Stabilitas dan Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur Lactobacillus plantarum terhadap pH Alkali

 1  7  110  2017-05-18 15:55:48 Report infringing document
ABSTRACT Stability and Antimicrobial Activity of Plantaricin Produced by Lactobacillus plantarum at Alkaline pH Supriatna, D., I. I. Arief, and Jakaria Plantaricin produced by L. plantarum is known to display an adaptive response to alkali stress that enhances its capacity to more effectively stable at alkali condition. The aim of the research was to examine the stability of plantaricin produced by L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 and 2C12 and its antimicrobial activity at alkaline pH. The experiment was done based on completely randomized design (CRD) with factorial arrangement 2 x 4, two levels of pH value and four levels of L. plantarum strains in three replications. Variables analyzed were protein concentration, inhibition zone of the antagonistic test was assayed by agar well diffusion and antimicrobial activity of plantaricin against indicator bacteria at alkaline pH. Plantaricin was found to be sensitive to alkaline treatment. No interaction between pH and strains of L. plantarum to antimicrobial activity of plantaricin (P>0.05). Plantaricin showed antimicrobial activity against Gram positif and Gram negatif bacteria including S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 and B. cereus. Plantaricin produced by L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 and 2C12 was stable at alkaline pH but the stability of plantaricin decreased because of alkaline treatment to S. typhimurium ATCC 14028 (P<0.01). Stability of plantaricin after alkaline treatment showed plantaricin potentially could be used as biopreservative on alkali products. Keywords: Lactobacillus plantarum, alkaline pH, plantaricin, biopreservative. iii PENDAHULUAN Latar Belakang Produk pangan alkali banyak terdapat di buah, sayuran dan beberapa produk pangan asal ternak, seperti albumin telur. Nilai pH produk pangan alkali berkisar 7,210. Konsumsi terhadap produk pangan alkali sangat bermanfaat bagi kesehatan, yakni untuk menjaga keseimbangan pH tubuh dan menurunkan resistensi tubuh terhadap penyakit kronis, seperti hipertensi, kanker dan stroke. Bakteri patogen dalam produk pangan alkali dapat menyebabkan kerusakan produk, menurunkan daya simpan produk serta beresiko terhadap kesehatan apabila dikonsumsi. Senyawa antimikrob alami yang stabil pada pengolahan produk pangan alkali sangat diperlukan untuk dapat mengontrol pertumbuhan bakteri patogen dalam produk pangan alkali sehingga dapat memperpanjang masa simpan produk. Bakteri asam laktat menghasilkan suatu senyawa antimikrob yang disebut bakteriosin. Bakteriosin ini sangat efektif untuk digunakan sebagai biopreservatif menggantikan bahan pengawet sintesis lainnya. Oleh karena itu, bahan pengawet alami lebih berpotensi untuk diaplikasikan sebagai pengganti bahan pengawet sintetis karena tidak mengandung toksin, dapat didegradasi oleh enzim-enzim pencernaan serta lebih aman untuk dikonsumsi. Bakteriosin dari makanan yang berhubungan dengan bakteri asam laktat telah diidentifikasi, contohnya plantaricin. Plantaricin merupakan salah satu jenis bakteriosin yang diproduksi oleh L. plantarum. Arief et al. (2008) telah berhasil melakukan isolasi terhadap L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 yang berasal dari daging sapi lokal Indonesia, menghasilkan suatu senyawa antimikrob yang diidentifikasi awal sebagai plantaricin. Penelitian terhadap senyawa antimikrob yang berpotensi untuk digunakan sebagai biopreservatif khususnya untuk tipe pengolahan produk pangan alkali perlu dilakukan, sehingga penelitian terhadap plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 perlu diuji karakteristik stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin pada bakteri indikator terhadap pH alkali. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 pada bakteri indikator terhadap pH alkali. TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Asam Laktat Bakteri Asam Laktat (BAL) erat kaitannya dengan proses fermentasi pangan, dan saat ini telah berkembang dalam industri pangan fermentasi. BAL sering ditemukan secara alamiah dalam bahan pangan. Bakteri ini secara luas terdistribusi pada susu, daging segar, sayuran, serta produk-produk lainnya. Peranan utama BAL adalah sebagai kultur starter produk-produk yang melibatkan proses fermentasi untuk memperoleh produk akhir dengan konsistensi tinggi, menstabilkan produk-produk sehingga diperoleh cita rasa yang spesifik serta untuk mengawetkan produk yang diinginkan (Smid dan Gorris, 2007). Selain itu, Leverentz et al. ( 2006) menyebutkan bahwa BAL merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat digunakan dalam mengontrol pertumbuhan bakteri patogen dalam bahan pangan karena mampu menurunkan pH dan menghasilkan bakteriosin. BAL mempunyai karakteristik morfologi, fisiologi dan metabolit tertentu. Deskripsi secara umum dari bakteri ini adalah termasuk dalam bakteri Gram positif, tidak berspora, berbentuk bulat maupun batang dan menghasilkan asam laktat sebagai mayoritas produk akhir selama memfermentasi karbohidrat (Axelsson, 2004). Lebih lanjut dinyatakan oleh Jay (1998) BAL bersifat mesofilik dan termofilik, beberapa dapat tumbuh pada suhu 5 oC dan tertinggi 45 oC, dapat bertahan pada pH 1,2-9,6 dan beberapa hanya dapat tumbuh pada kisaran pH yang sempit (pH 4,0-4,5). Bakteri ini termasuk mikroorganisme GRAS (Generally Recognized as Safe) atau golongan mikroorganisme yang aman ditambahkan dalam makanan karena sifatnya yang tidak toksik dan tidak menghasilkan toksin, yang dikenal dengan sebutan “food grade microorganism”, yaitu mikroorganisme yang tidak beresiko terhadap kesehatan (Alakomi et al., 2000). BAL terbagi dalam 8 genus antara lain Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium, dan Corinebacterium. Berdasarkan tipe fermentasinya, BAL terbagi menjadi homofermentatif dan heterofermentatif. Kelompok homofermentatif menghasilkan asam laktat sebagai produk utama dari fermentasi gula sedangkan kelompok heterofermentatif menghasilkan asam laktat dan senyawa lain yaitu CO2, etanol, asetaldehida, diasetil serta senyawa lainnya (Fardiaz, 1992). 2 Lactobacillus Lactobacillus merupakan bakteri Gram positif, tidak menghasilkan spora, biasanya tidak bergerak, anaerob fakultatif, katalase negatif, koloninya dalam media agar berukuran 2-5 mm, konfeks, opak, sedikit transparan, tidak berpigmen dan metabolit utamanya adalah asam laktat. Tumbuh baik pada suhu 25-40 oC dan tersebar luas di lingkungan terutama dalam produk-produk pangan asal hewan dan sayuran. Bakteri ini menetap dalam saluran pencernaan unggas dan mamalia (Ray dan Bhunia, 2008). Lactobacillus dibagi menjadi tiga grup, disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Grup Spesies Lactobacillus sp Karakteristik Fermentasi karbohidrat Grup I Homofermentatif Grup II Fakultatif heterofermentatif Grup III Heterofermentatif Produk akhir fermentasi karbohidrat Laktat Laktat, asetat, etanol, CO2, format Laktat, asetat, etanol, CO2 Contoh spesies L. delbrueckii ssp. delbrueckii, bulgaricus, lactis L. leichmannii L. acidophilus L. elveticus L. brevis L. sanfrancisco L. reuteri L. casei ssp. casei, rhamnosus, pseudoplantarum L. plantarum L. curvatus L. sake L. fermentum L. divergens L. kefir L. confuses Sumber: Ray dan Bhunia (2008). Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 L. plantarum termasuk bakteri dalam filum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo Lactobacillales, family Lactobacillaceae dan genus Lactobacillus. L. plantarum mempunyai kemampuan untuk menghambat mikroorganisme patogen pada bahan pangan dengan daerah penghambatan terbesar dibandingkan dengan bakteri asam laktat lainnya (Syahniar, 2009). L. plantarum tergolong dalam bakteri Gram positif, berbentuk batang tunggal maupun rantai pendek, tidak berspora, katalase negatif, dan anaerob fakultatif (Ray dan Bhunia, 2008). L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 merupakan isolat BAL yang diisolasi dari daging sapi lokal Indonesia, peranakan Ongole. Galur L. plantarum 1A5, 1B1, 3 2B2 dan 2C12 mampu bertahan dalam media NaCl 6,5%, tumbuh pada suhu 15 oC, tumbuh baik pada 37 oC dan 45 oC, dan tahan pada kondisi usus (pH 7,2) dan bertahan hidup lebih baik pada pH 2 (Wijayanto, 2009). Senyawa Antimikrob Senyawa antimikrob dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan mikroba), fungisidal (membunuh kapang), fungistatik (menghambat pertumbuhan kapang) dan germisidal (menghambat germinasi spora bakteri). Kemampuan suatu zat antimikrob dalam menghambat pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain konsentrasi zat pengawet, waktu penyimpanan, suhu lingkungan, sifat-sifat mikroba (jenis, konsentrasi, umur dan keadaan mikroba), sifat-sifat fisik dan kimia makanan, termasuk kadar air, pH, jenis dan jumlah senyawa di dalamnya (Fardiaz, 1992). Metabolit-metabolit bakteri asam laktat yang berfungsi sebagai senyawa antimikrob antara lain asam organik (asam laktat dan asam asetat), bakteriosin, hidrogen peroksida, diasetil, CO2 dan semua metabolit yang mempunyai aktivitas antimikrob (Fardiaz, 1992; Jay et al., 2005; Settanni dan Corsetti, 2008). Asam Organik Penghambatan pertumbuhan pada mikroba oleh asam organik diakibatkan adanya akumulasi anion. Anion menyebabkan berkurangnya kecepatan dari sintesis makromolekul dan mempengaruhi transportasi antar membran sel. Bakteri asam laktat dan juga bakteri lain meniadakan efek dari akumulasi anion dengan cara mengurangi pH pada sitoplasma (Ouwehand dan Vesterlund, 2004). Asam-asam organik yang dihasilkan oleh BAL mengakibatkan akumulasi produk akhir asam dan penurunan pH yang akan menghambat pertumbuhan bakteri baik Gram positif maupun bakteri Gram negatif. Turunnya pH internal menyebabkan terdenaturasinya protein dan kehilangan viabilitasnya (Ray, 1992). Bakteriosin BAL memproduksi komponen antimikrob, salah satunya bakteriosin. Kemampuan bakteriosin dalam melakukan aktivitasnya sebagai biopreservatif dicapai oleh efek penghambatannya terhadap mikroorganisme patogen yang berbahaya (Savadogo et al., 2006; Smid dan Gorris, 2007). 4 Bakteriosin adalah peptida-peptida yang diproduksi oleh sejumlah bakteri Gram positif dan Gram negatif (Aymerich et al., 2008). Bakteriosin yang diproduksi oleh BAL dapat didefinisikan sebagai protein aktif atau kompleks protein yang menunjukkan aksi bakterisidal melawan bakteri Gram positif, terutama spesies yang berkerabat dekat dengan spesies penghasil (Jack et al., 1995; Ray dan Bhunia, 2008; Parada et al., 2007). Penggunaan bakteriosin sebagai biopreservatif, perlu memperhatikan dan menentukan jumlah konsentrasi bakteriosin yang harus ditambahkan dalam produk pangan, dan efisiensi bakteriosin dalam mengontrol bakteri-bakteri patogen (Ananou et al., 2005). Beberapa bakteriosin yang telah berhasil dikarakterisasi, disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Bakteriosin asal L. plantarum yang Telah Berhasil Dikarakterisasi Spesies L. plantarum L. plantarum KLDS1.0391 Jenis Bakteriosin plantaricin MG L. plantarum A-1 plantaricin ASM1 "Jiaoke", Fermentasi krim Algerian Hata et al. (2010) L. plantarum OL15 plantaricin OL15 Fermentasi minyak zaitun Mourad et al. (2005) L. plantarum C19 plantaricin C19 Fermentasi mentimun Atrih et al. (2001) L. plantarum BFE 905 plantaricin D Salad Franz et al. (1998) L. plantarum 423 plantaricin 423 Sorgum Van Reenen et al. (1998) L. plantarum LL441 plantaricin C Keju Cabrales Gonzales et al. (1994) Asal Isolasi Industri Tortilla Literatur Gong et al. (2010) Hidrogen Peroksida BAL memproduksi H2O2 di bawah kondisi pertumbuhan aerob. BAL mengsekresikan H2O2 tersebut sebagai alat pelindung diri yang mampu bersifat bakteriostatik maupun bakterisidal. H2O2 merupakan salah satu agen pengoksidasi kuat, dapat dijadikan sebagai zat antimikrob melawan bakteri, fungi dan bahkan virus (Ray dan Bhunia, 2008). 5 Kemampuan H2O2 untuk mengoksidasi menyebabkan perubahan tetap pada sistem enzim sel mikroba sehingga digunakan sebagai antimikrob. Selain itu, senyawa ini juga dapat terdekomposisi menjadi air dan oksigen. Kemampuan bakterisidal dari H2O2 tergantung pada pH, konsentrasi, suhu, waktu dan tipe serta jumlah mikroorganisme. Konsentrasi tertentu, spora bakteri ditemukan paling resisten terhadap H2O2, diikuti dengan bakteri Gram positif. Bakteri yang paling sensitif terhadap H2O2 adalah bakteri Gram negatif, terutama koliform (Ouwehand dan Vesterlund, 2004). Mekanisme Aksi Penghambatan oleh Bakteriosin Beberapa bakteriosin mempunyai sifat bakterisidal melawan beberapa strain dan spesies yang berelasi dekat tetapi beberapa dapat efektif melawan banyak strain dalam spesies dan genera yang berbeda. Namun, sel penghasil bakteriosin akan mengalami ketahanan terhadap bakteriosin yang dihasilkannya sendiri, disebabkan memperoleh ketahanan protein yang spesifik. Bakteriosin ini pada umumnya sangat efektif melawan sel dari bakteri Gram positif dan bakteri-bakteri lain yang kekerabatannya dekat. Bakteriosin asal BAL tidak efisien dalam menghambat bakteri Gram negatif karena membran terluarnya bersifat hidrofilik dan dapat menghalangi aksi bakteriosin. Membran sitoplasma dari mikroorganisme Gram negatif dikarakterisasi melalui keberadaan lapisan luar yang mengandung fosfolipida, protein, polisakarida, lemak, dan substansi non permeabel (Ray dan Bhunia, 2008). Aktivitas antimikrob bakteriosin merupakan interaksi awal antara molekulmolekul kationik dari bakteriosin dengan polimer-polimer anionik di permukaan sel, salah satunya adalah asam teikoat. Asam teikoat tersebut merupakan reseptor bakteriosin yang hanya dihasilkan oleh bakteri Gram positif. Selanjutnya, aksi bakterisidal dari bakteriosin melawan sel yang sensitif akan dihasilkan melalui destabilisasi fungsi dari membran sitoplasma, berupa peningkatan permeabilitas membran sehingga mengganggu keseimbangan barier dan dapat mengakibatkan kematian sel (Jack et al., 2005). Mekanisme lainnya antara lain perubahan aktivitas enzim, penghambatan germinasi spora dan inaktivasi pembawa anionik langsung membentuk pori-pori selektif dan non selektif (Ray dan Bhunia, 2008). 6 Pemurnian Protein Purifikasi Parsial Menggunakan Amonium Sulfat Penggunaan amonium sulfat dalam proses pemurnian protein telah banyak digunakan. Day dan Underwood (2002) menyatakan bahwa proses pengendapan merupakan awal proses pemurnian protein. Bahan yang biasa digunakan dalam mengendapkan protein dalam larutan adalah amonium sulfat. Amonium sulfat mampu membuka permukaan hidrofobik dari protein sehingga membentuk interaksi hidrofobik dan membentuk presipitat atau endapan protein (Walker, 2000). Proses pemurnian protein menggunakan amonium sulfat menghasilkan presipat yang masih tercemar dengan garam dari amonium sulfat sehingga dilakukan proses dialisis. Dialisis dapat menghilangkan pengotor-pengotor pada permukaan partikel protein (Day dan Underwood, 2002). Kromatografi Pertukaran Ion Proses kromatografi pertukaran ion menggunakan resin sebagai bahan yang dapat memurnikan protein. Day dan Underwood (2002) menyatakan bahwa resin pertukaran ion diperoleh dengan memasukkan gugus yang dapat diionisasi ke dalam matriks polimer. Secara komersial resin penukar ion terdiri dari resin penukar kation (bermuatan negatif) akan mengikat ion positif dan resin penukar anion (bermuatan positif) akan mengikat ion negatif. SP SepharoseTM merupakan salah satu penukar kation yang kuat dan merupakan kelompok sulfopropil yang stabil baik secara fisik maupun kimiawi (Wikstroms, 2002). Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan fisik, dimana komponenkomponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu lapisan stationer dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut disepanjang landasan stationer. Kromatografi pertukaran ion terdiri dari landasan stationer berupa padatan dan fasa bergerak berupa cairan (Day dan Underwood, 2002). Buffer yang digunakan dalam kromatografi penukar kation adalah buffer anion seperti asetat, barbiturat dan fosfat (Wilson, 2000). Protein tidak akan terikat pada resin penukar ion dan akan mengalir keluar kolom pada pH isoelektrik (pI). Protein akan bermuatan positif dan akan berikatan dengan penukar kation (SP Sepharose) ketika pH di bawah pH isoelektrik (pI). SP SepharoseTM mempunyai pH berkisar 4-13 (Wikstroms, 2002). 7 Mikroba Patogen pada Bahan Pangan Bakteri patogen dibedakan atas penyebab intoksikasi yaitu keracunan yang disebabkan oleh toksin yang dihasilkan bakteri patogen yang berkembang di dalam bahan makanan, sedangkan infeksi yaitu bakteri yang menghasilkan racun di dalam saluran pencernaan (Fardiaz, 1992). Bakteri secara umum dibedakan menjadi dua bagian berdasarkan sifat pewarnaan gram yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif tergantung pada komposisi dalam dinding sel. Dinding sel bakteri Gram positif sebagian besar terdiri dari lapisan peptidoglikan (90%) dan bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi pada dinding selnya dalam bentuk liposakarida dan lipoprotein (Fardiaz, 1992). Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif, disajikan pada Tabel 3. Tabel 3. Perbedaan Antara Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif Sifat Komposisi dinding sel Ketahanan terhadap antibiotik Penghambatan oleh pewarna basa Kebutuhan nutrien Ketahanana terhadap perlakuan fisik Bakteri Gram Positif lipida rendah (1-4%) lebih sensitif lebih dihambat relatif kompleks Gram Negatif lipida tinggi (11-12%) lebih tahan kurang dihambat kompleks sederhana lebih tahan kurang tahan Sumber: Buckle et al. (2007). Kelompok bakteri patogen yang bersifat Gram positif diantaranya Staphylococcus aureus, Listeria monocytigenes dan Bacillus cereus sedangkan bakteri yang bersifat Gram negatif diantaranya Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan Salmonella typhimurium. Staphylococcus aureus S. aureus termasuk famili Micrococcaceae, merupakan bakteri Gram positif, berbentuk kokus yang terdapat dalam bentuk tunggal, berpasangan tetrad atau kelompok, seperti buah anggur dengan diameter berkisar 0,5-1,5 µm, anaerob fakultatif, tidak bergerak, tidak berspora dan biasanya termasuk katalase positif (Ray dan Bhunia, 2008). Suhu optimum pertumbuhan S. aureus adalah 35-37 oC, suhu minimum 6,7 oC dan suhu maksimum 45,5 oC. Bakteri ini dapat tumbuh pada pH 8 4,0-9,8 dengan pH optimum sekitar 7,0-7,8. Hsieh et al. (1998) mencatat terjadinya peningkatan besar dalam sensitivitas S. aureus terhadap kation dan antimikrob pada kondisi pH alkali. Bacillus cereus B. cereus merupakan bakteri pembentuk spora tergolong dalam famili Bacillaceae. B. cereus adalah bakteri Gram positif berbentuk batang, bergerak, dapat membentuk spora, bersifat anaerobik fakultatif dan tersebar secara luas dalam tanah dan air. Kemampuan membentuk spora memungkinkan mikroorganisme ini tetap hidup pada pengolahan dengan pemanasan (Buckle et al., 2007). Ray dan Bhunia (2008), menyatakan bahwa sel bakteri ini sensitif terhadap pasteurisasi, namun sporanya dapat bertahan terhadap suhu tinggi. Suhu untuk pertumbuhan B. cereus berkisar 4-50 oC, dengan suhu optimum pertumbuhannya adalah 35-40 oC. Parameter pertumbuhan lainnya adalah bakteri ini dapat tumbuh pada pH 4,9-9,3 dengan aw minimum 0,95 serta konsentrasi NaCl adalah 10%. Torkar dan Matijasi (2003) menyatakan bahwa B. cereus stabil pada pH 3 hingga pH 10. Lebih lanjut, Padan et al. (2005) dalam penelitiannya menyatakan bahwa perubahan asam teikoat berkontribusi pada spesies Bacillus sp. pada pH alkali. Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa merupakan bakteri non-spora tergolong dalam famili Pseudomonadaceae. Pseudomonas merupakan salah satu jenis bakteri Gram negatif, berbentuk batang, berukuran 0,5-0,8 µm atau 1,5-3,0 µm, hampir semua strain adalah motil dengan flagela tunggal, oksidatif positif, suhu optimum pertumbuhan adalah 37-42 oC, aerob, tidak toleran terhadap penurunan aw serta tumbuh pada aw minimum 0,98, secara umum dapat ditemukan di tanah, air, di permukaan tanaman dan hewan. P. aeruginosa merupakan opportunistic pathogen, artinya bakteri ini akan menyerang kekebalan dari inangnya dan menyebabkan infeksi. Uji laboratorium terhadap P. aeruginosa menunjukkan bahwa bakteri ini tumbuh di media yang mengandung asam asetat sebagai sumber karbon dan amonium sulfat sebagai sumber nitrogen (Todar, 2009). Bakteri ini merupakan penyebab berbagai jenis kerusakan bahan pangan yang sebagian besar berhubungan dengan kemampuan spesies ini 9 dalam memproduksi enzim yang dapat memecah baik komponen lemak maupun protein dari bahan pangan (Buckle et al., 2007). Salmonella typhimurium Salmonella sp. merupakan kelompok bakteri Gram negatif dan merupakan bakteri patogen yang tidak diperkenankan ada dalam produk-produk pangan. Bakteri ini dapat tumbuh pada kisaran suhu 5-45 oC dengan suhu optimum 37 oC, pH optimum pertumbuhan adalah 6,5-7,5 (Portillo, 2000). Salmonella memiliki ketahanan panas yang tinggi pada pH 5,5 dan aw rendah. Salmonella berbentuk batang lurus, berukuran 0,7-1,5 µm x 2-5 µm, termasuk bakteri anaerob fakultatif dan biasanya dapat bergerak menggunakan flagela peritrikus. Salmonella dapat bergerak dengan metabolisme bersifat fakultatif anerob (Buckle et al., 2007). Bakteri Gram negatif seperti Salmonella sp., lebih tahan terhadap bakteriosin yang berasal dari BAL karena komposisi dari membrannya berbeda dengan mikroorganisme Gram positif (Ray dan Bhunia, 2008; Drosinos et al., 2009). Escherichia coli E. coli termasuk dalam famili Enterobacteriaceae merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk batang yang dengan ukuran 1,1-1,5 µm x 2,0-6,0 µm, soliter maupun berkoloni, anaerobik fakultatif dan katalase positif. E. coli dapat tumbuh optimum pada pH 7,0-7,5 dengan pH minimum 4,0 dan pH maksimum 8,5 (Fardiaz, 1992). Bakteri ini dapat tumbuh dalam kisaran suhu yang luas yaitu 1-45 °C (Pelczar dan Chan, 2007). Membran luar E. coli meningkatkan kelangsungan hidup bakteri ini dalam asam ekstrim, tetapi kelangsungan hidupnya berkurang di alkali ekstrim (Yohannes et al., 2005). Nilai pH Beberapa Produk Pangan Produk pangan terdiri atas produk pangan asam dan produk pangan alkali. Produk pangan asam merupakan produk pangan fermentasi yang mengandung asam, seperti seperti yogurt, sosis, keju, salami, dsb. Produk pangan alkali, seperti album telur (Sperber dan Doyle, 2009), natto dari kacang kedelai dan dadawa dari kacangkacangan (Wang dan Fung, 1996). Nilai pH olahan dari beberapa produk pangan dapat dilihat pada Tabel 4. 10 Tabel 4. Nilai pH Beberapa Produk Pangan Produk Pangan minuman bersoda keju cheddar daging giling susu ikan segar keju peram bubur jagung albumin telur nixtamalized corn Nilai pH 2,0 5,2 6,2 6,4 6,7 >7,0 8,5 8,6 10,0 Sumber: Sperber (2009). Konsumsi terhadap produk pangan alkali sangat bermanfaat untuk menjaga keseimbangan pH tubuh, menjaga kesehatan tulang dan menurunkan resistensi tubuh terhadap penyakit kronis, seperti hipertensi dan stroke (Schwalfenberg, 2012). 11 MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Terpadu, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2011 hingga Oktober 2011. Materi Bahan-bahan utama yang digunakan adalah kultur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12, koleksi Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan IPB. Bakteri indikator yang digunakan untuk uji antagonistik adalah S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus. Media yang digunakan yaitu de Man Rogosa and sharpe agar (MRSA), de Man Rogosa and shrape broth (MRSB), yeast extract, nutrien agar (NA), nutrient broth (NB), Mueller Hinton agar (MHA), amonium sulfat, membran saring Sartorius, buffer kalium fosfat pH 6,8 (campuran KH2PO4 dan K2HPO4), resin SP SepharoseTM fast-flow, kristal violet, larutan lugol iodin, safranin, etanol 95%, NaOH 1 N, HCl 1 N dan larutan Mc. Farland no. 0,5. Larutan pengencer yang digunakan adalah NaCl 0,85% dan akuades. Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, jarum Ose, autoclave, waterbath, cawan petri, timbangan, cooling box, gelas objek, gelas ukur, labu Erlenmeyer, mikro pipet, pipet Pasteur, pemanas Bunsen, sentrifuse, membran filter Millifore, alumunium foil, kapas, tip, botol Schott, ependorf, pH meter, kertas pH universal, jangka sorong digital, inkubator, oven, refrigerator, vortex, cork borer, mikroskop OPMIAS En Ver1.0 dan spektrofotometri UV-visible. Prosedur Penyegaran dan Pembiakan Kultur (Pelczar dan Chan, 2007) Penyegaran dilakukan dengan cara kultur L. plantarum dan bakteri indikator sebanyak 250 l diinokulasikan secara duplo pada media MRSB untuk kultur L. plantarum dan media NB untuk bakteri indikator sehingga dihasilkan kultur sebanyak 5 ml. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam untuk mendapatkan kultur antara. Sebanyak 1 ml kultur antara diinokulasikan kembali secara duplo pada media MRSB dan NB sehingga dihasilkan kultur sebanyak 10 ml. 12 Kultur diinkubasikan kembali sehingga didapatkan kultur kerja. Kultur kerja ditumbuhkan pada media MRSA untuk kultur L. plantarum dan NA untuk bakteri indikator, selanjutnya dihitung populasinya dan digunakan untuk pewarnaan Gram. Karakteristik Morfologi dan Pewarnaan Gram (Pelczar dan Chan, 2007) Kultur L. plantarum dan bakteri indikator yang tumbuh di media agar, diperikasa sifat morfologinya untuk mengetahui kemurniannya. Pengujian morfologi starter dengan bantuan pewarnaan Gram dan pengamatan dengan mikroskop pada perbesaran 1000 kali. Pengujian pewarnaan Gram dilakukan dengan cara kultur bakteri dioleskan pada gelas objek dengan jarum Ose dan difiksasi panas, kemudian ditetesi dengan kristal violet, dibiarkan selama ± 1 menit. Preparat selanjutnya dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan. Preparat yang sudah kering ditetesi dengan larutan lugol iodin dan didiamkan selama ± 1 menit, kemudian dibilas kembali dengan akuades dan preparat selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat selama ± 5 detik, dibilas kembali dengan akuades dan dikeringudarakan. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama ± 30 detik dan dibilas kembali dengan akuades, lalu preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diperiksa di bawah mikroskop. Bakteri dikelompokkan menjadi bakteri Gram positif, bila dapat mempertahankan zat warna ungu kristal dan tampak berwarna ungu tua. Kelompok bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah. Hasil pengamatan morfologi kultur bakteri didokumentasikan menggunakan perangkat lunak OPMIAS En Ver1.0 yang dihubungkan pada mikroskop. Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel Sebanyak empat galur L. plantarum masing-masing diinokulasikan ke media MRSB dan diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam. Supernatan bebas sel disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit suhu 4 °C yang selanjutnya disebut supernatan. Supernatan disaring dengan membran saring Sartorius 0,22 µm kemudian dinetralkan dengan NaOH 1 N sampai pH 5,8-6,2. Supernatan yang merupakan ekstrak kasar bakteriosin tersebut siap untuk diuji aktivitasnya dengan metode difusi sumur. 13 Produksi dan Purifikasi plantaricin Purifikasi bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen senyawa kimia yang dapat terpisah dan kandungan senyawa aktifnya. Purifikasi plantaricin terdiri dari purifikasi parsial menggunakan presipitasi amonium sulfat, dialisis dan kromatografi kolom. Purifikasi Parsial Menggunakan Amonium Sulfat (Gong et al., 2010) Sebanyak 1 liter media MRSB ditambahkan yeast extract 3% dan NaCl 1% diinokulasi dengan 10% (v/v) kultur L. plantarum, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 20 jam. Setelah itu, disimpan pada refrigerator suhu 4 oC selama 2 jam kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit suhu 4 o C. Setelah selesai dilakukan penyaringan dengan menggunakan membran saring Sartorius diameter 0.22 µm dan selanjutnya supernatan bebas sel dinetralkan pH-nya menjadi 5,8-6,2 dengan menggunakan NaOH 1 N. Supernatan netral bebas sel yang telah disaring steril ditambahkan serbuk amonium sulfat sebanyak 80% secara bertahap (20%, 40%, 60%, 80%) kemudian dihomogenkan dan distirer secara perlahan pada suhu 4 oC selama 2 jam. Hasil yang didapat pada tahap ini adalah presipitat bakteriosin. Pengecekan protein presipitat bakteriosin diamati menggunakan spektrofotometer UV-visible pada panjang gelombang 280 nm. Penggunaan padatan amonium sulfat (% penjenuhan) dapat dilihat pada Lampiran 18. Dialisis (Day dan Underwood, 2002) Dialisis dilakukan dengan tujuan untuk desalting atau menghilangkan garam amonium sulfat yang masih tercampur dengan presipitat bakteriosin. Buffer yang digunakan adalah buffer kalium fosfat pH 6,8 (campuran KH2PO4 dan K2HPO4 dengan konsentrasi tertentu) dengan perbandingan 1:1000 (satu bagian presipitat dan 1000 bagian buffer). Dialisis dilakukan dengan menggunakan membran dialisis diameter 20 µm pada buffer kalium fosfat selama 12 jam, dan dilakukan penggantian buffer sebanyak 2 kali (2 jam dan 4 jam) pada suhu 4 oC. Setelah selesai, didapatkan ekstrak plantaricin kasar. Pengecekan protein plantaricin kasar hasil dialisis diamati menggunakan spektrofotometri UV-visible pada panjang gelombang 280 nm. 14 Purifikasi Plantaricin Menggunakan Kromatografi Kolom (Hata et al., 2010) Tahap selanjutnya adalah kromatografi kolom untuk plantaricin murni. Resin yang digunakan adalah SP Sepharose TM menghasilkan -fast flow dengan kolom terbuka (open column) Econo-Column Bio-Rad. Purifikasi parsial plantaricin menggunakan kromatografi kolom dengan resin SP SepharoseTM-fast flow dapat meningkatkan spesifik protein dari supernatan bebas sel sebesar 253 AU/mg dan meningkat kembali pada proses kromatografi kolom menggunakan SP SepharoseTMfast flow menjadi 11.900 AU/mg. Buffer yang digunakan adalah buffer potasium fosfat pH 6,8. Kolom terlebih dahulu diisi dengan resin. Plantaricin kasar hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan, dan dibawah kolom diberikan tabung penampung eluat yang keluar dari kolom. Proses kromatografi dilakukan pada suhu 4 oC. Eluat pertama adalah buffer dan selanjutnya adalah sampel plantaricin kasar. Kecepatan alir yang diberikan adalah 0,8 ml/menit. Fraksi plantaricin murni yang diperoleh ditampung setiap 3 ml per tabung penampung eluat. Pengecekan protein plantaricin murni hasil kromatografi kolom diamati menggunakan spektrofotometer UV-visible pada gelombang 280 nm. Stabilitas Protein Plantaricin pada pH Alkali (Hata et al., 2010) Plantaricin murni hasil purifikasi parsial menggunakan kromatografi kolom, digunakan dalam pengujian stabilitas plantaricin terhadap pH alkali. Plantaricin murni hasil kromatografi kolom diuji stabilitasnya terhadap pH yang berbeda, yaitu 1) pH 7 dan 2) pH 9. Plantaricin murni perlakuan pH alkali dilakukan dengan menambahkan larutan NaOH 1 N menggunakan mikro pipet secara perlahan kemudian dicek kondisi pH plantaricin murni menggunakan kertas pH universal hingga pH 9. Pengujian stabilitas protein plantaricin murni setelah perlakuan pH alkali dilakukan dengan melakukan pengecekan protein plantaricin murni menggunakan spektrofotometer UV-visible pada panjang gelombang 280 nm. Uji Aktivitas Antimikrob Plantaricin pada Kondisi Alkali terhadap Bakteri Indikator (Savadogo et al., 2006) Plantaricin murni hasil kromatografi kolom diuji dengan menggunakan metode difusi sumur. Kultur bakteri indikator patogen dan pembusuk makanan sebanyak 106 cfu/ml yang berumur 24 jam dipipet ke dalam cawan petri dan 15 ditambahkan media konfrontasi MHA sebanyak ± 20 ml. Setelah agar dalam cawan mengeras, ditengah-tengah agar dibuat lubang sumur dengan menggunakan cork borer berdiameter 5 mm. Plantaricin murni sebanyak 50 l dipipet ke dalam lubang sumur kemudian cawan dilapisi kertas saring terlebih dahulu sebelum ditutup dan disimpan dalam refrigerator (suhu ± 10 oC) selama 2 jam untuk memberikan kesempatan plantaricin meresap ke dalam agar. Seluruh cawan yang berisi bakteri indikator (S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus) dan plantaricin murni asal empat galur L. plantarum diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Zona hambat yang terbentuk di sekitar sumur pada seluruh cawan diamati dan diukur diameternya dengan menggunakan jangka sorong. Diameter dari masing-masing zona hambat diukur sebanyak tiga kali di daerah yang berbeda yang kemudian hasilnya dirata-ratakan. Setiap pengujian diulang sebanyak tiga kali dan pada setiap ulangan dilakukan secara duplo (Gambar 1). Zona hambat yang diperoleh dikategorikan menurut daya hambatnya, dapat dilihat pada Tabel 5. Keterangan: A : Sumur untuk plantaricin murni (diameter 5 mm) C B A B : Zona hambat C : Koloni bakteri indikator Garis / / : Pengukuran diameter zona Gambar 1. Metode Pengukuran Diameter Zona Hambat Bakteri. Tabel 5. Kategori Zona Hambat Bakteri Zona Hambat Bakteri Kategori ≥ 20 mm Sangat kuat 10-20 mm Kuat 5-10 mm Sedang ≤ 5 mm Lemah Sumber: Davis dan Stout (1971). 16 Rancangan dan Analisis Data Rancangan dan analisis data pada penelitian ini meliputi identifikasi aktivitas antimikrob supernatan bebas sel asal galur L. plantarum, konsentrasi protein plantaricin pada masing-masing tahap produksi plantaricin, stabilitas dan aktivitas plantaricin terhadap perlakuan pH alkali. Identifikasi Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dengan faktor perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dan jenis bakteri indikator (S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus) dengan tiga ulangan. Peubah yang diamati yaitu diameter zona hambat supernatan netral bebas sel. Data dialisis secara deskriptif untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang diperoleh. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: Yij =  + αi + εij Keterangan: Yij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i galur L. plantarum dan ulangan ke-j (j= 1, 2, 3)  = Pengaruh rata-rata galur L. plantarum αi = Pengaruh level perlakuan ke-i dari level perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (i= 1, 2, 3, 4) εij = Pengaruh Galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j Produksi Plantaricin Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dengan faktor perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dengan tiga kali ulangan. Peubah yang diamati yaitu konsentrasi protein plantaricin pada masing-masing tahap produksi plantaricin. Data dialisis secara deskriptif untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang diperoleh. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: 17 Yij =  + αi + εij Keterangan: Yij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i galur L. plantarum dan ulangan ke-j (j= 1, 2, 3)  = Pengaruh rata-rata galur L. plantarum αi = Pengaruh level perlakuan ke-i dari level perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (i= 1, 2, 3, 4) εij = Pengaruh Galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j Stabilitas dan Aktivitas Plantaricin terhadap Perlakuan pH Alkali Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial 2 x 4. Faktor pertama adalah perbedaan pH (pH 7 dan pH 9), sedangkan faktor kedua adalah perbedaan galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dengan tiga ulangan. Peubah yang diamati adalah diameter zona hambat hasil uji antagonistik dari plantaricin dengan perlakuan pH berbeda dan plantaricin asal galur L. plantarum yang berbeda. Data diolah dengan analisis ragam (uji parametrik) atau analysis of variance (ANOVA). Setiap analisis ragam yang menunjukkan bahwa perlakuan berpengaruh nyata, maka dilanjutkan dengan uji Tukey. Apabila data tidak memenuhi analisis ragam maka dilanjutkan uji non parametrik (Kruskall-Wallis). Pembahasan secara deskriptif juga dilakukan untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang telah diperoleh. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk Keterangan: Yijk = variabel respon akibat pengaruh perlakuan pH pada taraf ke-i dan galur L. plantarum ke-j pada ulangan ke-k (K= 1, 2, 3) µ = nilai tengah umum αi = pengaruh taraf perlakuan pH ke-i terhadap diameter zona hambat (i= pH 7 dan pH 9) βj = pengaruh taraf perlakuan galur L. plantarum ke-j terhadap diameter zona hambat (j= L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) (αβ)ij = pengaruh interaksi antara perlakuan ke-i dengan ke-j εijk = pengaruh galat percobaan ke-i dan ke-j terhadap ulangan ke-k, k= 1, 2, 3 18 HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram Karakteristik morfologi L. plantarum yang telah didapat adalah Gram positif, berbentuk batang tunggal dan koloni berantai pendek. Karakteristik morfologi tersebut sesuai dengan Ray dan Bhunia (2008) bahwa L. plantarum tergolong bakteri Gram positif, berbentuk batang tunggal maupun rantai pendek. Pemeriksaan karakteristik kultur bakteri bertujuan untuk memastikan kemurnian kultur bakteri yang digunakan. Karakteristik morfologi yang diperoleh tersebut menunjukkan bahwa kultur homogen dan tidak tercemar, seperti yang diperoleh dalam penelitian sebelumnya (Hidayati, 2006; Permanasari, 2008). Karakteristik morfologi kelima bakteri indikator yang digunakan, antara lain P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus berbentuk batang. Buckle et al. (2007) menyatakan bahwa bakteri P. aeruginosa dan B. cereus memiliki morfologi berbentuk batang. Hasil karakteristik morfologi bakteri S. typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922 adalah berbentuk batang soliter maupun berkoloni sedangkan S. aureus ATCC 25923 berbentuk kokus dalam susunan tunggal maupun berkoloni seperti buah anggur. Ray dan Bhunia (2008) menyatakan bahwa S. typhimurium memiliki morfologi berbentuk batang lurus, E. coli berbentuk batang, sedangkan S. aureus berbentuk kokus, tetrad dan berpasangan seperti buah anggur. Bakteri secara umum dibedakan menjadi dua berdasarkan pewarnaan Gram, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Pewarnaan Gram merupakan suatu teknik pewarnaan secara mikroskopis untuk menentukan jenis bakteri sebagai bakteri Gram positif dan Gram negatif dan sering digunakan untuk pengujian kemurnian suatu bakteri. Teknik ini terdiri dari empat tahap, yaitu (a) tahap awal pewarnaan dengan kristal violet, (b) fiksasi dengan iodin, (c) dekolorisasi dengan etanol dan (d) pewarnaan dengan safranin. Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif tergantung pada komposisi dinding sel (Pelczar dan Chan, 2007). Hasil pewarnaan Gram terhadap kultur L. plantarum, serta bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dan B. cereus menunjukkan bahwa bakteri-bakteri tersebut tergolong dalam bakteri Gram positif. Hal ini disebabkan pada proses pewarnaan Gram, kultur L. plantarum serta bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dan B. cereus menyerap warna ungu yang berasal dari kompleks antara kristal violet dengan 19 iodin dan tetap mempertahankan warna ungu tersebut meskipun telah ditambahkan alkohol 95% dan zat warna safranin. Bakteri P. aeruginosa ATCC 27853, S. typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922, berdasarkan hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa ketiga bakteri ini tergolong dalam bakteri Gram negatif. Hal ini disebabkan ketiga bakteri tersebut tidak dapat mempertahankan warna ungu dari zat pewarna kristal violet saat ditambahkan alkohol 95% serta menyerap warna merah yang berasal dari safranin. Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif tergantung pada komposisi dalam dinding sel (Pelczar dan Chan, 2007). Dinding sel bakteri Gram positif sebagian besar terdiri dari lapisan peptidoglikan (90%). Pelczar dan Chan (2007) menyatakan bahwa bakteri Gram positif mempertahankan warna ungu disebabkan dinding sel mengalami dehidrasi ketika ditetesi alkohol, sehingga poripori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menurun. Keadaan ini membuat kompleks kristal violet dengan iodin tidak dapat keluar dari sel, akibatnya zat warna safranin tidak dapat masuk ke dalam dinding sel. Dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi dalam bentuk lipopolisakarida dan lipoprotein (Fardiaz, 1992). Lipida pada dinding sel bakteri Gram negatif akan larut oleh alkohol sehingga pori-pori mengembang dan menyebabkan kompleks kristal violet dengan iodin keluar dari sel, akibatnya dinding sel bakteri menjadi tidak berwarna. Dinding sel bakteri yang tidak berwarna tersebut akan menyerap zat warna safranin sehingga sel bakteri akan tampak berwarna merah ketika dilihat dibawah mikroskop (Pelczar dan Chan, 2007). Hasil pewarnaan Gram dan pengamatan morfologi dari kultur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 serta bakteri indikator secara mikroskopis dapat dilihat pada Tabel 6 dan 7. 20 Tabel 6. Karakteristik Isolat L. plantarum Isolat L. plantarum Pewarnaan Gram L. plantarum 1A5 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek L. plantarum 1B1 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek L. plantarum 2B2 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek L. plantarum 2C12 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek Morfologi Gambar Morfologi (Pembesaran 10x100) 21 Tabel 7. Karakteristik Isolat Bakteri Indikator Isolat Bakteri Indikator Pewarnaan Gram Morfologi E. coli ATCC 25922 Gram Negatif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek P. aeruginosa ATCC 27853 Gram Negatif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek S. typhimurium ATCC 14028 Gram Negatif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek B. cereus Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek S. aureus ATCC 25923 Gram Positif Bulat, bergerombol seperti buah anggur Gambar Morfologi (Pembesaran 10x100) Keterangan: Kultur Koleksi Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak Tahun 2011, Fakultas Peternakan IPB, ATCC; American Type Culture Collection 22 Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel Kondisi asam dalam supernatan bebas sel akan mengurangi kemampuan bakteriosin dalam menghambat bakteri indikator pada uji antagonistik. Oleh karena itu, supernatan bebas sel yang dihasilkan dinetralkan hingga mencapai kondisi pH 5,8-6,2. Produksi maksimum dari bakteriosin didapatkan pada kondisi pH 6,5 dari rentang pH 2 hingga pH 10, dan bakteriosin kehilangan aktivitas antimikrob pada pH 12 (Bhattacharya dan Arijit, 2010). Kondisi pH supernatan bebas sel asal L. plantarum, dapat dilihat pada Gambar 2. Nilai pH 6.50 5.50 4.50 3.50 2.50 1.50 pHawal awal pH pH netral pH netral 1A5 4,024.01 ± 0,04 6.11 6,11 ± 0,34 1B1 1B1 3.94 3,94 ± 0,11 5.87 5,87 ± 0,12 2B2 2B2 4.00 4,00 ± 0,02 6.17 6,17 ± 0,31 2C12 3,983.98 ± 0,01 6.04 6,04 ± 0,16 Galur L. plantarum Keterangan: pH awal pH netral = pH initial supernatan bebas sel = pH netral supernatan bebas sel setelah penambahan NaOH 1 N Gambar 2. Kondisi pH Supernatan Bebas Sel asal Galur L. plantarum pada Media MRSB dengan Yeast Extract (3%) dan NaCl (1%). Nilai pH supernatan bebas sel berkisar 3,94-4,02. Kondisi asam dari supernatan bebas sel ini disebabkan oleh adanya asam-asam organik yang terbentuk sebagai metabolit primer dari bakteri asam laktat yang akan menghambat pertumbuhan bakteri. Nilai pH supernatan bebas sel setelah penetralan berkisar 5,87-6,17. Asam organik rantai pendek, seperti asam asetat dan asam laktat merupakan metabolit primer dari supernatan bebas sel yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat (Fardiaz, 1992; Jay et al., 2005; Settanni dan Corsetti, 2008). Aktivitas antimikrob supernatan netral bebas sel diuji melalui aktivitasnya terhadap bakteri indikator. Hasil uji antagonistik supernatan netral bebas sel asal empat galur L. plantarum terhadap masing-masing bakteri indikator ditunjukkan dengan adanya diameter zona hambat disekitar sumur konfrontasi, dapat dilihat pada Tabel 8. 23 Tabel 8. Diameter Zona Hambat Supernatan Netral Bebas Sel asal Galur L. plantarum terhadap Bakteri Indikator Bakteri Indikator Supernatan Netral Bebas Sel asal Galur L. plantarum 1A5 1B1 2B2 2C12 --------------------------------- mm ------------------------------- E. coli 15,73 ± 0,31 15,22 ± 0,87 9,74 ± 1,36 10,93 ± 1,40 S. aureus 17,72 ± 1,27 16,21 ± 0,49 15,01 ± 1,54 10,46 ± 1,40 S. typhimurium 18,00 ± 0,64 13,09 ± 0,30 9,13 ± 0,64 14,55 ± 3,45 B. cereus 16,30 ± 1,42 15,02 ± 1,56 11,05 ± 0,39 7,46 ± 0,91 P. aeruginosa 16,86 ± 0,84 13,37 ± 0,96 13,50 ± 1,12 10,32 ± 0,92 Keterangan : Diameter lubang sumur (5 mm) termasuk kedalam diameter zona hambat Rataan diameter zona hambat dari masing-masing galur L. plantarum berbeda-beda. Perbedaan aktivitas hambat dikarenakan bakteriosin mempunyai aktivitas hambat terhadap bakteri spesifik, dan biasanya mempunyai hubungan kekerabatan (filogenik) serta tergantung pada perbedaan jenis dinding sel bakteri yang dihambat yang berpengaruh pada ketahanan suatu bakteri terhadap zat antimikrob (Usmiati et al., 2009). Rataan diameter zona hambat dari supernatan netral bebas sel berkisar 7,46-18,00 mm (Tabel 8). Rataan diameter zona hambat dari supernatan netral bebas sel termasuk dalam kategori kuat (Davis dan Stout, 1971). Supernatan netral bebas sel dari keempat galur L. plantarum mampu menghambat bakteri indikator. Hasil ini sama dengan yang diperoleh Omemu dan Faniran (2011) yang menyatakan bahwa supernatan netral bebas sel asal L. plantarum mampu menghambat bakteri patogen. Keempat galur L. plantarum mampu menghambat bakteri dari strain bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif seperti E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan S. typhimurium ATCC 14028, lebih tahan terhadap bakteriosin yang berasal dari L. plantarum karena komposisi dari membrannya berbeda dengan bakteri Gram positif. Hal ini berbeda dengan Drosinos et al. (2009) yang menyatakan bahwa bakteriosin asal L. plantarum hanya akan menghambat bakteri Gram positif atau bakteri-bakteri yang berkerabat dekat dengan spesies penghasil, serta tidak efisien dalam menghambat bakteri Gram negatif karena membran terluarnya bersifat hidrofilik dan dapat menghalangi aksi bakteriosin. Lebih lanjut Ray dan Bhunia (2008) menyatakan bahwa keberadaan lapisan luar 24 yang mengandung fosfolipida, protein, polisakarida, lemak dan substansi non permeabel akan mempengaruhi aktivitas antimikrob bakteriosin dalam menghambat bakteri Gram negatif. Bakteriosin asal L. plantarum dikarakterisasi sebagai kompleks protein, sangat sensitif terhadap perubahan pH lingkungan. Perubahan pH lingkungan berpengaruh terhadap bakteriosin yang dihasilkan, selain pengaruh nutrien dan temperatur (Todorov dan Dicks, 2005). Penurunan pH dalam bakteriosin asal L. plantarum akan mempengaruhi susunan protein dari bakteriosin tersebut, sehingga mempengaruhi aktivitas penghambatan senyawa antimikrob yang dihasilkan. Oleh karena itu, supernatan netral bebas sel yang diperoleh perlu dilakukan tahap lanjutan berupa purifikasi parsial. Purifikasi Parsial Plantaricin Hasil kuantitatif kadar protein dari setiap tahapan purifikasi parsial plantaricin menggunakan amonium sulfat, dialisis, dan purifikasi parsial menggunakan kromatografi kolom dari masing-masing galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12, dapat dilihat pada Gambar 3. Secara deskriptif, hasil kuantitatif ini menunjukkan bahwa rataan konsentrasi protein yang dihasilkan oleh galur L. plantarum 1A5, 1B1, dan 2B2 merupakan nilai yang lebih tinggi dibandingkan dengan galur L. plantarum 2C12. Rataan kadar protein plantaricin kasar dari galur L. plantarum menunjukkan terjadinya peningkatan dari presipitat bakteriosin menjadi plantaricin kasar kecuali galur L. plantarum 2C12. Ekstrak plantaricin kasar dari keempat galur L. plantarum menunjukkan jenis protein yang hidrofobik karena posisi endapan protein yang terpresipitasi berada melayang di bagian atas supernatan bebas sel. Abo-Amer (2007) menyatakan hal ini sebagai karakteristik protein yang hidrofobik terhadap plantaricin AA135 yang dihasilkan oleh L. plantarum AA135. Karakteristik protein hidrofobik dari ekstrak plantaricin kasar sangat diperlukan untuk aktivitasnya dalam menghambat bakteri karena penghambatan oleh plantaricin tergantung pada interaksi hidrofobik antara sel-sel bakteri dengan molekul-molekul plantaricin (Parada et al., 2007). Lebih lanjut Jack et al. (2005) menyatakan bahwa interaksi antara molekulmolekul kationik dari plantaricin dengan polimer-polimer anionik di permukaan sel bakteri akan menyebabkan destabilisasi fungsi dari membran sitoplasma sel bakteri, 25 berupa peningkatan permeabilitas membran sehingga mengganggu keseimbangan Konsentrasi Protein (mg/ml) barier dan akan mengakibatkan kematian sel bakteri. 160 140 120 100 80 60 40 20 0 PresipitatBakteriosin Bakteriosin Presipitat Plantaricin Kasar Plantaricin Kasar Plantaricin Murni Plantaricin Murni 1A5 1A5 24.08 24,08 ± 12,40 56.65 56,65 ± 25,18 46.53 46,53 ± 18,22 1B1 1B1 24.61 24,61 ± 12,57 71.19 71,19 ± 30,95 158.74 158,74 ± 45,06 2B2 2B2 15.62 15,62 ± 6,85 44.59 44,59 ± 20,97 103.88 103,88 ± 30,39 2C12 2C12 3.41 3,41 ± 0,46 0.96 0,96 ± 0,36 13.31 13,31 ± 2,24 Galur L. plantarum Keterangan: Presipitat Bakteriosin = Hasil Purifikasi Parsial dengan Amonium Sulfat Plantaricin Kasar = Hasil Dialisis Plantaricin = Hasil Purifikasi Parsial dengan Kromatografi Kolom Gambar 3. Konsentrasi Protein pada Tahap Purifikasi Parsial Plantaricin asal Galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12). Kadar protein plantaricin meningkat kembali setelah proses purifikasi menggunakan kromatografi kolom dari plantaricin kasar menjadi plantaricin murni, kecuali galur L. plantarum 1A5. Rataan konsentrasi protein plantaricin murni dari yang terbesar berturut-turut adalah galur L. plantarum 1B1, 2B2, 1A5 dan 2C12. Stabilitas Protein Plantaricin terhadap pH Alkali Pengujian stabilitas plantaricin dari keempat galur L. plantarum terhadap pH alkali secara in vitro dilakukan pada pH 9, menunjukkan tingkat kesensitifan yang tinggi pada plantaricin yang diproduksi oleh keempat galur L. plantarum. Hubungan antara kondisi pH lingkungan dengan konsentrasi protein plantaricin dari keempat galur L. plantarum, dapat dilihat pada Gambar 4. 26 Konsentrasi Protein (mg/ml) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 pH pH 7 7 pH 9 pH 9 1A5 1A5 46.53 46,53 ± 18,22 41.71 41,71 ± 14,38 1B1 1B1 158.74 158,74 ± 45,06 99.84 99,84 ± 28,34 2B2 2B2 103.88 103,88 ± 30,39 69.42 69,42 ± 19,95 2C12 2C12 13.31 13,31 ± 2,24 9.78 9,78 ± 0,84 Plantaricin asal Galur L. plantarum Keterangan: pH 7 =Plantaricin tanpa Perlakuan pH Alkali (kontrol) pH 9 =Plantaricin dengan Perlakuan pH Alkali Gambar 4. Konsentrasi Protein Plantaricin asal Galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) terhadap pH Alkali. Peningkatan pH lingkungan dalam plantaricin dari pH 7 ke pH 9 menurunkan konsentrasi protein plantaricin dari masing-masing galur L. plantarum (Gambar 4). Hal ini menunjukkan adanya pengaruh pH alkali terhadap jumlah protein dalam plantaricin. Kemampuan suatu senyawa antimikrob dalam menghambat pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain pH, waktu penyimpanan, suhu lingkungan, sifat-sifat mikroba (jenis, konsentrasi, umur dan keadaan mikroba), jenis dan jumlah senyawa di dalamnya (Fardiaz, 1992). Rataan persentase penurunan konsentrasi protein plantaricin dari L. plantarum 1A5 sebesar 5%, plantaricin L. plantarum 1B1 sebesar 22%, plantaricin L. plantarum 2B2 sebesar 36%, serta plantaricin L. plantarum 2C12 sebesar 27% (Lampiran 19). Meskipun plantaricin dari keempat galur L. plantarum mengalami penurunan konsentrasi protein, plantaricin dari keempat galur L. plantarum tersebut memiliki ketahanan yang cukup baik terhadap pH alkali dibuktikan dengan persentase penurunan protein sebesar <40%. Hasil penelitian ini menunjukan adanya pengaruh pH alkali terhadap plantaricin dari keempat galur L. plantarum. Gonzales et al. (1994) menyatakan hal serupa, bahwa plantaricin C menghasilkan bakteriosin yang stabil pada pH asam dan pH netral, namun aktivitas antimikrob plantaricin C menurun pada kondisi pH alkali. 27 Kondisi alkali dapat menginduksi solubilitas dari lapisan protein (Duncan et al., 1972). Hal ini memperkuat dugaan bahwa plantaricin dari keempat galur L. plantarum merupakan komponen antimikrob berbahan protein, yang bila dalam kondisi alkali akan terhidrolisis, sehingga menyebabkan penurunan aktivitas antimikrob dalam menghambat bakteri patogen. Penelitian ini selain mengetahui stabilitas protein plantaricin terhadap pH alkali, juga diamati uji antagonistik plantaricin terhadap bakteri indikator melalui uji difusi sumur. Hasil uji antagonistik plantaricin asal galur L. plantarum terhadap masing-masing bakteri indikator ditunjukkan dengan adanya diameter zona hambat. Uji Aktivitas Antimikrob Plantaricin pada Bakteri Indikator Terhadap pH Alkali Escherichia coli ATCC 25922 Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin setelah perlakuan pH alkali terhadap E. coli ATCC 25922, dapat dilihat pada Tabel 9. Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin tidak dipengaruhi oleh interaksi antara perlakuan pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Hasil ini menunjukkan bahwa plantaricin memiliki aktivitas penghambatan terhadap E. coli ATCC 25922 yang sama tanpa dipengaruhi oleh pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Tabel 9. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap E. coli ATCC 25922 pH 7* Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) --------------------------------------9,43 ± 1,53 9,72 ± 0,22 9,52 ± 2,17 8,16 ± 0,23 9,21 ± 1,04 pH 9 9,17 ± 0,52 8,52 ± 0,51 9,08 ± 0,63 7,84 ± 0,30 Rata-rata 9,30 ± 1,03 9,12 ± 0,37 9,30 ± 1,40 8,00 ± 0,27 Perlakuan 8,65 ± 0,49 Keterangan: Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 berkisar 8,00-9,30 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori sedang (Davis dan Stout, 1971). E. coli termasuk bakteri Gram negatif dengan pH pertumbuhan optimum pada 7,0-7,5 (Fardiaz, 1992). Aktivitas penghambatan plantaricin dari keempat galur L. 28 plantarum terhadap E. coli ATCC 25922 disebabkan oleh pH lingkungan yang tidak sesuai bagi pertumbuhan E. coli ATCC 25922. Yohannes et al. (2005) menyatakan bahwa membran luar dari E. coli, pertumbuhannya menurun pada lingkungan alkali. Salmonella typhimurium ATCC 14028 Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum pada pH alkali terhadap S. typhimurium ATCC 14028, disajikan pada Tabel 10. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa rataan diameter zona hambat tidak dipengaruhi oleh adanya interaksi antara perlakuan pH alkali dan galur L. plantarum. Perlakuan pH yang berbeda berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap diameter zona hambat. Hal ini menunjukkan bahwa stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin menurun akibat pengaruh pH alkali. Tabel 10. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S. typhimurium ATCC 14028 pH 7* Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) ---------------------------------------9,40 ± 1,11 8,98 ± 1,07 8,82 ± 1,12 8,91 ± 0,55 9,03 ± 0,96a pH 9 8,47 ± 0,66 8,52 ± 0,67 8,11 ± 1,00 8,22 ± 0,48 Rata-rata 8,94 ± 0,89 8,75 ± 0,87 8,47 ± 1,06 8,57 ± 0,52 Perlakuan 8,33 ± 0,70b Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan nyata (P<0,05) Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum terhadap pH yang berbeda berkisar 8,33-9,03 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori sedang (Davis dan Stout, 2004). Plantaricin dari keempat galur L. plantarum masih dapat menghambat S. typhimurium ATCC 14028 dari strain bakteri Gram negatif meskipun dengan aktivitas antimikrob plantaricin yang menurun. Portillo (2000) menyatakan bahwa Salmonella sp. merupakan bakteri Gram negatif dan pH pertumbuhan optimum pada 6,5-7,5. Aktivitas penghambatan plantaricin dari keempat galur L. plantarum terhadap S. typhimurium ATCC 14028 disebabkan oleh pH lingkungan yang tidak sesuai bagi pertumbuhan S. typhimurium ATCC 14028. Lebih lanjut Ogunbanwo et al. (2003) menyatakan bahwa bakteriosin dari L. plantarum F1 dan L. brevis OG1 29 dapat menghambat bakteri Gram negatif seperti S. typhimurium. Aktivitas penghambatan plantaricin terhadap S. typhimurium ATCC 14028, dapat dilihat pada Gambar 5. Zona Hambat Zona Hambat (A) Keterangan: (B) A = pH 7 (Kontrol) B = pH 9 (Alkali) Gambar 5. Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum 1A5 terhadap S. typhimurium ATCC 14028: (A) L. plantarum 1A5 pada pH 7 (kontrol) dan (B) L. plantarum 1A5 pada pH 7 (alkali). Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin dari keempat galur L. plantarum setelah perlakuan pH alkali terhadap P. aeruginosa ATCC 27853, dapat dilihat pada Tabel 11. Analisis ragam menunjukkan bahwa aktivitas antimikrob plantaricin terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 tidak dipengaruhi oleh interaksi antara galur L. plantarum dengan perlakuan pH. Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin terhadap P. aeruginosa ATCC 27853, sangat nyata (P<0,01) dipengaruhi oleh galur L. plantarum. Tabel 11. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 Perlakuan Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) --------------------------------------- pH 7* 9,03 ± 1,70 9,10 ± 1,55 8,37 ± 1,09 16,42 ± 4,46 10,37 ± 2,20 pH 9 8,16 ± 0,33 8,47 ± 0,93 8,39 ± 0,67 15,25 ± 4,33 10,07 ± 1,57 Rata-rata 8,60 ± 1,02B 8,79 ± 1,24AB 8,38 ± 0,88B 15,84 ± 4,40A Keterangan: Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan nyata (P<0,01) Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol 30 Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 berkisar 8,38-15,84 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori kuat (Davis dan Stout, 1971). Interaksi antara pH dengan galur L. plantarum yang berbeda tidak mempengaruhi aktivitas plantaricin terhadap P. aeruginosa ATCC 27853. Hal ini menunjukkan bahwa plantaricin dari keempat galur L. plantarum terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 mempunyai aktivitas penghambatan yang tidak berbeda. Hasil uji lanjut menunjukkan bahwa galur L. plantarum 2C12 menghasilkan rataan diameter zona hambat yang berbeda nyata (P<0,01) terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 dengan galur L. plantarum lainnya. Namun, galur L. plantarum 2C12 menunjukkan aktivitas yang tidak berbeda nyata dengan galur L. plantarum 1B1 (P<0,01). P. aeruginosa merupakan opportunistic pathogen, artinya bakteri ini akan menyerang kekebalan dari inangnya dan menyebabkan infeksi (Todar, 2009). Selain itu, kemampuan dari P. aeruginosa dalam memproduksi enzim yang dapat memecah komponen lemak dan protein (Buckle et al., 2007). Staphylococcus aureus ATCC 25923 Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin setelah perlakuan pH alkali terhadap S. aureus ATCC 25923, dapat dilihat pada Tabel 12. Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin tidak dipengaruhi oleh interaksi antara perlakuan pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Hasil ini menunjukkan bahwa plantaricin memiliki aktivitas penghambatan terhadap S. aureus ATCC 25923 yang sama tanpa dipengaruhi oleh pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Tabel 12. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S. aureus ATCC 25923 pH 7* Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) --------------------------------------8,51 ± 0,35 8,50 ± 0,64 8,65 ± 0,85 11,96 ± 1,58 9,41 ± 0,86 pH 9 8,54 ± 0,61 8,57 ± 0,74 8,23 ± 0,63 9,31 ± 1,49 Rata-rata 8,53 ± 0,48 8,54 ± 0,69 8,44 ± 0,74 10,64 ± 1,54 Perlakuan 8,66 ± 0,87 Keterangan: Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol 31 Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 berkisar 8,44-10,64 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori sedang (Davis dan Stout, 1971). Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin stabil setelah perlakuan pH alkali terhadap S. aureus ATCC 25923. S. aureus termasuk bakteri Gram positif, tumbuh pada pH 4,0-9,8 dengan pH optimum pertumbuhan pada 7,0-7,8 (Ray dan Bhunia, 2008). Hsieh et al. (1998) menyatakan bahwa terjadinya peningkatan besar dalam sensitivitas S. aureus terhadap kation dan aktivitas antimikrob pada kondisi pH alkali. Bacillus cereus Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin setelah perlakuan pH alkali terhadap B. cereus, dapat dilihat pada Tabel 13. Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin tidak dipengaruhi oleh interaksi antara perlakuan pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Hasil ini menunjukkan bahwa plantaricin memiliki aktivitas penghambatan yang sama tanpa dipengaruhi oleh pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Tabel 13. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap B. cereus pH 7* Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) --------------------------------------8,92 ± 1,14 9,10 ± 0,77 8,86 ± 0,90 8,57 ± 0,59 8,86 ± 0,85 pH 9 8,45 ± 0,58 8,89 ± 0,61 8,97 ± 0,97 9,15 ± 1,02 Rata-rata 8,69 ± 0,86 9,00 ± 0,69 8,92 ± 0,94 8,86 ± 0,81 Perlakuan 8,87 ± 0,80 Keterangan: Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum berkisar 8,69-9,00 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori sedang (Davis dan Stout, 1971). Torkar dan Matijasi (2003) menyatakan bahwa B. cereus stabil pada pH 3 hingga pH 10. Lebih lanjut, Padan et al. (2005) dalam penelitiannya menyatakan bahwa perubahan asam teikoat berkontribusi pada spesies Bacillus sp. pada pH alkali. Gonzales et al. (1994) juga menyatakan bahwa plantaricin C dapat menghambat pertumbuhan sel vegetatif B. cereus. 32 Plantaricin yang dihasilkan oleh keempat galur L. plantarum mampu menghambat bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif, serta stabil terhadap perlakuan pH alkali namun aktivitas antimikrob plantaricin menurun akibat perlakuan pH alkali terhadap S. typhimurium. Hal ini sesuai dengan penelitian Gong et al. (2010) yang menyatakan bahwa plantaricin MG dari L. plantarum KLDS1.0391 menghasilkan senyawa antimikrob yang stabil pada pH 2 hingga pH 10 serta mampu menghambat bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (E. coli, Pseudomonas sp., Salmonella sp.) dengan nilai aktivitas penghambatan terbesar terhadap E. coli dan S. typhimurium namun tidak terhadap Lactobacillus sp. Karakteristik stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin terhadap pH alkali menunjukkan potensi plantaricin untuk dapat digunakan sebagai biopreservatif dalam produk pangan alkali. 33 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Medium alkali mempengaruhi stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 yang ditunjukkan dengan turunnya konsentrasi protein dari masing-masing galur L. plantarum. Aktivitas antimikrob plantaricin terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 dipengaruhi oleh galur L. plantarum yang berbeda. Plantaricin asal galur L. plantarum stabil terhadap pH alkali namun aktivitas antimikrob plantaricin menurun akibat perlakuan pH alkali terhadap S. typhimurium ATCC 14028. Karakteristik stabilitas plantaricin terhadap pH alkali menunjukkan potensi plantaricin untuk dapat digunakan sebagai biopreservatif dalam produk pangan alkali. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan nilai optimum stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 terhadap pH alkali dengan spektrum yang lebih luas (pH 10 hingga pH 12). Perlu juga dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai karakteristik kuantitatif protein plantaricin pada pH alkali menggunakan Elektroforesis SDS-Page. Penelitian mengenai toksikologi plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 perlu untuk dilakukan sebelum plantaricin digunakan sebagai biopreservatif dalam pengolahan produk pangan alkali. 34 STABILITAS DAN AKTIVITAS ANTIMIKROB PLANTARICIN ASAL GALUR Lactobacillus plantarum TERHADAP pH ALKALI SKRIPSI DEDE SUPRIATNA DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012 STABILITAS DAN AKTIVITAS ANTIMIKROB PLANTARICIN ASAL GALUR Lactobacillus plantarum TERHADAP pH ALKALI SKRIPSI DEDE SUPRIATNA DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012 RINGKASAN DEDE SUPRIATNA. D14069001. 2012. Stabilitas dan Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur Lactobacillus plantarum terhadap pH Alkali. Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Dr. Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si. Pembimbing Anggota : Dr. Jakaria, S.Pt., M.Si. Produk pangan alkali banyak terdapat di buah, sayuran dan beberapa produk pangan asal ternak, contohnya albumin telur. Konsumsi terhadap produk pangan alkali sangat bermanfaat untuk menjaga keseimbangan pH tubuh, menjaga kesehatan tulang dan menurunkan resistensi tubuh terhadap penyakit kronis, seperti kanker, hipertensi dan stroke. Bakteri patogen dalam produk pangan alkali dapat menyebabkan kerusakan produk, menurunkan daya simpan produk serta beresiko terhadap kesehatan apabila dikonsumsi. Penelitian terhadap senyawa antimikrob yang berpotensi untuk digunakan sebagai biopreservatif khususnya untuk tipe pengolahan produk pangan alkali perlu dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum terhadap pH alkali. Penelitian dimulai dengan melakukan karakterisasi morfologi sel kultur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dan bakteri indikator (Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dan Bacillus cereus), produksi plantaricin asal galur L. plantarum serta pengujian stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin terhadap pH alkali. Produksi plantaricin asal L. plantarum meliputi purifikasi parsial menggunakan amonium sulfat, dialisis dan kromatografi kolom. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor dari Maret 2011 hingga Oktober 2011. Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah terhadap aktivitas antimikrob supernatan bebas sel, konsentrasi protein plantaricin dari masing-masing tahap produksi plantaricin serta stabilitas protein plantaricin terhadap pH alkali dengan tiga ulangan. Pengujian aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum pada pH alkali dilakukan terhadap bakteri indikator dengan metode difusi sumur, menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial 2x4 dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah pH dan faktor kedua adalah galur L. plantarum. Data dianalisis dengan sidik ragam untuk data yang memenuhi uji asumsi, dan uji non parametrik Kruskal-Wallis untuk data yang tidak memenuhi uji asumsi. Rancangan percobaan lainnya yang digunakan adalah secara deskriptif untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang diperoleh. Hasil kuantitatif konsentrasi protein plantaricin dari setiap tahap purifikasi menunjukan bahwa rataan konsentrasi protein plantaricin asal galur L. plantarum 2C12 merupakan nilai yang lebih kecil dibandingkan dengan galur L. plantarum lainnya. Plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 sensitif terhadap perlakuan pH alkali yang ditunjukkan dengan menurunnya konsentrasi protein plantaricin. Stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum terhadap bakteri indikator, tidak dipengaruhi oleh interaksi antara perlakuan pH dan galur L. plantarum (P>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa plantaricin dari keempat galur L. plantarum stabil terhadap perlakuan pH alkali namun aktivitas antimikrob plantaricin menurun akibat perlakuan pH alkali terhadap S. typhimurium ATCC 14028 (P<0,05). Plantaricin mempunyai aktivitas antimikrob yang berbeda akibat perlakuan galur L. plantarum terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 (P<0,01). Stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin terhadap pH alkali menunjukkan potensi plantaricin untuk dapat digunakan sebagai biopreservatif dalam produk pangan alkali. Kata-kata kunci: Lactobacillus plantarum, pH alkali, plantaricin, biopreservatif. ii ABSTRACT Stability and Antimicrobial Activity of Plantaricin Produced by Lactobacillus plantarum at Alkaline pH Supriatna, D., I. I. Arief, and Jakaria Plantaricin produced by L. plantarum is known to display an adaptive response to alkali stress that enhances its capacity to more effectively stable at alkali condition. The aim of the research was to examine the stability of plantaricin produced by L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 and 2C12 and its antimicrobial activity at alkaline pH. The experiment was done based on completely randomized design (CRD) with factorial arrangement 2 x 4, two levels of pH value and four levels of L. plantarum strains in three replications. Variables analyzed were protein concentration, inhibition zone of the antagonistic test was assayed by agar well diffusion and antimicrobial activity of plantaricin against indicator bacteria at alkaline pH. Plantaricin was found to be sensitive to alkaline treatment. No interaction between pH and strains of L. plantarum to antimicrobial activity of plantaricin (P>0.05). Plantaricin showed antimicrobial activity against Gram positif and Gram negatif bacteria including S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 and B. cereus. Plantaricin produced by L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 and 2C12 was stable at alkaline pH but the stability of plantaricin decreased because of alkaline treatment to S. typhimurium ATCC 14028 (P<0.01). Stability of plantaricin after alkaline treatment showed plantaricin potentially could be used as biopreservative on alkali products. Keywords: Lactobacillus plantarum, alkaline pH, plantaricin, biopreservative. iii STABILITAS DAN AKTIVITAS ANTIMIKROB PLANTARICIN ASAL GALUR Lactobacillus plantarum TERHADAP pH ALKALI DEDE SUPRIATNA D14069001 Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012 iv Judul : Stabilitas dan Aktivitas Antimikrob Plantaricin Lactobacillus plantarum terhadap pH Alkali asal Galur Nama : Dede Supriatna NIM : D14069001 Menyetujui, Pembimbing Utama, Pembimbing Anggota, (Dr. Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si.) NIP. 19750304 199903 2 001 (Dr. Jakaria, S.Pt., M.Si.) NIP. 19660105 199903 1 001 Mengetahui: Ketua Departemen, Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc.) NIP. 19591212 198603 1 004 Tanggal Ujian : 27 Februari 2012 Tanggal Lulus : v RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 28 Januari 1988 di Kota Banjar. Penulis adalah anak keempat dari lima bersaudara dari pasangan Makbul Suparman dan Ikah Mulyani. Riwayat pendidikan Penulis dimulai dari SDN 3 Banjar (1994-2000), SLTPN 1 Banjar (2000-2003) dan dilanjutkan ke SMAN 1 Banjar (2003-2006). Penulis kemudian melanjutkan pendidikan dan diterima sebagai mahasiswa Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) pada tahun 2006. Penerapan Sistem Mayor Minor yang diterapkan oleh IPB membawa Penulis pada Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis kemudian mengajukan perpindahan Mayor ke Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2008. Selama masa pendidikan, Penulis aktif dalam organisasi kemahasiswaan Badan Eksekutif Mahasiswa FMIPA periode 2007-2008, Badan Eksekutif Mahasiswa KM periode 2009-2010, pengurus inti Paguyuban Beasiswa Karya Salemba Empat (KSE) IPB periode 2009-2010, serta dalam kepanitiaan kegiatankegiatan kampus lainnya. Penulis juga mendapatkan beasiswa BBM periode 20072009, beasiswa KSE periode 2008-2010, beasiswa Bank Mandiri (2010), dan besiswa Bank BNI (2011). Penulis juga aktif dalam kegiatan-kegiatan seminar Internasional seperti 5th World Youth Congress (WYC) di Istanbul-Turki (2010), 6th International Student Conference Education Without Borders (EWB) di Dubai-UAE (2011), Election Exchange Program (EEP) di Istanbul-Turki (2011) serta Turkish Language Summer Course (TLSC) di Ankara University-Turki (2011). Penulis juga mendapat penghargaan yang sangat baik dari Rektor Institut Pertanian Bogor yakni sebagai “Mahasiswa Berprestasi pada Bidang Ekstrakurikuler Internasional” periode Agustus 2010-Mei 2011 dan Mei 2011-Agustus 2011 di Institut Pertanian Bogor. vi KATA PENGANTAR Assalammu‟alaikum Warrahmatullahi Wabarakaatuhu “Alhamdulillah hirabbil’alamin’. Puji dan syukur senantiasa dipanjatkan kehadirat Allah SWT, karena atas Rahmat dan Karunia-Nya, penelitian dan penulisan skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik. Shalawat serta salam semoga selalu dilimpahkan kepada Nabi Muhammad SAW dan seluruh pengikutnya hingga akhir jaman. Skripsi yang berjudul “Stabilitas dan Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur Lactobacillus plantarum terhadap pH Alkali” dipilih sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Substansi penelitian ini terkait dengan karakteristik substrat antimikrob plantaricin yang diproduksi oleh L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 yang telah diisolasi dari daging sapi lokal Indonesia. Produk pangan alkali banyak terdapat di buah, sayuran dan beberapa produk pangan asal ternak, seperti albumin telur. Konsumsi terhadap produk pangan alkali sangat bermanfaat untuk menjaga keseimbangan pH tubuh, menjaga kesehatan tulang dan menurunkan resistensi tubuh terhadap penyakit kronis, seperti hipertensi, kanker dan stroke. Bakteri patogen dalam produk pangan alkali dapat menyebabkan kerusakan produk, menurunkan daya simpan produk serta beresiko terhadap kesehatan apabila dikonsumsi. Penelitian terhadap senyawa antimikrob yang berpotensi untuk digunakan sebagai biopreservatif khususnya untuk tipe pengolahan produk pangan alkali perlu dilakukan, sehingga penelitian terhadap plantaricin asal galur L. plantarum perlu diuji karakteristik stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin pada bakteri indikator terhadap pH alkali. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat dan menambah pengetahuan bagi penulis sendiri dan semoga bermanfaat bagi para pembaca. Amin. Bogor, Maret 2012 Penulis vii DAFTAR ISI Halaman RINGKASAN . ........................................................................................ i ABSTRACT ............................................................................................ iii LEMBAR PERNYATAAN .................................................................... iv LEMBAR PENGESAHAN .................................................................... v RIWAYAT HIDUP ................................................................................. vi KATA PENGANTAR ............................................................................ vii DAFTAR ISI ........................................................................................... viii DAFTAR TABEL ................................................................................... x DAFTAR GAMBAR . ............................................................................. xi DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................... xii PENDAHULUAN .................................................................................. 1 Latar Belakang ............................................................................ Tujuan ......................................................................................... 1 1 TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 2 Bakteri Asam Laktat ................................................................... Lactobacillus ................................................................... Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 ........ Senyawa Antimikrob ................................................................... Asam Organik ................................................................. Bakteriosin ...................................................................... Hidrogen Peroksida ......................................................... Mekanisme Aksi Penghambatan oleh Bakteriosin ...................... Pemurnian Protein ....................................................................... Purifikasi Parsial Menggunakan Amonium Sulfat .......... Kromatografi Pertukaran Ion .......................................... Mikroba Patogen dalam Bahan Pangan ...................................... Staphylococcus aureus .................................................... Bacillus cereus ................................................................ Pseudomonas aeruginosa ................................................ Salmonella typhimurium ................................................. Escherichia coli ............................................................... Nilai pH Beberapa Produk Pangan ............................................. 2 3 3 4 4 4 5 6 7 7 7 8 8 9 9 10 10 10 MATERI DAN METODE ...................................................................... 12 Lokasi dan Waktu ....................................................................... Materi .......................................................................................... Prosedur ...................................................................................... Penyegaran dan Pembiakan Kultur ................................. 12 12 12 12 viii Karakteristik Morfologi dan Pewarnaan Gram ............... Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel ................... Produksi dan Purifikasi Plantaricin ................................ Purifikasi Parsial Menggunakan Amonium Sulfat . Dialisis ................................................................... Purifikasi Plantaricin Menggunakan Kromatografi Kolom .................................................................... Stabilitas Protein Plantaricin pada pH Alkali ................. Uji Aktivitas Antimikrob Plantaricin pada pH Alkali .... Rancangan dan Analisis Data ..................................................... Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel ................... Produksi Plantaricin ....................................................... Stabilitas dan Aktivitas Plantaricin pada pH Alkali ....... 13 13 14 14 14 15 15 15 17 17 17 18 HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 19 Karakteristik Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram ......... Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel ................... Purifikasi Parsial Plantaricin .......................................... Stabilitas Protein Plantaricin pada pH Alkali ................. Uji Aktivitas Antimikrob Plantaricin pada Kondisi Alkali terhadap Bakteri Indikator .................................... E. coli ATCC 25922 .............................................. S. typhimurium ATCC 14028 ................................ P. aeruginosa ATCC 27853 ................................. S. aureus ATCC 25923 ......................................... B. cereus ................................................................ 19 23 25 26 28 28 29 30 31 32 KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 34 Kesimpulan ................................................................................. Saran ............................................................................................ 34 34 UCAPAN TERIMAKASIH ................................................................... 35 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 36 LAMPIRAN ............................................................................................ 40 ix DAFTAR TABEL Nomor Halaman 1. Grup Spesies Lactobacillus sp .................................................... 3 2. Bakteriosin asal L. plantarum yang Telah Dikarakterisasi ......... 5 3. Perbedaan Antara Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif ........ 8 4. Nilai pH Beberapa Produk Pangan ............................................. 11 5. Kategori Zona Hambat Bakteri ................................................... 16 6. Karakteristik Isolat L. plantarum ................................................ 21 7. Karakteristik Isolat Bakteri Indikator ......................................... 22 8. Diameter Zona Hambat Supernatan Netral Bebas Sel asal Galur L. plantarum terhadap Bakteri Patogen ...................................... 24 Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap E. coli ATCC 25922 ........................... 28 10. Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S. typhimurium ATCC 14028 ............. 29 11. Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 ............... 30 12. Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S. aureus ATCC 25923 ....................... 31 13. Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap B. cereus .............................................. 32 9. x DAFTAR GAMBAR Nomor Halaman 1. Metode Pengukuran Diameter Zona Hambat Bakteri . ................ 16 2. Kondisi pH Supernatan Bebas Sel asal Galur L. plantarum . ...... 23 3. Konsentrasi Protein pada Tahap Purifikasi Parsial Plantaricin asal Galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) . .................. 26 4. Konsentrasi Protein Plantaricin asal Galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12) pada Perlakuan pH Alkali ............... 27 5. Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum 1A5 terhadap S. typhimurium ATCC 14028......................................... 30 xi DAFTAR LAMPIRAN Nomor Halaman Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH alkali terhadap S. typhimurium ................ 41 Hasil Uji Tukey Konfrontasi Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S. typhimurium ..................................... 41 Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH alkali terhadap S. aureus .......................... 41 Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH alkali terhadap E. coli .............................. 41 Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH alkali terhadap P. aeruginosa .................. 42 Hasil Uji Kruskal-Wallis Diameter Zona Hambat Plantaricin asal L. plantarum Berbeda terhadap P. aeruginosa ..................... 42 Hasil Uji Kruskal-Wallis Konfrontasi Plantaricin asal Galur L. plantarum pada Galur Berbeda terhadap P. aeruginosa ......... 42 Hasil Uji Kruskal-Wallis Diameter Zona Hambat Plantaricin asal L. plantarum pada pH berbeda terhadap P. aeruginosa ....... 43 Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH alkali terhadap B. cereus .......................... 43 10. Komposisi Mueller Hinton Agar (MHA) ..................................... 43 11. Komposisi de Man Rogosa and Sharpe Broth (MRSB) ............... 43 12. Komposisi Nutrient Broth (NB) .................................................. 44 13. Komposisi MERCK Natrium/Sodium Chlorida (NaCl) .............. 44 14. Pembuatan Buffer Kalium Fosfat 0,1 M ...................................... 45 15. Purifikasi Parsial Plantaricin asal Galur L. plantarum Menggunakan Amonium Sulfat ................................................... 46 16. Proses Dialisis ............................................................................. 46 17. Proses Kromatografi Kolom ........................................................ 46 18. Penggunaan Padatan Amonium Sulfat (% Penjenuhan) .............. 47 19. Hasil Spektrofotometri Protein Plantaricin Asal Galur L. plantarum tehadap pH Alkali .................................................. 47 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. xii PENDAHULUAN Latar Belakang Produk pangan alkali banyak terdapat di buah, sayuran dan beberapa produk pangan asal ternak, seperti albumin telur. Nilai pH produk pangan alkali berkisar 7,210. Konsumsi terhadap produk pangan alkali sangat bermanfaat bagi kesehatan, yakni untuk menjaga keseimbangan pH tubuh dan menurunkan resistensi tubuh terhadap penyakit kronis, seperti hipertensi, kanker dan stroke. Bakteri patogen dalam produk pangan alkali dapat menyebabkan kerusakan produk, menurunkan daya simpan produk serta beresiko terhadap kesehatan apabila dikonsumsi. Senyawa antimikrob alami yang stabil pada pengolahan produk pangan alkali sangat diperlukan untuk dapat mengontrol pertumbuhan bakteri patogen dalam produk pangan alkali sehingga dapat memperpanjang masa simpan produk. Bakteri asam laktat menghasilkan suatu senyawa antimikrob yang disebut bakteriosin. Bakteriosin ini sangat efektif untuk digunakan sebagai biopreservatif menggantikan bahan pengawet sintesis lainnya. Oleh karena itu, bahan pengawet alami lebih berpotensi untuk diaplikasikan sebagai pengganti bahan pengawet sintetis karena tidak mengandung toksin, dapat didegradasi oleh enzim-enzim pencernaan serta lebih aman untuk dikonsumsi. Bakteriosin dari makanan yang berhubungan dengan bakteri asam laktat telah diidentifikasi, contohnya plantaricin. Plantaricin merupakan salah satu jenis bakteriosin yang diproduksi oleh L. plantarum. Arief et al. (2008) telah berhasil melakukan isolasi terhadap L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 yang berasal dari daging sapi lokal Indonesia, menghasilkan suatu senyawa antimikrob yang diidentifikasi awal sebagai plantaricin. Penelitian terhadap senyawa antimikrob yang berpotensi untuk digunakan sebagai biopreservatif khususnya untuk tipe pengolahan produk pangan alkali perlu dilakukan, sehingga penelitian terhadap plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 perlu diuji karakteristik stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin pada bakteri indikator terhadap pH alkali. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 pada bakteri indikator terhadap pH alkali. TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Asam Laktat Bakteri Asam Laktat (BAL) erat kaitannya dengan proses fermentasi pangan, dan saat ini telah berkembang dalam industri pangan fermentasi. BAL sering ditemukan secara alamiah dalam bahan pangan. Bakteri ini secara luas terdistribusi pada susu, daging segar, sayuran, serta produk-produk lainnya. Peranan utama BAL adalah sebagai kultur starter produk-produk yang melibatkan proses fermentasi untuk memperoleh produk akhir dengan konsistensi tinggi, menstabilkan produk-produk sehingga diperoleh cita rasa yang spesifik serta untuk mengawetkan produk yang diinginkan (Smid dan Gorris, 2007). Selain itu, Leverentz et al. ( 2006) menyebutkan bahwa BAL merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat digunakan dalam mengontrol pertumbuhan bakteri patogen dalam bahan pangan karena mampu menurunkan pH dan menghasilkan bakteriosin. BAL mempunyai karakteristik morfologi, fisiologi dan metabolit tertentu. Deskripsi secara umum dari bakteri ini adalah termasuk dalam bakteri Gram positif, tidak berspora, berbentuk bulat maupun batang dan menghasilkan asam laktat sebagai mayoritas produk akhir selama memfermentasi karbohidrat (Axelsson, 2004). Lebih lanjut dinyatakan oleh Jay (1998) BAL bersifat mesofilik dan termofilik, beberapa dapat tumbuh pada suhu 5 oC dan tertinggi 45 oC, dapat bertahan pada pH 1,2-9,6 dan beberapa hanya dapat tumbuh pada kisaran pH yang sempit (pH 4,0-4,5). Bakteri ini termasuk mikroorganisme GRAS (Generally Recognized as Safe) atau golongan mikroorganisme yang aman ditambahkan dalam makanan karena sifatnya yang tidak toksik dan tidak menghasilkan toksin, yang dikenal dengan sebutan “food grade microorganism”, yaitu mikroorganisme yang tidak beresiko terhadap kesehatan (Alakomi et al., 2000). BAL terbagi dalam 8 genus antara lain Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium, dan Corinebacterium. Berdasarkan tipe fermentasinya, BAL terbagi menjadi homofermentatif dan heterofermentatif. Kelompok homofermentatif menghasilkan asam laktat sebagai produk utama dari fermentasi gula sedangkan kelompok heterofermentatif menghasilkan asam laktat dan senyawa lain yaitu CO2, etanol, asetaldehida, diasetil serta senyawa lainnya (Fardiaz, 1992). 2 Lactobacillus Lactobacillus merupakan bakteri Gram positif, tidak menghasilkan spora, biasanya tidak bergerak, anaerob fakultatif, katalase negatif, koloninya dalam media agar berukuran 2-5 mm, konfeks, opak, sedikit transparan, tidak berpigmen dan metabolit utamanya adalah asam laktat. Tumbuh baik pada suhu 25-40 oC dan tersebar luas di lingkungan terutama dalam produk-produk pangan asal hewan dan sayuran. Bakteri ini menetap dalam saluran pencernaan unggas dan mamalia (Ray dan Bhunia, 2008). Lactobacillus dibagi menjadi tiga grup, disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Grup Spesies Lactobacillus sp Karakteristik Fermentasi karbohidrat Grup I Homofermentatif Grup II Fakultatif heterofermentatif Grup III Heterofermentatif Produk akhir fermentasi karbohidrat Laktat Laktat, asetat, etanol, CO2, format Laktat, asetat, etanol, CO2 Contoh spesies L. delbrueckii ssp. delbrueckii, bulgaricus, lactis L. leichmannii L. acidophilus L. elveticus L. brevis L. sanfrancisco L. reuteri L. casei ssp. casei, rhamnosus, pseudoplantarum L. plantarum L. curvatus L. sake L. fermentum L. divergens L. kefir L. confuses Sumber: Ray dan Bhunia (2008). Lactobacillus plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 L. plantarum termasuk bakteri dalam filum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo Lactobacillales, family Lactobacillaceae dan genus Lactobacillus. L. plantarum mempunyai kemampuan untuk menghambat mikroorganisme patogen pada bahan pangan dengan daerah penghambatan terbesar dibandingkan dengan bakteri asam laktat lainnya (Syahniar, 2009). L. plantarum tergolong dalam bakteri Gram positif, berbentuk batang tunggal maupun rantai pendek, tidak berspora, katalase negatif, dan anaerob fakultatif (Ray dan Bhunia, 2008). L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 merupakan isolat BAL yang diisolasi dari daging sapi lokal Indonesia, peranakan Ongole. Galur L. plantarum 1A5, 1B1, 3 2B2 dan 2C12 mampu bertahan dalam media NaCl 6,5%, tumbuh pada suhu 15 oC, tumbuh baik pada 37 oC dan 45 oC, dan tahan pada kondisi usus (pH 7,2) dan bertahan hidup lebih baik pada pH 2 (Wijayanto, 2009). Senyawa Antimikrob Senyawa antimikrob dapat bersifat bakterisidal (membunuh bakteri), bakteristatik (menghambat pertumbuhan mikroba), fungisidal (membunuh kapang), fungistatik (menghambat pertumbuhan kapang) dan germisidal (menghambat germinasi spora bakteri). Kemampuan suatu zat antimikrob dalam menghambat pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain konsentrasi zat pengawet, waktu penyimpanan, suhu lingkungan, sifat-sifat mikroba (jenis, konsentrasi, umur dan keadaan mikroba), sifat-sifat fisik dan kimia makanan, termasuk kadar air, pH, jenis dan jumlah senyawa di dalamnya (Fardiaz, 1992). Metabolit-metabolit bakteri asam laktat yang berfungsi sebagai senyawa antimikrob antara lain asam organik (asam laktat dan asam asetat), bakteriosin, hidrogen peroksida, diasetil, CO2 dan semua metabolit yang mempunyai aktivitas antimikrob (Fardiaz, 1992; Jay et al., 2005; Settanni dan Corsetti, 2008). Asam Organik Penghambatan pertumbuhan pada mikroba oleh asam organik diakibatkan adanya akumulasi anion. Anion menyebabkan berkurangnya kecepatan dari sintesis makromolekul dan mempengaruhi transportasi antar membran sel. Bakteri asam laktat dan juga bakteri lain meniadakan efek dari akumulasi anion dengan cara mengurangi pH pada sitoplasma (Ouwehand dan Vesterlund, 2004). Asam-asam organik yang dihasilkan oleh BAL mengakibatkan akumulasi produk akhir asam dan penurunan pH yang akan menghambat pertumbuhan bakteri baik Gram positif maupun bakteri Gram negatif. Turunnya pH internal menyebabkan terdenaturasinya protein dan kehilangan viabilitasnya (Ray, 1992). Bakteriosin BAL memproduksi komponen antimikrob, salah satunya bakteriosin. Kemampuan bakteriosin dalam melakukan aktivitasnya sebagai biopreservatif dicapai oleh efek penghambatannya terhadap mikroorganisme patogen yang berbahaya (Savadogo et al., 2006; Smid dan Gorris, 2007). 4 Bakteriosin adalah peptida-peptida yang diproduksi oleh sejumlah bakteri Gram positif dan Gram negatif (Aymerich et al., 2008). Bakteriosin yang diproduksi oleh BAL dapat didefinisikan sebagai protein aktif atau kompleks protein yang menunjukkan aksi bakterisidal melawan bakteri Gram positif, terutama spesies yang berkerabat dekat dengan spesies penghasil (Jack et al., 1995; Ray dan Bhunia, 2008; Parada et al., 2007). Penggunaan bakteriosin sebagai biopreservatif, perlu memperhatikan dan menentukan jumlah konsentrasi bakteriosin yang harus ditambahkan dalam produk pangan, dan efisiensi bakteriosin dalam mengontrol bakteri-bakteri patogen (Ananou et al., 2005). Beberapa bakteriosin yang telah berhasil dikarakterisasi, disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Bakteriosin asal L. plantarum yang Telah Berhasil Dikarakterisasi Spesies L. plantarum L. plantarum KLDS1.0391 Jenis Bakteriosin plantaricin MG L. plantarum A-1 plantaricin ASM1 "Jiaoke", Fermentasi krim Algerian Hata et al. (2010) L. plantarum OL15 plantaricin OL15 Fermentasi minyak zaitun Mourad et al. (2005) L. plantarum C19 plantaricin C19 Fermentasi mentimun Atrih et al. (2001) L. plantarum BFE 905 plantaricin D Salad Franz et al. (1998) L. plantarum 423 plantaricin 423 Sorgum Van Reenen et al. (1998) L. plantarum LL441 plantaricin C Keju Cabrales Gonzales et al. (1994) Asal Isolasi Industri Tortilla Literatur Gong et al. (2010) Hidrogen Peroksida BAL memproduksi H2O2 di bawah kondisi pertumbuhan aerob. BAL mengsekresikan H2O2 tersebut sebagai alat pelindung diri yang mampu bersifat bakteriostatik maupun bakterisidal. H2O2 merupakan salah satu agen pengoksidasi kuat, dapat dijadikan sebagai zat antimikrob melawan bakteri, fungi dan bahkan virus (Ray dan Bhunia, 2008). 5 Kemampuan H2O2 untuk mengoksidasi menyebabkan perubahan tetap pada sistem enzim sel mikroba sehingga digunakan sebagai antimikrob. Selain itu, senyawa ini juga dapat terdekomposisi menjadi air dan oksigen. Kemampuan bakterisidal dari H2O2 tergantung pada pH, konsentrasi, suhu, waktu dan tipe serta jumlah mikroorganisme. Konsentrasi tertentu, spora bakteri ditemukan paling resisten terhadap H2O2, diikuti dengan bakteri Gram positif. Bakteri yang paling sensitif terhadap H2O2 adalah bakteri Gram negatif, terutama koliform (Ouwehand dan Vesterlund, 2004). Mekanisme Aksi Penghambatan oleh Bakteriosin Beberapa bakteriosin mempunyai sifat bakterisidal melawan beberapa strain dan spesies yang berelasi dekat tetapi beberapa dapat efektif melawan banyak strain dalam spesies dan genera yang berbeda. Namun, sel penghasil bakteriosin akan mengalami ketahanan terhadap bakteriosin yang dihasilkannya sendiri, disebabkan memperoleh ketahanan protein yang spesifik. Bakteriosin ini pada umumnya sangat efektif melawan sel dari bakteri Gram positif dan bakteri-bakteri lain yang kekerabatannya dekat. Bakteriosin asal BAL tidak efisien dalam menghambat bakteri Gram negatif karena membran terluarnya bersifat hidrofilik dan dapat menghalangi aksi bakteriosin. Membran sitoplasma dari mikroorganisme Gram negatif dikarakterisasi melalui keberadaan lapisan luar yang mengandung fosfolipida, protein, polisakarida, lemak, dan substansi non permeabel (Ray dan Bhunia, 2008). Aktivitas antimikrob bakteriosin merupakan interaksi awal antara molekulmolekul kationik dari bakteriosin dengan polimer-polimer anionik di permukaan sel, salah satunya adalah asam teikoat. Asam teikoat tersebut merupakan reseptor bakteriosin yang hanya dihasilkan oleh bakteri Gram positif. Selanjutnya, aksi bakterisidal dari bakteriosin melawan sel yang sensitif akan dihasilkan melalui destabilisasi fungsi dari membran sitoplasma, berupa peningkatan permeabilitas membran sehingga mengganggu keseimbangan barier dan dapat mengakibatkan kematian sel (Jack et al., 2005). Mekanisme lainnya antara lain perubahan aktivitas enzim, penghambatan germinasi spora dan inaktivasi pembawa anionik langsung membentuk pori-pori selektif dan non selektif (Ray dan Bhunia, 2008). 6 Pemurnian Protein Purifikasi Parsial Menggunakan Amonium Sulfat Penggunaan amonium sulfat dalam proses pemurnian protein telah banyak digunakan. Day dan Underwood (2002) menyatakan bahwa proses pengendapan merupakan awal proses pemurnian protein. Bahan yang biasa digunakan dalam mengendapkan protein dalam larutan adalah amonium sulfat. Amonium sulfat mampu membuka permukaan hidrofobik dari protein sehingga membentuk interaksi hidrofobik dan membentuk presipitat atau endapan protein (Walker, 2000). Proses pemurnian protein menggunakan amonium sulfat menghasilkan presipat yang masih tercemar dengan garam dari amonium sulfat sehingga dilakukan proses dialisis. Dialisis dapat menghilangkan pengotor-pengotor pada permukaan partikel protein (Day dan Underwood, 2002). Kromatografi Pertukaran Ion Proses kromatografi pertukaran ion menggunakan resin sebagai bahan yang dapat memurnikan protein. Day dan Underwood (2002) menyatakan bahwa resin pertukaran ion diperoleh dengan memasukkan gugus yang dapat diionisasi ke dalam matriks polimer. Secara komersial resin penukar ion terdiri dari resin penukar kation (bermuatan negatif) akan mengikat ion positif dan resin penukar anion (bermuatan positif) akan mengikat ion negatif. SP SepharoseTM merupakan salah satu penukar kation yang kuat dan merupakan kelompok sulfopropil yang stabil baik secara fisik maupun kimiawi (Wikstroms, 2002). Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan fisik, dimana komponenkomponen yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu lapisan stationer dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut disepanjang landasan stationer. Kromatografi pertukaran ion terdiri dari landasan stationer berupa padatan dan fasa bergerak berupa cairan (Day dan Underwood, 2002). Buffer yang digunakan dalam kromatografi penukar kation adalah buffer anion seperti asetat, barbiturat dan fosfat (Wilson, 2000). Protein tidak akan terikat pada resin penukar ion dan akan mengalir keluar kolom pada pH isoelektrik (pI). Protein akan bermuatan positif dan akan berikatan dengan penukar kation (SP Sepharose) ketika pH di bawah pH isoelektrik (pI). SP SepharoseTM mempunyai pH berkisar 4-13 (Wikstroms, 2002). 7 Mikroba Patogen pada Bahan Pangan Bakteri patogen dibedakan atas penyebab intoksikasi yaitu keracunan yang disebabkan oleh toksin yang dihasilkan bakteri patogen yang berkembang di dalam bahan makanan, sedangkan infeksi yaitu bakteri yang menghasilkan racun di dalam saluran pencernaan (Fardiaz, 1992). Bakteri secara umum dibedakan menjadi dua bagian berdasarkan sifat pewarnaan gram yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif tergantung pada komposisi dalam dinding sel. Dinding sel bakteri Gram positif sebagian besar terdiri dari lapisan peptidoglikan (90%) dan bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi pada dinding selnya dalam bentuk liposakarida dan lipoprotein (Fardiaz, 1992). Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif, disajikan pada Tabel 3. Tabel 3. Perbedaan Antara Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif Sifat Komposisi dinding sel Ketahanan terhadap antibiotik Penghambatan oleh pewarna basa Kebutuhan nutrien Ketahanana terhadap perlakuan fisik Bakteri Gram Positif lipida rendah (1-4%) lebih sensitif lebih dihambat relatif kompleks Gram Negatif lipida tinggi (11-12%) lebih tahan kurang dihambat kompleks sederhana lebih tahan kurang tahan Sumber: Buckle et al. (2007). Kelompok bakteri patogen yang bersifat Gram positif diantaranya Staphylococcus aureus, Listeria monocytigenes dan Bacillus cereus sedangkan bakteri yang bersifat Gram negatif diantaranya Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan Salmonella typhimurium. Staphylococcus aureus S. aureus termasuk famili Micrococcaceae, merupakan bakteri Gram positif, berbentuk kokus yang terdapat dalam bentuk tunggal, berpasangan tetrad atau kelompok, seperti buah anggur dengan diameter berkisar 0,5-1,5 µm, anaerob fakultatif, tidak bergerak, tidak berspora dan biasanya termasuk katalase positif (Ray dan Bhunia, 2008). Suhu optimum pertumbuhan S. aureus adalah 35-37 oC, suhu minimum 6,7 oC dan suhu maksimum 45,5 oC. Bakteri ini dapat tumbuh pada pH 8 4,0-9,8 dengan pH optimum sekitar 7,0-7,8. Hsieh et al. (1998) mencatat terjadinya peningkatan besar dalam sensitivitas S. aureus terhadap kation dan antimikrob pada kondisi pH alkali. Bacillus cereus B. cereus merupakan bakteri pembentuk spora tergolong dalam famili Bacillaceae. B. cereus adalah bakteri Gram positif berbentuk batang, bergerak, dapat membentuk spora, bersifat anaerobik fakultatif dan tersebar secara luas dalam tanah dan air. Kemampuan membentuk spora memungkinkan mikroorganisme ini tetap hidup pada pengolahan dengan pemanasan (Buckle et al., 2007). Ray dan Bhunia (2008), menyatakan bahwa sel bakteri ini sensitif terhadap pasteurisasi, namun sporanya dapat bertahan terhadap suhu tinggi. Suhu untuk pertumbuhan B. cereus berkisar 4-50 oC, dengan suhu optimum pertumbuhannya adalah 35-40 oC. Parameter pertumbuhan lainnya adalah bakteri ini dapat tumbuh pada pH 4,9-9,3 dengan aw minimum 0,95 serta konsentrasi NaCl adalah 10%. Torkar dan Matijasi (2003) menyatakan bahwa B. cereus stabil pada pH 3 hingga pH 10. Lebih lanjut, Padan et al. (2005) dalam penelitiannya menyatakan bahwa perubahan asam teikoat berkontribusi pada spesies Bacillus sp. pada pH alkali. Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa merupakan bakteri non-spora tergolong dalam famili Pseudomonadaceae. Pseudomonas merupakan salah satu jenis bakteri Gram negatif, berbentuk batang, berukuran 0,5-0,8 µm atau 1,5-3,0 µm, hampir semua strain adalah motil dengan flagela tunggal, oksidatif positif, suhu optimum pertumbuhan adalah 37-42 oC, aerob, tidak toleran terhadap penurunan aw serta tumbuh pada aw minimum 0,98, secara umum dapat ditemukan di tanah, air, di permukaan tanaman dan hewan. P. aeruginosa merupakan opportunistic pathogen, artinya bakteri ini akan menyerang kekebalan dari inangnya dan menyebabkan infeksi. Uji laboratorium terhadap P. aeruginosa menunjukkan bahwa bakteri ini tumbuh di media yang mengandung asam asetat sebagai sumber karbon dan amonium sulfat sebagai sumber nitrogen (Todar, 2009). Bakteri ini merupakan penyebab berbagai jenis kerusakan bahan pangan yang sebagian besar berhubungan dengan kemampuan spesies ini 9 dalam memproduksi enzim yang dapat memecah baik komponen lemak maupun protein dari bahan pangan (Buckle et al., 2007). Salmonella typhimurium Salmonella sp. merupakan kelompok bakteri Gram negatif dan merupakan bakteri patogen yang tidak diperkenankan ada dalam produk-produk pangan. Bakteri ini dapat tumbuh pada kisaran suhu 5-45 oC dengan suhu optimum 37 oC, pH optimum pertumbuhan adalah 6,5-7,5 (Portillo, 2000). Salmonella memiliki ketahanan panas yang tinggi pada pH 5,5 dan aw rendah. Salmonella berbentuk batang lurus, berukuran 0,7-1,5 µm x 2-5 µm, termasuk bakteri anaerob fakultatif dan biasanya dapat bergerak menggunakan flagela peritrikus. Salmonella dapat bergerak dengan metabolisme bersifat fakultatif anerob (Buckle et al., 2007). Bakteri Gram negatif seperti Salmonella sp., lebih tahan terhadap bakteriosin yang berasal dari BAL karena komposisi dari membrannya berbeda dengan mikroorganisme Gram positif (Ray dan Bhunia, 2008; Drosinos et al., 2009). Escherichia coli E. coli termasuk dalam famili Enterobacteriaceae merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk batang yang dengan ukuran 1,1-1,5 µm x 2,0-6,0 µm, soliter maupun berkoloni, anaerobik fakultatif dan katalase positif. E. coli dapat tumbuh optimum pada pH 7,0-7,5 dengan pH minimum 4,0 dan pH maksimum 8,5 (Fardiaz, 1992). Bakteri ini dapat tumbuh dalam kisaran suhu yang luas yaitu 1-45 °C (Pelczar dan Chan, 2007). Membran luar E. coli meningkatkan kelangsungan hidup bakteri ini dalam asam ekstrim, tetapi kelangsungan hidupnya berkurang di alkali ekstrim (Yohannes et al., 2005). Nilai pH Beberapa Produk Pangan Produk pangan terdiri atas produk pangan asam dan produk pangan alkali. Produk pangan asam merupakan produk pangan fermentasi yang mengandung asam, seperti seperti yogurt, sosis, keju, salami, dsb. Produk pangan alkali, seperti album telur (Sperber dan Doyle, 2009), natto dari kacang kedelai dan dadawa dari kacangkacangan (Wang dan Fung, 1996). Nilai pH olahan dari beberapa produk pangan dapat dilihat pada Tabel 4. 10 Tabel 4. Nilai pH Beberapa Produk Pangan Produk Pangan minuman bersoda keju cheddar daging giling susu ikan segar keju peram bubur jagung albumin telur nixtamalized corn Nilai pH 2,0 5,2 6,2 6,4 6,7 >7,0 8,5 8,6 10,0 Sumber: Sperber (2009). Konsumsi terhadap produk pangan alkali sangat bermanfaat untuk menjaga keseimbangan pH tubuh, menjaga kesehatan tulang dan menurunkan resistensi tubuh terhadap penyakit kronis, seperti hipertensi dan stroke (Schwalfenberg, 2012). 11 MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak dan Laboratorium Terpadu, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2011 hingga Oktober 2011. Materi Bahan-bahan utama yang digunakan adalah kultur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12, koleksi Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak, Fakultas Peternakan IPB. Bakteri indikator yang digunakan untuk uji antagonistik adalah S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus. Media yang digunakan yaitu de Man Rogosa and sharpe agar (MRSA), de Man Rogosa and shrape broth (MRSB), yeast extract, nutrien agar (NA), nutrient broth (NB), Mueller Hinton agar (MHA), amonium sulfat, membran saring Sartorius, buffer kalium fosfat pH 6,8 (campuran KH2PO4 dan K2HPO4), resin SP SepharoseTM fast-flow, kristal violet, larutan lugol iodin, safranin, etanol 95%, NaOH 1 N, HCl 1 N dan larutan Mc. Farland no. 0,5. Larutan pengencer yang digunakan adalah NaCl 0,85% dan akuades. Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, jarum Ose, autoclave, waterbath, cawan petri, timbangan, cooling box, gelas objek, gelas ukur, labu Erlenmeyer, mikro pipet, pipet Pasteur, pemanas Bunsen, sentrifuse, membran filter Millifore, alumunium foil, kapas, tip, botol Schott, ependorf, pH meter, kertas pH universal, jangka sorong digital, inkubator, oven, refrigerator, vortex, cork borer, mikroskop OPMIAS En Ver1.0 dan spektrofotometri UV-visible. Prosedur Penyegaran dan Pembiakan Kultur (Pelczar dan Chan, 2007) Penyegaran dilakukan dengan cara kultur L. plantarum dan bakteri indikator sebanyak 250 l diinokulasikan secara duplo pada media MRSB untuk kultur L. plantarum dan media NB untuk bakteri indikator sehingga dihasilkan kultur sebanyak 5 ml. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam untuk mendapatkan kultur antara. Sebanyak 1 ml kultur antara diinokulasikan kembali secara duplo pada media MRSB dan NB sehingga dihasilkan kultur sebanyak 10 ml. 12 Kultur diinkubasikan kembali sehingga didapatkan kultur kerja. Kultur kerja ditumbuhkan pada media MRSA untuk kultur L. plantarum dan NA untuk bakteri indikator, selanjutnya dihitung populasinya dan digunakan untuk pewarnaan Gram. Karakteristik Morfologi dan Pewarnaan Gram (Pelczar dan Chan, 2007) Kultur L. plantarum dan bakteri indikator yang tumbuh di media agar, diperikasa sifat morfologinya untuk mengetahui kemurniannya. Pengujian morfologi starter dengan bantuan pewarnaan Gram dan pengamatan dengan mikroskop pada perbesaran 1000 kali. Pengujian pewarnaan Gram dilakukan dengan cara kultur bakteri dioleskan pada gelas objek dengan jarum Ose dan difiksasi panas, kemudian ditetesi dengan kristal violet, dibiarkan selama ± 1 menit. Preparat selanjutnya dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan. Preparat yang sudah kering ditetesi dengan larutan lugol iodin dan didiamkan selama ± 1 menit, kemudian dibilas kembali dengan akuades dan preparat selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95% sebagai bahan pemucat selama ± 5 detik, dibilas kembali dengan akuades dan dikeringudarakan. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama ± 30 detik dan dibilas kembali dengan akuades, lalu preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diperiksa di bawah mikroskop. Bakteri dikelompokkan menjadi bakteri Gram positif, bila dapat mempertahankan zat warna ungu kristal dan tampak berwarna ungu tua. Kelompok bakteri Gram negatif akan terlihat berwarna merah. Hasil pengamatan morfologi kultur bakteri didokumentasikan menggunakan perangkat lunak OPMIAS En Ver1.0 yang dihubungkan pada mikroskop. Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel Sebanyak empat galur L. plantarum masing-masing diinokulasikan ke media MRSB dan diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam. Supernatan bebas sel disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit suhu 4 °C yang selanjutnya disebut supernatan. Supernatan disaring dengan membran saring Sartorius 0,22 µm kemudian dinetralkan dengan NaOH 1 N sampai pH 5,8-6,2. Supernatan yang merupakan ekstrak kasar bakteriosin tersebut siap untuk diuji aktivitasnya dengan metode difusi sumur. 13 Produksi dan Purifikasi plantaricin Purifikasi bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen senyawa kimia yang dapat terpisah dan kandungan senyawa aktifnya. Purifikasi plantaricin terdiri dari purifikasi parsial menggunakan presipitasi amonium sulfat, dialisis dan kromatografi kolom. Purifikasi Parsial Menggunakan Amonium Sulfat (Gong et al., 2010) Sebanyak 1 liter media MRSB ditambahkan yeast extract 3% dan NaCl 1% diinokulasi dengan 10% (v/v) kultur L. plantarum, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 20 jam. Setelah itu, disimpan pada refrigerator suhu 4 oC selama 2 jam kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit suhu 4 o C. Setelah selesai dilakukan penyaringan dengan menggunakan membran saring Sartorius diameter 0.22 µm dan selanjutnya supernatan bebas sel dinetralkan pH-nya menjadi 5,8-6,2 dengan menggunakan NaOH 1 N. Supernatan netral bebas sel yang telah disaring steril ditambahkan serbuk amonium sulfat sebanyak 80% secara bertahap (20%, 40%, 60%, 80%) kemudian dihomogenkan dan distirer secara perlahan pada suhu 4 oC selama 2 jam. Hasil yang didapat pada tahap ini adalah presipitat bakteriosin. Pengecekan protein presipitat bakteriosin diamati menggunakan spektrofotometer UV-visible pada panjang gelombang 280 nm. Penggunaan padatan amonium sulfat (% penjenuhan) dapat dilihat pada Lampiran 18. Dialisis (Day dan Underwood, 2002) Dialisis dilakukan dengan tujuan untuk desalting atau menghilangkan garam amonium sulfat yang masih tercampur dengan presipitat bakteriosin. Buffer yang digunakan adalah buffer kalium fosfat pH 6,8 (campuran KH2PO4 dan K2HPO4 dengan konsentrasi tertentu) dengan perbandingan 1:1000 (satu bagian presipitat dan 1000 bagian buffer). Dialisis dilakukan dengan menggunakan membran dialisis diameter 20 µm pada buffer kalium fosfat selama 12 jam, dan dilakukan penggantian buffer sebanyak 2 kali (2 jam dan 4 jam) pada suhu 4 oC. Setelah selesai, didapatkan ekstrak plantaricin kasar. Pengecekan protein plantaricin kasar hasil dialisis diamati menggunakan spektrofotometri UV-visible pada panjang gelombang 280 nm. 14 Purifikasi Plantaricin Menggunakan Kromatografi Kolom (Hata et al., 2010) Tahap selanjutnya adalah kromatografi kolom untuk plantaricin murni. Resin yang digunakan adalah SP Sepharose TM menghasilkan -fast flow dengan kolom terbuka (open column) Econo-Column Bio-Rad. Purifikasi parsial plantaricin menggunakan kromatografi kolom dengan resin SP SepharoseTM-fast flow dapat meningkatkan spesifik protein dari supernatan bebas sel sebesar 253 AU/mg dan meningkat kembali pada proses kromatografi kolom menggunakan SP SepharoseTMfast flow menjadi 11.900 AU/mg. Buffer yang digunakan adalah buffer potasium fosfat pH 6,8. Kolom terlebih dahulu diisi dengan resin. Plantaricin kasar hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan, dan dibawah kolom diberikan tabung penampung eluat yang keluar dari kolom. Proses kromatografi dilakukan pada suhu 4 oC. Eluat pertama adalah buffer dan selanjutnya adalah sampel plantaricin kasar. Kecepatan alir yang diberikan adalah 0,8 ml/menit. Fraksi plantaricin murni yang diperoleh ditampung setiap 3 ml per tabung penampung eluat. Pengecekan protein plantaricin murni hasil kromatografi kolom diamati menggunakan spektrofotometer UV-visible pada gelombang 280 nm. Stabilitas Protein Plantaricin pada pH Alkali (Hata et al., 2010) Plantaricin murni hasil purifikasi parsial menggunakan kromatografi kolom, digunakan dalam pengujian stabilitas plantaricin terhadap pH alkali. Plantaricin murni hasil kromatografi kolom diuji stabilitasnya terhadap pH yang berbeda, yaitu 1) pH 7 dan 2) pH 9. Plantaricin murni perlakuan pH alkali dilakukan dengan menambahkan larutan NaOH 1 N menggunakan mikro pipet secara perlahan kemudian dicek kondisi pH plantaricin murni menggunakan kertas pH universal hingga pH 9. Pengujian stabilitas protein plantaricin murni setelah perlakuan pH alkali dilakukan dengan melakukan pengecekan protein plantaricin murni menggunakan spektrofotometer UV-visible pada panjang gelombang 280 nm. Uji Aktivitas Antimikrob Plantaricin pada Kondisi Alkali terhadap Bakteri Indikator (Savadogo et al., 2006) Plantaricin murni hasil kromatografi kolom diuji dengan menggunakan metode difusi sumur. Kultur bakteri indikator patogen dan pembusuk makanan sebanyak 106 cfu/ml yang berumur 24 jam dipipet ke dalam cawan petri dan 15 ditambahkan media konfrontasi MHA sebanyak ± 20 ml. Setelah agar dalam cawan mengeras, ditengah-tengah agar dibuat lubang sumur dengan menggunakan cork borer berdiameter 5 mm. Plantaricin murni sebanyak 50 l dipipet ke dalam lubang sumur kemudian cawan dilapisi kertas saring terlebih dahulu sebelum ditutup dan disimpan dalam refrigerator (suhu ± 10 oC) selama 2 jam untuk memberikan kesempatan plantaricin meresap ke dalam agar. Seluruh cawan yang berisi bakteri indikator (S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus) dan plantaricin murni asal empat galur L. plantarum diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Zona hambat yang terbentuk di sekitar sumur pada seluruh cawan diamati dan diukur diameternya dengan menggunakan jangka sorong. Diameter dari masing-masing zona hambat diukur sebanyak tiga kali di daerah yang berbeda yang kemudian hasilnya dirata-ratakan. Setiap pengujian diulang sebanyak tiga kali dan pada setiap ulangan dilakukan secara duplo (Gambar 1). Zona hambat yang diperoleh dikategorikan menurut daya hambatnya, dapat dilihat pada Tabel 5. Keterangan: A : Sumur untuk plantaricin murni (diameter 5 mm) C B A B : Zona hambat C : Koloni bakteri indikator Garis / / : Pengukuran diameter zona Gambar 1. Metode Pengukuran Diameter Zona Hambat Bakteri. Tabel 5. Kategori Zona Hambat Bakteri Zona Hambat Bakteri Kategori ≥ 20 mm Sangat kuat 10-20 mm Kuat 5-10 mm Sedang ≤ 5 mm Lemah Sumber: Davis dan Stout (1971). 16 Rancangan dan Analisis Data Rancangan dan analisis data pada penelitian ini meliputi identifikasi aktivitas antimikrob supernatan bebas sel asal galur L. plantarum, konsentrasi protein plantaricin pada masing-masing tahap produksi plantaricin, stabilitas dan aktivitas plantaricin terhadap perlakuan pH alkali. Identifikasi Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dengan faktor perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dan jenis bakteri indikator (S. typhimurium ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus) dengan tiga ulangan. Peubah yang diamati yaitu diameter zona hambat supernatan netral bebas sel. Data dialisis secara deskriptif untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang diperoleh. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: Yij =  + αi + εij Keterangan: Yij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i galur L. plantarum dan ulangan ke-j (j= 1, 2, 3)  = Pengaruh rata-rata galur L. plantarum αi = Pengaruh level perlakuan ke-i dari level perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (i= 1, 2, 3, 4) εij = Pengaruh Galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j Produksi Plantaricin Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dengan faktor perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dengan tiga kali ulangan. Peubah yang diamati yaitu konsentrasi protein plantaricin pada masing-masing tahap produksi plantaricin. Data dialisis secara deskriptif untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang diperoleh. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: 17 Yij =  + αi + εij Keterangan: Yij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i galur L. plantarum dan ulangan ke-j (j= 1, 2, 3)  = Pengaruh rata-rata galur L. plantarum αi = Pengaruh level perlakuan ke-i dari level perlakuan galur L. plantarum yang berbeda (i= 1, 2, 3, 4) εij = Pengaruh Galat perlakuan ke-i pada ulangan ke-j Stabilitas dan Aktivitas Plantaricin terhadap Perlakuan pH Alkali Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial 2 x 4. Faktor pertama adalah perbedaan pH (pH 7 dan pH 9), sedangkan faktor kedua adalah perbedaan galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dengan tiga ulangan. Peubah yang diamati adalah diameter zona hambat hasil uji antagonistik dari plantaricin dengan perlakuan pH berbeda dan plantaricin asal galur L. plantarum yang berbeda. Data diolah dengan analisis ragam (uji parametrik) atau analysis of variance (ANOVA). Setiap analisis ragam yang menunjukkan bahwa perlakuan berpengaruh nyata, maka dilanjutkan dengan uji Tukey. Apabila data tidak memenuhi analisis ragam maka dilanjutkan uji non parametrik (Kruskall-Wallis). Pembahasan secara deskriptif juga dilakukan untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang telah diperoleh. Model matematis yang digunakan berdasarkan Steel dan Torrie (1995) sebagai berikut: Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk Keterangan: Yijk = variabel respon akibat pengaruh perlakuan pH pada taraf ke-i dan galur L. plantarum ke-j pada ulangan ke-k (K= 1, 2, 3) µ = nilai tengah umum αi = pengaruh taraf perlakuan pH ke-i terhadap diameter zona hambat (i= pH 7 dan pH 9) βj = pengaruh taraf perlakuan galur L. plantarum ke-j terhadap diameter zona hambat (j= L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) (αβ)ij = pengaruh interaksi antara perlakuan ke-i dengan ke-j εijk = pengaruh galat percobaan ke-i dan ke-j terhadap ulangan ke-k, k= 1, 2, 3 18 HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Morfologi Sel dan Pewarnaan Gram Karakteristik morfologi L. plantarum yang telah didapat adalah Gram positif, berbentuk batang tunggal dan koloni berantai pendek. Karakteristik morfologi tersebut sesuai dengan Ray dan Bhunia (2008) bahwa L. plantarum tergolong bakteri Gram positif, berbentuk batang tunggal maupun rantai pendek. Pemeriksaan karakteristik kultur bakteri bertujuan untuk memastikan kemurnian kultur bakteri yang digunakan. Karakteristik morfologi yang diperoleh tersebut menunjukkan bahwa kultur homogen dan tidak tercemar, seperti yang diperoleh dalam penelitian sebelumnya (Hidayati, 2006; Permanasari, 2008). Karakteristik morfologi kelima bakteri indikator yang digunakan, antara lain P. aeruginosa ATCC 27853 dan B. cereus berbentuk batang. Buckle et al. (2007) menyatakan bahwa bakteri P. aeruginosa dan B. cereus memiliki morfologi berbentuk batang. Hasil karakteristik morfologi bakteri S. typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922 adalah berbentuk batang soliter maupun berkoloni sedangkan S. aureus ATCC 25923 berbentuk kokus dalam susunan tunggal maupun berkoloni seperti buah anggur. Ray dan Bhunia (2008) menyatakan bahwa S. typhimurium memiliki morfologi berbentuk batang lurus, E. coli berbentuk batang, sedangkan S. aureus berbentuk kokus, tetrad dan berpasangan seperti buah anggur. Bakteri secara umum dibedakan menjadi dua berdasarkan pewarnaan Gram, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Pewarnaan Gram merupakan suatu teknik pewarnaan secara mikroskopis untuk menentukan jenis bakteri sebagai bakteri Gram positif dan Gram negatif dan sering digunakan untuk pengujian kemurnian suatu bakteri. Teknik ini terdiri dari empat tahap, yaitu (a) tahap awal pewarnaan dengan kristal violet, (b) fiksasi dengan iodin, (c) dekolorisasi dengan etanol dan (d) pewarnaan dengan safranin. Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif tergantung pada komposisi dinding sel (Pelczar dan Chan, 2007). Hasil pewarnaan Gram terhadap kultur L. plantarum, serta bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dan B. cereus menunjukkan bahwa bakteri-bakteri tersebut tergolong dalam bakteri Gram positif. Hal ini disebabkan pada proses pewarnaan Gram, kultur L. plantarum serta bakteri indikator S. aureus ATCC 25923 dan B. cereus menyerap warna ungu yang berasal dari kompleks antara kristal violet dengan 19 iodin dan tetap mempertahankan warna ungu tersebut meskipun telah ditambahkan alkohol 95% dan zat warna safranin. Bakteri P. aeruginosa ATCC 27853, S. typhimurium ATCC 14028 dan E. coli ATCC 25922, berdasarkan hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa ketiga bakteri ini tergolong dalam bakteri Gram negatif. Hal ini disebabkan ketiga bakteri tersebut tidak dapat mempertahankan warna ungu dari zat pewarna kristal violet saat ditambahkan alkohol 95% serta menyerap warna merah yang berasal dari safranin. Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif tergantung pada komposisi dalam dinding sel (Pelczar dan Chan, 2007). Dinding sel bakteri Gram positif sebagian besar terdiri dari lapisan peptidoglikan (90%). Pelczar dan Chan (2007) menyatakan bahwa bakteri Gram positif mempertahankan warna ungu disebabkan dinding sel mengalami dehidrasi ketika ditetesi alkohol, sehingga poripori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menurun. Keadaan ini membuat kompleks kristal violet dengan iodin tidak dapat keluar dari sel, akibatnya zat warna safranin tidak dapat masuk ke dalam dinding sel. Dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi dalam bentuk lipopolisakarida dan lipoprotein (Fardiaz, 1992). Lipida pada dinding sel bakteri Gram negatif akan larut oleh alkohol sehingga pori-pori mengembang dan menyebabkan kompleks kristal violet dengan iodin keluar dari sel, akibatnya dinding sel bakteri menjadi tidak berwarna. Dinding sel bakteri yang tidak berwarna tersebut akan menyerap zat warna safranin sehingga sel bakteri akan tampak berwarna merah ketika dilihat dibawah mikroskop (Pelczar dan Chan, 2007). Hasil pewarnaan Gram dan pengamatan morfologi dari kultur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 serta bakteri indikator secara mikroskopis dapat dilihat pada Tabel 6 dan 7. 20 Tabel 6. Karakteristik Isolat L. plantarum Isolat L. plantarum Pewarnaan Gram L. plantarum 1A5 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek L. plantarum 1B1 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek L. plantarum 2B2 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek L. plantarum 2C12 Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek Morfologi Gambar Morfologi (Pembesaran 10x100) 21 Tabel 7. Karakteristik Isolat Bakteri Indikator Isolat Bakteri Indikator Pewarnaan Gram Morfologi E. coli ATCC 25922 Gram Negatif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek P. aeruginosa ATCC 27853 Gram Negatif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek S. typhimurium ATCC 14028 Gram Negatif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek B. cereus Gram Positif Batang, susunan tunggal maupun rantai pendek S. aureus ATCC 25923 Gram Positif Bulat, bergerombol seperti buah anggur Gambar Morfologi (Pembesaran 10x100) Keterangan: Kultur Koleksi Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak Tahun 2011, Fakultas Peternakan IPB, ATCC; American Type Culture Collection 22 Aktivitas Antimikrob Supernatan Bebas Sel Kondisi asam dalam supernatan bebas sel akan mengurangi kemampuan bakteriosin dalam menghambat bakteri indikator pada uji antagonistik. Oleh karena itu, supernatan bebas sel yang dihasilkan dinetralkan hingga mencapai kondisi pH 5,8-6,2. Produksi maksimum dari bakteriosin didapatkan pada kondisi pH 6,5 dari rentang pH 2 hingga pH 10, dan bakteriosin kehilangan aktivitas antimikrob pada pH 12 (Bhattacharya dan Arijit, 2010). Kondisi pH supernatan bebas sel asal L. plantarum, dapat dilihat pada Gambar 2. Nilai pH 6.50 5.50 4.50 3.50 2.50 1.50 pHawal awal pH pH netral pH netral 1A5 4,024.01 ± 0,04 6.11 6,11 ± 0,34 1B1 1B1 3.94 3,94 ± 0,11 5.87 5,87 ± 0,12 2B2 2B2 4.00 4,00 ± 0,02 6.17 6,17 ± 0,31 2C12 3,983.98 ± 0,01 6.04 6,04 ± 0,16 Galur L. plantarum Keterangan: pH awal pH netral = pH initial supernatan bebas sel = pH netral supernatan bebas sel setelah penambahan NaOH 1 N Gambar 2. Kondisi pH Supernatan Bebas Sel asal Galur L. plantarum pada Media MRSB dengan Yeast Extract (3%) dan NaCl (1%). Nilai pH supernatan bebas sel berkisar 3,94-4,02. Kondisi asam dari supernatan bebas sel ini disebabkan oleh adanya asam-asam organik yang terbentuk sebagai metabolit primer dari bakteri asam laktat yang akan menghambat pertumbuhan bakteri. Nilai pH supernatan bebas sel setelah penetralan berkisar 5,87-6,17. Asam organik rantai pendek, seperti asam asetat dan asam laktat merupakan metabolit primer dari supernatan bebas sel yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat (Fardiaz, 1992; Jay et al., 2005; Settanni dan Corsetti, 2008). Aktivitas antimikrob supernatan netral bebas sel diuji melalui aktivitasnya terhadap bakteri indikator. Hasil uji antagonistik supernatan netral bebas sel asal empat galur L. plantarum terhadap masing-masing bakteri indikator ditunjukkan dengan adanya diameter zona hambat disekitar sumur konfrontasi, dapat dilihat pada Tabel 8. 23 Tabel 8. Diameter Zona Hambat Supernatan Netral Bebas Sel asal Galur L. plantarum terhadap Bakteri Indikator Bakteri Indikator Supernatan Netral Bebas Sel asal Galur L. plantarum 1A5 1B1 2B2 2C12 --------------------------------- mm ------------------------------- E. coli 15,73 ± 0,31 15,22 ± 0,87 9,74 ± 1,36 10,93 ± 1,40 S. aureus 17,72 ± 1,27 16,21 ± 0,49 15,01 ± 1,54 10,46 ± 1,40 S. typhimurium 18,00 ± 0,64 13,09 ± 0,30 9,13 ± 0,64 14,55 ± 3,45 B. cereus 16,30 ± 1,42 15,02 ± 1,56 11,05 ± 0,39 7,46 ± 0,91 P. aeruginosa 16,86 ± 0,84 13,37 ± 0,96 13,50 ± 1,12 10,32 ± 0,92 Keterangan : Diameter lubang sumur (5 mm) termasuk kedalam diameter zona hambat Rataan diameter zona hambat dari masing-masing galur L. plantarum berbeda-beda. Perbedaan aktivitas hambat dikarenakan bakteriosin mempunyai aktivitas hambat terhadap bakteri spesifik, dan biasanya mempunyai hubungan kekerabatan (filogenik) serta tergantung pada perbedaan jenis dinding sel bakteri yang dihambat yang berpengaruh pada ketahanan suatu bakteri terhadap zat antimikrob (Usmiati et al., 2009). Rataan diameter zona hambat dari supernatan netral bebas sel berkisar 7,46-18,00 mm (Tabel 8). Rataan diameter zona hambat dari supernatan netral bebas sel termasuk dalam kategori kuat (Davis dan Stout, 1971). Supernatan netral bebas sel dari keempat galur L. plantarum mampu menghambat bakteri indikator. Hasil ini sama dengan yang diperoleh Omemu dan Faniran (2011) yang menyatakan bahwa supernatan netral bebas sel asal L. plantarum mampu menghambat bakteri patogen. Keempat galur L. plantarum mampu menghambat bakteri dari strain bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif seperti E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 dan S. typhimurium ATCC 14028, lebih tahan terhadap bakteriosin yang berasal dari L. plantarum karena komposisi dari membrannya berbeda dengan bakteri Gram positif. Hal ini berbeda dengan Drosinos et al. (2009) yang menyatakan bahwa bakteriosin asal L. plantarum hanya akan menghambat bakteri Gram positif atau bakteri-bakteri yang berkerabat dekat dengan spesies penghasil, serta tidak efisien dalam menghambat bakteri Gram negatif karena membran terluarnya bersifat hidrofilik dan dapat menghalangi aksi bakteriosin. Lebih lanjut Ray dan Bhunia (2008) menyatakan bahwa keberadaan lapisan luar 24 yang mengandung fosfolipida, protein, polisakarida, lemak dan substansi non permeabel akan mempengaruhi aktivitas antimikrob bakteriosin dalam menghambat bakteri Gram negatif. Bakteriosin asal L. plantarum dikarakterisasi sebagai kompleks protein, sangat sensitif terhadap perubahan pH lingkungan. Perubahan pH lingkungan berpengaruh terhadap bakteriosin yang dihasilkan, selain pengaruh nutrien dan temperatur (Todorov dan Dicks, 2005). Penurunan pH dalam bakteriosin asal L. plantarum akan mempengaruhi susunan protein dari bakteriosin tersebut, sehingga mempengaruhi aktivitas penghambatan senyawa antimikrob yang dihasilkan. Oleh karena itu, supernatan netral bebas sel yang diperoleh perlu dilakukan tahap lanjutan berupa purifikasi parsial. Purifikasi Parsial Plantaricin Hasil kuantitatif kadar protein dari setiap tahapan purifikasi parsial plantaricin menggunakan amonium sulfat, dialisis, dan purifikasi parsial menggunakan kromatografi kolom dari masing-masing galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12, dapat dilihat pada Gambar 3. Secara deskriptif, hasil kuantitatif ini menunjukkan bahwa rataan konsentrasi protein yang dihasilkan oleh galur L. plantarum 1A5, 1B1, dan 2B2 merupakan nilai yang lebih tinggi dibandingkan dengan galur L. plantarum 2C12. Rataan kadar protein plantaricin kasar dari galur L. plantarum menunjukkan terjadinya peningkatan dari presipitat bakteriosin menjadi plantaricin kasar kecuali galur L. plantarum 2C12. Ekstrak plantaricin kasar dari keempat galur L. plantarum menunjukkan jenis protein yang hidrofobik karena posisi endapan protein yang terpresipitasi berada melayang di bagian atas supernatan bebas sel. Abo-Amer (2007) menyatakan hal ini sebagai karakteristik protein yang hidrofobik terhadap plantaricin AA135 yang dihasilkan oleh L. plantarum AA135. Karakteristik protein hidrofobik dari ekstrak plantaricin kasar sangat diperlukan untuk aktivitasnya dalam menghambat bakteri karena penghambatan oleh plantaricin tergantung pada interaksi hidrofobik antara sel-sel bakteri dengan molekul-molekul plantaricin (Parada et al., 2007). Lebih lanjut Jack et al. (2005) menyatakan bahwa interaksi antara molekulmolekul kationik dari plantaricin dengan polimer-polimer anionik di permukaan sel bakteri akan menyebabkan destabilisasi fungsi dari membran sitoplasma sel bakteri, 25 berupa peningkatan permeabilitas membran sehingga mengganggu keseimbangan Konsentrasi Protein (mg/ml) barier dan akan mengakibatkan kematian sel bakteri. 160 140 120 100 80 60 40 20 0 PresipitatBakteriosin Bakteriosin Presipitat Plantaricin Kasar Plantaricin Kasar Plantaricin Murni Plantaricin Murni 1A5 1A5 24.08 24,08 ± 12,40 56.65 56,65 ± 25,18 46.53 46,53 ± 18,22 1B1 1B1 24.61 24,61 ± 12,57 71.19 71,19 ± 30,95 158.74 158,74 ± 45,06 2B2 2B2 15.62 15,62 ± 6,85 44.59 44,59 ± 20,97 103.88 103,88 ± 30,39 2C12 2C12 3.41 3,41 ± 0,46 0.96 0,96 ± 0,36 13.31 13,31 ± 2,24 Galur L. plantarum Keterangan: Presipitat Bakteriosin = Hasil Purifikasi Parsial dengan Amonium Sulfat Plantaricin Kasar = Hasil Dialisis Plantaricin = Hasil Purifikasi Parsial dengan Kromatografi Kolom Gambar 3. Konsentrasi Protein pada Tahap Purifikasi Parsial Plantaricin asal Galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12). Kadar protein plantaricin meningkat kembali setelah proses purifikasi menggunakan kromatografi kolom dari plantaricin kasar menjadi plantaricin murni, kecuali galur L. plantarum 1A5. Rataan konsentrasi protein plantaricin murni dari yang terbesar berturut-turut adalah galur L. plantarum 1B1, 2B2, 1A5 dan 2C12. Stabilitas Protein Plantaricin terhadap pH Alkali Pengujian stabilitas plantaricin dari keempat galur L. plantarum terhadap pH alkali secara in vitro dilakukan pada pH 9, menunjukkan tingkat kesensitifan yang tinggi pada plantaricin yang diproduksi oleh keempat galur L. plantarum. Hubungan antara kondisi pH lingkungan dengan konsentrasi protein plantaricin dari keempat galur L. plantarum, dapat dilihat pada Gambar 4. 26 Konsentrasi Protein (mg/ml) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 pH pH 7 7 pH 9 pH 9 1A5 1A5 46.53 46,53 ± 18,22 41.71 41,71 ± 14,38 1B1 1B1 158.74 158,74 ± 45,06 99.84 99,84 ± 28,34 2B2 2B2 103.88 103,88 ± 30,39 69.42 69,42 ± 19,95 2C12 2C12 13.31 13,31 ± 2,24 9.78 9,78 ± 0,84 Plantaricin asal Galur L. plantarum Keterangan: pH 7 =Plantaricin tanpa Perlakuan pH Alkali (kontrol) pH 9 =Plantaricin dengan Perlakuan pH Alkali Gambar 4. Konsentrasi Protein Plantaricin asal Galur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) terhadap pH Alkali. Peningkatan pH lingkungan dalam plantaricin dari pH 7 ke pH 9 menurunkan konsentrasi protein plantaricin dari masing-masing galur L. plantarum (Gambar 4). Hal ini menunjukkan adanya pengaruh pH alkali terhadap jumlah protein dalam plantaricin. Kemampuan suatu senyawa antimikrob dalam menghambat pertumbuhan mikroba dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain pH, waktu penyimpanan, suhu lingkungan, sifat-sifat mikroba (jenis, konsentrasi, umur dan keadaan mikroba), jenis dan jumlah senyawa di dalamnya (Fardiaz, 1992). Rataan persentase penurunan konsentrasi protein plantaricin dari L. plantarum 1A5 sebesar 5%, plantaricin L. plantarum 1B1 sebesar 22%, plantaricin L. plantarum 2B2 sebesar 36%, serta plantaricin L. plantarum 2C12 sebesar 27% (Lampiran 19). Meskipun plantaricin dari keempat galur L. plantarum mengalami penurunan konsentrasi protein, plantaricin dari keempat galur L. plantarum tersebut memiliki ketahanan yang cukup baik terhadap pH alkali dibuktikan dengan persentase penurunan protein sebesar <40%. Hasil penelitian ini menunjukan adanya pengaruh pH alkali terhadap plantaricin dari keempat galur L. plantarum. Gonzales et al. (1994) menyatakan hal serupa, bahwa plantaricin C menghasilkan bakteriosin yang stabil pada pH asam dan pH netral, namun aktivitas antimikrob plantaricin C menurun pada kondisi pH alkali. 27 Kondisi alkali dapat menginduksi solubilitas dari lapisan protein (Duncan et al., 1972). Hal ini memperkuat dugaan bahwa plantaricin dari keempat galur L. plantarum merupakan komponen antimikrob berbahan protein, yang bila dalam kondisi alkali akan terhidrolisis, sehingga menyebabkan penurunan aktivitas antimikrob dalam menghambat bakteri patogen. Penelitian ini selain mengetahui stabilitas protein plantaricin terhadap pH alkali, juga diamati uji antagonistik plantaricin terhadap bakteri indikator melalui uji difusi sumur. Hasil uji antagonistik plantaricin asal galur L. plantarum terhadap masing-masing bakteri indikator ditunjukkan dengan adanya diameter zona hambat. Uji Aktivitas Antimikrob Plantaricin pada Bakteri Indikator Terhadap pH Alkali Escherichia coli ATCC 25922 Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin setelah perlakuan pH alkali terhadap E. coli ATCC 25922, dapat dilihat pada Tabel 9. Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin tidak dipengaruhi oleh interaksi antara perlakuan pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Hasil ini menunjukkan bahwa plantaricin memiliki aktivitas penghambatan terhadap E. coli ATCC 25922 yang sama tanpa dipengaruhi oleh pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Tabel 9. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap E. coli ATCC 25922 pH 7* Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) --------------------------------------9,43 ± 1,53 9,72 ± 0,22 9,52 ± 2,17 8,16 ± 0,23 9,21 ± 1,04 pH 9 9,17 ± 0,52 8,52 ± 0,51 9,08 ± 0,63 7,84 ± 0,30 Rata-rata 9,30 ± 1,03 9,12 ± 0,37 9,30 ± 1,40 8,00 ± 0,27 Perlakuan 8,65 ± 0,49 Keterangan: Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 berkisar 8,00-9,30 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori sedang (Davis dan Stout, 1971). E. coli termasuk bakteri Gram negatif dengan pH pertumbuhan optimum pada 7,0-7,5 (Fardiaz, 1992). Aktivitas penghambatan plantaricin dari keempat galur L. 28 plantarum terhadap E. coli ATCC 25922 disebabkan oleh pH lingkungan yang tidak sesuai bagi pertumbuhan E. coli ATCC 25922. Yohannes et al. (2005) menyatakan bahwa membran luar dari E. coli, pertumbuhannya menurun pada lingkungan alkali. Salmonella typhimurium ATCC 14028 Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum pada pH alkali terhadap S. typhimurium ATCC 14028, disajikan pada Tabel 10. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa rataan diameter zona hambat tidak dipengaruhi oleh adanya interaksi antara perlakuan pH alkali dan galur L. plantarum. Perlakuan pH yang berbeda berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap diameter zona hambat. Hal ini menunjukkan bahwa stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin menurun akibat pengaruh pH alkali. Tabel 10. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S. typhimurium ATCC 14028 pH 7* Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) ---------------------------------------9,40 ± 1,11 8,98 ± 1,07 8,82 ± 1,12 8,91 ± 0,55 9,03 ± 0,96a pH 9 8,47 ± 0,66 8,52 ± 0,67 8,11 ± 1,00 8,22 ± 0,48 Rata-rata 8,94 ± 0,89 8,75 ± 0,87 8,47 ± 1,06 8,57 ± 0,52 Perlakuan 8,33 ± 0,70b Keterangan: Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan nyata (P<0,05) Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum terhadap pH yang berbeda berkisar 8,33-9,03 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori sedang (Davis dan Stout, 2004). Plantaricin dari keempat galur L. plantarum masih dapat menghambat S. typhimurium ATCC 14028 dari strain bakteri Gram negatif meskipun dengan aktivitas antimikrob plantaricin yang menurun. Portillo (2000) menyatakan bahwa Salmonella sp. merupakan bakteri Gram negatif dan pH pertumbuhan optimum pada 6,5-7,5. Aktivitas penghambatan plantaricin dari keempat galur L. plantarum terhadap S. typhimurium ATCC 14028 disebabkan oleh pH lingkungan yang tidak sesuai bagi pertumbuhan S. typhimurium ATCC 14028. Lebih lanjut Ogunbanwo et al. (2003) menyatakan bahwa bakteriosin dari L. plantarum F1 dan L. brevis OG1 29 dapat menghambat bakteri Gram negatif seperti S. typhimurium. Aktivitas penghambatan plantaricin terhadap S. typhimurium ATCC 14028, dapat dilihat pada Gambar 5. Zona Hambat Zona Hambat (A) Keterangan: (B) A = pH 7 (Kontrol) B = pH 9 (Alkali) Gambar 5. Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum 1A5 terhadap S. typhimurium ATCC 14028: (A) L. plantarum 1A5 pada pH 7 (kontrol) dan (B) L. plantarum 1A5 pada pH 7 (alkali). Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin dari keempat galur L. plantarum setelah perlakuan pH alkali terhadap P. aeruginosa ATCC 27853, dapat dilihat pada Tabel 11. Analisis ragam menunjukkan bahwa aktivitas antimikrob plantaricin terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 tidak dipengaruhi oleh interaksi antara galur L. plantarum dengan perlakuan pH. Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin terhadap P. aeruginosa ATCC 27853, sangat nyata (P<0,01) dipengaruhi oleh galur L. plantarum. Tabel 11. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 Perlakuan Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) --------------------------------------- pH 7* 9,03 ± 1,70 9,10 ± 1,55 8,37 ± 1,09 16,42 ± 4,46 10,37 ± 2,20 pH 9 8,16 ± 0,33 8,47 ± 0,93 8,39 ± 0,67 15,25 ± 4,33 10,07 ± 1,57 Rata-rata 8,60 ± 1,02B 8,79 ± 1,24AB 8,38 ± 0,88B 15,84 ± 4,40A Keterangan: Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan nyata (P<0,01) Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol 30 Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 berkisar 8,38-15,84 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori kuat (Davis dan Stout, 1971). Interaksi antara pH dengan galur L. plantarum yang berbeda tidak mempengaruhi aktivitas plantaricin terhadap P. aeruginosa ATCC 27853. Hal ini menunjukkan bahwa plantaricin dari keempat galur L. plantarum terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 mempunyai aktivitas penghambatan yang tidak berbeda. Hasil uji lanjut menunjukkan bahwa galur L. plantarum 2C12 menghasilkan rataan diameter zona hambat yang berbeda nyata (P<0,01) terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 dengan galur L. plantarum lainnya. Namun, galur L. plantarum 2C12 menunjukkan aktivitas yang tidak berbeda nyata dengan galur L. plantarum 1B1 (P<0,01). P. aeruginosa merupakan opportunistic pathogen, artinya bakteri ini akan menyerang kekebalan dari inangnya dan menyebabkan infeksi (Todar, 2009). Selain itu, kemampuan dari P. aeruginosa dalam memproduksi enzim yang dapat memecah komponen lemak dan protein (Buckle et al., 2007). Staphylococcus aureus ATCC 25923 Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin setelah perlakuan pH alkali terhadap S. aureus ATCC 25923, dapat dilihat pada Tabel 12. Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin tidak dipengaruhi oleh interaksi antara perlakuan pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Hasil ini menunjukkan bahwa plantaricin memiliki aktivitas penghambatan terhadap S. aureus ATCC 25923 yang sama tanpa dipengaruhi oleh pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Tabel 12. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S. aureus ATCC 25923 pH 7* Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) --------------------------------------8,51 ± 0,35 8,50 ± 0,64 8,65 ± 0,85 11,96 ± 1,58 9,41 ± 0,86 pH 9 8,54 ± 0,61 8,57 ± 0,74 8,23 ± 0,63 9,31 ± 1,49 Rata-rata 8,53 ± 0,48 8,54 ± 0,69 8,44 ± 0,74 10,64 ± 1,54 Perlakuan 8,66 ± 0,87 Keterangan: Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol 31 Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 berkisar 8,44-10,64 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori sedang (Davis dan Stout, 1971). Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin stabil setelah perlakuan pH alkali terhadap S. aureus ATCC 25923. S. aureus termasuk bakteri Gram positif, tumbuh pada pH 4,0-9,8 dengan pH optimum pertumbuhan pada 7,0-7,8 (Ray dan Bhunia, 2008). Hsieh et al. (1998) menyatakan bahwa terjadinya peningkatan besar dalam sensitivitas S. aureus terhadap kation dan aktivitas antimikrob pada kondisi pH alkali. Bacillus cereus Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin setelah perlakuan pH alkali terhadap B. cereus, dapat dilihat pada Tabel 13. Stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin tidak dipengaruhi oleh interaksi antara perlakuan pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Hasil ini menunjukkan bahwa plantaricin memiliki aktivitas penghambatan yang sama tanpa dipengaruhi oleh pH yang berbeda dan galur L. plantarum yang berbeda. Tabel 13. Diameter Zona Hambat Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap B. cereus pH 7* Plantaricin Asal Galur L. plantarum Rata-rata 1A5 1B1 2B2 2C12 ------------------------------------ (mm) --------------------------------------8,92 ± 1,14 9,10 ± 0,77 8,86 ± 0,90 8,57 ± 0,59 8,86 ± 0,85 pH 9 8,45 ± 0,58 8,89 ± 0,61 8,97 ± 0,97 9,15 ± 1,02 Rata-rata 8,69 ± 0,86 9,00 ± 0,69 8,92 ± 0,94 8,86 ± 0,81 Perlakuan 8,87 ± 0,80 Keterangan: Diameter lubang sumur ± 5 mm (termasuk ke dalam zona hambat) * = Kontrol Rata-rata zona hambat aktivitas antimikrob plantaricin asal empat galur L. plantarum berkisar 8,69-9,00 mm. Rataan diameter zona hambat tersebut termasuk dalam kategori sedang (Davis dan Stout, 1971). Torkar dan Matijasi (2003) menyatakan bahwa B. cereus stabil pada pH 3 hingga pH 10. Lebih lanjut, Padan et al. (2005) dalam penelitiannya menyatakan bahwa perubahan asam teikoat berkontribusi pada spesies Bacillus sp. pada pH alkali. Gonzales et al. (1994) juga menyatakan bahwa plantaricin C dapat menghambat pertumbuhan sel vegetatif B. cereus. 32 Plantaricin yang dihasilkan oleh keempat galur L. plantarum mampu menghambat bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif, serta stabil terhadap perlakuan pH alkali namun aktivitas antimikrob plantaricin menurun akibat perlakuan pH alkali terhadap S. typhimurium. Hal ini sesuai dengan penelitian Gong et al. (2010) yang menyatakan bahwa plantaricin MG dari L. plantarum KLDS1.0391 menghasilkan senyawa antimikrob yang stabil pada pH 2 hingga pH 10 serta mampu menghambat bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (E. coli, Pseudomonas sp., Salmonella sp.) dengan nilai aktivitas penghambatan terbesar terhadap E. coli dan S. typhimurium namun tidak terhadap Lactobacillus sp. Karakteristik stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin terhadap pH alkali menunjukkan potensi plantaricin untuk dapat digunakan sebagai biopreservatif dalam produk pangan alkali. 33 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Medium alkali mempengaruhi stabilitas aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2, dan 2C12 yang ditunjukkan dengan turunnya konsentrasi protein dari masing-masing galur L. plantarum. Aktivitas antimikrob plantaricin terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 dipengaruhi oleh galur L. plantarum yang berbeda. Plantaricin asal galur L. plantarum stabil terhadap pH alkali namun aktivitas antimikrob plantaricin menurun akibat perlakuan pH alkali terhadap S. typhimurium ATCC 14028. Karakteristik stabilitas plantaricin terhadap pH alkali menunjukkan potensi plantaricin untuk dapat digunakan sebagai biopreservatif dalam produk pangan alkali. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan nilai optimum stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 terhadap pH alkali dengan spektrum yang lebih luas (pH 10 hingga pH 12). Perlu juga dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai karakteristik kuantitatif protein plantaricin pada pH alkali menggunakan Elektroforesis SDS-Page. Penelitian mengenai toksikologi plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 perlu untuk dilakukan sebelum plantaricin digunakan sebagai biopreservatif dalam pengolahan produk pangan alkali. 34 UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan nikmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Shalawat serta salam semoga tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW, beserta para keluarga, sahabat serta para pengikutnya hingga akhir zaman. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si. sebagai pembimbing utama dan Dr. Jakaria, S.Pt., M.Si. sebagai pembimbing anggota. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc., sebagai pembimbing akademik. Penulis mengucapkan terimakasih kepada Tuti Suryati, S.Pt., M.Si. dan Ir. Widya Hermana, M.Si. selaku dosen penguji sidang yang telah memberikan saran terhadap skripsi ini. Penulis mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua, Ayahanda Makbul Suparman dan Ibunda Ikah Mulyani yang senantiasa memberikan kasih sayang, semangat, dukungan penuh secara materil dan selalu mendoakan yang terbaik untuk keberhasilan Penulis. Terima kasih kepada kakak-kakak tercinta Neni Heryati, Ujang Sholeh, Nano Sumpeno dan adik tercinta Rudi Heryanto yang selalu menguatkan serta keluarga besar atas segala dukungan dan doa. Ucapan terima kasih Penulis sampaikan kepada keluarga besar tim penelitian Plantaricin (Gilang Ayuningtyas, Tri Santi M., Handa Habibullah S., Anis Usfah P., Ade Fuziawan, Khairul Bariyah, Fariz A.M.K., dan Indri Septiani), keluarga besar Laboratorium Mikrobiologi Bagian THT (Devi Murtini S.Pt. dan Dwi Febriantini), Rithoh Yahya, S.Pt., Tri Utami S.Pt., Sarwar Khan, Ribka, serta Bapak Sukmawijaya, Amd. dan Dedi Permadi, Amd. atas bantuannya selama penelitian. Terimakasih Penulis ucapkan juga kepada IPTP 44, sahabat-sahabat Penulis (Fatih Türk, Abdüssamet Calıskan, Furkan Leventoglu, Can Tepe, Ahmad Yani, Ahmad Fauzi dan Abrar Abdul J.) dan teman-teman yang tidak dapat disebutkan satu per satu, atas segala dukungan, semangat dan bantuannya selama penulisan skripsi. Terakhir Penulis ucapkan terima kasih kepada civitas akademika Fakultas Peternakan IPB. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi para pembaca. Bogor, Maret 2012 Penulis 35 DAFTAR PUSTAKA Abo-Amer, A. E. 2007. Characterization of a bacteriocin-like inhibitory substance produced by Lactobacillus plantarum isolated from Egyptian home-made yogurt. J. Scie. Asia. 33: 313-319. Alakomi, H. L., E. Skytta, M. Saarela, & Mattila-Sandholm T. 2000. Lactic acid permeabilizes Gram negatif bacteria by disrupting the outer membrane. J. Appl. Environ. Microbiol. 66(5): 2001-2005. Ananou, S., M. Garriga, M. Hugas, M. Maqueda, M. Martinez-Bueno, & A. M. Galvez. 2005. Control of Listeria monocytogenes in model sausages by enterocin AS-48. Int. J. Food Microbiol. 103: 179-190. Arief, I. I., R. R. A. Maheswari, & T. Suryati. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari daging sapi lokal di pasar tradisional daerah Bogor. Laporan Penelitian Hibah Bersaing XIII/3. LPPM-IPB. Atrih, A., N. Rekhif, A. J. G. Moir, A. Lebrihi, & G. Lefebvre. 2001. Mode of action, purification, and amino acid sequence of plantaricin C19, and antiListeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum C19. Int. J. Food Microbiol. 68: 93-104. Axelsson, L. 2004. Lactic acid bacteria: classification and physiology. In: S. Salminen, S., A. V. Wright, & A. Ouwehand (Eds.). Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional Aspects. 3rd ed. Revisied and Expanded. Marcel Dekker, Inc., New York. Aymerich, T., A . Picouet, & J. M. Monfort. 2008. Decontamination technologies for meat products. J. Meat Science. 78: 114–129. Bhattacharya, S. & D. Arijit. 2010. Study of physical and cultural parameters on the bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from traditional indian fermented food. Am. J. Food Technol. 5(2): 111-120. Buckle, K. A., R. A. Edwards, G. H. Fleet, & M. Wooton. 2007. Ilmu Pangan. Terjemahan H. Purnomo dan Adiono. Universitas Indonesia Press, Jakarta. Davis, W. W. & T. R. Stout. 1971. Disk plate method of microbiological antibiotic assay. Appl. Microbiol. 22(4): 659-665. Day, R. & A. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Edisi ke-6. Terjemahan: Sofyan Iis. Erlangga, Jakarta. Doonan, S. 2004. Protein Purification Protocols. In: Paul Calter (Ed.). Bulk Purification by Fractional Precipitation. 2nd ed. Human Press. Totowa. New Jersey. Duncan, C. L., R. R. Reich, & R. G. Labbe. 1972. Germination of heat altered and alkali altered spores of Clostridium perfringens type altered by Lysozyme and an initiation protein. J. Bacteriol. 109: 550-559. Fardiaz, S. 1992. Mirobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. 36 Franz, C. M. A. P., M. Du Tolt, N. A. Olasupo, U. Schillinger, & W. H. Holzapfel. 1998. Plantaricin D, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum BFE 905 from ready-to-eat-salad. Int. J. Food Microbiol. 26: 231-235. Gong, H. S., X. C. Meng, & H. Wang. 2010. Plantaricin MG active against Gramnegative bacteria produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 isolated from „„Jiaoke”, a traditional fermented cream from China. Int. J. Food Control. 21: 89-95 Gonzales, B., P. Arca, B. Mayo, & J. E. Suarez. 1994. Detection, purification, and partial characterization of Plantaricin C, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum strain of dairy origin. Appl. Environ. Microbiol. 60(6): 2158-2163. Hata, T., R. Tanaka, & S. Ohmomo. 2010. Isolation and characterization of plantaricin ASM1: A new bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum A-1. Int. J. Food Microbiol. 137: 94-99. Hidayati, N. 2006. Isolasi, identifikasi dan karakterisasi Lactobacillus plantarum asal daging sapi dan aplikasinya pada kondisi pembuatan sosis fermentasi. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Hsieh, P. C., S. A. Seigel, B. Rogers, D. Davis, & K. Lewis. 1998. Bacteria lacking a multi-drug pump: a sensitive tool for drug discovery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 6602–6606. Jack, R. W., J. R. Tagg, & B. Ray. 1995. Bacteriocin of Gram positive bacteria. Microbiol. Rev. 59(2):171-200. Jay, J. M., M. J. Loessner, & D. A. Golden. 2005. Modern Food Microbiology. 7th ed. Springer Science Business Media, New York. Leverentz B, W. S. Conway, W. Janisiewicz, M. Abadias, C. P. Kurtzman, & M. J. Camp. 2006. Biocontrol of the food-borne pathogens Listeria monosytogene and Salmonella enterica Serovar Poona on fresh-cut apples with naturally occuring bacterial and yeast antagonists. Appl. Environ. Microbiol. 72: 11351140. Mourad, K., Z. K. Halima, & K. N. Eddine. 2005. Detection and activity of plantaricin OL15 a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum OL15 isolated from Algerian fermented olives. Grasas y Aceltea. 56(3): 192-197. Ogunbanwo, S. T, A. I. Sanni, & A. A Onilude. 2003. Characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OG1. Afr. J. Biotechnol. 2(8): 219-227. Omemu A. M. & O. W. Faniran. 2011. Assessment of the antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from two femented maize products-ogi and kunnu-zaki. Mal. J. Microbiol. 7(3): 124-128. Ouwehand, A. C. & S. Vesterlund. 2004. Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: S. Salminen, A. V. Wright, & A. Ouwehand (Eds.). Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional Aspects. 3rd ed. Revised and Expanded. Marcel Dekker, Inc., New York. 37 Padan, E., E. Bibi, M. Ito, & T. A. Krulwich. 2005. Alkaline pH homeostasis in bacteria: new insights. Biochem. Biophys. Acta. 1717: 67-88. Parada, J. L., C. R. Caron, A. B. P. Medeiros, & C. R. Soccol. 2007. Bacteriocin from lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives. Bracilli. Arch. J. Biol. Technol. 50 (3): 521-542. Pelczar, M. J., & E. C. S. Chan. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 1. Terjemahan R. S. Hadioetomo, T. Imas, S. D. Tjitrosomo & S. L. Angka. Universitas Indonesia Press, Jakarta. Permanasari, R. 2008. Karakteristik substrat antimikroba bakteri asam laktat hasil isolasi dari daging sapi dan aktivitas antagonistiknya terhadap bakteri patogen. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Ray, B. 1992. Food Biopreservatives of Microbial Origin. CRC Press, New York. Ray, B. & R. Bhunia 2008. Fundamental Food Microbiology. 4th ed. CRC Press, New York. Savadogo, A., A. T. Q. Cheik, H. N. B. Imael, & S. A. Traore. 2006. Bacteriocins and lactic acid bacteria – a minireview. Afr. J. Biotechnol. 5(9): 678-683. Sawatari, Y. & A. Yokota. 2007. Diversity and mechanisms of alkali tolerance in lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol. 73: 3909-3915. Schwalfenberg, G. K. 2012. The Alkaline Diet: Is There Evidence That an Alkaline pH Diet Benefits Health?. J. Environ. Public Health. 10.1155/2012/727630. Settanni, L. & A. Corsetti. 2008. Application of bacteriocins in vegetable food biopreservation. Int. J. Food Microbiology. 121: 123-138. Smid, E. J. & L. G. M. Gorris. 2007. Natural antimicrobials for food preservation. In: M. S. Rahman (Ed.). Handbook of Food Preservation. 2nd ed. CRC Press, New York. Sperber, W. H. 2009. Introduction to the Microbiologial Spoilage of Foods and Beverage. In: M. P. Doyle (Ed.). Compendium of the Microbiological Spoilage of Foods and Beverage, Food Microbiology and Food Safety. Springer Science Publishing Business Media, Ltd., London. Steel, R.G.D & J. H. Torrie. 1995. Principles and Procedures of Statistic. A. Biometrical Approach. 2nd ed. Mc Graw Hill Book Co., New York. Syahniar, T. M. 2009. Produksi dan karakterisasi bakteriosin asal Lactobacillus plantarum 1A5 serta aktivitas antimikrobanya terhadap bakteri patogen. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Todar, K. 2009. Opportunistic infection caused by Pseudomonas aeruginosa. http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/Pseudomonas.html/.[16 Desember 2011]. Torkar, K. G. & B. B. Matijasi. 2003. Partial characterization of bacteriocins produced by Bacillus cereus isolated from milk and milk products. J. Food Technol Biotechnol. 41(2): 121-129. 38 Todorov, S. D. & L. M. T. Dicks. 2005. Effect of growth medium on bacteriocin production by Lactobacillus plantarum ST194BZ, a strain isolated from Boza. Food Technol. Biotechnol. 43(2): 165-173. Usmiati, S., Miskiyah, & R. R. A. Maheswari. 2009. Pengaruh Penggunaan Bakteriosin dari Lactobacillus sp. Galur SCG1223 terhadap Kualitas Mikrobiologi Daging Sapi Segar. JITV. 14(2): 150-166. Van Reenen, C. A., L. M. T. Dicks, & M. L. Chikindas. 1998. Isolation, purification and partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol. 84: 1131-1137. Walker, J. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry: Protein Structure, Purification and Characterization. 5th ed. K. Wilson & J. Walker (Eds.). Cambridge University Press, Cambridge. Wang, J. & D.Y.C. Fung. 1996. Alkaline-fermented foods: a review with emphasis on pidan fermentation. Crit. Rev. Microbiol. 22: 101–138. Wijayanto, U. 2009. Analisis in vitro toleransi bakteri asam laktat terhadap pH lambung dan garam empedu sebagai kandidat probiotik. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Wikstroms. 2002. SP SepharoseTM for Fast Flow (Instructions). Amersham Biosciences, Sweden. Wilson, K. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry: Chromatographic Techniques. K. Wilson & J. Walker (Eds.). 5th ed. Cambridge University Press, Cambridge. Yohannes, E., A. E. Thurber, J. C. Wilks, D. P. Tate, & J. L. Slonczewski. 2005. Polyamine stress at high pH in Escherichia coli K-12. BMC Microbiol. 5: 59. 39 LAMPIRAN 40 Lampiran 1. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S.typhimurium ATCC 14028 Sumber Keragaman Plantaricin Derajat Bebas 3 Jumlah Kuadrat 0,8333 Kuadrat Tengah 0,27778 F 0,32 P 0,8126 pH 1 4,1667 4,16667 4,76 0,0444* Plantaricin*pH 3 0,8333 0,27778 0,32 0,8126 Galat 16 14,0000 0,87500 Total 23 15,9193 * Keterangan: = Berbeda nyata pada Taraf Uji 5 % Lampiran 2. Hasil Uji Tukey Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Berbeda terhadap S. typhimurium ATCC 14028 pH pH 7 Nilai Tengah 8.5000 pH 9 7.6667 Kehomogenan Grup A B Lampiran 3. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S. aureus ATCC 25923 Sumber Keragaman Plantaricin Derajat Bebas 3 Jumlah Kuadrat 20,5685 Kuadrat Tengah 6,8562 F 7,54 P 0,062 pH 1 3,3227 3,3227 3,65 0,074 Plantaricin*pH 3 7,5147 2,5049 2,75 0,077 Galat 16 14,5487 0,9093 Total 23 45,9546 Lampiran 4. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap E. coli Sumber Keragaman Plantaricin pH Plantaricin*pH Galat Total Derajat Bebas 3 1 3 16 23 Jumlah Kuadrat 7,064 1,870 0,280 16,330 12,6835 Kuadrat Tengah 2,355 1,870 0,280 1,021 F 2,31 1,83 0,27 P 0,116 0,195 0,843 41 Lampiran 5. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 Derajat Bebas 3 Jumlah Kuadrat 236,952 Kuadrat Tengah 79,984 F 13,57 P 0,000** pH 1 2,614 2,614 0,45 0,512 Plantaricin*pH 3 1,142 0,381 0,07 0,977 Galat 16 93,121 5,820 Sumber Keragaman Plantarum Total 23 12,6835 ** Keterangan: = Berbeda sangat nyata pada Taraf Uji 1 % Lampiran 6. Hasil Uji Kruskal-Wallis Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum Berbeda terhadap P. eruginosa ATCC 27853 Plantaricin asal Galur L. plantarum 1A5 N Nilai Tengah Ranking Z 6 8,290 9,7 -1,13 1B1 6 8,345 10,5 -0,80 2B2 6 8,005 8,7 -1,53 2C12 6 16,730 21,2 3,47 Total H= 12,22 Db= 3 24 P= 0,007* 12,5 Keterangan: *= Berbeda sangat nyata pada Taraf Uji 1 % Lampiran 7. Hasil Uji Kruskal-Wallis Konfrontasi Plantaricin asal Galur L. plantarum pada Galur berbeda terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 Plantaricin asal Galur L. plantarum L. plantarum 1A5 Nilai Tengah 9,1667 L. plantarum 1B1 11,083 L. plantarum 2B2 8,4167 L. plantarum 2C12 21,333 Kehomogenan Grup B AB B A 42 Lampiran 8. Uji Kruskal-Wallis Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Berbeda terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 Perlakuan pH 7 N 12 Nilai Tengah 9,130 Ranking 13,2 pH 9 12 8,420 11,8 Total H= 0,21 24 Db= 1 Z 0,460 -0,460 12,5 P= 0,644 Lampiran 9. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap B. cereus Sumber Keragaman Derajat Bebas 3 Jumlah Kuadrat 0,3224 Kuadrat Tengah 0,1075 F P 0,15 0,928 pH 1 0,0000 0,0000 0,00 0,996 Plantaricin*pH 3 0,9192 0,3064 0,43 0,735 Galat 16 11,4419 0,7151 Total 23 12,6835 Plantaricn Lampiran 10. Komposisi Mueller Hinton Agar (MHA) Beef dehydrated infusion from 300,0 Casein hydrolysate 17,5 Starch 1,5 Agar 17,0 Cara Pembuatan Media: Sebanyak 38 gram MHA dicampur ke dalam 1000 ml akuades, diaduk sampai tercampur rata, kemudian dimasukkan ke dalam botol Scoot dan direbus hingga mendidih. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media MHA disimpan dalam refrigerator (4-7 oC) bila tidak segera digunakan dan dipanaskan kembali dalam waterbath (± 70 oC) bila ingin digunakan. pH 7,3 ± 0,2 pada 25 oC Lampiran 11. Komposisi de Man Rogosa and Sharpe Broth (MRSB) Peptone 10,0 Lab-lemco‟Powder 8,0 Yeast extract 4,0 Glucosa 20,0 Sorbitan mono-oleat 1 ml Di-potassium hydrogen phosphate 2,0 43 Sodium acetate 3 H2O 5,0 Triammonium citrate 2,0 Magnesium sulphate 7 H2O 0,2 Mangenese sulphate 4 H2O 0,05 Cara Pembuatan Media: Sebanyak 52 gram MRSB dicampur ke dalam 1000 ml akuades, diaduk sampai tercampur rata, kemudian dimasukkan ke dalam botol Scoot, lalu disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media MRSB dapat langsung digunakan atau dapat disimpan dalam refrigerator (4-7 oC) bila tidak segera digunakan. pH 6,2 ± 0,2 pada 25 oC Lampiran 12. Komposisi Nutrient Broth (NB) Beef extract 3,0 g Peptone 5,0 g Cara Pembuatan Media: Sebanyak 8 gram NB dicampur ke dalam 1000 ml akuades, diaduk rata dan direbus sampai mendidih, kemudian dimasukkan sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi, lalu disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media NB dapat langsung digunakan atau dapat disimpan dalam refrigerator (4-7 oC) bila tidak segera digunakan. pH 6,8 ± 0,2 Lampiran 13. Komposisi MERCK Natrium/Sodium Chlorida (NaCl) M = 56,44 g/mol Cara Pembuatan: Sebanyak 0,85 gram media NaCl dicampur ke dalam 100 ml akuades (untuk membuat larutan NaCl fisiologi 0,85 %) lalu diaduk. Media yang sudah dituangkan ke dalam tabung reaksi @ 9 ml, disterilkan di dalam autoclave pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media NaCl dapat langsung digunakan dengan mendinginkannya terlebih dahulu hingga suhunya 30 oC atau dapat disimpan pada suhu refrigerator (47 oC) bila tidak segera digunakan. 44 Lampiran 14. Pembuatan buffer kalium fosfat 0,1 M Larutan K2HPO4 (BM= 174,18) Molaritas = 1M= Bobot BM x olume larutan gram , 8x L X gram = 174, 18 gram, untuk 1 L larutan K2HPO4 Larutan KH2PO4 (BM= 136,09) Molaritas = 1M= Bobot BM x olume larutan gram ,0 x L X gram = 136,09 gram, untuk 1 L larutan KH2PO4 Pembuatan buffer Potassium Phosphate 1M 1 M K2HPO4 + 1 M KH2PO4 (49,7 ml) (50,3 ml) 100 ml Buffer Potasium Fosfat 1 M, pH 6-6,8 Pengenceran Buffer Potassium Phosphate1M menjadi 0,1 M V1M1 = V2M2 100 ml x 1M = V2 x 0,1 M V2 = 100 / 0,1 = 1000 ml Sehingga 100 ml buffer kalium fosfat 1 M dilarutkan dalam 900 ml akuades pH netral, dihasilkan buffer kalium fosfat 0,1 M dengan pH 6 – 6,8 45 Lampiran 15. Purifikasi Parsial Plantaricin asal Galur L. plantarum Menggunakan Amonium Sulfat (A) (B) (C) (B) (C) Keterangan: (A). Supernatan Netral Bebas Sel (B). Penambahan Amonium Sulfat (C). Presipitat Bakteriosin Lampiran 16. Proses Dialisis (A) Keterangan: (A). Persiapan Membran Dialisis (B). Proses Dialisis (C). Plantaricin Kasar Lampiran 17. Proses Kromatografi Kolom (A) (B) Keterangan: (A). Proses Kromatografi Kolom (B). Fraksi Plantaricin Murni 46 Lampiran 18. Penggunaan Padatan Amonium Sulfat (% Penjenuhan) Awal % 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Konsentrasi Akhir dari Padatan Amonium Sulfat (gram) 0 10,6 13,4 16,4 19,4 22,6 25,8 29,1 32,6 36,1 39,8 43,6 47,6 51,6 55,9 60,3 65,0 69,7 5 7,9 10,8 13,7 16,6 19,7 22,9 26,2 29,6 33,1 36,8 40,5 44,4 48,4 52,6 57,0 61,5 66,2 10 5,3 8,1 10,9 13,9 16,9 20,0 23,3 26,6 30,1 33,7 37,4 41,2 45,2 49,3 53,6 58,1 62,7 15 2,6 5,4 8,2 11,2 14,1 17,2 20,4 23,7 27,1 30,6 34,3 38,1 42,0 46,0 50,3 54,7 59,2 20 0 2,7 5,5 8,3 11,3 14,3 17,5 20,7 24,1 27,6 31,2 34,9 38,7 42,7 46,9 51,2 55,7 0 2,7 5,6 8,6 11,5 14,6 17,9 21,1 24,5 28,0 31,7 35,5 39,5 43,6 47,8 52,2 0 2,8 5,6 8,6 11,7 14,8 18,1 21,4 24,9 28,5 32,3 36,2 40,2 44,5 48,8 0 2,9 5,7 8,7 11,8 15,1 18,4 21,8 25,8 29,6 32,9 36,9 41,0 45,3 0 2,9 5,8 8,9 12,0 15,3 18,7 22,2 26,3 29,6 33,5 37,6 41,8 0 3,0 5,9 9,0 12,3 15,6 19,0 22,6 26,3 30,2 34,2 38,3 0 3,0 6,0 9,2 12,5 15,9 19,0 23,5 26,8 30,8 34,8 0 3,1 6,1 9,3 12,7 16,1 20,1 23,5 27,3 31,2 0 3,1 6,2 9,5 12,9 16,8 20,1 23,9 27,9 0 3,2 6,3 9,7 13,2 16,8 20,5 24,4 0 3,2 6,5 9,9 13,4 17,1 20,9 0 3,3 6,6 10,1 13,7 17,4 0 3,4 6,7 10,3 13,9 0 3,4 6,8 10,5 0 3,4 7,0 0 3,5 0 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Sumber: Doonan, 2004. Lampiran 19. Hasil Spektrofotometri Protein Plantaricin asal Galur L. plantarum terhadap pH Alkali Plantaricin Perlakuan Panjang Gelombang (nm) A280 1A5 pH 7 pH 9 0,091 ± 0,038 0,079 ± 0,029 46,528 ± 18,223 41,705 ± 14,384 5,00 ± 4,56 1B1 pH 7 pH 9 0,256 ± 0,073 0,170 ± 0,049 158,738 ± 45,059 99,844 ± 28,343 22,00 ± 9,26 2B2 pH 7 pH 9 0,173 ± 0,051 0,117 ± 0,034 103,880 ± 30,389 69,420 ± 19,952 36,00 ± 4.17 pH 7 0,019 ± 0,008 0,014 ± 0,003 13,307 ± 2,240 9,779 ± 0,840 27,00 ± 1,03 2C12 pH 9 Protein (mg/ml) Penurunan Konsentrasi Protein (%) 47 DAFTAR PUSTAKA Abo-Amer, A. E. 2007. Characterization of a bacteriocin-like inhibitory substance produced by Lactobacillus plantarum isolated from Egyptian home-made yogurt. J. Scie. Asia. 33: 313-319. Alakomi, H. L., E. Skytta, M. Saarela, & Mattila-Sandholm T. 2000. Lactic acid permeabilizes Gram negatif bacteria by disrupting the outer membrane. J. Appl. Environ. Microbiol. 66(5): 2001-2005. Ananou, S., M. Garriga, M. Hugas, M. Maqueda, M. Martinez-Bueno, & A. M. Galvez. 2005. Control of Listeria monocytogenes in model sausages by enterocin AS-48. Int. J. Food Microbiol. 103: 179-190. Arief, I. I., R. R. A. Maheswari, & T. Suryati. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari daging sapi lokal di pasar tradisional daerah Bogor. Laporan Penelitian Hibah Bersaing XIII/3. LPPM-IPB. Atrih, A., N. Rekhif, A. J. G. Moir, A. Lebrihi, & G. Lefebvre. 2001. Mode of action, purification, and amino acid sequence of plantaricin C19, and antiListeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum C19. Int. J. Food Microbiol. 68: 93-104. Axelsson, L. 2004. Lactic acid bacteria: classification and physiology. In: S. Salminen, S., A. V. Wright, & A. Ouwehand (Eds.). Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional Aspects. 3rd ed. Revisied and Expanded. Marcel Dekker, Inc., New York. Aymerich, T., A . Picouet, & J. M. Monfort. 2008. Decontamination technologies for meat products. J. Meat Science. 78: 114–129. Bhattacharya, S. & D. Arijit. 2010. Study of physical and cultural parameters on the bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from traditional indian fermented food. Am. J. Food Technol. 5(2): 111-120. Buckle, K. A., R. A. Edwards, G. H. Fleet, & M. Wooton. 2007. Ilmu Pangan. Terjemahan H. Purnomo dan Adiono. Universitas Indonesia Press, Jakarta. Davis, W. W. & T. R. Stout. 1971. Disk plate method of microbiological antibiotic assay. Appl. Microbiol. 22(4): 659-665. Day, R. & A. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Edisi ke-6. Terjemahan: Sofyan Iis. Erlangga, Jakarta. Doonan, S. 2004. Protein Purification Protocols. In: Paul Calter (Ed.). Bulk Purification by Fractional Precipitation. 2nd ed. Human Press. Totowa. New Jersey. Duncan, C. L., R. R. Reich, & R. G. Labbe. 1972. Germination of heat altered and alkali altered spores of Clostridium perfringens type altered by Lysozyme and an initiation protein. J. Bacteriol. 109: 550-559. Fardiaz, S. 1992. Mirobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. 36 Franz, C. M. A. P., M. Du Tolt, N. A. Olasupo, U. Schillinger, & W. H. Holzapfel. 1998. Plantaricin D, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum BFE 905 from ready-to-eat-salad. Int. J. Food Microbiol. 26: 231-235. Gong, H. S., X. C. Meng, & H. Wang. 2010. Plantaricin MG active against Gramnegative bacteria produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 isolated from „„Jiaoke”, a traditional fermented cream from China. Int. J. Food Control. 21: 89-95 Gonzales, B., P. Arca, B. Mayo, & J. E. Suarez. 1994. Detection, purification, and partial characterization of Plantaricin C, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum strain of dairy origin. Appl. Environ. Microbiol. 60(6): 2158-2163. Hata, T., R. Tanaka, & S. Ohmomo. 2010. Isolation and characterization of plantaricin ASM1: A new bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum A-1. Int. J. Food Microbiol. 137: 94-99. Hidayati, N. 2006. Isolasi, identifikasi dan karakterisasi Lactobacillus plantarum asal daging sapi dan aplikasinya pada kondisi pembuatan sosis fermentasi. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Hsieh, P. C., S. A. Seigel, B. Rogers, D. Davis, & K. Lewis. 1998. Bacteria lacking a multi-drug pump: a sensitive tool for drug discovery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 6602–6606. Jack, R. W., J. R. Tagg, & B. Ray. 1995. Bacteriocin of Gram positive bacteria. Microbiol. Rev. 59(2):171-200. Jay, J. M., M. J. Loessner, & D. A. Golden. 2005. Modern Food Microbiology. 7th ed. Springer Science Business Media, New York. Leverentz B, W. S. Conway, W. Janisiewicz, M. Abadias, C. P. Kurtzman, & M. J. Camp. 2006. Biocontrol of the food-borne pathogens Listeria monosytogene and Salmonella enterica Serovar Poona on fresh-cut apples with naturally occuring bacterial and yeast antagonists. Appl. Environ. Microbiol. 72: 11351140. Mourad, K., Z. K. Halima, & K. N. Eddine. 2005. Detection and activity of plantaricin OL15 a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum OL15 isolated from Algerian fermented olives. Grasas y Aceltea. 56(3): 192-197. Ogunbanwo, S. T, A. I. Sanni, & A. A Onilude. 2003. Characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OG1. Afr. J. Biotechnol. 2(8): 219-227. Omemu A. M. & O. W. Faniran. 2011. Assessment of the antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from two femented maize products-ogi and kunnu-zaki. Mal. J. Microbiol. 7(3): 124-128. Ouwehand, A. C. & S. Vesterlund. 2004. Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: S. Salminen, A. V. Wright, & A. Ouwehand (Eds.). Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional Aspects. 3rd ed. Revised and Expanded. Marcel Dekker, Inc., New York. 37 Padan, E., E. Bibi, M. Ito, & T. A. Krulwich. 2005. Alkaline pH homeostasis in bacteria: new insights. Biochem. Biophys. Acta. 1717: 67-88. Parada, J. L., C. R. Caron, A. B. P. Medeiros, & C. R. Soccol. 2007. Bacteriocin from lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives. Bracilli. Arch. J. Biol. Technol. 50 (3): 521-542. Pelczar, M. J., & E. C. S. Chan. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 1. Terjemahan R. S. Hadioetomo, T. Imas, S. D. Tjitrosomo & S. L. Angka. Universitas Indonesia Press, Jakarta. Permanasari, R. 2008. Karakteristik substrat antimikroba bakteri asam laktat hasil isolasi dari daging sapi dan aktivitas antagonistiknya terhadap bakteri patogen. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Ray, B. 1992. Food Biopreservatives of Microbial Origin. CRC Press, New York. Ray, B. & R. Bhunia 2008. Fundamental Food Microbiology. 4th ed. CRC Press, New York. Savadogo, A., A. T. Q. Cheik, H. N. B. Imael, & S. A. Traore. 2006. Bacteriocins and lactic acid bacteria – a minireview. Afr. J. Biotechnol. 5(9): 678-683. Sawatari, Y. & A. Yokota. 2007. Diversity and mechanisms of alkali tolerance in lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol. 73: 3909-3915. Schwalfenberg, G. K. 2012. The Alkaline Diet: Is There Evidence That an Alkaline pH Diet Benefits Health?. J. Environ. Public Health. 10.1155/2012/727630. Settanni, L. & A. Corsetti. 2008. Application of bacteriocins in vegetable food biopreservation. Int. J. Food Microbiology. 121: 123-138. Smid, E. J. & L. G. M. Gorris. 2007. Natural antimicrobials for food preservation. In: M. S. Rahman (Ed.). Handbook of Food Preservation. 2nd ed. CRC Press, New York. Sperber, W. H. 2009. Introduction to the Microbiologial Spoilage of Foods and Beverage. In: M. P. Doyle (Ed.). Compendium of the Microbiological Spoilage of Foods and Beverage, Food Microbiology and Food Safety. Springer Science Publishing Business Media, Ltd., London. Steel, R.G.D & J. H. Torrie. 1995. Principles and Procedures of Statistic. A. Biometrical Approach. 2nd ed. Mc Graw Hill Book Co., New York. Syahniar, T. M. 2009. Produksi dan karakterisasi bakteriosin asal Lactobacillus plantarum 1A5 serta aktivitas antimikrobanya terhadap bakteri patogen. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Todar, K. 2009. Opportunistic infection caused by Pseudomonas aeruginosa. http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/Pseudomonas.html/.[16 Desember 2011]. Torkar, K. G. & B. B. Matijasi. 2003. Partial characterization of bacteriocins produced by Bacillus cereus isolated from milk and milk products. J. Food Technol Biotechnol. 41(2): 121-129. 38 Todorov, S. D. & L. M. T. Dicks. 2005. Effect of growth medium on bacteriocin production by Lactobacillus plantarum ST194BZ, a strain isolated from Boza. Food Technol. Biotechnol. 43(2): 165-173. Usmiati, S., Miskiyah, & R. R. A. Maheswari. 2009. Pengaruh Penggunaan Bakteriosin dari Lactobacillus sp. Galur SCG1223 terhadap Kualitas Mikrobiologi Daging Sapi Segar. JITV. 14(2): 150-166. Van Reenen, C. A., L. M. T. Dicks, & M. L. Chikindas. 1998. Isolation, purification and partial characterization of plantaricin 423, a bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol. 84: 1131-1137. Walker, J. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry: Protein Structure, Purification and Characterization. 5th ed. K. Wilson & J. Walker (Eds.). Cambridge University Press, Cambridge. Wang, J. & D.Y.C. Fung. 1996. Alkaline-fermented foods: a review with emphasis on pidan fermentation. Crit. Rev. Microbiol. 22: 101–138. Wijayanto, U. 2009. Analisis in vitro toleransi bakteri asam laktat terhadap pH lambung dan garam empedu sebagai kandidat probiotik. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Wikstroms. 2002. SP SepharoseTM for Fast Flow (Instructions). Amersham Biosciences, Sweden. Wilson, K. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry: Chromatographic Techniques. K. Wilson & J. Walker (Eds.). 5th ed. Cambridge University Press, Cambridge. Yohannes, E., A. E. Thurber, J. C. Wilks, D. P. Tate, & J. L. Slonczewski. 2005. Polyamine stress at high pH in Escherichia coli K-12. BMC Microbiol. 5: 59. 39 LAMPIRAN 40 Lampiran 1. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S.typhimurium ATCC 14028 Sumber Keragaman Plantaricin Derajat Bebas 3 Jumlah Kuadrat 0,8333 Kuadrat Tengah 0,27778 F 0,32 P 0,8126 pH 1 4,1667 4,16667 4,76 0,0444* Plantaricin*pH 3 0,8333 0,27778 0,32 0,8126 Galat 16 14,0000 0,87500 Total 23 15,9193 * Keterangan: = Berbeda nyata pada Taraf Uji 5 % Lampiran 2. Hasil Uji Tukey Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Berbeda terhadap S. typhimurium ATCC 14028 pH pH 7 Nilai Tengah 8.5000 pH 9 7.6667 Kehomogenan Grup A B Lampiran 3. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap S. aureus ATCC 25923 Sumber Keragaman Plantaricin Derajat Bebas 3 Jumlah Kuadrat 20,5685 Kuadrat Tengah 6,8562 F 7,54 P 0,062 pH 1 3,3227 3,3227 3,65 0,074 Plantaricin*pH 3 7,5147 2,5049 2,75 0,077 Galat 16 14,5487 0,9093 Total 23 45,9546 Lampiran 4. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap E. coli Sumber Keragaman Plantaricin pH Plantaricin*pH Galat Total Derajat Bebas 3 1 3 16 23 Jumlah Kuadrat 7,064 1,870 0,280 16,330 12,6835 Kuadrat Tengah 2,355 1,870 0,280 1,021 F 2,31 1,83 0,27 P 0,116 0,195 0,843 41 Lampiran 5. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 Derajat Bebas 3 Jumlah Kuadrat 236,952 Kuadrat Tengah 79,984 F 13,57 P 0,000** pH 1 2,614 2,614 0,45 0,512 Plantaricin*pH 3 1,142 0,381 0,07 0,977 Galat 16 93,121 5,820 Sumber Keragaman Plantarum Total 23 12,6835 ** Keterangan: = Berbeda sangat nyata pada Taraf Uji 1 % Lampiran 6. Hasil Uji Kruskal-Wallis Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum Berbeda terhadap P. eruginosa ATCC 27853 Plantaricin asal Galur L. plantarum 1A5 N Nilai Tengah Ranking Z 6 8,290 9,7 -1,13 1B1 6 8,345 10,5 -0,80 2B2 6 8,005 8,7 -1,53 2C12 6 16,730 21,2 3,47 Total H= 12,22 Db= 3 24 P= 0,007* 12,5 Keterangan: *= Berbeda sangat nyata pada Taraf Uji 1 % Lampiran 7. Hasil Uji Kruskal-Wallis Konfrontasi Plantaricin asal Galur L. plantarum pada Galur berbeda terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 Plantaricin asal Galur L. plantarum L. plantarum 1A5 Nilai Tengah 9,1667 L. plantarum 1B1 11,083 L. plantarum 2B2 8,4167 L. plantarum 2C12 21,333 Kehomogenan Grup B AB B A 42 Lampiran 8. Uji Kruskal-Wallis Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Berbeda terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 Perlakuan pH 7 N 12 Nilai Tengah 9,130 Ranking 13,2 pH 9 12 8,420 11,8 Total H= 0,21 24 Db= 1 Z 0,460 -0,460 12,5 P= 0,644 Lampiran 9. Analisis Ragam Diameter Zona Hambat Plantaricin asal Galur L. plantarum pada pH Alkali terhadap B. cereus Sumber Keragaman Derajat Bebas 3 Jumlah Kuadrat 0,3224 Kuadrat Tengah 0,1075 F P 0,15 0,928 pH 1 0,0000 0,0000 0,00 0,996 Plantaricin*pH 3 0,9192 0,3064 0,43 0,735 Galat 16 11,4419 0,7151 Total 23 12,6835 Plantaricn Lampiran 10. Komposisi Mueller Hinton Agar (MHA) Beef dehydrated infusion from 300,0 Casein hydrolysate 17,5 Starch 1,5 Agar 17,0 Cara Pembuatan Media: Sebanyak 38 gram MHA dicampur ke dalam 1000 ml akuades, diaduk sampai tercampur rata, kemudian dimasukkan ke dalam botol Scoot dan direbus hingga mendidih. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media MHA disimpan dalam refrigerator (4-7 oC) bila tidak segera digunakan dan dipanaskan kembali dalam waterbath (± 70 oC) bila ingin digunakan. pH 7,3 ± 0,2 pada 25 oC Lampiran 11. Komposisi de Man Rogosa and Sharpe Broth (MRSB) Peptone 10,0 Lab-lemco‟Powder 8,0 Yeast extract 4,0 Glucosa 20,0 Sorbitan mono-oleat 1 ml Di-potassium hydrogen phosphate 2,0 43 Sodium acetate 3 H2O 5,0 Triammonium citrate 2,0 Magnesium sulphate 7 H2O 0,2 Mangenese sulphate 4 H2O 0,05 Cara Pembuatan Media: Sebanyak 52 gram MRSB dicampur ke dalam 1000 ml akuades, diaduk sampai tercampur rata, kemudian dimasukkan ke dalam botol Scoot, lalu disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media MRSB dapat langsung digunakan atau dapat disimpan dalam refrigerator (4-7 oC) bila tidak segera digunakan. pH 6,2 ± 0,2 pada 25 oC Lampiran 12. Komposisi Nutrient Broth (NB) Beef extract 3,0 g Peptone 5,0 g Cara Pembuatan Media: Sebanyak 8 gram NB dicampur ke dalam 1000 ml akuades, diaduk rata dan direbus sampai mendidih, kemudian dimasukkan sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi, lalu disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media NB dapat langsung digunakan atau dapat disimpan dalam refrigerator (4-7 oC) bila tidak segera digunakan. pH 6,8 ± 0,2 Lampiran 13. Komposisi MERCK Natrium/Sodium Chlorida (NaCl) M = 56,44 g/mol Cara Pembuatan: Sebanyak 0,85 gram media NaCl dicampur ke dalam 100 ml akuades (untuk membuat larutan NaCl fisiologi 0,85 %) lalu diaduk. Media yang sudah dituangkan ke dalam tabung reaksi @ 9 ml, disterilkan di dalam autoclave pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media NaCl dapat langsung digunakan dengan mendinginkannya terlebih dahulu hingga suhunya 30 oC atau dapat disimpan pada suhu refrigerator (47 oC) bila tidak segera digunakan. 44 Lampiran 14. Pembuatan buffer kalium fosfat 0,1 M Larutan K2HPO4 (BM= 174,18) Molaritas = 1M= Bobot BM x olume larutan gram , 8x L X gram = 174, 18 gram, untuk 1 L larutan K2HPO4 Larutan KH2PO4 (BM= 136,09) Molaritas = 1M= Bobot BM x olume larutan gram ,0 x L X gram = 136,09 gram, untuk 1 L larutan KH2PO4 Pembuatan buffer Potassium Phosphate 1M 1 M K2HPO4 + 1 M KH2PO4 (49,7 ml) (50,3 ml) 100 ml Buffer Potasium Fosfat 1 M, pH 6-6,8 Pengenceran Buffer Potassium Phosphate1M menjadi 0,1 M V1M1 = V2M2 100 ml x 1M = V2 x 0,1 M V2 = 100 / 0,1 = 1000 ml Sehingga 100 ml buffer kalium fosfat 1 M dilarutkan dalam 900 ml akuades pH netral, dihasilkan buffer kalium fosfat 0,1 M dengan pH 6 – 6,8 45 Lampiran 15. Purifikasi Parsial Plantaricin asal Galur L. plantarum Menggunakan Amonium Sulfat (A) (B) (C) (B) (C) Keterangan: (A). Supernatan Netral Bebas Sel (B). Penambahan Amonium Sulfat (C). Presipitat Bakteriosin Lampiran 16. Proses Dialisis (A) Keterangan: (A). Persiapan Membran Dialisis (B). Proses Dialisis (C). Plantaricin Kasar Lampiran 17. Proses Kromatografi Kolom (A) (B) Keterangan: (A). Proses Kromatografi Kolom (B). Fraksi Plantaricin Murni 46 Lampiran 18. Penggunaan Padatan Amonium Sulfat (% Penjenuhan) Awal % 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Konsentrasi Akhir dari Padatan Amonium Sulfat (gram) 0 10,6 13,4 16,4 19,4 22,6 25,8 29,1 32,6 36,1 39,8 43,6 47,6 51,6 55,9 60,3 65,0 69,7 5 7,9 10,8 13,7 16,6 19,7 22,9 26,2 29,6 33,1 36,8 40,5 44,4 48,4 52,6 57,0 61,5 66,2 10 5,3 8,1 10,9 13,9 16,9 20,0 23,3 26,6 30,1 33,7 37,4 41,2 45,2 49,3 53,6 58,1 62,7 15 2,6 5,4 8,2 11,2 14,1 17,2 20,4 23,7 27,1 30,6 34,3 38,1 42,0 46,0 50,3 54,7 59,2 20 0 2,7 5,5 8,3 11,3 14,3 17,5 20,7 24,1 27,6 31,2 34,9 38,7 42,7 46,9 51,2 55,7 0 2,7 5,6 8,6 11,5 14,6 17,9 21,1 24,5 28,0 31,7 35,5 39,5 43,6 47,8 52,2 0 2,8 5,6 8,6 11,7 14,8 18,1 21,4 24,9 28,5 32,3 36,2 40,2 44,5 48,8 0 2,9 5,7 8,7 11,8 15,1 18,4 21,8 25,8 29,6 32,9 36,9 41,0 45,3 0 2,9 5,8 8,9 12,0 15,3 18,7 22,2 26,3 29,6 33,5 37,6 41,8 0 3,0 5,9 9,0 12,3 15,6 19,0 22,6 26,3 30,2 34,2 38,3 0 3,0 6,0 9,2 12,5 15,9 19,0 23,5 26,8 30,8 34,8 0 3,1 6,1 9,3 12,7 16,1 20,1 23,5 27,3 31,2 0 3,1 6,2 9,5 12,9 16,8 20,1 23,9 27,9 0 3,2 6,3 9,7 13,2 16,8 20,5 24,4 0 3,2 6,5 9,9 13,4 17,1 20,9 0 3,3 6,6 10,1 13,7 17,4 0 3,4 6,7 10,3 13,9 0 3,4 6,8 10,5 0 3,4 7,0 0 3,5 0 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Sumber: Doonan, 2004. Lampiran 19. Hasil Spektrofotometri Protein Plantaricin asal Galur L. plantarum terhadap pH Alkali Plantaricin Perlakuan Panjang Gelombang (nm) A280 1A5 pH 7 pH 9 0,091 ± 0,038 0,079 ± 0,029 46,528 ± 18,223 41,705 ± 14,384 5,00 ± 4,56 1B1 pH 7 pH 9 0,256 ± 0,073 0,170 ± 0,049 158,738 ± 45,059 99,844 ± 28,343 22,00 ± 9,26 2B2 pH 7 pH 9 0,173 ± 0,051 0,117 ± 0,034 103,880 ± 30,389 69,420 ± 19,952 36,00 ± 4.17 pH 7 0,019 ± 0,008 0,014 ± 0,003 13,307 ± 2,240 9,779 ± 0,840 27,00 ± 1,03 2C12 pH 9 Protein (mg/ml) Penurunan Konsentrasi Protein (%) 47 RINGKASAN DEDE SUPRIATNA. D14069001. 2012. Stabilitas dan Aktivitas Antimikrob Plantaricin asal Galur Lactobacillus plantarum terhadap pH Alkali. Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Dr. Irma Isnafia Arief, S.Pt., M.Si. Pembimbing Anggota : Dr. Jakaria, S.Pt., M.Si. Produk pangan alkali banyak terdapat di buah, sayuran dan beberapa produk pangan asal ternak, contohnya albumin telur. Konsumsi terhadap produk pangan alkali sangat bermanfaat untuk menjaga keseimbangan pH tubuh, menjaga kesehatan tulang dan menurunkan resistensi tubuh terhadap penyakit kronis, seperti kanker, hipertensi dan stroke. Bakteri patogen dalam produk pangan alkali dapat menyebabkan kerusakan produk, menurunkan daya simpan produk serta beresiko terhadap kesehatan apabila dikonsumsi. Penelitian terhadap senyawa antimikrob yang berpotensi untuk digunakan sebagai biopreservatif khususnya untuk tipe pengolahan produk pangan alkali perlu dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum terhadap pH alkali. Penelitian dimulai dengan melakukan karakterisasi morfologi sel kultur L. plantarum (1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12) dan bakteri indikator (Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dan Bacillus cereus), produksi plantaricin asal galur L. plantarum serta pengujian stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin terhadap pH alkali. Produksi plantaricin asal L. plantarum meliputi purifikasi parsial menggunakan amonium sulfat, dialisis dan kromatografi kolom. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor dari Maret 2011 hingga Oktober 2011. Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) pola searah terhadap aktivitas antimikrob supernatan bebas sel, konsentrasi protein plantaricin dari masing-masing tahap produksi plantaricin serta stabilitas protein plantaricin terhadap pH alkali dengan tiga ulangan. Pengujian aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum pada pH alkali dilakukan terhadap bakteri indikator dengan metode difusi sumur, menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial 2x4 dengan tiga ulangan. Faktor pertama adalah pH dan faktor kedua adalah galur L. plantarum. Data dianalisis dengan sidik ragam untuk data yang memenuhi uji asumsi, dan uji non parametrik Kruskal-Wallis untuk data yang tidak memenuhi uji asumsi. Rancangan percobaan lainnya yang digunakan adalah secara deskriptif untuk memperjelas pembahasan terhadap hasil yang diperoleh. Hasil kuantitatif konsentrasi protein plantaricin dari setiap tahap purifikasi menunjukan bahwa rataan konsentrasi protein plantaricin asal galur L. plantarum 2C12 merupakan nilai yang lebih kecil dibandingkan dengan galur L. plantarum lainnya. Plantaricin asal galur L. plantarum 1A5, 1B1, 2B2 dan 2C12 sensitif terhadap perlakuan pH alkali yang ditunjukkan dengan menurunnya konsentrasi protein plantaricin. Stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin asal galur L. plantarum terhadap bakteri indikator, tidak dipengaruhi oleh interaksi antara perlakuan pH dan galur L. plantarum (P>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa plantaricin dari keempat galur L. plantarum stabil terhadap perlakuan pH alkali namun aktivitas antimikrob plantaricin menurun akibat perlakuan pH alkali terhadap S. typhimurium ATCC 14028 (P<0,05). Plantaricin mempunyai aktivitas antimikrob yang berbeda akibat perlakuan galur L. plantarum terhadap P. aeruginosa ATCC 27853 (P<0,01). Stabilitas dan aktivitas antimikrob plantaricin terhadap pH alkali menunjukkan potensi plantaricin untuk dapat digunakan sebagai biopreservatif dalam produk pangan alkali. Kata-kata kunci: Lactobacillus plantarum, pH alkali, plantaricin, biopreservatif. ii
Dokumen baru
Dokumen yang terkait

Stabilitas dan Aktivitas Antimikrob Plantaric..

Gratis

Feedback