarum L) merupakan komoditas perkebunan penting yangditanam sebagai bahan baku utama gula yang berperan dalam pemeliharaanketahanan pangan dan revitalisasi pertanian. Hingga saat ini, gula merupakan komoditas strategis dalam perekonomian Indonesia karena disamping sebagai salah satu kebutuhan pokok masyarakat juga sebagai sumber kalori yang relatif murah.

Berdasarkan angka rata-rata produksi gula hablur Perkebunan Rakyat (PR) per provinsi periode 2006-2010 terdapat 8 provinsi yang menghasilkan gula hablur untuk produksi nasional. Jawa Timur menyumbang produksi sebesar 72,57%, Jawa Tengah 16,90%, Lampung 4,60%, Jawa Barat 3,95%, Daerah Istimewa Yogyakarta 1,34% sedangkan Sumatera Utara, Sulawesi Selatan dan Sumatera Selatan hanya menyumbang masing-masing kurang dari 1,00 %. Rataan produksi gula PR di Sumatera Utara tahun 2006-2010 sebesar 4,54 ton (Respatiet al, 2010), dan pada tahun 2012-2013 turun menjadi 3,24 ton dengan luas areal pertanaman tebu rakyat 1.252,52 ha, total produksi 77.926,93 ton dengan rataan produksi 60,21 ton/ha(Disbun Sumatera Utara, 2013).

Sejalan dengan kebijakan Kementerian Pertanian yang dicerminkan pada visinya untuk mewujudkan pertanian industrial unggul berkelanjutan yang berbasis sumberdaya lokal untuk meningkatkan kemandirian pangan, nilai tambah, daya saing, ekspor dan kesejahteraan petani maka dibutuhkan seperangkat teknologi yang tepat untuk mengangkat posisi sumber daya genetik lokal, terutama yang mendorong kemandirian nasional dan kesejahteraan petani.Perhatian yang lebih besar terhadap plasma nutfah yang ada, perlu ditingkatkanterutama varietas lokal melalui upaya pengelolaan plasma nutfah secara optimal dalam bentuk kegiatan inventarisasi

(19)

(koleksi), pendataan (dokumentasi) dan pelestarian (konservasi) yang selanjutnya diikuti dengan upaya identifikasi karakter-karakter penting melaluikegiatan karakterisasi dan evaluasi secara sistematis (Syukur, 2006).

Areal pertanaman tebu di Sumatera Utara merupakan areal pertanaman lahan kering yang sebagian besar diusahakan oleh Perkebunan Besar dan pertanaman Tebu Rakyat dengan luasan yang relatif kecil. Areal pertanaman berada di dua wilayah yaitu Kabupaten Langkat dan Deli Serdang (Koswara, 2008). Klon tebu unggul lokal yang dikembangkan pada industri gula di Sumatera Utara didominasi varietas lama F 156 (BZ 134) dan seri PS yang diminati dan lambat laun beralih ke varietas baru(Mulyadi et al, 1997) dan beberapa kultivar lokal (Kuning, Gelagah, Berastagi, Gambas, dan Merah) yang dibudidayakan masyarakat(Sinaga dan Susanto, 2009).

Untuk mendapatkan hasil tebu dengan kondisi pertanaman lahan kering, maka diperlukan adanya bahan tanaman yang toleran kekeringan.Sebagai upaya tindak lanjut dan antisipasinya, maka kegiatan perakitan teknologi pertanian salah satunya diorientasikan kepada upaya penemuan varietasyang toleran terhadap kondisi cekamankekeringan serta adaptif dengan kondisi Sumatera Utara. Untuk itu perlu dilakukan identifikasi genetik kultivar dan klontebu komersil Sumatera Utara yang toleran terhadap kekeringan.

Salah satu cara yang dilakukan untuk mengidentifikasi dan menyeleksi tanaman secara genetik adalah dengan menggunakan penanda molekuler. RAPD merupakan salah satu metode penanda genetik yang dapat digunakan untuk berbagai keperluan penelitian pada tingkat molekuler karena lebih murah, regenerasi lebih cepat, membutuhkan DNA lebih sedikit, tidak menggunakan radioisotop dan untuk analisis tidak perlu keahlian yang khusus(Sudarmi, 2013).Penanda inidigunakan untuk berbagai aplikasi dalam pemetaan gen, genetika populasi, genetika evolusi molekuler, dan pemuliaan tanaman dan hewan. Teknik ini dapat dilakukan di

(20)

laboratorium moderat untuk sebagian besar aplikasi(Kumar dan Gurusubramanian, 2011).

Penelitian tebu di Sumatera Utara masih sangat minim, bahkan data hasil eksplorasi keragaman genetik terhadap kultivar lokal belum ada ditemukan. Pendataan keragaman genetik merupakan bukti taksonomi yang memperkaya keanekaragaman hayati serta mempermudah dalam pengawasan plasma nutfah dan sebagai dasar perakitan tanaman.Pendataan secara molekuler dengan penanda RAPD mampu menghasilkan pola pengelompokan dan data hubungan genetik. Selanjutnya dari polapengelompokandan hubungangenetikdapat diidentifikasikultivaryang beragam dariberbagai kelompokdanmenggunakannyadalam program pemuliaanmasa depan.

Perumusan Masalah

Program akselerasi peningkatan produktivitas tebu untuk pencapaian swasembada gula di Sumatera Utara perlu dilaksanakan. Salah satunya adalah perluasan pertanaman ke lahan marginal yaitu lahan kering. Pengelolaan pertanaman tebu lahan kering selain memperhatikan sifat lahan, kondisi fisik lingkungan, ketepatan waktu juga penggunaan varietas toleran. Teknologi varietas merupakan salah satu input budidaya tanaman yang relatif rendah. Dampak masukan dengan menggunakan varietas unggul sangat besar yaitu mampu meningkatkan produksi secara signifikan. Untuk itu upaya pencarian varietas unggul baru yang sesuai untuk kondisi lahan kering di Sumatera Utara perlu diupayakan.

Dalam rangkapencarian aksesi unggul tebu di Sumatera Utara maka terlebih dahulu perlu dilakukan upaya identifikasi keragaman genetik. Tujuannya untuk mendapatkan informasi keragaman genetik dan pengelompokan setiap aksesi plasma nutfah tebu. Identifikasi keragaman genetik dapat dilakukan dengan penanda morfologi/sitologi dan molekuler. Identifikasi dengan penanda morfologi dan sitologi

(21)

untuk membedakan antara satu tanaman dengan tanaman lainnya, memiliki kelemahan. Hal ini kadang-kadang menyebabkan perbedaan yang tidak tegas dan variasi yang cukup sulit untuk diperhatikan sehingga menyebabkan kerumitan. Identifikasi dengan molekuler memungkinkan studi individu akan ketidaktepatan pengukuran yang disebabkan oleh faktor lingkungan.Untuk itu perlu dilakukan pendataan keragaman genetik tebu Sumatera Utara secara molekuler sehingga diperoleh pola pengelompokan aksesi yang dapat dijadikan sebagai dasar dalam program pemuliaan tebu untuk menghasilkan varietas lokal yang toleran kekeringan. Bagan alir penelitian identifikasi kemiripan genetik beberapa genotipe tebu (Saccharum spp.) Sumatera Utaraseperti pada Gambar 1.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemiripan genetik beberapa genotipe Saccharum spp. Sumatera Utara dengan varietas tebu toleran kekeringan(PS 864 dan PSJT 941).

Hipotesis Penelitian

Terdapatkemiripan genetik beberapa genotipe Saccharum sppSumatera Utara dengan varietastebu toleran kekeringan (PS 864 dan PSJT 941).

Manfaat Penelitian

1. Tersedia informasi keragaman genetik beberapa genotipe tebu di Sumatera Utara 2. Terinventarisirnya plasma nutfah lokal tebu di Sumatera Utara melalui upaya

identifikasi secara genetik

3. Sumber informasi dalam pemuliaan tebu untuk perakitan varietas tebu toleran kekeringan di Sumatera Utara

4. Mendapatkan primer yang sesuai untuk dijadikan sebagai acuan dalam studi analisis genetik tanaman tebu.

(22)

Gambar 1. Bagan alir penelitian identifikasi kemiripan genetik beberapa genotipe tebu (Saccharum spp.) Sumatera Utara dengan varietas PS 864 dan PSJT 941 toleran kekeringan menggunakanRAPD

(23)

TINJAUAN PUSTAKA

Tebu merupakan tanaman monokotil yang banyak dibudidayakan didaerah tropis dan sub tropis terutama karena kemampuan menyimpan sukrosa atau gula dengan konsentrasi yang tinggi pada ruas batang.

Asal Usul, Taksonomi dan Genetik

Tebu merupakan genus Saccharum, dari suku Andropogoneae termasuk keluarga rumput-rumputan (Poaceae). Genus Saccharum terdiri dari 6 spesies yaitu S. officinarum, S. spontaneum,S. robustum, S. edule, S. barberi, dan S. sinense. Tebu

merupakanintrogresidari beberapa genera yang berbagi karakteristik umum dan membentuk kelompok interbriding tertutup yang saling terkait, dikenal sebagai Saccharum majemuk.Saccharum majemuk terdiri dari Saccharum,Erianthus

golongan Ripidium, Mischantus golongan Diandra, Narenga dan Sclerostachya. Genera ini dicirikan dengan tingginya tingkat poliploidi dan jumlah kromosom yang sering tidak seimbang (aneuploidi) sehingga sulit untuk menentukan taksonominya, mengakibatkan banyak revisi dengan hubungan taksonomi sebelumnya(Sundara, 2000; Australian Goverment, 2004;2011).

GenusSaccharumterdiridari35-40spesies danmemiliki2 pusatkeragaman yaitu TheOld World(Asia dan Afrika) dan NewWorld(Amerika Utara, Tengahdan Selatan).

Asiamemilikisekitar 25spesies asli, Amerika Utara 6spesies asli dimana baru 4-5spesies yang dikenal, Amerika Tengah 3-4 spesies asli danbeberapaspesies introduksi, Afrika 2spesiesaslidanAustralia1spesiesnaturalisasi(Gianotto et al, 2011).

S.officinarumdiduga dihasilkan dari introgresi kompleks antara

S.spontaneum, Erianthus arundinaceus dan Miscanthus sinensis. Spesies S.

saccharum yang dibudidayakan saat inimerupakan hasil persilangan

interspesifik(S.officinarum dengan S. spontaneum atau S. robustum) disebut proses nobilisasi di mana induk betina, S. officinarum, memberikan kontribusikualitas

(24)

ataukadar gula, sedangkan tetua jantanmemberikan kontribusikekuatan pertumbuhandan ketahanan penyakit terhadap keturunannya.Spesies ini memiliki jumlah kromosom 2n=80 dengan jumlah kromosom dasar (x) 10 sehingga termasuk poliploidi (lebih dari 2 set kromosom misalnya octaploidi (2n=80, 8 set kromosom

lengkap).S. officinarum bukan poliploidi sederhana tetapi merupakan spesies hibrida kompleks yang berbeda karena autopoliploidi (lebih dari 2 set kromosom homolog berasal dari 1 spesies) dan juga allopoliploidi (memiliki 2 atau lebih set kromosom)(Sundara, 2000; Australian Goverment, 2004). Spesies ini menyebabkan terjadinya penyebaran industri tebu di daerah tropis dan sub tropis.Spesies S. officinarumberasal dari daerah Pasifik Selatan kemungkinan dari Papua Nugini dan

tersebar melalui 3 rute pada jaman yang berbeda. Pertama, dimulai kira-kira 8000 SM melalui pulau Salomon, Hebrides baru dan Caledonia baru. Kedua, dimulai kira-kira 6000 SM melaluiPhilippina, Kalimantan, Jawa, Malaysia, dan Burma sampai ke India, dan ketiga, antara tahun 500 M dan 1100 M melalui Fiji ke Tonga, Tahiti, Marquesas dan Hawai (Blackburn, 1984).

Spesies S. spontaneummembentuk kelompokyang sangat kompleks, beberapa jenisberasal dariAfrikabagian UtaradanTimur, Anatolia, Turkmenistan, Kalimantan, Burma, India, Cina, Jawa, Papua Nugini, Filipina, SulawesidanTaiwan yang dipercaya berevolusi di Asia Selatan. Spesies inimerupakan rumput tahunan kecil yang mempunyai polimorfisme yang tinggi, dengan kromosom 2n=40-128. Tanaman ini juga merupakanpoliploidikompleks denganjumlah kromosomdasarkemungkinan8atau10(James, 2004;Australian Goverment, 2011).

Spesies S. edule merupakanspesiesyang berasaldari Papua Nuginidankepulauandisekitarnya. Spesies ini terkait erat denganS.robustum, dengan kemiripan morfologi yang besar sehinggaotoritastertentutidakmenganggapnyasebagaispesies yang berbeda.

(25)

S.eduledidugaberasal dariintrogresiS.officinarumatauS.robustumdengangenera

lain(James, 2004;Australian Goverment, 2011)

Spesies S. robustum merupakan tipe liar, dianggap sebagai tetua S.officinarum. Ada spekulasi yang mengatakan bahwa spesies ini merupakan tahap

mediumjalur evolusi antaraS.spontaneumdanS.officinarum. Tanaman ini termasuk spesies asli Papua Nugini, Melanesia dan kepulauandisekitarnya(James, 2004).

SpesiesS.sinense, disebut sebagai tebu Cinamerupakan tipe liar, dianggap sebagai hasil introgresi S.officinarum dan S.spontaneum, namun kebanyakan karakteristiknya mirip dengan S. officinarum. Spesies initermasuk tanaman asli Canton, IndoCina, Taiwan, India bagian Selatan, Bihar dan Bengal(Verheye, 2010).Tebu Uba, merupakanjenis yang palingkhas dari S.sinense, secara luasditanam secara komersialdi beberapa belahan dunia. TebuUbatetap menjadi varietas yang digunakansampaihibridalaindiidentifikasitahan terhadappenyakit mosaikdanmemilikikualitasgiling yang lebih baik. Spesies iniditanamdi Afrika Selatan dalamjumlah yang lebih besardibanding di tempat lain, bahkantetapmenjadi varietasutamaketika penyakitmosaikmuncul di sanapada awalabad kedua puluh. Meskipun pembungaan hampirsteril, namun beberapa kultivar Uba digunakanuntuk pemuliaantebu. Beberapa varietasBarbadosdan pertanaman tebu di Hawai awalnya menggunakan Uba sebagai tetua. (James, 2004;Australian Goverment, 2011)

Spesies S. barberi merupakan spesies tebu aslisubtropis yang awalnya digunakan untuk memproduksi gula di India Utara (sekarang Pakistan) selama berabad-abad. S.barberi dibedakan atas 5 kelompok utama berdasarkan karakter vegetatif daun, batang, dan akar yaitu Mungo, Nargori, Saretia, Sunnabile, dan Pansahi. Klon Pansahi kurang eksklusif di bagian benua India, namunbanyak ditemukan di Cina Selatan, Indochina, dan Taiwan. Beberapa pemulia menilai S. officinarum dan S. spontaneum membentuk cadangan tetua untuk spesies ini, tetapi

(26)

S. barberi memiliki banyak karakteristik yang mirip dengan S. officinarum yang

tidak terdapat pada S. spontaneum(James, 2004). MorfologiUmum Saccharum spp

Tanaman tebu termasuk tanaman C4 yang sudah mengalami adaptasi dari tanaman liar (S. robustum L.).Biomassa yang dihasilkan dibanding tanaman sefamilinya (rumput) sangat besar yakni mencapai 160 ton tebu per ha, sehingga dikenal sebagai the giant grass yang dicirikan oleh sifat yang memakan tempat (bulky) karena tingginya kadar air yang terkandung didalamnya (±75%)(Koswara, 2008).

Bagian utama tebu adalah batang, daun, sistem perakaran dan bunga.Batang berkembang dari tunas potonganbatanglain yang ditanam untuk perbanyakan vegetatif. Potongan batang digunakan sebagai bahan tanam yang disebut sett yang terdiri dari satu atau beberapa tunas.Tunas berkembang pada kondisi yang sesuai dan menghasilkanbatangprimeryang memproduksi batang sekunderdan juga menumbuhkan batangtersier, sehinggamendorongprosesanakan(Sundara, 2000). Batangterdiri darisegmenyang disebutruas yang terdiri daribukudaninternode. Bukumerupakan tempat daunmenempel padabatang, di manatunasdanprimordia akarberada. Panjang dandiameterruasbervariasitergantung varietas dan kondisi pertumbuhan(Miller et al., 2012).

Gambar 2.Bagian batang(daun diklentek) (Miller et al., 2012).

Daun terbagi dua bagian yaitu selubung daun dan helaian, dipisahkan oleh persambungan helaian daun. Selubung daun, menyelubungi batang, memanjang terus sampai satu ruas tertutup lengkap. Daun menempel bergantian ke buku, sehingga

(27)

membentuk dua tingkatan pada sisi berlawanan. Luas permukaan daun atas rata-rata 0,5 m2 dan jumlah daun hijau per tangkai rata-rata sepuluh, tergantung varietas dan kondisi pertumbuhan(Miller et al., 2012). Panjang daun mencapai kira-kira 2 m dan lebar 2-7 cm. Permukaan bagian atas dan bawah daun mempunyai stomata pada kutikula. Sel parenkim dikelilingi 2 lapis berkas pembuluh. Lapisan dalam disebut bundle sheath mengandung sel besar dengan pigmen klorofil(Sundara, 2000).

Gambar 3.Bagiandaun(dilepasdari batang)(Miller et al., 2012).

Pada tebu 2 jenisakarakan berkembang daribibit yang ditanam. Perangkatakar, yang timbul dariberkas akar,tipis danbercabangsedangkanakar tunas yangberasal dariberkas akaryang lebih rendah daritunas,tebal, berdagingdan cabangnya sedikit(Miller et al., 2012). Bulu akar berasal dari lapisantunggalkutikula dan tonjolan yang berumur singkat. Kebanyakan tebu yang ditanam di tanah, sebagian besar akar (±90%) berada pada 50 cm lapisan atas.Akar yang lebih tua lebih tebal beberapa milimeter dari akar tali pada sistem perakaran dan mencapai kedalaman sekitar 2 m. Pada tanah berpasir dan lebih longgar akar lebih tipis dan menyebar luas, ketika tanah menjadi padat akar menebal dan penyebarannya terbatas(Sundara, 2000).

Gambar 4.Perangkat dan tunas akar(Miller et al., 2012)

(28)

Perbungaan tebu disebut dengan arrow. Tebu merupakan tanaman berhari pendek. Dengan kondisi photoperiodismeini, seharusnya bunga dapat terbentuk di daerah tropis, tetapi tebu tidak dapat berbunga disetiap tempat, karena memerlukan kondisi lingkungan spesifik(Sundara, 2000).Biasanya, panjang hari yang pendek 12,5 jam dan suhu malam hari 680F akan menimbulkan inisiasi bunga. Suhu yang terlalu rendah dan/atau stres air menghambat perkembangan perbungaan. Perbungaan tebu merupakan malai terbuka yang bercabang. Perbungaan terdiri dari ribuan bunga kecil, masing-masing menghasilkan1 biji. Benih sangat kecil, beratnya sekitar 250 per g atau 113.500 per pon(Miller et al., 2012).Perbungaan beradaptasi dengan penyerbukan melalui angin.Malai terminal berbentuk longgar panjangnya 25-50 cm, penampilan halusdengancincinrambut yang panjangdi bawahspikelet(Blackburn, 1984).

Gambar 5. Diagram propagul Saccharum spp.:a. propagul lengkap,koma

cupulate, pedikel kosong dan rachilla ditambah spikelet sessile,b. gluma I, c. gluma II,d. palea,e.bunga dengan 2 lodikula, 3 benang sari dan gynoceum dengan ovarium dan dua stigma berbulu (Gianotto et al, 2011).

Tunas pada S.officinarumdigunakan sebagai dasaruntuk membentuk batang yang tidak bercabang dengan tinggi 2-4matau lebih dengan diameter2,5-5cm. Spesies inidibudidayakanuntukmemproduksi batang yang besar, berbentuk lonjoran, bagiandari mana guladiekstraksi.Umumnya ruasmempunyai jarak denganinterval sekitar15-25cm,jarak ruas menjadi lebih dekat pada bagian batangpaling atas. Warna dan kekerasan batang bervariasi tergantung varietas. Setiapbatang memiliki kekerasan tertentu, kulit tertutup lilin(epidermis) yang dikelilingisuatu massa dari

(29)

jaringanlunak (parenkim) yangdiselingidenganserat-serat(vaskular bundel) (James, 2004).

S.spontaneum memiliki karakteristik pertumbuhan yang sangat vigor, tahan

terhadap penyakit, batangramping, keras, sering ditemukan denganpusat yang berongga dan akumulasi sukrosa rendah.Warna batanghijaupucatketika muda dan menjadiputih ataukekuningan dengan bertambahnya usia, biasanyaditutupi dengan lilinyang tebal. Ruasbatangbiasanyapanjang, tidak memiliki retakantumbuh. Buku biasanyalebih tebal dariruas.Batangtumbuhdarirumpunataustolon,pembentukan anakanrhizomatous aktif.BerdasarkanklasifikasiPanjepada karaktervegetatif, ada 2subspesies yaituindicum, berjuntai ataurebah(kecuali bentukJawayang dikenal sebagai Gelagah), danaegyptiacumyangtegak. Tanaman ini mempunyai perbungaan dengan malai yang kecil dan tidakmenyerbuk sendiri. S.spontaneum adalah spesies yang adaptif dantumbuh pada berbagai habitat dan ketinggian tempat yang berbeda di daerah tropis sampai beriklim sedang (James, 2004;Australian Goverment, 2011).

S.eduleditandai dengan karakteristik yangtidak biasa, batang membengkak

dan perbungaan yang gugur, digunakansebagai sumbermakanan dikepulauan Pasifik danPapuaNugini yang dikenal sebagai navisco di Vanuatu dan pitpit di Papua Nugini(James, 2004;Australian Goverment, 2011).

Didalam habitat alaminya yaitu daerah tepi pantai tropis basah, S. robustumtumbuh sangat vigor, membentuk jumbai yang kompak, mencapai

pertumbuhan hingga 10 m. S. robustum sering digunakan sebagai pagar di Papua Nugini. Klon rentan terhadap virus mosaik tebu sehingga sering dikaitkan sebagai bukti hubungan yang dekat dengan S.officinarum (James, 2004).

S. sinense mempunyai morfologi dengan pertumbuhan klon yang tinggi,

batang keras dan vigor dengan kemampuan adaptasi yang luas, tipe kemasakanlebih awal, kadar serat tinggi, kualitas jus rendah, tahan terhadap penyakit mosaik, tetapi peka terhadap penyakit busuk akar merah dan bergaris(Verheye, 2010 ).

(30)

S.barberi, menyerupai rumput liar lokal India Utara sehingga diduga berasal

dari S. Spontaneum dengan bentuk morfologi batangpendek, ketebalan batangtipis sampai medium, kadar serat tinggi dan kadar sukrosa medium. Spesies ini tidak dibudidayakan lagi karena produksinya rendah(Verheye, 2010).

GenotipeSaccharum sppdi Sumatera Utara

Menurut Sinaga dan Susanto (2009), sampai saat ini telah dieksplorasi sebanyak 7 kultivar dan klon tebu yang banyak dibudidayakan oleh masyarakat di Sumatera Utara dan umumnya potensial untuk dikembangkan sebagai tanaman penghasil gula di Sumatera Utara. Ketujuh kultivar dan klon tebu tersebut adalah kultivar tebu kuning, gelagah, tebu berastagi, tebu merah dan tebu gambas, klon tebu PS 41 (tebu rotan) dan BZ 134. Pengamatan tentang toleransinya terhadap penurunan ketersediaan air tanah menunjukkan babwa ketersediaan air tanah 75% sudah cukup untuk menjaga pertumbuhan enam kultivar dan klon tebu (tebu kuning, gelagah, tebu berastagi, tebu gambas, PS 41 dan BZ 134) tanpa kehilangan hasil yang nyata.

Varietas unggul lokal yang dikembangkan pada industri gula di Sumatera Utara didominasi oleh varietas lama F 156 (BZ 134) dan seri PSyang diminati praktisi dan secara lambat laun beralih ke varietas baru(Mulyadi et al, 1997).Melihat tipologi wilayah Sumatera Utara, beberapa varietas bina yang sedang ditanam dan dikembangkan di Sumatera Utara seperti pada Tabel 1.

Tabel 1. Varietas yang sedang ditanam dan dikembangkan di PT.Perkebunan Nusantara II Sumatera Utara

Tipe Kemasakan Varietas yang tersedia di TG 2010/2011

Varietas yang berpotensi untuk dikembangkan

Awal PS 881,PS 862

Awal-Tengah PSBM 901,HCW 2161

Tengah GMP 1, GMP 2

Tengah-Lambat Kidang Kencana PS 864

Lambat BZ 134 -

Dalam Tahap Pengujian VMC 73229,PSCO 902,Kentung, PS 851,PS 861,PS 863,PS

882,PSJT 941, PS 921 (Sumber: PT. Perkebunan Nusantara II-Risbang Tebu, 2010)

(31)

Varietas Tebu Toleran Kekeringan

Menyikapi adanya fenomena iklim yang tidak menentu seperti saat ini sangat diperlukan varietas tebu yang adaptif terhadap perubahan iklim yang cenderung ekstrim. Saat ini, Pusat Penelitian Perkebunan Gula Indonesia (P3GI) Pasuruan, telah menghasilkan varietas yang adaptif terhadap kondisi kekeringanyaitu PS 864, PS 865, PSJT 941, PS 881 dan Kentung. Dari ke lima varietas ini yang dapat di tanam secara luas di berbagai tempat adalah PS 864 dan PS 865 sementara PSJT untuk daerah Jatitujuh, PS 881 dan Kentung untuk daerah Lampung dan sekitarnya.

Varietas PS 864, sebelumnya dikenal dengan seri PS 86-10029, merupakan keturunan dari polycrossPR 1117. Pada lahan bertekstur ringan sampai berat, PS 864 masih cukup baik pertumbuhannya, bahkan pada lahan tegalan dimana kondisi kering panjang terjadi, dijumpai keadaan tanaman tinggal 3-5 daun hijau, masih menunjukkan tingkat kelengasan batang yang cukup tinggi. Potensi produksi tebu cukup tinggi. Tipe kemasakan terdapat kecenderungan pada kelompok tengah lambat. Potensi produksi 888 ± 230 ku/ha, rendemen 9,19 ± 0,64 %, hablur gula 82,5 ± 27,3 ku/ha (tegalan)(P3GI, 2004),

Varietas PSJT 941, sebelumnya dikenal dengan nama seri PSJT 94-33 merupakan keturunan hasil persilangan polycross BP 1854 tahun 1994. Varietas inisejak awal diseleksi pada tipologi lahan kering. Varietas menunjukkan daya keprasan sangat baik dan toleransi kekeringan yang tinggi, sehingga menunjukkan keunggulan yang sangat nyata di lahan tegalan beriklim kering. Tipe kemasakan pada kelompok tengah. Potensi produksi 1084-1270 ku/ha, rendemen 9,39-10,6% dan hablur gula 103-148 ku/ha (plant cane)(P3GI, 2007).

Penanda Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)

Pemuliaan tanaman akan lebih mengarah kepada penggunaan teknik dan metodologi pemuliaan molekuler dengan menggunakan penanda genetik. Studi keragaman genetik menjadi lebih mudah dengan munculnya DNA berbasis penanda

(32)

molekuler yang menunjukkan efisiensi pilihan yang lebih baik untuk perbaikan tanaman(Alvarado, 2012).

Teknologi penanda molekuler pada tanaman berkembang sejalan dengan semakin banyaknya pilihan penanda DNA yaitu: 1) penanda yang berdasarkan pada hibridisasi DNA seperti Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP), 2) berdasarkan pada reaksi rantai polimerase yaitu Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan sekuen nukleotida sebagai primer, seperti Randomly Amplified

Polymorphic DNA (RAPD) dan Amplified Fragment LengthPolymorphism (AFLP),

3) berdasarkan pada PCR dengan menggunakan primer yang menggabungkan sekuen komplementer spesifik dalam DNA target, seperti Sequence Tagged Sites (STS),

Sequence Characterized AmplifiedRegions (SCARs), Simple SequenceRepeats

(SSRs) atau mikrosatelit, dan Single Nucleotide Polymorphisms (SNP). Pemilihan penanda yang akan digunakan perlu mempertimbangkan tujuan yang diinginkan, sumber dana, fasilitas yang tersedia, serta kelebihan dan kekurangan masing-masing tipe penanda(Azrai, 2006).

Keuntungan penggunaan penanda RAPD

Kegunaan penandaRAPDadalah untukstudikeragaman genetikdan pengembanganlanjutan genotipemelaluipengembangan penanda terkait dengan karakter yang diinginkan seperti Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)(Ryan, 2003), penelitian kemiripan genetikkarena sederhana dan merupakan tekniktercepat berbasisDNA (Zhang et al., 2008), memungkinkankarakterisasigenom pada beberapa kelompoktanaman, mempelajaripolimorfisme, mengidentifikasigen yang menarikdan karakterisasi sumber daya genetik dan dalamekologimolekulerdibunakan untuk menentukanidentitastaksonomi, deteksi interspesifik aliran gen, menilaihubungankekerabatan, menganalisa sampelgenomcampuran, dan produksipenyelidikanspesifik(Sera et al., 2003).

RAPDtelah digunakan secara luaskarenakeuntungannya yaitu a) tidak memerlukanprobeDNAdan urutaninformasiuntuk desainprimertertentu, b) tidak

(33)

memerlukan langkahblottingatauhibridisasisehingga regenerasi lebih cepat, c)prosedurnyasederhana, efisien dan mudah dalam preparasi, d) membutuhkanhanya sejumlah kecilDNA(sekitar 10 ngperreaksi), e) jumlahfragmen yang dihasilkan tinggi, f)menggunakan primerarbitraryacak yang dapat dibeli dan mudah ditemukan, g)unit biaya perpengujianrendahdibandingkan denganteknologipenandalainnya, h) kesesuaian untukgenom yang tidak diketahui (dapat digunakan untuk analisis genom semua jenis organisme) dan, h)tidak menggunakan radioisotop(Hadrys et al., 1992; Kumar dan Gurusubramanian, 2011;Sudarmi, 2013).

Prinsip analisa DNA dengan RAPD

Teknologi RAPD standar menggunakan oligonukleotida sintetik pendek (basa 10-mer) urutan acak sebagai primer untuk amplifikasi sejumlah nanogram total DNA genom pada suhu annealingrendah melalui PCR. Ketika menggunakan primerdengan urutan 10 pasangan basa, beberapa fragmen yangteramplifikasi (pada lokus yang berbeda) biasanya hadir pada setiap set primerdalam setiap genom.Prinsipnya adalahprimer oligonukleotidapendek tunggal mengikat pada lokus berbeda yang digunakan untuk mengamplifikasi urutanacaktemplateDNAkompleks. Dalam hal ini berartifragmenamplifikasi yang dihasilkanmelalui PCRtergantung pada panjang, ukuranprimerdantargetgenom. Fragmenyang teramplifikasi(hingga 3,0kb), biasanyadipisahkan padagelagarosa(1,5-2,0%) lalu divisualisasikan dengan pewarnaetidium bromidadanpolimorfisme berfungsi sebagai penanda genetik dominan, yang diwariskan secara Mendel. Karena primer terdiri dari urutan acak dan tidak membedakan antara area coding dan noncoding, maka masuk akal jika menggunakan teknik ini untuk sampel genomyang sangat acak dibanding metode konvensional(Hadrys et al., 1992;Lynch dan Milligan, 1994; Bardakci, 2001).

Pada suhu annealing yang tepat selama siklus termal, primeroligonukleotida urutan acak mengikat beberapa tapak primingdalam urutan komplementer pada DNA genomiktemplate dan menghasilkan produk DNA diskrit jika tapak primingberada

(34)

pada jarak yang amplifikatif satu sama lain. Profil DNA hasil amplifikasi tergantung pada urutan homolog nukleotida antara DNA template dan primer. Variasi nukleotida antara pasangan yang berbeda pada DNA template akan menghasilkan ada atau tidaknya pita karena perubahan pada tapak priming.Salah satu penyebab polimorfisme RAPD adalah penyusunan ulang kromosom seperti penyisipan/penghapusan. Oleh karena itu, produk amplifikasi dari alel sama yang heterozigot dengan panjang yang berbeda akan terdeteksi sebagai ada dan tidaknya pita pada profil RAPD (Bardakci, 2001).

AsumsipenggunaanteknikRAPDadalah amplifikasi fragmenyang unik, dimanasecara prosedurtidak mengamplifikasiduafragmen berbedayangsaling bermigrasi padagelkarenaukuran yang sama. Dalam hal saling migrasi (apakah ukuran pita sesuai dengan fragmen DNA homolog yang sama), gel elektroforesis dapat memisahkan DNA secara kuantitatif, tetapi tidak dapat memisahkan fragmen yang sama besar secara kualitatif (sesuai dengan urutan basa). Saling migrasi pada teknikRAPDmudah dideteksi denganelusiindividuprodukPCRpadagel danpenyelidikan ulangprodukmelaluianalisisSouthern atau dengan menggunakangelpoliakrilamidauntukmeningkatkan resolusipemisahanpita (Hadrys et al., 1992; Kumar danGurusubramanian, 2011).

Penggunaan Penanda RAPD Pada Saccharum spp

Penanda RAPD pada tanaman tebu banyak digunakan untuk mempelajari keragaman genetik untuk melihat hubungan kekerabatan dengan menganalisa jarak genetik antar genotipe sebagai langkah awal untuk inventarisasi. Nilai jarak genetik rendah merupakan indikasi bahwa sebagian besar genom aksesi yang dipelajari identik.Pan et al., (2004), melakukan estimasi keragaman genetik diantara 33 koleksi

S. spontaneumL dengan menggunakan 17 primer(KO2T, OPAl0,

OPA11,OPA17,OPAD01,OPAD13,OPAH09,OPAX20,OPBB02,OPBB18,OPB04,O PBE 07,OPBE09,OPC-04, OPN19, OPY17 dan 262) dan menghasilkan 157 pita.

(35)

Ullah et al., (2013), menganalisis keragaman genetik 5 varietas tebu giling dengan menggunakan 20 primer dan hanya 8 primer (OPA02,OPA08, OPA12,OPB05,OPB18,OPC02,OPC04 dan OPE04) menghasilkan jumlah pita dengan intensitas tinggi yang relatif maksimum, smear minimal dan ukuran pitaberkisar 190-1200bp. Pitayang diperoleh menunjukkan73,5% polimorfisme; Ahmed dan Khaled (2008), mendeteksi kemiripan genetik beberapa genotipe tebu menggunakan 24 primer dan menghasilkan total 44 fragmen yang diamplifikasi tetapi 7 primer yang mampu mengamplifikasi fragmen (OPA01,OPA04,OPA07,OPB07,OPB10,OPO10, OPO14); Kawar et al (2009), menyeleksi 17 kultivar tebu menggunakan 40 primeryang menghasilkan 325 pita dan

134 polimorphik. Primeryang memproduksipita spesifikadalahOPA04,OPA17,OPA19,

OPAB08,OPAB17,OPC03,OPC06,OPC08,OPC14,OPC15,OPC16,OPC17,OPC18,O PG04,OPG05,OPG12,OPG17,OPK20 dan OPK19; Chaiyabut et al., (2014), menganalisa hubungan genetik 56 kultivar tebu di Thailand denganmenskrining96

primerdan hanya

9primer(OPB17,OPC02,OPC18,OPC19,OPD08,OPD02,OPD08,OPH05,

OPU03,OPZ04) yang mampu menunjukkanfragmen yang menghasilkan pita yang mudahdianalisadan menunjukkanpolimorfismeyang berbeda diantara kultivar.Tabasum et al (2011) menganalisa jarak genetik 40 genotip tebu dengan menggunakan 30 primer RAPD. Dari 30 primer yang digunakan terbentuk 2 kelompok besar genotipe tebu. Rataan persentase polimorphisme dari 30 primer yang digunakan adalah 92,05%.

Penanda RAPD juga digunakan untuk identifikasi hibrida dan perbaikankultivar, sehingga cocokdigunakan dalamtahap awalbenih-bibit. Zhanget al (2008), mengidentifikasi hibrida interspesifik tebu dengan menggunakan 91

(36)

primeruntuk skrining dan hanya 5 primer(OPA19,OPC19,OPE02,OPF04 dan

OPN11) menghasilkan perbedaan yang jelas dan memproduksi pita yang dapat digunakan dalam identifikasi bahan hibrid.

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu

Sampel bahan tanaman diambil dari daerah Kota Medan,Kabupaten Langkat, Deli Serdang dan Karo, Provinsi Sumatera Utara. Sampel varietas toleran kekeringan diambil dari kebun koleksi PT. Perkebunan Nusantara IIyaitu kebun koleksi Risbang Tebu Sunggal dan Tanjung Jati. Selanjutnya isolasi DNAdilaksanakan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. Kegiatan penelitian dilaksanakan bulan April- Oktober 2014.

Bahan dan Alat Bahan tanaman

Bahan tanamanmerupakan aksesi tebu yang diambil dari beberapa lokasi di Sumatera Utara. Profil 30 aksesi tebu terdapat pada Lampiran 6.

Tabel 2. Bahan tanamandan lokasi pengambilan sampel

Kode Aksesi Lokasi

(Desa,Kec) Kabupaten Lintang Bujur Ketinggian

1 PS 864 Tanjung Jati

9 KidangKencana Tanjung Jati

(37)

Perak Hamparan Perak Serdang 14 BZ 134 Sunggal Sei Mencirim

Sunggal

Deli Serdang

03°35’27.5” 98°33’55.4” 42

15 BZ 134 TanjungJati Tanjung Jati Binjai

Langkat 03°37’29.5” 98°27’06.5 43

16 GambasHamparan

Perak

Klumpang Kebun

Hamparan Perak Deli Serdang

03°40’16.8” 98°35’49.9” 20

(38)

Tabel 2. Lanjutan……

17 GambasSunggal Paya Geli

Sunggal

Deli Serdang

03°34’46.2” 98°35’33.9” 26

18 GambasStabat Karang Rejo

Stabat

Langkat 03°42’30.7” 98°30’20.3” 43

19 KuningHamparan Perak

20 KuningSunggal Medan Krio

Sunggal

Deli Serdang

03°34’17.5” 98°35’00.6” 29

21 KuningTanjungJati Tanjung Jati Binjai

Langkat 03°37’02.5” 98°27’42.1” 47

22 GelagahMedan

Helvetia

Sei Sekambing Medan Helvetia

Medan 03°35’58.7” 98°37’41.3” 56

23 GelagahSunggal Sei Sengko

Sunggal

Deli Serdang

03°33’39.8” 98°34’02.6” 41

24 GelagahTanjungJati Tanjung Jati Binjai

Langkat 03°37’43.2” 98°27’42.8” 39

25 MerahKabanjahe Simpang Korpri Berastagi

Karo 03°09’57.2” 98°30’36.6” 1368

26 MerahHamparan

Perak

27 MerahStabat Karang Rejo

Stabat

Langkat 03°42’49.8” 98°30’14.6” 26

28 BerastagiSibolangit Sibolangit Sibolangit

Deli Serdang

03°16’57.6” 98°33’21.2” 812

29 BerastagiBerastagi Peceran Berastagi

Karo 03°12’10.0” 98°31’23.7” 1435

30 BerastagiKabanjahe Ketaren Kabanjahe

Karo 03°07’02.5” 98°30’22.6” 1206

Bahan kimia

Bahan yang digunakan adalah nitrogen cair,polyvinylpolypyrrolidone (PVPP), β-mercaptoethanol, cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) (Amresco), NaCl, Tris, HCl (p.a), Asetat Glacial, kloroform, isoamilalkohol, Isopropanol,

NaOH, Na-EDTA, ethanol 70 dan 100%,alkohol70%, agarose(Promega), ethidium

bromida, loading dye (Promega), aquades, ddH2O (Aqua bidestilata), buffer CTAB,

buffer TE, buffer TAE 1X dan 50X, primeroligonukloetida(Oligo Macrogen),Go Tag

GreenMaster Mix(Promega) dan DNA ladder1 kbp(Amresco).

Alat

Alat yang digunakan adalah Geographic Positioning System (GPS) (Garmin GPS map 76CSx), gunting, plastik polyethylene, kertas cokelat, neraca analitik (Sartorius BP 160 P), mortar, pestle, pinset, sarung tangan, hot plate(Biosan MSH-300), magnetic stirer, centrifuge (Biofuge Heraeus Pico), water bath/heating block (Biosan Ultraherm BWT-U), tabung eppendorf(Biologix) (2,0 ml, 1,5 ml, 0,2 ml),

erlenmeyer (Pyrex), beaker glass(Pyrex), gelas ukur (Pyrex), pipet (Pyrex),

(39)

vortex(Biosan V-1 Plus), shaker, mikropipet(Rainin)(1-10 μl, 2-200 μl, 100-1000 μl), tips pipet (Biologix) (1 ml, 200 µ l,10 µ l),autoklaf(Tomy High-Pressure Steam

Sterilizer ES-315), oven, pH meter (Hanna Instruments 8417),elektroforesis apparatus (SCIE-PLUS), PCR (Applied Biosystem Verity 96 Well Thermal Cycler),

gel dokumentasi (Uvitec Cambridge), lemari es (Sharp), UPS (ICA), kamera dan alat-alat tulis.

Pelaksanaan Penelitian Pengambilan sample daun

Penelitian ini menggunakan metode surveyuntuk mengoleksi sampel dari lokasi pertanaman. Tanaman tebu yang akan digunakan sebagai sampel ditentukan lokasi titik koordinat dengan GPS. Sampel bahan tanam adalah segmen daun muda yang masih segar dari tanaman yang berumur 3-8 bulan (Hossain et al, 2006; Khan et al, 2009), yang diambildari beberapa lokasi pertanaman tebu petani/masyarakatdan

PT. P.Nusantara II yang berada di Kabupaten Deli Serdang dan Langkat (varietas komersil). Sampel klon BZ134 diambil dari tiga lokasi (Kec. Hamparan Perak dan Sunggal Kab. Deli Serdang, Kec. Binjai Kab. Langkat) sebab klon ini yang paling lama dan paling banyak dibudidayakan petani/perkebunan besar. Sampel kultivar tebu lokal, diambil dari Kota Medan, Kab. Deli Serdang, Langkat dan Karo. Sedangkan sampel bahan tanam varietastoleran kekeringan diperolehdari Kebun Koleksi PT. P. Nusantara II. Peta sebaran titik lokasi pengambilan sampel seperti pada Lampiran 5.

Daun tebu yang diambil dari lapangan, dibungkus dengan kertas dan dimasukkan ke dalam kemasan plastik polyethylene (polyethylene bag), selanjutnya dimasukkan ke dalam lemari es untuk menjaga agar daun tetap segar sampai dilakukan proses isolasi DNA.

Isolasi dan pemurnian DNA

DNA diekstraksi menggunakan protokol ekstraksi yang dimodifikasi(Doyle dan Doyle, 1990; Orozco-Castillo et al.,1995). Sampel daun segar dicuci dengan air

(40)

mengalir dan dikeringanginkan, kemudian disterilisasi dengan alkohol 70% . Tulang daun dibuang lalu daun dipotong-potong menggunakan guntingsteril. Kemudian potongan daun ditimbang kira-kira 0,2-0,3g (Hossain et al, 2006), dimasukkan kedalam mortar dan ditambah nitrogen cair. Selanjutnyasampel digerus halus sampai berbentuk bubuk dengan menambahkan 0,1 gr PVPPsebagai antioksidan. Bubuk halus kemudian dimasukkan ke dalam tabung eppendorf2 ml laluditambahkan 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 10µ l β-mercaptoethanol(Toruan-Mathius et al, 1996).Campuran tersebut dikocok dengan vorteks lalu diberi tanda sesuai aksesi,kemudian diinkubasi dalam water bath selama30 menit pada suhu 65oC (setiap 10 menit tabung dikocok perlahan secara reguler). Setelah dibiarkandingin hingga suhu kamar, kemudianke dalam campuran ditambah 1 mlkloroformisoamilalkohol(KIAA) (24:1), lalu divorteks kembali sampai homogen. Campuran tersebutselanjutnya disentrifugasi selama 10 menit dengankecepatan 13.000 rpm.Lapisanatas dipipet ke dalamtabung effendorf 2,0 ml lain lalu ditambah 1 ml KIAA kemudian divorteks kembali sampai larutan membentuk kristal. Selanjutnya disentrifugasi 5 menitdengan kecepatan 13.000 rpm. Supernatan yang terbentuk dipindah ke tabung effendorf 1,5 ml dan ditambah isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan dan diperhatikan ada benang halus. Bila benang-benang halus sudah tampak jelas, lalu diinkubasi pada suhu 40C selama 30 menit. Setelah masa inkubasi berakhir larutan disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Selanjutnya cairan isopropanol dibuang dan benang-benang halus (endapan DNA) dalam tabung dikeringanginkan, kemudian ditambahkan 100 µ l buffer TE dan dispin manual agar terbentuk suspensi homogen antara pelet dengan buffer. Selanjutnya ditambah 1 ml ethanol 100% di bolak balik secara reguler

kemudian diinkubasi pada suhu 40C selama 30 menit. Setelah masa inkubasi selesai, selanjutnya tabung disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.

(41)

Selanjutnya lapisan atas dibuang, hingga tinggal pelet lalu tabung dikeringanginkan. Setelah kering angin pelet dibilas dengan menambahkan ethanol 70% sebanyak 500 µ l dibolak balik secara perlahan, kemudian ethanol dibuang lalu dikeringanginkan. Jika pelet telah kering angin kemudian ditambah 100 µ l buffer TE lalu dispin manual hingga homogen sehingga terbentuk stok DNA. Stok DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis PCR atau disimpan pada suhu -200C bila tidak digunakan. Deskripsi pembuatan bahan yang digunakan untuk isolasi dan pemurnian DNA seperti pada Lampiran 1.

Uji kualitas DNA

Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8% (b/v). Agarose ditimbang, beratnya dikonversi sesuai dengan volume elekroforesis apparatus, kemudian dilarutkan ke dalambuffer TAE 1x (sesuai volume elekroforesis apparatus). Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan diberi tanda,

kemudian dipanaskan dan diaduk dengan magnetic stirer hingga larutan menjadi bening dan dibiarkan mendidih selama 35 menit. Jika setelah pemanasan volume dalam tabung berkurang ditambahkan aquades sampai batas tanda dan kemudian dipanaskan kembali sampai mendidih lalu didinginkan dan ditambah larutan etidium bromidesebanyak 0,5 µ l. Selanjutnya dipanaskan kembali lalu didinginkan dengan

cara mengalirkan air mengalir pada tabung.Setelah larutan agak dingin (suhu ±600C), larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ±40 menit. Jika gel telah memadat sisir pembuat lubang dilepas kemudian gel dimasukkan ke dalam elektroforesis apparatusdan diberi larutan TAE 1x ±670 ml hingga batas tanda (terendam). DNA sample yang telah diisolasi dan dimurnikan dimasukkan ke dalam sumur gel. Sebelum stok DNA dimasukkan ke dalam sumur gel, terlebih dahulu diberi loading buffer (pewarnaan) sebanyak 1 µ l ditambah 5 µ l stok DNA, kemudian dicampur rata dengan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam sumur gel. Runningelektroforesis dilakukan pada kondisi

(42)

70 volt selama 60 menit. Selanjutnya gel tersebut dimasukkan kedalam gel dokumentasi. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV transluminator.Deskripsi pembuatan bahan yang digunakan untuk uji kualitas DNA

seperti pada Lampiran 1. Seleksi primer

Primeryang digunakan adalahurutan acak yang digunakan untuk

menghasilkan produk amplifikasi dan mempunyai tingkat polimorfisme yang tinggi untuk mendapatkan penanda pita, baik dari jelasnya pita yang dihasilkan maupun jumlah lokus yang diperoleh. Terlebih dahulu dilakukan seleksi pada10 primer (OPA 17, OPA 19, OPB 10, OPB 18, OPC 04, OPC 17, OPC 18, OPC 19, OPD 08, dan OPH 05) yang telah terbukti menunjukkan polimorphisme pada tebu. (Pan et al., 2004; Zhanget al, 2008;Kawar et al, 2009; Ullah et al., 2013; Chaiyabut et al., 2014)dengan cara membuat beberapa reaksi PCR terhadap beberapa primer yang berbeda pada kondisi yang sama dan menggunakan sampel DNA yang sama, sehingga dapat diketahui kondisi optimum serta tingkat variasi pita yang dihasilkan setiap primer. Dari 10primeryang diseleksi ada 3 primeryang tidak reproduktif dalam mengamplifikasi dan menghasilkan tingkat polimorphisme pita DNA sehingga diseleksi 4primer lain (OPA 04, OPD 03, OPD 14 dan OPN 03). Dari 4 primer ini hanya 3 primer (OPA 04, OPD 03 dan OPN 03) yang mampu mengamplifikasi DNA dan terbukti menunjukkan polimorphisme pada penanda pita DNA.

Tabel 3. Daftar primer RAPD yang digunakan untuk genotyping 30 aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara

Primer Sekuen (5’-3’) %

GC Primer Sekuen (5’-3’)

% GC OPA 04 AATCGGGCTG 60 OPC 19 GTTGCCAGCC 70 OPB 10 CTGCTGGGAC 70 OPD 03 GTCGCCGTCA 70 OPB 18 CCACAG CAGT 60 OPD 08 GTGTGCCCCA 70 OPC 04 CCGCATCTAC 60 OPH 05 AGTCGTCCCC 70 OPC 18 TGAGTGGGTG 60 OPN 03 GGTACTCCCC 70

(43)

Amplifikasi PCR

Amplifikasi PCR mengikuti prosedur William et al., (1990), dilakukan dengan menggunakan 10primeryang mampu menunjukkan polimorphisme pada tebu.Reaksi amplifikasi dibuat dalam larutan dengan volume 25 µ l yang terdiri dari ddH2O 9,5 µl, Go Green Tag 12,5 µl, primer 1 µl dan stok DNA sebanyak 2

µ l.Persiapan amplifikasi dengan melakukan preparasi master mix untuk running PCR. Larutan master mix(sampel yang digunakan 30) terdiri dari ddH2O 9,5 µl x 31=

294,5 µl, Go Green Tag 12,5 µl x 31 = 387,5 µ l, primer 1 µ l x 31 = 31 µ l. Dari tube diambil 23 µ l ke dalam tube lain sehingga diperoleh 30tube untuk PCR lalu ditambah DNA sebanyak 2 µ l. Selanjutnya tabung dispin manual, kemudian tabung berisi stok DNA dan campuran master mix dimasukkan ke dalam blok sampel pada mesin PCR. Untuk reaksi amplifikasi PCR didesain waktu, suhu dan siklus termal. Reaksi diaturpadathermal cycler yang diikuti programdenaturasi awal pada 940C selama 2 menit, 45 siklus dijalankan untuk denaturasi pada 940C selama 1 menit, annealingprimer pada 360C, 1 menit dan elongasi atau extension pada 720C, 2 menit.Setelahsiklus terakhir, tahapan akhir pada 72ºC, 10menitditambahkanuntuk memungkinkanperpanjanganlengkap semua amplifikasi fragmen. Setelah programsiklus lengkap, reaksidisimpan pada 4ºC(Setiyo, 2001).

Elektroforesis

Produk hasil PCRdikonfirmasi dengan elektroforesis pada gel agarosedalam

buffer TAE 1x dengan marka DNA (DNA ladder) 1 kbp. Sebelum dilakukan

elektroforesis disiapkan gelagarose konsentrasi 1,2% (b/v). Agarose ditimbang 1,56 g kemudian dilarutkan dengan menambahkan 130 ml buffer TAE 1x. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu dipanaskan dan diaduk dengan magnetic stirer hingga larutan menjadi bening. Selanjutnya larutan didinginkan lalu

ditambah larutan pewarna etidium bromide1,5 µ l, dipanaskan kembali dan kemudian

(44)

didinginkan lagi. Setelah larutan agak dingin (600C) lalu dimasukkan ke dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang (well-forming comb) dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit atau sampai gel mengeras. Kemudian well-forming comb dilepas secara perlahan. Selanjutnya elektroforesis tray yang berisi gel

agarose diletakkan ke dalam tankelektroforesis dan larutan buffer TAE 1x dituang ke dalam tank tersebut ±670 ml (terendam) hingga 1 mm diatas permukaan gel atau batas yang telah ditentukan. Selanjutnya sebanyak 5 µ l DNA ladder (marker) dicampur dengan loading dye 2 µ l pada sumur gelpertama, lalu masing-masing 8 µ l sampelproduk hasilPCR dimasukkan ke dalam sumur gel ke dua dan seterusnya.Setelah semua sample dimasukkan ke dalam well gel, tank elektroforesis ditutup dan dihubungkan dengan arus listrik. Proses runningelektroforesis dilakukan pada kondisi 80 volt selama 100 menit. Setelah runningelektroforesis selesai, DNA yang telah dielektroforesis divisualisasi dengan cara meletakkan gel pada UV transaluminatorlalu di dokumentasikan.Deskripsi pembuatan bahan yang digunakan

untuk proses elektroforesis seperti pada Lampiran 1.

Analisis DataRAPD Penentuan skoring

Setelahelektroforesis, semua pitaatau fragmenyang berbedaditentukan ukuran pita DNAnya dengan menggunakan program Uvitec. Dari hasil rekapitulasi ukuran pita DNA kemudian diberinomor identifikasiatas dasarada(1) atau tidak ada (0), secara terpisahuntuk setiap individudan setiapprimer. Skoryang diperoleh dengan menggunakansemuaprimerdalam analisisRAPDkemudiandikombinasikan untuk menciptakanmatriks datatunggal.Skoring produk PCR-RAPD ini berdasarkan

muncul tidaknya pita DNA digunakan untuk menentukan keragaman genetik.

Penentuan tingkat keinformatifan primer

(45)

Tingkat keinformatifan primer (Plolymorphic Information Content=PIC)merupakan parameter untuk menghitung efisiensi marka dan

karakteristik genetik. PIC dihitung menggunakan rumus Ramirez et al, (2014): PIC=2fi (1-fi)(1)

dimana fi: frekwensi alel teramplifikasi (1)dan 1-fi: frekwensi alel nol.

Penentuan ukuran pasangan basa

Matriks ketidaksamaan (dissimilarity) tiap kombinasi pasangan dihitung berdasarkan Dissimilarity Index Simple Matching Dice Coefficient denganbootstrap 1000 sesuai rumus:

dij = 1- 1∑�=1��(2)

L

dimanadij: ketidaksamaan antara i dan j, L: jumlah lokus, π: tingkat ploidi dan ml:

jumlah alel yang umum diantara i dan j untuk lokus 1.

Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat dilakukan dengan 2 tipe analisis deskriptif dari keragaman:1) Principal Coordinates Analysis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel

ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan 2) Neigbour-Joining Tree (NJ Tree) untuk memperoleh gambaran dari kekerabatan diantara individu-individu. Data dan analisis deskriptif menggunakan software Darwin5.05 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2009). Analisis data dilakukan secara deskriptif dan dendogram. Skema hubungan kekerabatan secara genetik diperhitungkan berdasarkan pada indeks similaritas (jarak genetik terdekat).

HASIL DAN PEMBAHASAN

(46)

Hasil

Kualitas DNA

DNA hasil isolasi 30 aksesi tebu Sumatera Utara di uji melaluiproses

elektroforesis menggunakan gel agarose dan selanjutnya di visualisasi dengan

menggunakan UV transaluminator. Hasil uji kualitas DNA 30 aksesi tebu Sumatera Utara seperti pada Gambar 6.

Gambar 6. Profil uji kualitas DNA 30 aksesi Saccharum spp.dari beberapa lokasi di Sumatera Utara (Lajur 1-30 seperti pada Tabel 2).

Hasil pengamatan kualitas DNA pada Gambar 6 menunjukkan adanya DNA pada setiap aksesi yang memenuhi syarat untuk dianalisis lebih lanjut dengan menggunakan mesin PCR. Pola pita yang didapat tampak jelas dan tebal, meskipun tingkat ketebalannya bervariasi pada setiap aksesi.

Amplifikasi PCR dan elektroforesis

Fingerprinting DNA 30 aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara dilakukan

dengan menggunakan 14 primer RAPD (Tabel 3).Sepuluh dari 14 primer yang digunakan dapat mengamplifikasi DNA dengan baik danmemproduksi jumlah pita relatif maksimal dengan intensitas tinggi dan smear yang minimal pada semua sampel. Hasil amplifikasi dari 4 primer (OPA 17, OPA 19, OPC 17 dan OPD 14) tidak konsisten dalam mengamplifikasi sampel. Primer OPA 17 menghasilkan produk amplifikasi hanya pada 10 sampel DNA dan OPA 19 mengamplifikasi pada 2sampel sedangkan primer OPC 17 dan OPD 14 tidak menghasilkan produk

(47)

amplifikasi. Ke empat primer ini tidak diikutkan dalam analisis data lebih lanjut untuk mencegah kesalahan penentuan polimorfisme.

Tabel 4. DaftarprimerRAPDdenganjumlahpitaperaksesi, jumlahpita monomorfikda npolimorfik, persentase polimorfisme, rentang ukuran pitaDNA dan tingkat keinformatifan masing-masing primer pada 30 genotipeSaccharum spp. Sumatera Utara

Primer JP PM PP PP (%) UA (bp) PIC OPA 04 9 0 9 100,00 417-1887 0,475 OPB 10 6 0 6 100,00 388-1950 0,495

OPB 18 8 1 7 87,50 196-1924 0,432

OPC 04 6 0 6 100,00 661-1973 0,408 OPC 18 9 0 9 100,00 419-1687 0,365 OPC 19 7 0 7 100,00 539-1547 0,487 OPD 03 9 0 9 100,00 542-1833 0,499 OPD 08 6 0 6 100,00 384-1118 0,452 OPH 05 6 0 6 100,00 346-1662 0,448 OPN 03 5 0 5 100,00 563-1215 0,370

Total 71 1 70 987,50 4,431

Rataan 7,1 0,10 7,0 98,75 0,443

Keterangan: JP: Jumlah polapita DNA, PM: Jumlah pita monomorfik, PP: Jumlah pita polimorfik, PP (%): Persentase polimorfisme, UA: Ukuranamplikon DNA, PIC: Polymorphic Information Content

Ukuran DNA hasil amplifikasi diestimasi melalui perbandingan migrasi setiap fragmen yang diamplifikasi dengan ukuran fragmen marker (DNA ladder 1 kb). Dari 10 primer yang produktif, total jumlah pita PCR RAPD yang dihasilkan sebanyak 71pola pita (lokus) dengan rataan jumlah pita per primer sebanyak 7,1 pita. Jumlah pita terbanyak (9) diamplifikasi oleh primer OPA 04, OPC 18 dan OPD 03 dan terendah (5) diamplifikasi oleh primer OPN 03. Total jumlah pita PCR RAPD polimorfik sebanyak 70 pita dengan rataan persentase polimorfisme sebesar 98,75%. Pita DNA dengan persentase polimorfik tertinggi (100%) dihasilkan oleh 9 primer (OPA 04, OPB 10, OPC 04, OPC 18, OPC 19, OPD 03, OPD 08, OPH 05 dan OPN 03) dan terendah (87,50%) dihasilkan oleh primer OPB 18. Rentang ukuran amplikon pita DNA dari 10 primer yang reproduktif berkisar 196-1973 bp (base

Gambar

Gambar 1. Bagan alir penelitian identifikasi kemiripan genetik beberapa genotipe  tebu (Saccharum spp.) Sumatera Utara dengan varietas PS 864 dan PSJT 941 toleran kekeringan menggunakanRAPD
Gambar 1 Bagan alir penelitian identifikasi kemiripan genetik beberapa genotipe tebu Saccharum spp Sumatera Utara dengan varietas PS 864 dan PSJT 941 toleran kekeringan menggunakanRAPD . View in document p.22
Gambar 2.Bagian batang(daun diklentek) (Miller  et al., 2012).
Gambar 2 Bagian batang daun diklentek Miller et al 2012 . View in document p.26
Gambar 3.Bagiandaun(dilepasdari batang)(Miller  et al., 2012).
Gambar 3 Bagiandaun dilepasdari batang Miller et al 2012 . View in document p.27
Gambar 4.Perangkat dan tunas akar(Miller  et al., 2012) Universitas Sumatera Utara
Gambar 4 Perangkat dan tunas akar Miller et al 2012 Universitas Sumatera Utara. View in document p.27
Gambar 5. Diagram propagul  Saccharum spp.:a. propagul lengkap,koma cupulate, pedikel kosong dan rachilla ditambah spikelet sessile,b
Gambar 5 Diagram propagul Saccharum spp a propagul lengkap koma cupulate pedikel kosong dan rachilla ditambah spikelet sessile b. View in document p.28
Tabel 1. Varietas yang sedang ditanam dan dikembangkan di PT.Perkebunan Nusantara II Sumatera Utara
Tabel 1 Varietas yang sedang ditanam dan dikembangkan di PT Perkebunan Nusantara II Sumatera Utara . View in document p.30
Tabel 2. Bahan tanamandan lokasi pengambilan sampel
Tabel 2 Bahan tanamandan lokasi pengambilan sampel . View in document p.36
Tabel 2. Lanjutan……
Tabel 2 Lanjutan . View in document p.38
Tabel 3. Daftar primer RAPD yang digunakan untuk genotyping 30 aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara
Tabel 3 Daftar primer RAPD yang digunakan untuk genotyping 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara . View in document p.42
Gambar 6. Profil uji kualitas DNA 30 aksesi Saccharum spp.dari beberapa lokasi di Sumatera Utara (Lajur 1-30 seperti pada Tabel 2)
Gambar 6 Profil uji kualitas DNA 30 aksesi Saccharum spp dari beberapa lokasi di Sumatera Utara Lajur 1 30 seperti pada Tabel 2 . View in document p.46
Tabel 4.
Tabel 4 . View in document p.47
Gambar 7. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp. Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPB 10, lajur M:marker ladderAmresco 1 kb, lajur 1-30 seperti pada Tabel 2
Gambar 7 Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPB 10 lajur M marker ladderAmresco 1 kb lajur 1 30 seperti pada Tabel 2. View in document p.48
Gambar 9. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp.Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPC 04, lajur M:marker ladderAmresco 1 kb,lajur 1-30 seperti pada Tabel 2
Gambar 9 Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPC 04 lajur M marker ladderAmresco 1 kb lajur 1 30 seperti pada Tabel 2. View in document p.49
Gambar 8. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp.Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPB 18, lajur M:marker ladderAmresco 1 kb, lajur 1-30 seperti pada Tabel 2
Gambar 8 Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPB 18 lajur M marker ladderAmresco 1 kb lajur 1 30 seperti pada Tabel 2. View in document p.49
Gambar 11. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp.Sumatera Utara yang
Gambar 11 Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang . View in document p.50
Gambar 10. Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp.Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPC 19, lajur M:marker ladderAmresco 1 kb, lajur 1-30 seperti pada Tabel 2
Gambar 10 Pola pita RAPD 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara yang diamplifikasi dengan primer OPC 19 lajur M marker ladderAmresco 1 kb lajur 1 30 seperti pada Tabel 2. View in document p.50
Tabel 5. Identifikasi aksesi dengan penanda genotipe spesifik
Tabel 5 Identifikasi aksesi dengan penanda genotipe spesifik . View in document p.51
Tabel 6. Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk kombinasi pasangan 30 aksesi Saccharum spp.Sumatera Utara
Tabel 6 Matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk kombinasi pasangan 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara . View in document p.52
Gambar 12. Dendogram 30 aksesi  Saccharum spp.Sumatera Utara berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching
Gambar 12 Dendogram 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching . View in document p.53
Gambar 13.Profil radial Neighbour-Joining Tree 30 aksesi Saccharum spp.Sumatera Utara berdasarkan analisis Matrix Dissimilarity Simple Matching
Gambar 13 Profil radial Neighbour Joining Tree 30 aksesi Saccharum spp Sumatera Utara berdasarkan analisis Matrix Dissimilarity Simple Matching . View in document p.54
Gambar 14. Perbandingan pola pita dan jumlah fragmen DNA pada varietas PS 864 dan PSJT 941  dengan menggunakan 10 primer RAPD
Gambar 14 Perbandingan pola pita dan jumlah fragmen DNA pada varietas PS 864 dan PSJT 941 dengan menggunakan 10 primer RAPD. View in document p.55
Gambar 15. Perbandingan pola pita dan jumlah fragmen DNA pada varietas BZ 134  dengan menggunakan 10 primer RAPD
Gambar 15 Perbandingan pola pita dan jumlah fragmen DNA pada varietas BZ 134 dengan menggunakan 10 primer RAPD. View in document p.56
Tabel 7. Kemiripan pita DNA varietas PS 864 dengan aksesi yang berada pada cabang yang sama dalam sub kelompok
Tabel 7 Kemiripan pita DNA varietas PS 864 dengan aksesi yang berada pada cabang yang sama dalam sub kelompok . View in document p.56
Tabel 7. Lanjutan……
Tabel 7 Lanjutan . View in document p.57
Tabel 8. Kemiripan pita DNA varietas PSJT 941 dengan aksesi yang berada padacabang yang sama dalam sub kelompok
Tabel 8 Kemiripan pita DNA varietas PSJT 941 dengan aksesi yang berada padacabang yang sama dalam sub kelompok . View in document p.57
Tabel 8. Lanjutan……
Tabel 8 Lanjutan . View in document p.58
Gambar 16. Hubungan genetik 30 aksesi Saccharum spp.berdasarkan analisis faktorial, aksis 1 (horizontal), aksis 2 (vertikal)
Gambar 16 Hubungan genetik 30 aksesi Saccharum spp berdasarkan analisis faktorial aksis 1 horizontal aksis 2 vertikal . View in document p.59

Referensi

Memperbarui...

Download now (124 pages)
Related subjects : buah gambas