Feedback

Stabilitas dan Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur Lactobacillus plantarum terhadap pH Alkali

Informasi dokumen
ABSTRACT Stability and Antimicrobial Activity of Plantaricin Produced by Lactobacillus plantarum at Alkaline pH Supriatna, D., I. I. Arief, and Jakaria Plantaricin produced by L. plantarum is known to display an adaptive response to alkali stress that enhances its capacity to more effectively stable at alkali condition. The aim of the research was to examine the stability of plantaricin produced by L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 and 2C12 and its antimicrobial activity at alkaline pH. The experiment was done based on completely randomized design (CRD) with factorial arrangement 2 x 4, two levels of pH value and four levels of L. plantarum strains in three replications. Variables analyzed were protein concentration, inhibition zone of the antagonistic test was assayed by agar well diffusion and antimicrobial activity of plantaricin against indicator bacteria at alkaline pH. Plantaricin was found to be sensitive to alkaline treatment. No interaction between pH and strains of L. plantarum to antimicrobial activity of plantaricin (P>0.05). Plantaricin showed antimicrobial activity against Gram positif and Gram negatif bacteria including S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 and B. cereus. Plantaricin produced by L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 and 2C12 was stable at alkaline pH but the stability of plantaricin decreased because of alkaline treatment to S. typhimurium ATCC 14028 (P7,0 8,5 8,6 10,0 Sumber: Sperber (2009). Konsumsi terhadap produk pangan alkali sangat bermanfaat untuk menjaga keseimbangan pH tubuh, menjaga kesehatan tulang dan menurunkan resistensi tubuh terhadap penyakit kronis, seperti hipertensi dan stroke (Schwalfenberg, 2012). 11 MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Terpadu, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2011 hingga Oktober 2011. Materi Bahan-bahan utama yang digunakan adalah kultur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12, koleksi Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan IPB. Bakteri indikator yang digunakan untuk uji antagonistik adalah S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus. Media yang digunakan yaitu de Man Rogosa and sharpe agar (MRSA), de Man Rogosa and shrape broth (MRSB), yeast extract, nutrien agar (NA), nutrient broth (NB), Mueller Hinton agar (MHA), amonium sulfat, membran saring Sartorius, buffer kalium fosfat pH 6,8 (campuran KH2PO4 dan K2HPO4), resin SP SepharoseTM fast-flow, kristal violet, larutan lugol iodin, safranin, etanol 95%, NaOH 1 N, HCl 1 N dan larutan Mc. Farland no. 0,5. Larutan pengencer yang digunakan adalah NaCl 0,85% dan akuades. Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, jarum Ose, autoclave, waterbath, cawan petri, timbangan, cooling box, gelas objek, gelas ukur, labu Erlenmeyer, mikro pipet, pipet Pasteur, pemanas Bunsen, sentrifuse, membran filter Millifore, alumunium foil, kapas, tip, botol Schott, ependorf, pH meter, kertas pH universal, jangka sorong digital, inkubator, oven, refrigerator, vortex, cork borer, mikroskop OPMIAS En Ver1.0 dan spektrofotometri UV-visible. Prosedur Penyegaran dan Pembiakan Kultur (Pelczar dan Chan, 2007) Penyegaran dilakukan dengan cara kultur L. plantarum dan bakteri indikator sebanyak 250 l diinokulasikan secara duplo pada media MRSB untuk kultur L. plantarum dan media NB untuk bakteri indikator sehingga dihasilkan kultur sebanyak 5 ml. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam untuk mendapatkan kultur antara. Sebanyak 1 ml kultur antara diinokulasikan kembali secara duplo pada media MRSB dan NB sehingga dihasilkan kultur sebanyak 10 ml. 12 Kultur diinkubasikan kembali sehingga didapatkan kultur kerja. Kultur kerja ditumbuhkan pada media MRSA untuk kultur L. plantarum dan NA untuk bakteri indikator, selanjutnya dihitung populasinya dan digunakan untuk pewarnaan Gram. Karakteristik Morfologi dan Pewarnaan Gram (Pelczar dan Chan, 2007) Kultur L. plantarum dan bakteri indikator yang tumbuh di media agar, diperikasa sifat morfologinya untuk mengetahui kemurniannya. Pengujian morfologi starter dengan bantuan pewarnaan Gram dan pengamatan dengan mikroskop pada perbesaran 1000 kali. Pengujian pewarnaan Gram dilakukan dengan cara kultur bakteri dioleskan pada gelas objek dengan jarum Ose dan difiksasi panas, kemudian ditetesi dengan kristal violet, dibiarkan selama ± 1 menit. Preparat selanjutnya dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan. Preparat yang sudah kering ditetesi dengan larutan lugol iodin dan didiamkan selama ± 1 menit, kemudian dibilas kembali dengan akuades dan preparat selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat selama ± 5 detik, dibilas kembali dengan akuades dan dikeringudarakan. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama ± 30 detik dan dibilas kembali dengan akuades, lalu preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diperiksa di bawah mikroskop. Bakteri dikelompokkan menjadi bakteri Gram positif, bila dapat mempertahankan zat warna ungu kristal dan tampak berwarna ungu tua. Kelompok bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah. Hasil pengamatan morfologi kultur bakteri didokumentasikan menggunakan perangkat lunak OPMIAS En Ver1.0 yang dihubungkan pada mikroskop. Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel Sebanyak empat galur L. plantarum masing-masing diinokulasikan ke media MRSB dan diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam. Supernatan bebas sel disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit suhu 4 °C yang selanjutnya disebut supernatan. Supernatan disaring dengan membran saring Sartorius 0,22 µm kemudian dinetralkan dengan NaOH 1 N sampai pH 5,8-6,2. Supernatan yang merupakan ekstrak kasar bakteriosin tersebut siap untuk diuji aktivitasnya dengan metode difusi sumur. 13 Produksi dan Purifikasi plantaricin Purifikasi bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen senyawa kimia yang dapat terpisah dan kandungan senyawa aktifnya. Purifikasi plantaricin terdiri dari purifikasi parsial menggunakan presipitasi amonium sulfat, dialisis dan kromatografi kolom. Purifikasi Parsial Menggunakan Amonium Sulfat (Gong et al., 2010) Sebanyak 1 liter media MRSB ditambahkan yeast extract 3% dan NaCl 1% diinokulasi dengan 10% (v/v) kultur L. plantarum, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 20 jam. Setelah itu, disimpan pada refrigerator suhu 4 oC selama 2 jam kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit suhu 4 o C. Setelah selesai dilakukan penyaringan dengan menggunakan membran saring Sartorius diameter 0.22 µm dan selanjutnya supernatan bebas sel dinetralkan pH-nya menjadi 5,8-6,2 dengan menggunakan NaOH 1 N. Supernatan netral bebas sel yang telah disaring steril ditambahkan serbuk amonium sulfat sebanyak 80% secara bertahap (20%, 40%, 60%, 80%) kemudian dihomogenkan dan distirer secara perlahan pada suhu 4 oC selama 2 jam. Hasil yang didapat pada tahap ini adalah presipitat bakteriosin. Pengecekan protein presipitat bakteriosin diamati menggunakan spektrofotometer UV-visible pada panjang gelombang 280 nm. Penggunaan padatan amonium sulfat (% penjenuhan) dapat dilihat pada Lampiran 18. Dialisis (Day dan Underwood, 2002) Dialisis dilakukan dengan tujuan untuk desalting atau menghilangkan garam amonium sulfat yang masih tercampur dengan presipitat bakteriosin. Buffer yang digunakan adalah buffer kalium fosfat pH 6,8 (campuran KH2PO4 dan K2HPO4 dengan konsentrasi tertentu) dengan perbandingan 1:1000 (satu bagian presipitat dan 1000 bagian buffer). Dialisis dilakukan dengan menggunakan membran dialisis diameter 20 µm pada buffer kalium fosfat selama 12 jam, dan dilakukan penggantian buffer sebanyak 2 kali (2 jam dan 4 jam) pada suhu 4 oC. Setelah selesai, didapatkan ekstrak plantaricin kasar. Pengecekan protein plantaricin kasar hasil dialisis diamati menggunakan spektrofotometri UV-visible pada panjang gelombang 280 nm. 14 Purifikasi Plantaricin Menggunakan Kromatografi Kolom (Hata et al., 2010) Tahap selanjutnya adalah kromatografi kolom untuk plantaricin murni. Resin yang digunakan adalah SP Sepharose TM menghasilkan -fast flow dengan kolom terbuka (open column) Econo-Column Bio-Rad. Purifikasi parsial plantaricin menggunakan kromatografi kolom dengan resin SP SepharoseTM-fast flow dapat meningkatkan spesifik protein dari supernatan bebas sel sebesar 253 AU/mg dan meningkat kembali pada proses kromatografi kolom menggunakan SP SepharoseTMfast flow menjadi 11.900 AU/mg. Buffer yang digunakan adalah buffer potasium fosfat pH 6,8. Kolom terlebih dahulu diisi dengan resin. Plantaricin kasar hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan, dan dibawah kolom diberikan tabung penampung eluat yang keluar dari kolom. Proses kromatografi dilakukan pada suhu 4 oC. Eluat pertama adalah buffer dan selanjutnya adalah sampel plantaricin kasar. Kecepatan alir yang diberikan adalah 0,8 ml/menit. Fraksi plantaricin murni yang diperoleh ditampung setiap 3 ml per tabung penampung eluat. Pengecekan protein plantaricin murni hasil kromatografi kolom diamati menggunakan spektrofotometer UV-visible pada gelombang 280 nm. Stabilitas Protein Plantaricin pada pH Alkali (Hata et al., 2010) Plantaricin murni hasil purifikasi parsial menggunakan kromatografi kolom, digunakan dalam pengujian stabilitas plantaricin terhadap pH alkali. Plantaricin murni hasil kromatografi kolom diuji stabilitasnya terhadap pH yang berbeda, yaitu 1) pH 7 dan 2) pH 9. Plantaricin murni perlakuan pH alkali dilakukan dengan menambahkan larutan NaOH 1 N menggunakan mikro pipet secara perlahan kemudian dicek kondisi pH plantaricin murni menggunakan kertas pH universal hingga pH 9. Pengujian stabilitas protein plantaricin murni setelah perlakuan pH alkali dilakukan dengan melakukan pengecekan protein plantaricin murni menggunakan spektrofotometer UV-visible pada panjang gelombang 280 nm. Uji Aktivitas Antimikrob Plantaricin pada Kondisi Alkali terhadap Bakteri Indikator (Savadogo et al., 2006) Plantaricin murni hasil kromatografi kolom diuji dengan menggunakan metode difusi sumur. Kultur bakteri indikator patogen dan pembusuk makanan sebanyak 106 cfu/ml yang berumur 24 jam dipipet ke dalam cawan petri dan 15 ditambahkan media konfrontasi MHA sebanyak ± 20 ml. Setelah agar dalam cawan mengeras, ditengah-tengah agar dibuat lubang sumur dengan menggunakan cork borer berdiameter 5 mm. Plantaricin murni sebanyak 50 l dipipet ke dalam lubang sumur kemudian cawan dilapisi kertas saring terlebih dahulu sebelum ditutup dan disimpan dalam refrigerator (suhu ± 10 oC) selama 2 jam untuk memberikan kesempatan plantaricin meresap ke dalam agar. Seluruh cawan yang berisi bakteri indikator (S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus) dan plantaricin murni asal empat galur L. plantarum diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Zona hambat yang terbentuk di sekitar sumur pada seluruh cawan diamati dan diukur diameternya dengan menggunakan jangka sorong. Diameter dari masing-masing zona hambat diukur sebanyak tiga kali di daerah yang berbeda yang kemudian hasilnya dirata-ratakan. Setiap pengujian diulang sebanyak tiga kali dan pada setiap ulangan dilakukan secara duplo (Gambar 1). Zona hambat yang diperoleh dikategorikan menurut daya hambatnya, dapat dilihat pada Tabel 5. Keterangan: A : Sumur untuk plantaricin murni (diameter 5 mm) C B A B : Zona hambat C : Koloni bakteri indikator Garis / / : Pengukuran diameter zona Gambar 1. Metode Pengukuran Diameter Zona Hambat Bakteri. Tabel 5. Kategori Zona Hambat Bakteri Zona Hambat Bakteri Kategori ≥ 20 mm Sangat kuat 10-20 mm Kuat 5-10 mm Sedang ≤ 5 mm Lemah Sumber: Davis dan Stout (1971). 16 Rancangan dan Analisis Data Rancangan dan analisis data pada penelitian ini meliputi identifikasi aktivitas antimikrob supernatan bebas sel asal galur L. plantarum, konsentrasi protein plantaricin pada masing-masing tahap produksi plantaricin, stabilitas dan aktivitas plantaricin terhadap perlakuan pH alkali. Identifikasi Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dengan faktor perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dan jenis bakteri indikator (S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus) dengan tiga ulangan. Peubah yang diamati yaitu diameter zona hambat supernatan netral bebas sel. Data dialisis secara deskriptif untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang diperoleh. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: Yij =  + αi + εij Keterangan: Yij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i galur L. plantarum dan ulangan ke-j (j= 1, 2, 3)  = Pengaruh rata-rata galur L. plantarum αi = Pengaruh level perlakuan ke-i dari level perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (i= 1, 2, 3, 4) εij = Pengaruh Galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j Produksi Plantaricin Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dengan faktor perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dengan tiga kali ulangan. Peubah yang diamati yaitu konsentrasi protein plantaricin pada masing-masing tahap produksi plantaricin. Data dialisis secara deskriptif untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang diperoleh. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: 17 Yij =  + αi + εij Keterangan: Yij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i galur L. plantarum dan ulangan ke-j (j= 1, 2, 3)  = Pengaruh rata-rata galur L. plantarum αi = Pengaruh level perlakuan ke-i dari level perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (i= 1, 2, 3, 4) εij = Pengaruh Galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j Stabilitas dan Aktivitas Plantaricin terhadap Perlakuan pH Alkali Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial 2 x 4. Faktor pertama adalah perbedaan pH (pH 7 dan pH 9), sedangkan faktor kedua adalah perbedaan galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dengan tiga ulangan. Peubah yang diamati adalah diameter zona hambat hasil uji antagonistik dari plantaricin dengan perlakuan pH berbeda dan plantaricin asal galur L. plantarum yang berbeda. Data diolah dengan analisis ragam (uji parametrik) atau analysis of variance (ANOVA). Setiap analisis ragam yang menunjukkan bahwa perlakuan berpengaruh nyata, maka dilanjutkan dengan uji Tukey. Apabila data tidak memenuhi analisis ragam maka dilanjutkan uji non parametrik (Kruskall-Wallis). Pembahasan secara deskriptif juga dilakukan untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang telah diperoleh. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk Keterangan: Yijk = variabel respon akibat pengaruh perlakuan pH pada taraf ke-i dan galur L. plantarum ke-j pada ulangan ke-k (K= 1, 2, 3) µ = nilai tengah umum αi = pengaruh taraf perlakuan pH ke-i terhadap diameter zona hambat (i= pH 7 dan pH 9) βj = pengaruh taraf perlakuan galur L. plantarum ke-j terhadap diameter zona hambat (j= L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) (αβ)ij = pengaruh interaksi antara perlakuan ke-i dengan ke-j εijk = pengaruh galat percobaan ke-i dan ke-j terhadap ulangan ke-k, k= 1, 2, 3 18 HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram Karakteristik morfologi L. plantarum yang telah didapat adalah Gram positif, berbentuk batang tunggal dan koloni berantai pendek. Karakteristik morfologi tersebut sesuai dengan Ray dan Bhunia (2008) bahwa L. plantarum tergolong bakteri Gram positif, berbentuk batang tunggal maupun rantai pendek. Pemeriksaan karakteristik kultur bakteri bertujuan untuk memastikan kemurnian kultur bakteri yang digunakan. Karakteristik morfologi yang diperoleh tersebut menunjukkan bahwa kultur homogen dan tidak tercemar, seperti yang diperoleh dalam penelitian sebelumnya (Hidayati, 2006; Permanasari, 2008). Karakteristik morfologi kelima bakteri indikator yang digunakan, antara lain P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus berbentuk batang. Buckle et al. (2007) menyatakan bahwa bakteri P. aeruginosa dan B. cereus memiliki morfologi berbentuk batang. Hasil karakteristik morfologi bakteri S. typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922 adalah berbentuk batang soliter maupun berkoloni sedangkan S. aureus ATCC 25923 berbentuk kokus dalam susunan tunggal maupun berkoloni seperti buah anggur. Ray dan Bhunia (2008) menyatakan bahwa S. typhimurium memiliki morfologi berbentuk batang lurus, E. coli berbentuk batang, sedangkan S. aureus berbentuk kokus, tetrad dan berpasangan seperti buah anggur. Bakteri secara umum dibedakan menjadi dua berdasarkan pewarnaan Gram, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Pewarnaan Gram merupakan suatu teknik pewarnaan secara mikroskopis untuk menentukan jenis bakteri sebagai bakteri Gram positif dan Gram negatif dan sering digunakan untuk pengujian kemurnian suatu bakteri. Teknik ini terdiri dari empat tahap, yaitu (a) tahap awal pewarnaan dengan kristal violet, (b) fiksasi dengan iodin, (c) dekolorisasi dengan etanol dan (d) pewarnaan dengan safranin. Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif tergantung pada komposisi dinding sel (Pelczar dan Chan, 2007). Hasil pewarnaan Gram terhadap kultur L. plantarum, serta bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dan B. cereus menunjukkan bahwa bakteri-bakteri tersebut tergolong dalam bakteri Gram positif. Hal ini disebabkan pada proses pewarnaan Gram, kultur L. plantarum serta bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dan B. cereus menyerap warna ungu yang berasal dari kompleks antara kristal violet dengan 19 iodin dan tetap mempertahankan warna ungu tersebut meskipun telah ditambahkan alkohol 95% dan zat warna safranin. Bakteri P. aeruginosa ATCC 27853, S. typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922, berdasarkan hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa ketiga bakteri ini tergolong dalam bakteri Gram negatif. Hal ini disebabkan ketiga bakteri tersebut tidak dapat mempertahankan warna ungu dari zat pewarna kristal violet saat ditambahkan alkohol 95% serta menyerap warna merah yang berasal dari safranin. Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif tergantung pada komposisi dalam dinding sel (Pelczar dan Chan, 2007). Dinding sel bakteri Gram positif sebagian besar terdiri dari lapisan peptidoglikan (90%). Pelczar dan Chan (2007) menyatakan bahwa bakteri Gram positif mempertahankan warna ungu disebabkan dinding sel mengalami dehidrasi ketika ditetesi alkohol, sehingga poripori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menurun. Keadaan ini membuat kompleks kristal violet dengan iodin tidak dapat keluar dari sel, akibatnya zat warna safranin tidak dapat masuk ke dalam dinding sel. Dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi dalam bentuk lipopolisakarida dan lipoprotein (Fardiaz, 1992). Lipida pada dinding sel bakteri Gram negatif akan larut oleh alkohol sehingga pori-pori mengembang dan menyebabkan kompleks kristal violet dengan iodin keluar dari sel, akibatnya dinding sel bakteri menjadi tidak berwarna. Dinding sel bakteri yang tidak berwarna tersebut akan menyerap zat warna safranin sehingga sel bakteri akan tampak berwarna merah ketika dilihat dibawah mikroskop (Pelczar dan Chan, 2007). Hasil pewarnaan Gram dan pengamatan morfologi dari kultur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 serta bakteri indikator secara mikroskopis dapat dilihat pada Tabel 6 dan 7. 20 Tabel 6. Karakteristik Isolat L. plantarum Isolat L. plantarum Pewarnaan Gram L. plantarum 1A5 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek L. plantarum 1B1 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek L. plantarum 2B2 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek L. plantarum 2C12 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek Morfologi Gambar Morfologi (Pembesaran 10x100) 21 Tabel 7. Karakteristik Isolat Bakteri Indikator Isolat Bakteri Indikator Pewarnaan Gram Morfologi E. coli ATCC 25922 Gram Negatif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek P. aeruginosa ATCC 27853 Gram Negatif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek S. typhimurium ATCC 14028 Gram Negatif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek B. cereus Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek S. aureus ATCC 25923 Gram Positif Bulat, bergerombol seperti buah anggur Gambar Morfologi (Pembesaran 10x100) Keterangan: Kultur Koleksi Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak Tahun 2011, Fakultas Peternakan IPB, ATCC; American Type Culture Collection 22 Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel Kondisi asam dalam supernatan bebas sel akan mengurangi kemampuan bakteriosin dalam menghambat bakteri indikator pada uji antagonistik. Oleh karena itu, supernatan bebas sel yang dihasilkan dinetralkan hingga mencapai kondisi pH 5,8-6,2. Produksi maksimum dari bakteriosin didapatkan pada kondisi pH 6,5 dari rentang pH 2 hingga pH 10, dan bakteriosin kehilangan aktivitas antimikrob pada pH 12 (Bhattacharya dan Arijit, 2010). Kondisi pH supernatan bebas sel asal L. plantarum, dapat dilihat pada Gambar 2. Nilai pH 6.50 5.50 4.50 3.50 2.50 1.50 pHawal awal pH pH netral pH netral 1A5 4,024.01 ± 0,04 6.11 6,11 ± 0,34 1B1 1B1 3.94 3,94 ± 0,11 5.87 5,87 ± 0,12 2B2 2B2 4.00 4,00 ± 0,02 6.17 6,17 ± 0,31 2C12 3,983.98 ± 0,01 6.04 6,04 ± 0,16 Galur L. plantarum Keterangan: pH awal pH netral = pH initial supernatan bebas sel = pH netral supernatan bebas sel setelah penambahan NaOH 1 N Gambar 2. Kondisi pH Supernatan Bebas Sel asal Galur L. plantarum pada Media MRSB dengan Yeast Extract (3%) dan NaCl (1%). Nilai pH supernatan bebas sel berkisar 3,94-4,02. Kondisi asam dari supernatan bebas sel ini disebabkan oleh adanya asam-asam organik yang terbentuk sebagai metabolit primer dari bakteri asam laktat yang akan menghambat pertumbuhan bakteri. Nilai pH supernatan bebas sel setelah penetralan berkisar 5,87-6,17. Asam organik rantai pendek, seperti asam asetat dan asam laktat merupakan metabolit primer dari supernatan bebas sel yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat (Fardiaz, 1992; Jay et al., 2005; Settanni dan Corsetti, 2008). Aktivitas antimikrob supernatan netral bebas sel diuji melalui aktivitasnya terhadap bakteri indikator. Hasil uji antagonistik supernatan netral bebas sel asal empat galur L. plantarum terhadap masing-masing bakteri indikator ditunjukkan dengan adanya diameter zona hambat disekitar sumur konfrontasi, dapat dilihat pada Tabel 8. 23 Tabel 8. Diameter Zona Hambat Supernatan Netral Bebas Sel asal Galur L. plantarum terhadap Bakteri Indikator Bakteri Indikator Supernatan Netral Bebas Sel asal Galur L. plantarum 1A5 1B1 2B2 2C12 --------------------------------- mm ------------------------------- E. coli 15,73 ± 0,31 15,22 ± 0,87 9,74 ± 1,36 10,93 ± 1,40 S. aureus 17,72 ± 1,27 16,21 ± 0,49 15,01 ± 1,54 10,46 ± 1,40 S. typhimurium 18,00 ± 0,64 13,09 ± 0,30 9,13 ± 0,64 14,55 ± 3,45 B. cereus 16,30 ± 1,42 15,02 ± 1,56 11,05 ± 0,39 7,46 ± 0,91 P. aeruginosa 16,86 ± 0,84 13,37 ± 0,96 13,50 ± 1,12 10,32 ± 0,92 Keterangan : Diameter lubang sumur (5 mm) termasuk kedalam diameter zona hambat Rataan diameter zona hambat dari masing-masing galur L. plantarum berbeda-beda. Perbedaan aktivitas hambat dikarenakan bakteriosin mempunyai aktivitas hambat terhadap bakteri spesifik, dan biasanya mempunyai hubungan kekerabatan (filogenik) serta tergantung pada perbedaan jenis dinding sel bakteri yang dihambat yang berpengaruh pada ketahanan suatu bakteri terhadap zat antimikrob (Usmiati et al., 2009). Rataan diameter zona hambat dari supernatan netral bebas sel berkisar 7,46-18,00 mm (Tabel 8). Rataan diameter zona hambat dari supernatan netral bebas sel termasuk dalam kategori kuat (Davis dan Stout, 1971). Supernatan netral bebas sel dari keempat galur L. plantarum mampu menghambat bakteri indikator. Hasil ini sama dengan yang diperoleh Omemu dan Faniran (2011) yang menyatakan bahwa supernatan netral bebas sel asal L. plantarum mampu menghambat bakteri patogen. Keempat galur L. plantarum mampu menghambat bakteri dari strain bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif seperti E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan S. typhimurium ATCC 14028, lebih tahan terhadap bakteriosin yang berasal dari L. plantarum karena komposisi dari membrannya berbeda dengan bakteri Gram positif. Hal ini berbeda dengan Drosinos et al. (2009) yang menyatakan bahwa bakteriosin asal L. plantarum hanya akan menghambat bakteri Gram positif atau bakteri-bakteri yang berkerabat dekat dengan spesies penghasil, serta tidak efisien dalam menghambat bakteri Gram negatif karena membran terluarnya bersifat hidrofilik dan dapat menghalangi aksi bakteriosin. Lebih lanjut Ray dan Bhunia (2008) menyatakan bahwa keberadaan lapisan luar 24 yang mengandung fosfolipida, protein, polisakarida, lemak dan substansi non permeabel akan mempengaruhi aktivitas antimikrob bakteriosin dalam menghambat bakteri Gram negatif. Bakteriosin asal L. plantarum dikarakterisasi sebagai kompleks protein, sangat sensitif terhadap perubahan pH lingkungan. Perubahan pH lingkungan berpengaruh terhadap bakteriosin yang dihasilkan, selain pengaruh nutrien dan temperatur (Todorov dan Dicks, 2005). Penurunan pH dalam bakteriosin asal L. plantarum akan mempengaruhi susunan protein dari bakteriosin tersebut, sehingga mempengaruhi aktivitas penghambatan senyawa antimikrob yang dihasilkan. Oleh karena itu, supernatan netral bebas sel yang diperoleh perlu dilakukan tahap lanjutan berupa purifikasi parsial. Purifikasi Parsial Plantaricin Hasil kuantitatif kadar protein dari setiap tahapan purifikasi parsial plantaricin menggunakan amonium sulfat, dialisis, dan purifikasi parsial menggunakan kromatografi kolom dari masing-masing galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12, dapat dilihat pada Gambar 3. Secara deskriptif, hasil kuantitatif ini menunjukkan bahwa rataan konsentrasi protein yang dihasilkan oleh galur L. plantarum 1A5, 1B1, dan 2B2 merupakan nilai yang lebih tinggi dibandingkan dengan galur L. plantarum 2C12. Rataan kadar protein plantaricin kasar dari galur L. plantarum menunjukkan terjadinya peningkatan dari presipitat bakteriosin menjadi plantaricin kasar kecuali galur L. plantarum 2C12. Ekstrak plantaricin kasar dari keempat galur L. plantarum menunjukkan jenis protein yang hidrofobik karena posisi endapan protein yang terpresipitasi berada melayang di bagian atas supernatan bebas sel. Abo-Amer (2007) menyatakan hal ini sebagai karakteristik protein yang hidrofobik terhadap plantaricin AA135 yang dihasilkan oleh L. plantarum AA135. Karakteristik protein hidrofobik dari ekstrak plantaricin kasar sangat diperlukan untuk aktivitasnya dalam menghambat bakteri karena penghambatan oleh plantaricin tergantung pada interaksi hidrofobik antara sel-sel bakteri dengan molekul-molekul plantaricin (Parada et al., 2007). Lebih lanjut Jack et al. (2005) menyatakan bahwa interaksi antara molekulmolekul kationik dari plantaricin dengan polimer-polimer anionik di permukaan sel bakteri akan menyebabkan destabilisasi fungsi dari membran sitoplasma sel bakteri, 25 berupa peningkatan permeabilitas membran sehingga mengganggu keseimbangan Konsentrasi Protein (mg/ml) barier dan akan mengakibatkan kematian sel bakteri. 160 140 120 100 80 60 40 20 0 PresipitatBakteriosin Bakteriosin Presipitat Plantaricin Kasar Plantaricin Kasar Plantaricin Murni Plantaricin Murni 1A5 1A5 24.08 24,08 ± 12,40 56.65 56,65 ± 25,18 46.53 46,53 ± 18,22 1B1 1B1 24.61 24,61 ± 12,57 71.19 71,19 ± 30,95 158.74 158,74 ± 45,06 2B2 2B2 15.62 15,62 ± 6,85 44.59 44,59 ± 20,97 103.88 103,88 ± 30,39 2C12 2C12 3.41 3,41 ± 0,46 0.96 0,96 ± 0,36 13.31 13,31 ± 2,24 Galur L. plantarum Keterangan: Presipitat Bakteriosin = Hasil Purifikasi Parsial dengan Amonium Sulfat Plantaricin Kasar = Hasil Dialisis Plantaricin = Hasil Purifikasi Parsial dengan Kromatografi Kolom Gambar 3. Konsentrasi Protein pada Tahap Purifikasi Parsial Plantaricin asal Galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12). Kadar protein plantaricin meningkat kembali setelah proses purifikasi menggunakan kromatografi kolom dari plantaricin kasar menjadi plantaricin murni, kecuali galur L. plantarum 1A5. Rataan konsentrasi protein plantaricin murni dari yang terbesar berturut-turut adalah galur L. plantarum 1B1, 2B2, 1A5 dan 2C12. Stabilitas Protein Plantaricin terhadap pH Alkali Pengujian stabilitas plantaricin dari keempat galur L. plantarum terhadap pH alkali secara in vitro dilakukan pada pH 9, menunjukkan tingkat kesensitifan yang tinggi pada plantaricin yang diproduksi oleh keempat galur L. plantarum. Hubungan antara kondisi pH lingkungan dengan konsentrasi protein plantaricin dari keempat galur L. plantarum, dapat dilihat pada Gambar 4. 26 Konsentrasi Protein (mg/ml) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 pH pH 7 7 pH 9 pH 9 1A5 1A5 46.53 46,53 ± 18,22 41.71 41,71 ± 14,38 1B1 1B1 158.74 158,74 ± 45,06 99.84 99,84 ± 28,34 2B2 2B2 103.88 103,88 ± 30,39 69.42 69,42 ± 19,95 2C12 2C12 13.31 13,31 ± 2,24 9.78 9,78 ± 0,84 Plantaricin asal Galur L. plantarum Keterangan: pH 7 =Plantaricin tanpa Perlakuan pH Alkali (kontrol) pH 9 =Plantaricin dengan Perlakuan pH Alkali Gambar 4. Konsentrasi Protein Plantaricin asal Galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) terhadap pH Alkali. Peningkatan pH lingkungan dalam plantaricin dari pH 7 ke pH 9 menurunkan konsentrasi protein plantaricin dari masing-masing galur L. plantarum (Gambar 4). Hal ini menunjukkan adanya pengaruh pH alkali terhadap jumlah protein dalam plantaricin. Kemampuan suatu senyawa antimikrob dalam menghambat pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain pH, waktu penyimpanan, suhu lingkungan, sifat-sifat mikroba (jenis, konsentrasi, umur dan keadaan mikroba), jenis dan jumlah senyawa di dalamnya (Fardiaz, 1992). Rataan persentase penurunan konsentrasi protein plantaricin dari L. plantarum 1A5 sebesar 5%, plantaricin L. plantarum 1B1 sebesar 22%, plantaricin L. plantarum 2B2 sebesar 36%, serta plantaricin L. plantarum 2C12 sebesar 27% (Lampiran 19). Meskipun plantaricin dari keempat galur L. plantarum mengalami penurunan konsentrasi protein, plantaricin dari keempat galur L. plantarum tersebut memiliki ketahanan yang cukup baik terhadap pH alkali dibuktikan dengan persentase penurunan protein sebesar
Stabilitas dan Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur Lactobacillus plantarum terhadap pH Alkali
Aktifitas terbaru
Penulis
Dokumen yang terkait
Upload teratas

Stabilitas dan Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur Lactobacillus plantarum terhadap pH Alkali

Gratis