Synbiotic Application for Pacific White Shrimp Litopenaeus vannamei Resistance to Infectious Myonecrosis Virus and Growth

Gratis

1
9
69
2 years ago
Preview
Full text
APLIKASI SINBIOTIK PADA UDANG VANAME Litopenaeus vannamei: RESISTENSI TERHADAP INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS DAN PERFORMA PERTUMBUHAN WIDA LESMANAWATI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Aplikasi Sinbiotik pada Udang Vaname Litopenaeus vanammei: Resistensi terhadap Infectious Myonecrosis Virus dan Performa Pertumbuhan adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Maret 2013 Wida Lesmanawati NIM C151100141 * Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait RINGKASAN WIDA LESMANAWATI. Aplikasi Sinbiotik pada Udang Vaname Litopenaeus vanammei: Resistensi terhadap Infectious Myonecrosis Virus dan Performa Pertumbuhan. Dibimbing oleh WIDANARNI dan SUKENDA. Wabah Infectious Myonecrosis (IMN) telah menyerang budidaya udang vaname di Indonesia dan menyebabkan kematian sampai dengan 70%. Banyak penelitian membuktikan keberhasilan probiotik dalam meningkatkan resistensi udang atau ikan terhadap penyakit dengan cara menekan patogen, meningkatkan imunitas atau memperbaiki kualitas air. Aplikasi prebiotik pada hewan akuatik juga telah menunjukkan berbagai keuntungan. Akan tetapi, kombinasi probiotik dengan prebiotik (sinbiotik) memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan bila diaplikasikan secara terpisah. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi potensi sinbiotik dari bakteri SKT-b dan oligosakarida hasil ekstraksi dari ubi jalar, untuk meningkatkan resistensi terhadap infeksi penyakit IMN serta performa pertumbuhan udang vaname. Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei-September 2012, bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK) dan Program Diploma, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini meliputi kegiatan persiapan prebiotik (preparasi ubi jalar, ekstraksi dan análisis oligosakarida), persiapan bakteri probiotik (pertumbuhan bakteri SKT-b), uji in vitro dan uji in vivo. Pada uji in vitro dilakukan pengujian kombinasi prebiotik (0, 1, 2 dan 3%) dengan probiotik (107, 108, 109, 1010 cfu ml-1) yang menghasilkan pertumbuhan bakteri probiotik paling baik. Pada uji in vivo, udang vaname diberi pakan yang telah ditambah probiotik (1010 cfu g pakan-1) dengan berbagai dosis prebiotik (0, 1, 2, dan 3%) melalui pakan selama 30 hari. Pengukuran parameter untuk pengujian performa pertumbuhan dilakukan pada akhir perlakuan, meliputi laju pertumbuhan spesifik, efisiensi pakan, retensi nutrien (protein dan lemak) dan aktivitas enzim pencernaan (protease dan amilase). Sedangkan pada pengujian resistensi terhadap IMN, udang perlakuan diinfeksi dengan virus IMN (IMNV) melalui injeksi dan pengamatan dilakukan selama 10 hari. Parameter yang diamati meliputi sintasan, gejala klinis, serta parameter imun berupa total hemosit (THC) dan aktivitas phenoloxidase (PO). Ekstrak etanol ubi jalar yang digunakan dalam penelitian ini mengandung tiga jenis oligosakarida yaitu maltoheptaosa, sukrosa dan rafinosa, dengan konsentrasi total oligosakarida mencapai 64,86%. Bakteri SKT-b berada di puncak pertumbuhannya pada jam ke 16 sebesar 5,9x1010 cfu ml-1. Hasil uji in vitro menunjukkan bahwa penambahan prebiotik ke media kultur dapat meningkatkan pertumbuhan bakteri SKT-b yang berkorelasi positif dengan peningkatan dosis prebiotik dan peningkatan konsentrasi inokulan. Kombinasi prebiotik dan probiotik yang optimal didapatkan dari penambahan prebiotik 3% dan inokulan bakteri SKTb konsentrasi 1010 cfu ml-1. Pada uji in vivo, pemberian pakan perlakuan sinbiotik (Pro+Pre) selama 30 hari mampu meningkatkan sintasan udang dan menurunkan tingkat infeksi IMNV seiring dengan peningkatan dosis prebiotik. Hal ini dikarenakan meningkatnya imunitas udang yang diberi perlakuan sinbiotik. Perlakuan Pro+Pre 2% dan Pro+Pre 3% mampu meningkatkan nilai total hemosit udang vaname sampai dengan 2 kali total hemosit udang Kontrol pada awal pengamatan. Penurunan jumlah THC setelah infeksi IMNV pada kedua perlakuan tersebut mengindikasikan reaksi cepat terhadap infeksi yang diberikan. Infeksi IMNV menyebabkan peningkatan aktivitas PO pada semua perlakuan sampai akhir pengamatan. Peningkatan aktivitas PO tertinggi terjadi pada perlakuan Pro+Pre 3%. Pemberian pakan sinbotik tidak mempengaruhi laju pertumbuhan, akan tetapi mampu meningkatkan efisiensi pakan udang yang diberi perlakuan Pro+Pre 2% dan Pro+Pre 3%. Hal ini dikarenakan meningkatnya nilai aktivitas enzim protease dan amilase dibandingkan Kontrol, sehingga diduga meningkatkan kecernaan pakan. Nilai retensi protein dan lemak udang pada perlakuan Pro+Pre 2% dan Pro+Pre 3% juga lebih tinggi dibandingkan Kontrol, mengindikasikan penyerapan nutrien yang lebih baik. Secara umum, perlakuan Pro+Pre 2% dan Pro+Pre 3% menunjukkan respon yang lebih baik terhadap peningkatan resistensi pada infeksi IMNV dan performa pertumbuhan udang vaname. Kata kunci: Infectious Myonecrosis Virus, Litopenaeus vannamei, performa pertumbuhan, respons imunitas, sinbiotik. SUMMARY WIDA LESMANAWATI. Synbiotic Application for Pacific White Shrimp Litopenaeus vannamei: Resistance to Infectious Myonecrosis Virus and Growth Performance. Supervised by WIDANARNI and SUKENDA. Outbreaks of Infectious Myonecrosis (IMN) attack white shrimp farming in Indonesia and caused death up to 70%. Many studies have shown efficacy of probiotics in improving the resistance of shrimp or fish against disease by suppressing pathogens, while enhancing immunity and or improving water quality. Application prebiotics also has shown a variety of benefits to the aquatic animal. However, the combination of probiotics with prebiotics (synbiotics) showed better results than when it is applied separately. This study aimed to evaluate the potential of synbiotics from SKT-b bacteria and oligosaccharides-extracted from sweet potatoes, in increasing both white shrimp resistance to IMN and their growth performance. The experiment was conducted in Mei-September 2012, held at the Fish Health Laboratory, Faculty of Fisheries and Marine Sciences and the Diploma Programme, Bogor Agricultural University. This study includes the preparation of a prebiotic (sweet potato-extrac preparation and analyzes of oligosaccharides), preparation of probiotic bacteria (SKT-b bacteria growth), in vitro and in vivo tests. In vitro study tested the combination of prebiotics dose 0, 1, 2 and 3% and probiotics 107, 108, 109, 1010 cfu ml-1, that result the best growth of probiotic bacteria. In in vivo test, the white shrimp was given a feed in which probiotics (10 10 cfu g feed-1) with various doses of prebiotics (0, 1, 2, and 3%) added, for 30 days. Measurement parameters to test the growth performance is conducted at the end of treatment, including specific growth rate, feed efficiency, retention of nutrients (protein and lipid) and the activity of digestive enzymes (protease and amylase). On challenge their resistance to IMN, shrimp was infected with IMN virus (IMNV) through injection and was observed for 10 days. Parameters observation includes survival, clinical symptoms, and immune parameters (total hemocyte [THC] and phenoloxidase [PO] activities). The ethanol extract of sweet potato used in this study contains three types of oligosaccharide-which are maltoheptaosa, sucrose, and raffinose-with the total concentration of oligosaccharides that reached 64,86%. SKT-b bacteria reached its optimal growth after 16 hours which was 5,9 x1010 cfu ml-1. The results of in vitro assays showed that the addition of prebiotic in culture medium can increase the growth of SKT-b bacteria which was positively correlated with the escalation of the dose of prebiotics and the concentrations of inoculants. The most optimal combination of prebiotics and probiotics was obtained from the addition of 3% of prebiotics and 1010 cfu ml-1 of SKT-b bacteria inoculant. In in vivo tests, the synbiotic feeding treatment (Pro+Pre) for 30 days increased shrimp survival and lowered its infection rates to IMNV, along with the increasing doses of prebiotics. This is because the increased of shrimp’s immunity after the synbiotics treatment was given. Pro+Pre 2% and Pro+Pre 3% treatment can increase THC of white shrimp to two times greater than THC of the shrimp control in the beginning of the observation. The decrease the amount of THC in both treatments after infection IMNV indicates a rapid reaction to the infection. IMNV infection caused the increase of PO activities in the shrimp in all treatments until the end of the observation. The highest PO activity itself occurred in Pro+Pre 3% treatment. The giving of synbiotic feed does not affect the growth rate. However, it can improve the food efficiency of shrimp with Pro+Pre 2% and Pro+Pre 3% treatment. This is caused by the increase of protease and amylase enzyme activities compared to the controls, which is believed can increase the digestibility of the feed. The retention value of protein and lipid in the shrimp with Pro+Pre 2% and Pro+Pre 3% treatment is also higher than the control, which indicates the better nutrient absorption. In general, Pro+Pre 2% and Pro+Pre 3% treatment showed a better response to both the increase of the resistance to IMNV infection and the growth performance of white shrimp. Keywords: growth performance, immune response, Infectious Myonecrosis Virus, Litopenaeus vannamei, synbiotic. © Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB APLIKASI SINBIOTIK PADA UDANG VANAME Litopenaeus vannamei: RESISTENSI TERHADAP INFECTIOUS MYONECROSIS VIRUS DAN PERFORMA PERTUMBUHAN WIDA LEMANAWATI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Akuakultur SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013 Penguji pada Ujian Tertutup: Dr Ir Mia Setiawati, MSi Judul Tesis : Aplikasi Sinbiotik pada Udang Vaname Litopenaeus vanammei: Resistensi terhadap Infectious Myonecrosis Virus dan Performa Pertumbuhan Nama : Wida Lesmanawati NIM : C151100141 Disetujui oleh Komisi Pembimbing Dr Ir Widanarni, MSi Ketua Dr Ir Sukenda, MSc Anggota Diketahui oleh Ketua Program Studi Ilmu Akuakultur Dekan Sekolah Pascasarjana Prof Dr Enang Harris, MS Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr Tanggal Ujian: 28 Januari 2013 Tanggal Lulus: PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan dengan baik. Karya ilmiah ini berjudul Aplikasi Sinbiotik pada Udang Vaname Litopenaeus vanammei: Resistensi terhadap Infectious Myonecrosis Virus dan Performa Pertumbuhan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Widanarni dan Bapak Dr Sukenda selaku pembimbing, Ibu Dr Mia Setiawati selaku penguji, Bapak Dr Kukuh Nirmala dan Bapak Prof Dr Enang Harris, atas bimbingan dan saran yang diberikan. Penghargaan turut penulis sampaikan kepada Bapak Prof Dr Zairin Junior dan Bapak Ir Irzal Effendi, MSi selaku Pimpinan Program Diploma Institut Pertanian Bogor. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada suami, anak-anak, bapak, ibu, adik-kakak tercinta serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya. Penulis sampaikan pula terima kasih dan penghargaan kepada teknisi laboratorium, teman-teman mahasiswa Program Studi Ilmu Akuakultur IPB khususnya angkatan 2010, teman-teman di Program Diploma IPB khususnya PK. IKN, serta semua pihak yang telah membantu secara langsung maupun tidak langsung. Akhir kata, penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat. Penulis menyadari hasil penelitian dalam karya ilmiah ini bukanlah sebuah kebenaran mutlak karena sangat mungkin berubah seiring berkembangnya ilmu pengetahuan. Bogor, Maret 2013 Wida Lesmanawati DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang 1.2 Perumusan Masalah 1.3 Tujuan Penelitian 1.4 Manfaat Penelitian 1.5 Hipotesis 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Probiotik, Prebiotik dan Sinbiotik 2.2 Sistem Imunitas Krustasea 2.3 Infectious Myonecrosis (IMN) 2.4 Ubi Jalar (Ipomoea batatas) 3 METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat 3.2 Metode 3.2.1 Preparasi, Ekstraksi, dan Analisis Oligosakarida 3.2.2 Pertumbuhan Bakteri Probiotik SKT-b 3.2.3 Uji Kombinasi Sinbiotik Optimal 3.2.4 Uji In Vivo 3.3 Prosedur Analisis Data 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Kandungan Oligosakarida dalam Ubi Jalar dan Pakan Komersil 4.2 Pertumbuhan Bakteri Probiotik SKT-b 4.3 Kombinasi Sinbiotik Optimal 4.4 Uji In Vivo 4.4.1 Populasi Bakteri Usus Udang 4.4.2 Resistensi Udang Vaname terhadap Infeksi IMNV 4.4.3 Performa Pertumbuhan 4.4.4 Kualitas Air Media Pemeliharaan 5 SIMPULAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP xiii xv xvii 1 1 3 3 3 3 4 5 7 9 11 11 11 12 13 13 19 20 20 21 22 22 24 29 32 33 34 39 52 DAFTAR TABEL 1 2 3 4 5 6 7 8 Klasifikasi karbohidrat Fungsi berbagai tipe sel hemosit pada sistem imunitas krustasea Karakteristik sifat biokimia dan fisiologis bakteri probiotik SKT-b Pengelompokan tingkat infeksi IMNV terhadap udang vaname berdasarkan gejala klinis yang muncul Perhitungan parameter pengujian performa pertumbuhan: penambahan bobot tubuh (∆ Biomasa), jumlah konsumsi pakan (JKP), laju pertumbuhan (SGR), efisiensi pakan (EP), retensi nutrien (protein dan lemak), aktivitas enzim (AE) (protease dan amilase) Jenis dan konsentrasi oligosakarida hasil ekstraksi dari tepung kukus ubi jalar dan pakan udang komersil dengan metode HPLC Penambahan bobot tubuh (∆ biomasa), jumlah konsumsi pakan (JKP), laju pertumbuhan (SGR), efisiensi pakan (EP), retensi nutrien dan sintasan udang vaname yang diberi empat jenis pakan perlakuan (rerata±simpangan baku, n=40) selama 30 hari Kisaran kualitas air media pemeliharaan udang vaname selama 30 hari pemberian pakan perlakuan 5 7 13 16 18 20 31 32 DAFTAR GAMBAR 1 Mekanisme pertahanan tubuh nonspesifik pada krustasea 2 Klasifikasi sel hemosit: a) hialin, b) semigranular, c) granular 3 Mekanisme pertahanan seluler: a) fagositosis, b) enkapsulasi, c) pembentukan nodul 4 Gejala klinis udang vaname yang terinfeksi IMNV 5 Bentuk ikosahedral dari IMNV: a) transmisi elektron mikrograf, fraksi gradien calsium chloride, diwarnai dengan phosphotungstic acid 2%, garis menunjukkan 100 nm, b) Rekonstruksi 3-dimensi virion IMNV dengan resolusi 8.0-Å 6 Varietas ubi jalar yang banyak diminati di North Carolina Sweet Potato Commission 7 Ubi jalar (Ipomoea batatas) berumbi putih yang digunakan sebagai sumber oligosakarida: a) mentah, b) setelah dikukus, diiris tipis dan dikeringkan, c) tepung, d) larutan stok ekstrak ubi jalar 8 Koloni bakteri probiotik SKT-b yang dikultur di media TCBS agar 9 Gejala klinis udang yang terinfeksi IMNV. Angka menunjukkan tingkat infeksi ringan (1), sedang (2), berat (3), dan sangat berat (4) 10 Kurva pertumbuhan bakteri SKT-b yang dikultur di media SWC cair dan dihitung dengan metode total plate count `11 Nilai absorbansi biakan perlakuan kombinasi bakteri SKT-b konsentrasi 107, 108, 109 dan 1010 cfu ml-1 dengan prebiotik dosis 0% (kontrol) ( ), 1% ( ), 2% ( ) dan 3% ( ) 12 Populasi bakteri dalam usus udang vaname (x107 cfu g usus-1) pada sebelum (awal) dan setelah 30 hari pemberian pakan perlakuan (n=5) 13 Sintasan udang vaname berbagai perlakuan pakan pada hari ke 10 setelah infeksi IMNV (n=15) 14 Tingkat infeksi udang vaname berbagai perlakuan sinbiotik pada hari ke 10 setelah infeksi IMNV (n=15). Simbol menunjukkan tingkat infeksi: mati ( ), sangat berat ( ), berat ( ), sedang ( ), ringan ( ) 15 Total hemosit udang vaname perlakuan: Kontrol (-) ( ), Kontrol (+) ( ), Pro+Pre 1% ( ), Pro+Pre 2% ( ), Pro+Pre 3% ( ) pada hari ke 0 sebelum infeksi, hari ke 5 dan ke 10 setelah infeksi IMNV (n=3) 16 Aktivitas PO udang vaname perlakuan: Kontrol (-) ( ), Kontrol (+) ( ), Pro+Pre 1% ( ), Pro+Pre 2% ( ), Pro+Pre 3% ( ) pada hari ke 0 sebelum infeksi, hari ke 5 dan ke 10 setelah infeksi IMNV (n=3) 17 Aktifitas enzim pencernaan (protease dan amilase) udang vaname (n=5) setelah 30 hari pemberian pakan perlakuan: Kontrol ( ), Pro+Pre 1% ( ), Pro+Pre 2% ( ), Pro+Pre 3% ( ) 6 6 7 8 9 10 11 12 16 21 22 23 25 26 27 28 31 DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Metode total plate count Pembuatan media bakteri Sistem resirkulasi pada wadah perlakuan Ekstraksi IMNV dari tubuh udang yang terinfeksi Tahapan dan waktu kegiatan penelitian pada uji in vivo Perhitungan total hemosit dengan menggunakan hemasitometer Prosedur analisis proksimat Prosedur analisis enzim Hasil analisis proksimat udang vaname dan pakan perlakuan Hasil analisis oligosakarida ekstrak ubi jalar dan pakan udang dengan HPLC 11 Hasil perhitungan pertumbuhan bakteri SKT-b 12 Hasil pengamatan tingkat infeksi IMNV pada udang vaname 13 Hasil pengukuran kualitas air pemeliharaan udang selama perlakuan 40 41 42 43 43 44 44 47 48 48 50 50 51 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Udang vaname (Litopenaeus vannamei) mulai diintroduksi ke Indonesia tahun 1999 hasil impor dari Taiwan dan Hawai. Budidaya udang ini menyebar cepat ke berbagai daerah di Indonesia. Sampai akhir tahun 2007, udang vaname telah dibudidayakan sekurangnya di 17 provinsi di Indonesia (Taukhid dan Nur’aini 2008). Komoditas ini telah menggantikan udang windu yang mengalami kegagalan akibat penyakit White Spot Syndrom (WSS). Teknik pengembangbiakan udang vaname lebih mudah daripada udang windu. Selama kegiatan pembesaran, udang ini dikenal sebagai hewan yang kuat, memiliki laju pertumbuhan yang seragam dan kebutuhan protein pakan lebih rendah (25-35%) dibandingkan udang windu (Weidner dan Rosenberry 1992). Dalam perkembangannya, budidaya udang vaname di Indonesia juga tidak lepas dari berbagai wabah penyakit yang menyerang, terutama oleh infeksi virus. Penyakit viral penting yang telah dilaporkan pada budidaya udang vaname yaitu WSS, Taura Syndrom (TS), Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis (IHHN), dan Infectious Myonecrosis (IMN). Wabah IMN pertama kali menyerang budidaya udang vaname di Situbondo pada pertengahan tahun 2006 (Taukhid dan Nura’ini 2008). Wabah tersebut kemudian menyebar cepat ke berbagai daerah di Indonesia dan telah menyebabkan kematian kumulatif udang vaname hingga 70%. Sampai saat ini belum ditemukan pengobatan yang efektif untuk penyakit viral. Penggunaan kemoteurapeutik termasuk antibiotik telah menimbulkan berbagai dampak negatif terutama munculnya bakteri resisten yang beresiko terhadap kesehatan manusia. Keluarnya pembatasan penggunaan antibiotik pada kegiatan akuakultur di banyak negara dan tingginya kesadaran konsumen akan keamanan pangan telah mendorong meningkatnya penelitian untuk mencari bahan alternatif yang alami dan aman. Selain vaksin, suplemen pakan termasuk probiotik dan prebiotik, mendapat perhatian yang tinggi (Genc et al. 2007). Penelitian mengenai penanggulangan penyakit IMN belum banyak dilakukan. Beberapa penelitian mengenai IMN terbatas pada purifikasi dan karaktrisasi agen penyakit (Poulos et al. 2006); metode deteksi dan status penyebaran penyakit (Poulos dan Lightner 2006; Andrade et al. 2007; Senapin et al. 2007; Taukhid dan Nur’aini 2008), immune assessment (Costa et al. 2009), serta gejala klinis dan mortalitas (Lightner et al. 2004; Tang et al. 2005). Selama ini upaya penanggulangan wabah IMN dilakukan dengan cara menghindari masuknya agen penyakit melalui biosekuriti, penggunaan benih specific pathogen free (SPF), mengurangi kepadatan, monitoring penyakit dan manajemen budidaya yang baik. Probiotik banyak menarik perhatian untuk tujuan penelitian maupun komersial dan saat ini umum digunakan sebagai makanan kesehatan hingga terapeutik, propilaktik, dan suplemen pertumbuhan (Nayak 2010). Beberapa tahun belakangan, semakin banyak penelitian yang membuktikan keberhasilan probiotik dalam meningkatkan resistensi udang dan ikan terhadap penyakit dengan cara menekan patogen, meningkatkan imunitas atau memperbaiki kualitas air (Verschuere et al. 2000). Aplikasi probiotik telah menjadi bagian dari praktik 2 kegiatan akuakultur. Strategi tersebut memberikan manfaat dalam mengatasi efek samping penggunaan antibiotik dan obat-obatan kimia lainnya serta meningkatkan produksi melalui perbaikan pertumbuhan dan resistensi terhadap penyakit. Selain itu, probiotik tertentu dapat berperan sebagai water additive yang memegang peran penting dalam dekomposisi bahan organik, menurunkan kadar amonia, nitrit dan H2S. Dalam akuakultur, jenis probiotik yang dievaluasi untuk digunakan jauh lebih luas dibandingkan dengan hewan darat. Beberapa probiotik baik sebagai monospesies maupun multispesies telah tersedia secara komersial untuk kegiatan akuakultur (Nayak 2010). Keberhasilan probiotik telah menjadi dasar bagi konsep lain seperti prebiotik dan sinbiotik (Nayak 2010). Berbagai penelitian telah menunjukkan keuntungan aplikasi probiotik dan prebiotik pada hewan akuatik (Merrifield et al. 2010; Nayak 2010; Ringo et al. 2010). Namun pada umumnya, aplikasi penggunaan probiotik dan prebiotik ini diteliti secara terpisah, sebaliknya sinbiotik belum banyak dipelajari. Berdasarkan beberapa penelitian, pemberian sinbiotik pada hewan akuatik menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan bila diaplikasikan secara terpisah (Li et al. 2009; Rodriguez-Estrada et al. 2009; Zhang et al. 2010). Penelitian ini mengevaluasi efek sinergis dari bakteri probiotik SKT-b dan oligosakarida hasil ekstraksi dari ubi jalar, dalam meningkatkan resistensi terhadap penyakit IMN dan performa pertumbuhan udang vaname. Bakteri SKT-b yang berhasil diisolasi dari pakan udang Skeletonema, secara in vitro maupun in vivo, telah terbukti berperan sebagai probiotik. Hasil analisis sekuen sebagian gen 16SrRNA menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk spesies Vibrio alginolyticus dengan indek kemiripan 88% (Widanarni et al. 2003). Bakteri SKT-b mampu menekan populasi bakteri V. harveyi, meningkatkan sintasan larva udang windu yang terinfeksi vibriosis, dan mampu menstimulasi sistem imunitas udang vaname (Widanarni et al. 2003; Widanarni et al. 2008; Syahailatua 2009). Oligosakarida tidak dapat dicerna (non-digestible oligosaccharides) diketahui berperan sebagai prebiotik. Sumber oligosakarida berasal dari biji-bijian, kacang-kacangan, umbi-umbian dan hasil tanaman lainnya. Haryati dan Supriyati (2010) membandingkan beberapa jenis prebiotik yaitu oligosakarida dari ubi jalar dan bungkil kedelai serta prebiotik komersial (mannanoligosaccharide, inulin, dan fructooligosaccharide) untuk meningkatkan efisiensi pakan ayam pedaging. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan ekstrak ubi jalar 0,2% mampu memberikan nilai FCR yang paling baik, sedangkan penambahan jenis prebiotik lainnya belum memberikan hasil yang memuaskan. Oligosakarida dalam ubi jalar juga dapat bersinergi dengan bakteri probiotik NP5 memberikan hasil yang lebih baik terhadap pertumbuhan ikan nila dibandingkan dengan perlakuan prebiotik dan probiotik saja (Putra 2010). Pemberian ekstrak oligosakarida dari ubi jalar diharapkan dapat menunjang pertumbuhan bakteri SKT-b, sehingga kombinasi yang seimbang antara probiotik dengan prebiotik ini dapat meningkatkan resistensi terhadap penyakit IMN serta performa pertumbuhan udang vaname. 3 1.2 Perumusan Masalah Penyakit IMN telah menyebabkan kematian udang vaname sampai dengan 70%. Probiotik dapat menjadi alternatif untuk pencegahan penyakit IMN karena dianggap mampu meningkatkan sintasan dan imunitas inangnya, disamping memperbaiki pertumbuhannya. Aplikasi probiotik yang ditunjang dengan prebiotik (sinbiotik) memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan bila diaplikasikan secara terpisah. Pemberian sinbiotik dari bakteri SKT-b dan oligosakarida diharapkan dapat meningkatkan resistensi terhadap infeksi penyakit IMN serta performa pertumbuhan udang vaname. 1.3 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi potensi sinbiotik dari bakteri SKT-b dan oligosakarida untuk meningkatkan resistensi terhadap infeksi penyakit IMN serta performa pertumbuhan udang vaname. 1.4 Manfaat Penelitian Hasil penelitian dapat dijadikan salah satu alternatif pemecahan masalah dalam penanggulangan penyakit IMN serta peningkatan produktifitas udang vaname. 1.5 Hipotesis Pemberian sinbiotik dari bakteri SKT-b dan oligosakarida melalui pakan dapat meningkatkan resistensi terhadap infeksi penyakit IMN dan performa pertumbuhan udang vaname. 4 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Probiotik, Prebiotik dan Sinbiotik Probiotik merupakan mikroorganisme hidup yang ketika diberikan dalam jumlah cukup dapat memberikan manfaat kesehatan pada inang (FAO/WHO 2001). Menurut Lisal (2005), kriteria dalam pemilihan probiotik yaitu sebaiknya merupakan mikroflora normal usus, bersifat nonpatogenik dan nontoksik bagi inang, toleran terhadap asam lambung dan garam empedu, mampu menempel dan berkoloniasi dalam usus, bersifat antagonistik terhadap patogen, memiliki pengaruh yang menguntungkan bagi inang, dan memiliki jumlah serta viabilitas yang tinggi. Dalam akuakultur, jenis probiotik yang dievaluasi dan digunakan lebih luas dibandingkan hewan terestrial, baik dalam bentuk monospesies maupun multispesies. Jenis-jenis probiotik tersebut memiliki mekanisme aksi yang berbeda diantaranya mampu meningkatkan efisiensi pakan dan bobot tubuh, memberi proteksi dalam melawan patogen melalui kompetisi ruang, produksi asam organik (asam formik, asam asetat dan asam laktat), produksi hidrogen peroksida dan beberapa bahan lainnya seperti antibiotik, bakteriosin, siderophores, lisozim serta memodulasi respons fisiologis dan imunologis ikan. Beberapa genus bakteri yang telah diteliti sebagai probiotik yaitu Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Aeromonas, Shewanella, Vibrio, Carnobacterium, dan Clostridium (Nayak 2010). Prebiotik adalah bahan makanan yang tidak dapat dicerna yang bermanfaat untuk menstimulasi pertumbuhan dan aktivitas bakteri tertentu (bakteri menguntungkan) di dalam usus. Studi mengenai prebiotik pada hewan akuatik berkaitan dengan efek terhadap pertumbuhan, konversi pakan, mikrobiota usus, resistensi terhadap patogen dan parameter imunitas. Prebiotik umumnya merupakan karbohidrat yang tidak dapat dicerna dalam saluran pencernaan inang. Karbohidrat dikelompokkan berdasarkan berat molekul atau tingkat polimerasinya (jumlah unit monosakarida), menjadi monosakarida, oligosakarida dan polisakarida (Tabel 1). Oligosakarida tidak dapat dicerna (non-digestible oligosaccharide) memiliki konfigurasi atom C dalam unit monosakarida yang membuat ikatan glikosidiknya tidak dapat dicerna oleh aktivitas hidrolisis dari enzim pencernaan manusia atau hewan. Prebiotik yang umum digunakan di akuakutur sampai sekarang meliputi inulin, fructooligosaccarides (FOS), short-cain fructooligosaccharides (scFOS), mannanoligosaccharides (MOS), galactooligosaccharides (GOS), xylooligosaccharides (XOS), arabinoxylooligosaccharides (AXOS), isomaltooligosaccharides (IMO) dan GroBiotic –A (Ringo et al. 2010). Sinbiotik merupakan kombinasi yang seimbang dari probiotik dan prebiotik. Aplikasi sinbiotik memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan pemberian probiotik dan prebiotik secara terpisah. Efek sinergis dari Bacillus OJ dan IMO mampu meningkatkan populasi mikrobial, respons imunitas dan resistensi terhadap penyakit pada L. vanammei, lebih baik dibandingkan dengan aplikasi terpisah dari Bacillus OJ dan IMO (Li et al. 2009). Hasil serupa juga dilaporkan oleh RodriguezEstrada et al. (2009) yang menyebutkan bahwa aplikasi Enterococcus faecalis dan MOS pada ikan salmon mampu meningkatkan respons imun dan sintasan ikan terhadap infeksi V. (L.) anguillarum. 5 Tabel 1 Klasifikasi karbohidrat (Subandiyono dan Hastuti 2009) No. Kelompok 1 Monosakarida (1 unit glukosa) Jenis a. Triosa (C3H6O3) b. Tetrosa (C4H8O4) c. Pentosa (C5H10O5) Gliseraldehida; Dihidroksiaseton Eritrosa Rribosa; Arabinosa; Xilosa; Xilulosa Glukosa; Galaktosa; Mannosa; Fruktosa Sukrosa; Laktosa; Maltosa; Selobiosa Rafinosa Stasilosa Verbaskosa 1. Pentosan (Araban; Xilan) 2. Heksosan (Glukan [Starch, Dekstrin, Glikogen, Selulosa]; Fruktan [Inulin, Levan]; Galaktan; Manan) Pektin; Hemiselulosa; Gum; Mucilage; Mukopolisakarida 2 Oligosakarida (2-10 unit glukosa) 3 Polisakarida ( >10 unit glukosa) d. Heksosa (C6H12O6) a. Disakarida (C12H22O11) b. Trisakarida (C18H32O16) c. Tetrasakarida (C24H42O16) d. Pentasakarida (C30H52O26) a. Homo-polisakarida (glukosa dengan jenis yang sama) Persenyawaan b. Hetero-polisakarida (glukosa dengan jenis yang berbeda) a. Khitin khusus b. Lignin 4 Contoh 2.2 Sistem Imunitas Krustasea Mekanisme pertahanan tubuh krustasea kurang berkembang dibandingkan ikan bersirip (finfish) dan vertebrata lainnya. Krustasea tidak memiliki memori adaptif dan hanya bergantung pada sistem pertahanan nonspesifik (Roch 1999). Sistem pertahanan tersebut meliputi pertahanan seluler berupa aktivitas sel-sel hemosit (fagositosis, enkapsulasi, dan pembentukkan nodul), serta pertahanan humoral berupa aktivasi dan pelepasan molekul-molekul penting yang tersimpan dalam hemosit (protein antikoagulan, aglutinin, enzim phenoloxidase [PO], peptida antimikrobial, protease inhibitor, dan sebagainya) (Jiravanichpaisal et al. 2006; Holmblad dan Soderhall 1999). Mekanisme pertahanan tubuh krustasea dijelaskan pada Gambar 1 (Smith et al. 2003). Berdasarkan keberadaan granular pada sitoplasma, terdapat tiga tipe hemosit pada krustasea yaitu sel hialin (nongranular), semi granular dan sel granular (Gambar 2). Fungsi dari masing-masing hemosit seperti pada Tabel 2 (Soderhall dan Cerenius 1992). Fagositosis merupakan mekanisme pertahanan sel yang paling umum dengan cara menelan dan menghancurkan patogen dan partikel asing yang masuk ke dalam tubuh. Penghancuran material yang difagosit melibatkan produksi intraseluler berupa radikal bebas. Selama proses kontak dan pengenalan dengan patogen, enzim inang seperti NADPH-oksidase menjadi aktif yang ditandai dengan meningkatnya konsumsi oksigen dan menghasilkan radikal bebas diantaranya anion superoksida (O2-) dan hidrogen peroksida (H2O2) (Munoz et al. 2000; Rodriguez dan Le Moullac 2000). Radikal bebas ini dapat langsung membunuh organisme yang menyerang, berkombinasi dengan senyawa-senyawa nitrogen (nitric oxide) atau bersinergi dengan lisozim (Roch 1999). Enkapsulasi dan pembentukan nodul 6 merupakan kumpulan hemosit yang saling bekerja sama untuk menangani partikel asing. Enkapsulasi terjadi bila inang diserang oleh partikel yang berukuran besar, sedangkan nodul terbentuk bila inang diserang oleh partikel kecil dalam jumlah banyak (Gambar 3) (Soderhall dan Cerenius 1992). β-1,3-glucan Peptidoglican Live bacteria Bacterial antigen β-1,3-glucan binding protein (βGBP) Semi granular hyaline Degranulation Inactive serine proteinase (proppA) Prophenoloxidase (proPO) Active serine proteinase (ppA) Granular Antibacterial peptides Phagocytosis Peroxinectin Degranulation Phenoloxidase (PO) Phenolic compounds Quinones Melanin  Cell adhesion  Release of reactive O2  Opsonization  Encapsulation Gambar 1 Mekanisme pertahanan tubuh nonspesifik pada krustasea a Gambar 2 b c Klasifikasi sel hemosit: a) hialin, b) semigranular, c) granular (Giulianini et al. 2007) 7 Tabel 2 Fungsi berbagai tipe sel hemosit pada sistem imunitas krustasea Fungsi Tipe hemosit Hialin Semigranular Granular Fagositosis Enkapsulasi Sitotoksisitas Ya Terbatas Tidak Tidak Ya Sangat terbatas -* Ya Ya Sistem aktivasi ProPO Tidak Ya Ya *Belum ada informasi a b c Gambar 3 Mekanisme pertahanan seluler: a) fagositosis, b) enkapsulasi, c) pembentukan nodul Sistem prophenoloxidase (proPO) merupakan bagian yang dominan dari mekanisme pertahanan tubuh krustasea, disimpan dan diproduksi oleh sel semigranular dan granular yang diaktifkan oleh kehadiran sejumlah kecil mikroba. Komponen awal dari sistem proPO adalah PO yang ketika aktif akan mengoksidasi senyawa fenol menjadi kuinolon dan secara spontan membentuk melanin sebagai produk akhir. Melanin beserta produk antaranya merupakan senyawa yang sangat reaktif yang berperan diantaranya dalam inaktivasi dan mencegah penyebaran partikel asing dalam tubuh melalui penghambatan produk ekstraseluler mikroorganisme (proteinase dan khitinase). Sistem proPO berpengaruh terhadap tingkah laku sel, perbanyakan dan atau aktivasi molekul-molekul penting yang fungsional serta netralisasi agen penginfeksi (Smith et al. 2003). 2.3 Infectious Myonecrosis (IMN) Wabah IMN pertama kali teridentifikasi pada budidaya udang vaname (Litopenaeus vanammei) di timur laut Brazil pada tahun 2004 dan ditemukan di Indonesia pada awal tahun 2006. Hasil analisis subsekuen membuktikan bahwa virus IMN (IMNV) yang menginfeksi udang vaname di Indonesia memiliki kemiripan sekuen asam nukleat 99,6% dengan IMNV yang menginfeksi di Brazil (Senapin et al. 2007). IMNV menginfeksi postlarva, juvenil dan subadult pada pembesaran udang vaname. Mewabahnya penyakit ini diduga berkaitan dengan stress fisik dan lingkungan seperti salinitas dan suhu ekstrim, penanganan udang, 8 serta penggunaan pakan kualitas rendah. Infeksi IMNV memperlihatkan gejala nekrosis dari mulai ringan sampai berat terutama di bagian abdomen dan ekor yang dapat berkembang menjadi kemerahan (Gambar 4) (Lightner et al. 2004). a b Gambar 4 Gejala klinis udang vaname yang terinfeksi IMNV: a) Lightner et al. 2004, b) Poulos et al. 2006 Hasil histopatologi, udang yang terinfeksi IMNV memperlihatkan lesi di otot skeletal meliputi multifocal necrosis, kongesi hemosit, inflamasi fibrosis, fagositosis dan munculnya badan inklusi sitoplasmik. Hasil in situ hybridisation (ISH) pada L. vannamei menunjukkan bahwa otot skeletal merupakan organ target utama dari infeksi IMNV. Hal ini yang menyebabkan penyakit IMN bersifat kronis dan kematian terjadi secara perlahan. Selain otot skeletal, IMNV juga ditemukan di organ limfoid, usus bagian belakang, insang serta sel fagositik dalam hepatopankreas dan hati. L vanammei merupakan inang utama dari IMNV, meskipun mampu menginfeksi L. stylirostris dan Penaeus monodon, namun tidak menyebabkan kematian sampai dengan empat minggu pengamatan setelah infeksi (Tang et al. 2005). Berdasarkan analisis imunologi, perubahan parameter imunologis yang signifikan hanya terjadi pada udang di tahap akhir infeksi IMNV, ketika pemulihan diri tidak dimungkinkan lagi. Infeksi IMNV menyebabkan peningkatan apoptosis pada hemosit (8 kali), titer aglutinasi (16 kali), produksi anion superoksida dari hemosit (50%), dan aktivitas antimikrobial dari hemolimph (21 kali melawan Micrococcus luteus). Infeksi IMNV juga menyebabkan penurunan total hemosit (30%) dan persentase granulosit sirkular (7%) (Costa et al. 2009). Agen penyebab penyakit IMN adalah virus berbentuk ikosahedral dengan diameter 40 nm, memiliki genom tunggal, double-stranded (dsRNA) dengan panjang molekul 7560 bp (Gambar 5). Hasil analisis filogenetik IMNV berdasarkan RDA-dependent dari gen RNA polimerase (RdRp), IMNV memiliki kemiripan dengan virus Giardia lamblia, yang merupakan anggota dari family Totiviridae. Berdasarkan hal ini, IMNV mungkin merupakan anggota unik dari Totiviridae atau mungkin merepresentasikan family virus dsRNA baru yang menginfeksi inang invertebrata (Poulos et al. 2006). 9 a b Gambar 5 Bentuk ikosahedral dari IMNV: a) transmisi elektron mikrograf, fraksi gradien calsium chloride, diwarnai dengan phosphotungstic acid 2%, garis menunjukkan 100 nm (Poulos et al. 2006), b) Rekonstruksi 3dimensi virion IMNV dengan resolusi 8.0-Å (Tang et al. 2008) 2.4 Ubi Jalar (Ipomoea batatas) Ubi jalar merupakan tanaman asli dari Amerika Tengah dan Amerika Selatan. Tanaman ini mulai menyebar ke seluruh dunia, terutama negara-negara beriklim tropis, pada abad ke 16. Orang-orang Spanyol menyebarkan ubi jalar ke kawasan Asia terutama Filipina, Jepang dan Indonesia. Data tahun 2009 menunjukkan produksi ubi jalar Indonesia menempati urutan ke 4 setelah China, Uganda dan Nigeria. Ubi jalar termasuk dalam ordo Solanaceae, family Convolvulaceae, genus Ipomoea dan spesies Ipomoea batatas serta memiliki nama binomial Ipomoea batatas (L) Lam. Tanaman ini memiliki warna kulit yang bervariasi antara kuning, oranye, merah, coklat, ungu dan abu-abu kecoklatan. Warna daging juga bervariasi mulai dari abu-abu kecoklatan, putih, merah, merah muda, ungu, kuning, sampai oranye, tergantung jenis dan banyaknya pigmen yang terdapat di dalamnya. Varietas umbi warna putih dan kuning pucat memiliki rasa manis dan kadar air lebih rendah dibandingkan dengan varietas berwarna merah, merah muda dan oranye (Wikipedia 2012). Menurut North Carolina Sweet Potato Commission (2013), terdapat ratusan varietas ubi jalar (Gambar 6), kebanyakan di produksi dalam jumlah kecil serta hanya dijual oleh petani lokal. Secara umum, ubi jalar mengandung karbohidrat yang tinggi (20,1%), terdiri dari pati (12,7%), gula (4,2%), dan serat (3,0%). Ubi jalar juga mengandung protein (1,6%) dan lemak (0,1%) yang rendah (Wikipedia 2012). Komposisi kimia ubi jalar bervariasi tergantung pada waktu panen, varietas dan proses pengolahan. Kandungan gula yang terdapat pada ubi jalar varietas sukuh terdiri dari fruktosa, glukosa, sukrosa, maltose dan maltotriosa (Marlis 2008). Roxas et al. (1985) menyebutkan bahwa ubi jalar varietas Kinabakab, Tinipay, BNAS 51 dan G113-2b hanya tediri dari monosakarida dan sukrosa. Pengukusan dapat meningkatkan konsentrasi gula dalam ubi jalar dibandingkan dengan kondisi mentahnya. Hal ini disebabkan oleh pemecahan struktur pati karena pengaruh panas dan air, menjadi molekul glukosa yang lebih sederhana (Marlis 2008). 10 Gambar 6 Varietas ubi jalar yang banyak diminati di North Carolina Sweet Potato Commission 11 3 METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan selama 16 minggu, pada bulan Mei–September 2012. Bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK) dan Program Diploma, Institut Pertanian Bogor (IPB). 3.2 Metode 3.2.1 Preparasi, Ekstraksi, dan Analisis Oligosakarida Ubi jalar (Ipomoea batatas) berumbi putih didapatkan dari penjual ubi di pasar Ciampea. Proses preparasi dan ekstraksi dimulai dengan mengukus ubi selama 30 menit, kemudian diiris tipis-tipis, dikeringkan dalam oven suhu 50 oC selama dua hari (sampai kering), dan selanjutnya ditepungkan menggunakan blender. Tepung kukus ubi jalar diekstraksi dalam etanol 70% dengan perbandingan 1:10 dan digoyang dalam shaker (kecepatan 120 rpm suhu 30 oC) selama 15 jam (Muchtadi 1989). Setelah disaring, filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan evaporator vakum pada suhu 40 oC, kemudian dikeringkan dengan freeze dryer untuk memisahkan filtrat dari pelarutnya. Sebanyak 50 gram ekstrak diencerkan dengan 100 ml akuades hingga didapatkan larutan stok 50% (Gambar 7). a b c d Gambar 7 Ubi jalar (Ipomoea batatas) berumbi putih yang digunakan sebagai sumber oligosakarida: a) mentah, b) setelah dikukus, diiris tipis dan dikeringkan, c) tepung, d) larutan stok ekstrak ubi jalar 12 Ekstrak oligosakarida hasil freeze dry kemudian dianalisis menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC), untuk mengetahui jenis dan konsentrasi oligosakarida yang terkandung dalam ekstrak. Analisis oligosakarida dengan HPLC menggunakan kolom Aminex HPX-87H pada suhu 35 oC dengan refractive indeks detector, laju alir 1 ml menit-1, fase gerak H2SO4 0,008N dan volume injeksi 20 µl. Analisis HPLC dilakukan di Balai Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), Serpong. 3.2.2 Pertumbuhan Bakteri Probiotik SKT-b Bakteri SKT-b yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari Laboratorium Kesehatan Ikan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK) IPB. Bakteri SKT-b memiliki ciri koloni berbentuk bulat, elevasi cembung, tepian rata, berwarna kuning pada media Thiosulfate Citrate Bilesalt Sucrose (TCBS) agar dan agak berlendir (Gambar 8). Karakteristik fisiologis dan biokimia bakteri SKT-b disajikan pada Tabel 3 (Widanarni et al. 2003). Bakteri SKT-b dikultur pada media Seawater Complete (SWC) cair dan diinkubasi dalam waterbath shaker (kecepatan 140 rpm, suhu 29 oC) selama 22 jam. Setiap dua jam, kultur bakteri diambil sebanyak 1 ml dan kemudian dihitung konsentrasinya dengan metode total plate count (TPC) pada media TCBS agar (Cappuccino dan Sherman 2008) (Lampiran 1). Selanjutnya dibuat kurva pertumbuhan bakteri SKT-b terhadap waktu. Pembuatan media bakteri dijelaskan pada Lampiran 2. Gambar 8 Koloni bakteri probiotik SKT-b yang dikultur di media TCBS agar 13 Tabel 3 Karakteristik sifat biokimia dan fisiologis bakteri probiotik SKT-b Parameter Gram Bentuk sel Motilitas Protease Amilase Kitinase Sumber karbon:  Glukosa  Sukrosa  Laktosa Keterangan Negatif Batang pendek + + + + + - 3.2.3 Uji Kombinasi Sinbiotik Optimal Pengujian kombinasi prebiotik-probiotik (sinbiotik) yang optimal dilakukan secara in vitro. Pengujian ini mencari kombinasi prebiotik-probiotik yang memperlihatkan kecepatan pertumbuhan bakteri probiotik paling baik. Biakan cair bakteri SKT-b konsentrasi 107, 108, 109, dan 1010 cfu ml-1, masing-masing sebanyak 1 ml ditumbuhkan dalam 9 ml air laut steril yang telah dicampur dengan prebiotik konsentrasi 0, 1, 2 dan 3% v/v. Sterilisasi prebiotik dilakukan dengan filtrasi mess size 0,20 µm. Biakan bakteri selanjutnya diinkubasi dalam waterbath shaker (kecepatan 140 rpm, suhu 29 oC) selama 12 jam. Pertumbuhan bakteri SKT-b diketahui dengan mengukur nilai absorbansi biakan setiap perlakuan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. 3.2.4 Uji In Vivo 3.2.4.1 Preparasi Probiotik Bakteri probiotik yang akan diberikan ke udang, sehari sebelumnya dikultur di media SWC cair dan diinkubasi dalam waterbath shaker (kecepatan 140 rpm, suhu 29 oC) selama 16 jam. Pelet bakteri dipisahkan dengan supernatan menggunakan sentrifus kecepatan 10.000 rpm selama lima menit. Pelet bakteri dicampurkan ke pakan sebanyak 1010 cfu g pakan-1. 3.2.4.2 Preparasi Pakan Bakteri SKT-b dan prebiotik sesuai dosis perlakuan ditambahkan ke pakan komersil menggunakan pengikat berupa gelatin sebanyak 3% dari bobot pakan. Pakan untuk udang kontrol juga ditambahkan gelatin 3% tanpa sinbiotik. Pelet dikeringanginkan selama 30 menit dan segera diberikan ke udang sebanyak satu kali setiap hari selama 30 hari. Pembuatan pakan perlakuan dilakukan setiap hari untuk menjaga kesegaran bahan. 14 3.2.4.3 Persiapan Wadah dan Media Wadah perlakuan berupa akuarium kaca berukuran 60x30x40 cm3. Sebelum digunakan, wadah didesinfeksi dengan klorin 100 ppm selama satu jam. Wadah dibilas air sampai bersih dan dijemur di bawah sinar matahari untuk menghilangkan residu klorin. Akuarium kemudian ditutup dengan plastik hitam untuk mengurangi intensitas cahaya yang masuk. Masing-masing akuarium dilengkapi dengan shelter (pipa paralon ½ inci) dan “anco” (tutup toples plastik diameter 18 cm). Air yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Pantai Ancol. Air laut ditampung dalam tandon dan didesinfeksi dengan klorin 30 ppm. Residu klorin dihilangkan dengan menambahkan Na-Thiosulfat 15 ppm (setengah dosis klorin). Setiap akuarium perlakuan diisi air laut setinggi 30 cm (54 liter). Akuarium dengan perlakuan yang sama digabung dalam satu sistem resirkulasi untuk mempertahankan kualitas air media pemeliharaan udang (Lampiran 3). 3.2.4.4 Kondisi Hewan Uji Udang vaname diperoleh dari PT. Global Gen Indonesia, Labuan, Banten. Sebelum digunakan, udang vaname (PL 41; bobot rataan 0,6 g) diadaptasikan selama dua minggu dalam wadah fiber volume 1 ton. Udang diberi pakan sekenyangnya sebanyak lima kali sehari pada pukul 06.00, 10.00, 14.00, 18.00 dan 22.00 WIB. Setelah proses adaptasi, udang uji (PL 55; bobot rataan 1,9 g) kemudian dipindahkan ke dalam akuarium perlakuan sebanyak 40 ekor per akuarium. Udang diberi pakan perlakuan selama 30 hari dengan metode dan frekuensi pemberian pakan yang sama seperti saat adaptasi. Selain dengan menggunakan sistem resirkulasi, kualitas air media dipertahankan dengan aerasi terus menerus dan penyifonan setiap dua kali sehari pada pagi dan sore hari. Penyifonan juga dilakukan untuk mengambil sisa pakan untuk pengukuran parameter jumlah konsumsi pakan. Uji in vivo dikelompokkan menjadi dua yaitu uji resistensi udang vaname terhadap infeksi IMNV dan uji performa pertumbuhan. Setelah pemberian pakan perlakuan selama 30 hari, dilakukan analisis dan perhitungan parameter pertumbuhan untuk uji performa pertumbuhan serta pengukuran populasi bakteri usus. Setelah itu, sebanyak 18 ekor udang tiap akuarium dipelihara kembali untuk dilakukan uji resistensi terhadap IMNV. Infeksi IMNV dilakukan dengan menginjeksikan hasil ekstraksi tubuh udang yang positif terinfeksi berdasarkan pengamatan gejala klinis dan hasil analisis PCR. Sampel udang yang positif terinfeksi IMNV didapatkan dari Balai Pengembangan Budidaya Air Payau (BPBAP) Situbondo, Jawa Timur dan diekstrak berdasarkan Escobedo et al. (2006) (Lampiran 4). Udang yang diinfeksi IMNV pada masing-masing akuarium, sebanyak 15 ekor digunakan untuk pengukuran parameter sintasan dan gejala klinis serta 3 ekor untuk pengukuran parameter imunitas. Selama waktu pengamatan, udang diberi pakan kontrol dengan metode dan frekuensi yang sama seperti saat perlakuan. Resirkulasi air, aerasi dan penyifonan tetap dilakukan untuk mempertahankan kualitas air. 15 3.2.4.5 Pengujian Resistensi Udang Vaname terhadap Infeksi IMNV Uji ini dilakukan untuk mengevaluasi kinerja sinbiotik dalam meningkatkan resistensi udang vaname yang diinfeksi IMNV. Pengujian terdiri dari lima perlakuan dengan tiga ulangan, sebagai berikut: Kontrol (-) : Udang vaname diberi pakan komersil dan diinjeksi PBS. Kontrol (+) : Udang vaname diberi pakan komersil dan diinfeksi IMNV. Pro+Pre 1% : Udang vaname diberi pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 1% serta diinfeksi IMNV. Pro+Pre 2% : Udang vaname diberi pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 2% serta diinfeksi IMNV. Pro+Pre 3% : Udang vaname diberi pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 3% serta diinfeksi IMNV. Udang diberi pakan perlakuan setiap hari selama 30 hari. Infeksi IMNV dilakukan melalui injeksi sebanyak 0,1 ml per ekor udang. Pengamatan dilakukan selama 10 hari setelah infeksi. Parameter yang diamati meliputi sintasan (SR) dan gejala klinis yang diukur pada akhir pengamatan, serta parameter imunitas (total hemosit dan aktivitas phenoloxidase) pada awal (hari ke 0 sebelum infeksi), tengah dan akhir pengamatan (hari ke 5 dan ke 10 setelah infeksi). Tahapan dan waktu kegiatan uji resistensi udang vaname terhadap IMNV dijelaskan pada Lampiran 5. a. Pengambilan Sampel Hemolimph Hemolimph diambil dari ventral sinus pada pangkal kaki renang pertama dengan menggunakan syringe 1 ml yang telah dibilas dan diisi antikoagulan sebanyak 200 µl. Hemolimph yang terkumpul kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf 2 ml dan dicatat volumenya sebagai faktor pengencer pada perhitungan nilai total hemosit dan aktivitas phenoloxidase. Untuk mengawetkan sampel hemolimph selama pengukuran parameter imunitas, sampel disimpan di dalam cool box yang telah diisi dengan batu es. b. Sintasan (SR) Sintasan udang dihitung dengan menggunakan rumus berikut: SR = (Nt / No) x 100 % Keterangan : Nt : Jumlah udang yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No : Jumlah udang pada awal pengamatan (ekor) c. Gejala Klinis Gejala klinis yang timbul pada udang dapat menunjukkan tingkat infeksi dari IMNV tersebut. Data gejala klinis yang dihasilkan berupa kualitatif (deskriptif) dan kemudian dibuat semi kuantitatif dengan cara skoring. 16 Pengelompokan gejala klinis ditentukan berdasarkan Hasan (2011) dengan sedikit modifikasi (Tabel 4 dan Gambar 9) Tabel 4 Level 1 2 3 4 Pengelompokan tingkat infeksi IMNV terhadap udang vaname berdasarkan gejala klinis yang muncul Gejala Klinis Tingkat Infeksi Ringan Terinfeksi tanpa gejala klinis Sedikit warna putih lebam di dalam jaringan di Sedang beberapa segmen abdomen Sebagian besar jaringan abdomen berwarna Berat putih lebam Bagian abdomen dari arah ekor berwarna merah Sangat berat (jaringan mati) 1 2 3 4 Gambar 9 Gejala klinis udang yang terinfeksi IMNV. Angka menunjukkan tingkat infeksi ringan (1), sedang (2), berat (3), dan sangat berat (4) d. Total Hemosit Pengukuran total hemosit (THC) dilakukan berdasarkan metode Blaxhall dan Daishley (1973). Hemolimph sebanyak 0,1 ml yang sudah ditambahkan antikoagulan, dihitung dengan menggunakan hemasitometer pada mikroskop perbesaran 400 kali. Perhitungan nilai THC dijelaskan di Lampiran 6. 17 e. Aktivitas Phenoloxidase (PO) Pengukuran PO dilakukan berdasarkan Liu dan Chen (2004). Aktivitas PO diukur berdasarkan formasi dopachrome yang dihasilkan oleh L-DOPA. Hemolimph yang sudah dicampur dengan antikoagulan sebanyak 1 ml disentrifus (1.500 rpm; suhu 4 oC) selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet disuspensikan kembali secara perlahan ke dalam 1 ml larutan cacodylatecitrate buffer, selanjutnya disentrifus kembali. Pelet diambil dan disuspensikan dalam 200 μl cacodylate-citrate buffer. Suspensi sel sebanyak 100 μl diinkubasi dengan 50 μl trypsin (1 mg ml-1 cacodylate-citrate buf

Dokumen baru

Tags

Dokumen yang terkait

Pengaruh Aplikasi Probiotik Terhadap Kualitas Air Dan Pertumbuhan Udang Litopenaeus vannamei
11
111
54
PT. South Pacific Viscose General Terms and Conditions for Sale INDONESIAN 2015
0
10
9
Analisis Genetik Sifat Ketahanan Melon (Cucumis melo L.) terhadap Virus Kuning Genetic Analysis on Resistance of Melon (Cucumis melo L.) to Yellow Virus
0
0
8
KNO3 Application Affect Growth and Production of Amorphophallus muelleri Blume
0
1
7
Agency for The Assessment and Application of Technology
0
3
144
RANGSANGAN PERKEMBANGAN OVARI UDANG PUTIH, Litopenaeus vannamei DENGAN PENYUNTIKAN ESTRADIOL-17βββββ
0
0
10
Infectious Bronchitis Vaccination Protocols for Laying Hens
0
0
6
Chaetoceros ceratosporum Diatomae in Feed Formula To Increase Growth and Post Larvae Immunity of Tiger Shrimp (Penaeus monodon Fab.) to Vibrio harveyi infection
0
0
6
Dried Skeletonema costatum in Feed Formulation for the Growth of Vaname Shrimp (Litopenaeus vannamei)
0
0
5
Effect of Maintenance at Different Salinity against White Spot Syndrome Virus (WSSV) Infection Level in Post Larvae Litopenaeus vannamei Shrimp
0
0
7
PERFORMANSI FISIOLOGIS UDANG VANAME, Litopenaeus vannamei YANG DIPELIHARA PADA MEDIA AIR TAWAR DENGAN APLIKASI KALIUM
0
1
17
Effect of 17β-Estradiol on Feminization, Growth Rate and Survival Rate of Pasific White Shrimp (Litopenaeus vannamei, Boone 1931) Postlarvae
0
0
6
Cyanobacteria Community Dynamics and Trophic Status of Intensive Shrimp ( Litopenaeus vannamei ) Farming Pond in Situbondo, East Java Indonesia
0
0
7
Load and Resistance Factor Design (LRFD) for Highway Bridge Substructures
0
0
592
JavaScript Essentials for SAP ABAP Developers A Guide to Mobile and Desktop Application Development pdf pdf
0
0
176
Show more