Ovine Pregnancy Associated Glycoprotein (ovPAG) as a marker of pregnancy on Garut Sheep

 0  45  134  2017-05-05 08:59:33 Report infringing document
OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (ovPAG) SEBAGAI PENANDA KEBUNTINGAN PADA DOMBA GARUT ENNY TANTINI SETIATIN SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Ovine PregnancyAssociated Glycoprotein (ovPAG) sebagai Penanda Kebuntingan pada Domba Garut adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di setiap akhir bab dalam disertasi ini Bogor, Maret 2010 Enny Tantini Setiatin NIM B061040011 ABSTRACT ENNY TANTINI SETIATIN. Ovine Pregnancy-Associated Glycoprotein (ovPAG) as a Marker of Pregnancy on Garut Sheep. Under direction of DONDIN SAJUTHI, BAMBANG PURWANTARA, and CHALID TALIB. Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG) structurally related to aspartic proteinase, expressed in the outer epithelial cell layer (trophectoderm) of ungulate placenta. Ovine PAG synthesized by mono- and binucleic trophoblast before complete implantation at day 14-15. Of this, ovPAG could be used as a marker for early pregnancy and foetal wellbeing. The research was started with extraction and isolation of PAG from placenta of garut sheep collected at parturation and to characterize their molecular weight. The procedures included extraction of protein at neutral pH (cotyledon was thawed, minced, added PBS, blended and centrifuged), acidic (H3PO41M, pH 4,5; centrifuged) and ammonium sulfate (40% and 80% (NH4)SO4, centrifuged) precipitation ; gel filtration (SephadexG75), anion exchanged chromatography (DEAE- cellulose). Cotyledone’s extract was subjected to Sephadex-G75 and DEAE cellulose, and their fractions were measured their absorbances. Sephadex-G75 and DEAE fractions at peak absorbances were assayed for protein concentration (Bichinconinic protein assay). Continuously, these fractions were subjected to monogel SDS-PAGE and stained by Commassie Brilliant Blue. Then, isolate was used to produce polyclonal antibody ( rabbit anti-ovPAG). Polyclonal antibody production was carried out in accordance with Animal Care and Use Committee of PT Indoanilab No: 03-IAth ACUC-08, 15 Nopember 2008. Rabbit anti-ovPAG DN32 gave the best immune response using Modified ELISA technique also could differenciate ovPAG in the urine of pregnant and non pregnant ewes using Western Blot Technique. Simultaneously, modified ELISA was developed started by producing ovine PAG standard, carried out by developing serial dilution at concentration 0,344; 0,172; 0,0688; 0,0344 and 0,0172 ng/ml, continued with intra- and interassay validation. Validation of standard showed coefficient variation intra-assay on QC-H and QC-L were 9,97 % and 5,87 %, respectively. Moreover, coefficient variation inter-assay on QC-H and QC-L were 16,95 % and 13,9 %, respectively. Using Western blot technique, protein at 31 kDa molecular weight appeared in pregnant’s urine whereas protein around 71 kDa became a common protein. Modified ELISA technique could differentiate the concentration of ovPAG in between pregnant and non pregnant urine at 55,56 % of nine ewes. Key words : Garut sheep, cotyledone, ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG), purification, Rabbit anti-ovPAG RINGKASAN ENNY TANTINI SETIATIN. Ovine Pregnancy-Associated Glycoprotein (ovPAG) sebagai Penanda Kebuntingan pada Domba Garut. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI, BAMBANG PURWANTARA, and CHALID TALIB. Pregnancy-associated glycoprotein (PAG) merupakan famili aspartik protease, terdapat di dalam sel trofektoderm plasenta ungulata. OvinePAG disintesa oleh sel mono- dan binukleat trofoblas sesaat menjelang implantasi pada hari ke 14-15. Oleh karena itu, PAG digunakan sebagai indikator penanda kebuntingan dini dan juga kesehatan fetus. Tujuan penelitia ini adalah ekstrasi dan isolasi ovPAG dalam kotiledon plasenta; memproduksi antibodi poliklonal (Rabbit anti-ovPAG); mendeterminasi ovPAG dalam urine domba bunting, dan pembuatan standar ovPAG. Kegiatan penelitian diawali dengan melakukan ekstraksi dan isolasi PAG dari plasenta domba garut yang dikoleksi pada saat melahirkan dan mengkarakterisasi PAG berdasarkan berat molekulnya. Pada saat melahirkan, kotiledon dikoleksi dari plasenta, disimpan pada -200C sampai seluruh induk domba (n=9 ekor) melahirkan. Selanjutnya kotiledon diekstrak dengan perlakuan presipitasi asam (H3PO41M, pH 4,5 ; sentrifus) dan garam (40% (NH4)SO4 dilanjutkan 80% (NH4)SO4, dan disentrifus). Berikutnya dilakukan isolasi protein melalui gel filtrasi (Sephadex G-75) dan kromatografi pertukaran anion (DEAE-cellulose). Fraksi yang ditampung diukur absorbansinya, fraksi yang memiliki absorbansi tinggi, diukur total proteinnya. Kemudian, dimasukkan dalam monogel SDS-PAGE utuk diukur perkiraan berat molekulnya berdasarkan pita protein yang muncul setelah diwarnai dengan Commassie Brilliant Blue. Isolat yang didapat dipergunakan untuk memproduksi antibodi poliklonal (Rabbit anti-ovPAG) dengan melakukan imunisasi pada kelinci New Zealand White (n=12 ekor). Pembuatan antibodi poliklonal dilakukan setelah mendapat persetujuan dari Komisi Pengawasan dan Kesejahteraan dan Penggunaan Hewan Percobaan (KPK-PHP) PT INDOANILAB No.:03-IA-ACUC 2008, Tanggal 15 Nopember 2008. Rabbit anti-ovPAG dideterminasi spesifitasnya terhadap ovPAG dalam urin untuk membedakan domba bunting dan tidak bunting menggunakan teknik Western Blot dan ELISA. ELISA termodifikasi , dikembangkan dengan diawali pembuatan standar ovPAG yang dibuat dengan melakukan pengenceran pada konsentrasi 0,344; 0,172; 0,0688; 0,0344 dan 0,0172 ng/ml, dilanjutkan dengan menghitung koefisien variasi intra- dan interasai. Kelinci memberikan respon imun terbaik dari DN32 ( Rabbit anti-ovPAG DN32). Determinasi Rabbit anti-ovPAG DN32 menggunakan teknik Western Blot terhadap ovPAG dalam urin domba bunting dan tidak bunting. Protein pada berat molekul 31 kDa merupakan protein spesifik dalam urin domba garut bunting sedangkan protein pada 71 kDa merupakan protein umum yang ditemukan dalam urin. Koefisien variasi intra-asai untuk kontrol kualitas konsentrasi tinggi dan rendah adalah berturut-turut 9,97 % and 5,87 %, sedangkan koefisien variasi inter asai pada kontrol kualitas konsentrasi tinggi dan rendah adalah 16,95 % dan 13,9 %. Teknik ELISA termodifikasi dapat membedakan konsentrasi ovPAG dalam urin domba tidak bunting dan bunting sebesar 55,56 % dari sembilan ekor domba yang diuji. Kata kunci : Domba garut, kotiledon, Ovine Pregnancy-Associated Glycoprotein (ovPAG), purifikasi, Rabbit anti-ovPAG © Hak Cipta milik IPB, tahun 2010 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (ovPAG) SEBAGAI PENANDA KEBUNTINGAN PADA DOMBA GARUT ENNY TANTINI SETIATIN Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Biologi Reproduksi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010 Penguji Luar Komisi pada : Ujian Tertutup Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka 1. Dr. drh. M. Agil, M.Sc.Agr. 2. Dr. drh. Diah Iskandriati : 1. Ir. Polmer Situmorang, Ph.D. 2. Prof. Dr. drh. Tuty L. Yusuf, M.S. PRAKATA Alhamdulillaahirobbil ‘alamiin penulis panjatkan ke hadirat Alloh SWT yang banyak memberi kenikmatan dan kemudahan lahir maupun batin. Hanya berkat rahmat, hidayah dan izinNYA, penulis dalam menyelesaikan disertasi dengan judul “Ovine Pregnancy-Associated Glycoprotein (ovPAG) sebagai Penanda Kebuntingan pada Domba Garut”. Disertasi ini ditulis untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam memperoleh gelar Doktor pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Lapangan Fakultas Peternakan IPB, Unit Rehabilitasi Reproduksi dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP, LPPM-IPB serta PT Indoanilab Bogor, yang penelitiannya dilaksanakan mulai Oktober 2006 sampai dengan Oktober 2009. Disertasi ini memuat satu bab yang merupakan pengembangan dari naskah artikel yang akan diterbitkan di jurnal ilmiah. Bab 3 berjudul Ekstraksi dan isolasi ovine pregnancy associated glycoprotein (ovPAG) dari kotiledon plasenta domba garut pada saat melahirkan sedang menunggu penerbitan di Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner 14(3):208-215. Pada kesempatan yang berbahagia ini penulis menyampaikan terimakasih dan penghargaan yang tak terhingga kepada : Prof. drh. Dondin Sajuthi, M.ST. Ph.D. selaku Ketua Komisi Pembimbing; Dr. drh. Bambang Purwantara, M.Sc. dan Dr. Chalid Talib selaku Anggota Komisi Pembimbing atas kesabaran sumbangan pemikiran; pengarahan; perhatian, dan nasihat mulai dari awal perencanaan; pelaksanaan penelitian serta selesainya penulisan disertasi ini. Penulis mendapatkan karunia terindah karena atas izinNYA, Allah berkenan memberi penulis Para Pembimbing yang tidak hanya membimbing di bidang keilmuan tetapi juga spiritual dan finansial. Terima kasih dan penghargaan penulis sampaikan kepada Dr. drh. M. Agil, M.Sc.Agr. dan Dr.drh. Diah Iskandriati, selaku Penguji Luar pada Ujian Tertutup serta Ir. Polmer Situmorang, Ph.D. dan Prof.Dr.drh. Tuty L. Yusuf, M.S. selaku Penguji Luar pada Ujian Terbuka atas segala sumbangan pemikiran; masukan ; saran, dan pengarahan sehingga penulisan Disertasi ini menjadi semakin lengkap dan bermakna. Selanjutnya terimakasih dan penghargaan penulis sampaikan kepada Rektor Universitas Diponegoro Semarang (UNDIP); Dekan; Kajur Produksi Ternak; Kolega di Laboratorium Pemuliaan dan Reproduksi Ternak Fakultas Peternakan UNDIP yang telah mengizinkan; memberi semangat; mendoakan, serta memberi bantuan dana penelitian dan penulisan disertasi sehingga penulis dapat melanjutkan studi lanjut Strata 3. Tak lupa penulis sampaikan terimakasih kepada Rektor Institut Pertanian Bogor (IPB); Dekan dan Staf Sekolah Pascasarjana IPB; Dekan Fakultas Kedokteran Hewan IPB; Ketua Program Studi Biologi Reproduksi beserta dosen; teknisi dan petugas administrasi, atas pelayanan yang baik selama penulis mengikuti pendidikan. Ucapan yang sama penulis sampaikan kepada Pengelola Beasiswa Program Pascasarjana (BPPS) Dirjen Dikti Depdiknas; Pengelola Penelitian Kerjasama Kemitraaan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) TA 2007 dan 2009; Hibah Penelitian Program Doktor 2009, dan Dana Bantuan Disertasi UNDIP untuk bantuan perkuliahan dan penulisan disertasi sehingga disertasi ini dapat terselesaikan. Penghormatan yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada ibu bapak tercinta Ibunda Moertati (Almh); Ayahanda N.S. Setiakomara (Alm); Ibunda Suryati (Almh) dan Ayahanda Adi Siswoyo (Alm); suami Drs. Mulyo Suprapto, Akt.; anak-anak M. Luthfiadi Setiapratama dan M. Rezky Setiapraptadi, serta saudara-saudara penulis atas segala kasih sayang; pengertian; doa bantuan immateriil dan materiil sehingga dapat menyelesaikan pendidikan dengan baik. Selama melaksanakan penelitian penulis juga mendapat banyak kemudahan dan kebaikan sehingga penelitian dapat berjalan lancar. Pertama, penulis menyampaikan terimakasih kepada teman-teman penemu DEEA Gesdect, Daud Samsudewa, SPt. MS.; Eko Sugiyanto, SPt., dan Akhmad Lukman, SPt. yang telah memberi inspirasi penulis untuk dapat mencari seri baru dari produk alat deteksi kebuntingan dini. Penulis ingin menyampaikan terimakasih sebesarbesarnya kepada Dr. Ir. Farida Fathul, M.Sc.; Ir. Umi Adiati; Dr. drh. Amrozi; Dr. Dra. Iis Arifiantini, M.S. ; Dr. Herdis ; Dr. Rizal ; Dr. drh. Agus Setiadi ; Prof. Dr. drh. Arief Boediono ; Bondan; drh. Dedi; Aep; drh. Dani; Keluarga Bapak Anda; drh. Ajat dan rekan-rekan di “Ternak Domba Sehat” selama pengerjaan penelitian di lapangan; Dr. drh. Ita Juwita; drh. Wahono Esthi, MS.; Wahyu; Dr. drh. M. Agil, MSc.Agr.; Dr. drh. Hera Maheswari, MSc.; Dr.drh. Puji Astuti, MSc.; Dr. drh. Diah Iskandriati; Uus Saefulloh, SSi. M.Biomed.; Dra. Isti KS; Dra. Maryati, MSi.; Silmi Mariya, SSi.; Rahmita, SKH; drh. Dede; Tri; Ririn; Iin; Dr. Ir. Nuril Hidayati, MSc.; Willy Praira, SSi., selama pengerjaan penelitian di laboratorium. Penulis harus menyampaikan terimakasih dan mohon maaf yang sebesar-besarnya kepada Nani, Wiwid, Ayu, Sri, Dewi, Yanti, Rima dan Yana yang telah membantu secara administrasi. Kepada rekan-rekan seperjuangan Dr. Ir. Thomas Mata Hine, M.S.; Ir. Bayu Rosadi, M.S., dan Ir. Satya Gunawan, M.S. , yang selalu bersama dalam penyelesaian studi doktor ini. Terima kasih dan maaf penulis sampaikan bagi teman-teman di Wacana Biologi Reproduksi terutama Raden Harry Murti S.Si.; drh. Sri, M.S.; dra. Ekayanti, M.Si.; Tatan Kastaman, S.Si.; Ir. Heri Sujoko, M.S.; Ir. Asri, M.S, dan Ir. Gholib. Kepada rekan-rekan dari Fakultas Peternakan UNDIP yang telah memberikan semangat dan doa, Prof. Dr. Ir. Joelal Achmadi, MSc.; Dr.Ir. Syaiful Anwar, MS.; Ir. Trisetyo Edi, MS. Dr. Ir. Irene Sumeidiana, MS.; Dr.Ir. Sri Wuwuh, MS.; Dr.Ir. Yon Supri Ondho, MS.; Ir. Barep Sutiyono, MS.; Dr.Ir. Seno Jauhari, MSc.; Dr.Ir. Edi Kurnianto, MSc.; Dr.Ir. Sutopo, MSc.; Dr.Ir. Agung Purnomoadi, MSc.; Dr.Ir. Endang Purbowati, MS.; Dr.Ir. Eko Pangestu, MS.; Ir. Heni Rizki, MS.; Ir. Yani; Ir. Susilo Budiyanto, MS.; Ir. Mulyono, MS., Ir. Titik Ekowati, MSc.; Dra. Sunarsih, MSi. Rekan-rekan Genesis, terimakasih dorongan dan doanya. Disertasi ini juga penulis dedikasikan untuk Ir. Bambang Srigandono, M.Sc. (Alm) dan drh. Rita Miranda, M.Sc. (Almh) yang telah mendorong penulis untuk melanjutkan studi S3. Semoga amal kebaikan tersebut diterima dan diridhoi Allah SWT serta mendapat balasan dariNYA dengan kebaikan yang berlipatganda. Penulis menyadari selama berinteraksi dengan rekan-rekan terutama saat menjalankan penelitian banyak melakukan kesalahan dalam tindakan maupun komunikasi yang kurang menyenangkan maka penulis mohon maaf lahir dan batin. Semoga disertasi ini bermanfaat dan semoga Allah SWT senantiasa memberi rahmat, hidayah dan meridhoi semua amal perbuatan kita. Amiiin. Bogor, Maret 2010 Enny Tantini Setiatin RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Semarang pada 12 September 1961 sebagai anak keempat dari pasangan Moertati (Almh) dan N.S. Setiakomara (Alm). Menikah dengan Drs. Mulyo Suprapto, Akt pada 1993 dan dikaruniai dua orang anak bernama M. Luthfiadi Setiapratama dan M. Rezky Setiapraptadi. Pendidikan sarjana ditempuh di Fakultas Kedokteran Hewan IPB diselesaikan pada tahun 1986. Pada tahun 1993, penulis diterima pada program S2 Animal and Forage Science, Reading University, UK dan lulus pada tahun 1994. Kesempatan untuk melanjutkan program doktor pada program studi Biologi Reproduksi, Sekolah Pascasarjana IPB diperoleh pada tahun 2004 yang dibiayai oleh Departemen Pendidikan Nasional melalui Program BPPS. Sejak 1989, penulis terdaftar sebagai Staf di Laboratorium Pemuliaan dan Reproduksi Ternak, Jurusan Produksi Ternak Fakultas Perternakan Universitas Diponegoro sampai saat ini serta staf peneliti Pusat Penelitian Pengembangan Teknologi, Lembaga Penelitian Universitas Diponegoro sampai tahun 2001. Mata kuliah yang diajarkan adalah Dasar Reproduksi Ternak, Ilmu Reproduksi Ternak, Reproduksi dan Inseminasi Buatan, Kesuburan dan Kemajiran Ternak serta Kesehatan Hewan. Artikel ilmiah yang berkaitan dengan penelitian disertasi serta dipublikasikan adalah : Setiatin ET, Sajuthi D, Purwantara B, Talib C. 2009. Ekstraksi dan isolasi ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) dari kotiledon plasenta domba garut pada saat melahirkan. Jurnal Ilmu Ternak Veteriner 14(3): 208-215. DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL xviii DAFTAR GAMBAR xix DAFTAR LAMPIRAN xxi DAFTAR SINGKATAN xxii PENDAHULUAN ................................................................................ 1 Latar Belakang ......................................................................... 1 Kerangka Pemikiran ................................................................. 2 Tujuan Penelitian ..................................................................... 3 Manfaat Penelitian ................................................................... 3 Hipotesis .................................................................................. 4 TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 5 Aktivitas Reproduksi Domba ................................................ 5 Siklus Estrus............................................................................. 5 Masa Kebuntingan ................................................................ 5 Fertilisasi .................................................................................. 5 Implantasi ................................................................................ 6 Penanda Kebuntingan ............................................................. 8 Sekresi Plasenta ....................................................................... 9 Progesteron ............................................................................... 9 Estrogen .................................................................................... 10 Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG).............................. 11 Mekanisme Sintesis Protein Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG)................................................................... 12 Isolasi ovPAG .......................................................................... 18 Filtrasi Gel ........................ ........................................................ 18 Kromatografi Pertukaran Anion ................................................ 18 Elektroforesis Gel pada Monogel Sodium Dedocyl SulfatePolyacrylamid Gel Electroforesis (SDS-PAGE) ...................... 20 xv Halaman Pewarnaan Commassie Brilliant Blue ...................................... 21 Pengukuran Konsentrasi Protein .............................................. 21 Antibodi Poliklonal .................................................................. 22 Determinasi Rabbit anti-ovPAG menggunakan Metode Western Blot ............................................................................. 24 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ..................... 25 EKSTRAKSI DAN ISOLASI OVINE PREGNANCY ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (ovPAG) DARI KOTILEDON PLASENTA DOMBA GARUT PADA SAAT MELAHIRKAN .............................. 29 Abstrak ..................................................................................... 29 Abstract .................................................................................... 29 Pendahuluan .............................................................................. 30 Metode Penelitian .................................................................. 33 Hasil dan Pembahasan ............................................................... 38 Kesimpulan ............................................................................... 45 Daftar Pustaka .......................................................................... 45 PEMBUATAN POLIKLONAL ANTIBODI RABBIT OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (Rabbit anti-ov PAG) 48 Abstrak ..................................................................................... 48 Abstract .................................................................................... 48 Pendahuluan .............................................................................. 49 Metode Penelitian .................................................................. 52 Hasil dan Pembahasan ............................................................... 55 Kesimpulan ............................................................................... 63 Daftar Pustaka .......................................................................... 63 xvi Halaman PENGUJIAN OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (ovPAG) MENGGUNAKAN TEKNIK ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) TERMODIFIKASI .............. 66 Abstrak ..................................................................................... 66 Abstract .................................................................................... 66 Pendahuluan .............................................................................. 67 Metode Penelitian .................................................................. 69 Hasil dan Pembahasan ............................................................. 71 Kesimpulan .............................................................................. 74 Daftar Pustaka .......................................................................... 75 PEMBAHASAN UMUM ..................................................................... 76 KESIMPULAN DAN SARAN UMUM ............................................... 81 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................. 82 LAMPIRAN ........................................................................................... 90 xvii DAFTAR TABEL Halaman 1 Jumlah Fraksi dan Konsentrasi Protein pada Kolom SephadexG75 dan DEAE-cellulose ........................................................... 41 2 Isolat ovPAG dan Konsentrassinya yang Diimunisasikan pada Kelinci New Zealand White ....................................................... 52 3 Rerata Konsentrasi ovPAG dalam Urin dan Plasma Domba Bunting dan Tidak Bunting terhadap Uji Antibodi Positif dan Negatif ......... .......................................................................... 73 4 Konsentrasi ovPAG dalam Urin Domba Garut Tidak Bunting dan Bunting ................................................................................. 73 xviii DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Alur kerangka pemikiran penelitian ovPAG 4 2 Tahapan awal kebuntingan domba .............................................. 8 3 Pola hormon dalam plasma darah domba .................................... 11 4 Sel binukleat, kontribusinya terhadap plasenta ruminansia yang definitif dan karakteristik endokrinnya ........................................ 13 5 Konsentrasi rata-rata ovPAG dalam plasma (± SEM) selama kebuntingan dan postpartum pada domba (A) Churra dan (B) Merino .................................................................................... 15 6 Diagram ekspresi ovPAG sepanjang usia kebuntingan ............... 17 7 Proses Filtrasi Gel ........................................................................ 19 8 Proses Kromatografi Pertukaran Anion ....................................... 19 9 Perbedaan respon primer dan sekunder antigen yang disuntikan 24 10 Prosedur Metode Western Blot .................................................... 25 11 Alur kerangka pemikiran penelitian ekstraksi dan isolasi ovPAG............................................................................................ 32 12 Tipe plasenta sinepiteliochorion pada domba ............................. 34 13 Proses Pembuatan Monogel SDS-PAGE .................................... 37 14 Kemiringan persamaan linear perhitungan migrasi relatif untuk menentukan berat molekul protein ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) ................................................................ 39 15 Pita protein dari isolat hasil ekstraksi kotiledon yang terpapar pada monogel SDS-PAGE dengan pewarnaan Commassie Brilliant Blue ............................................................................... 40 16 Absorbansi protein dalam fraksi dari kolom Sephadex-G75 (NH4HCO3) dan DEAE-cellulose (Tris-HCl 0,01 M, NaCl 20,40,80,160,320 mM dan 1M) ................................................... 42 17 Pita protein fraksi hasil filtrasi gel Sephadex-G75 ....................... 44 xix Halaman 18 Pita protein fraksi hasil kromatografi pertukaran anion DEAE-Cellulose .......................................................................... 44 19 Alur kerangka pemikiran penelitian pembuatan antibodi poliklonal rabbit anti- ovPAG .................................................... 51 20 Respon imun poliklonal antibodi rabbit anti-ovPAG terhadap berbagai sumber isolat ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) .................... .................................................................. 58 21 Perbandingan potensi DN16 dan DN32 sebagai sumber rabbit anti-ovPAG ............................................................................... 59 22 Determinasi rabbit anti-ovPAG negatif (Ab -) maupun positif (Ab +) terhadap berbagai sumber ovPAG (K, DN32, DN16, DN8, DT, S) ................................................................................ 60 23 Determinasi rabbit anti-ovPAG DN32 positif dan negatif terhadap ovPAG dalam urin domba garut bunting dan tidak bunting ........................................................................................ 62 24 Alur kerangka pemikiran penelitian pengujian ovPAG menggunakan teknik ELISA Termodifikasi ............................... 68 25 Kemiringan dan persamaan linear standar DN32 pada tiga lempeng ELISA .......................................................................... 71 xx DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Persetujuan Komisi ACUC ......................................................... 89 2 Sodium dedocyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ............................................................................... 90 3 Pewarnaan Commassie Brilliant Blue ......................................... 91 4 Perhitungan berat molekul protein dalam monogel SDS-PAGE 92 5 Makalah Publikasi ....................................................................... 93 6 Uji Beda t-student antara Konsentrasi ovPAG dalam Urin Domba Tidak Bunting dan Bunting ............................................ 106 xxi DAFTAR SINGKATAN % : persen (NH4)2SO4 : amonium sulfat µl : mikroliter 0 : derajat Celcius 1 CV : 1 column volume 2N H2SO4 : 2 Normalitas asam sulfat Ab : antibodi Ag : antigen AMP : Adenosin mono phosphate APS : Amonium per sulphate ATP : adenosin tri phosphate BCA : bichinconinic acid BICP : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt BM : berat molekul boPAG, bPAG : bovine pregnancy-associated glycoprotein caPAG, cPAG : caprine pregnancy-associated glycoprotein CBB : commassie brilliant blue cDNA : cyclic deoxiribonucleic acid COOH : karboksil DEAE : diethylaminoethane dH2O : deionized water DN : DEAE-NaCl DT : DEAE-Tris HCl ELISA : enzyme linked immuno sorbent assay FCA : Freud’s complete adjuvant FICA : Freud’s Incomplete adjuvant g : gravitasi H2SO4 : asam sulfat H3PO4 : asam fosfat C xxii HCG : Human Chorionic Gonatotrophine IB : inseminasi buatan ICM : inner cell mass Interferon-τ : Interferon-tau kDa : kilo Dalton KOH : kalium hidroksida KPA : kromatografi pertukaran anion M : molar Mg2+ : ion magnesium positif 2 ml : mililiter mM : milimolar mRNA : massenger ribonucleic acid MRP : maternal recognition of pregnancy NaCl : natrium chlorida NBT : nitrotetrazolium blue chlorine-98% ng : nanogram NH4HCO3 : amonium bikarbonat NZW : New Zealand White OD : optical density OH : hidroksil ovPAG : ovine pregnancy-associated glycoprotein PAG : pregnancy-associated glygoprotein PBS : phosphate buffer saline PEG : polietilen glikol pH : derajat keasaman QC-H : Quality Control-Hihgh QC-L : Quality Control-Low RIA : radio immuno assay S : Sephadex SBN : sel binukleik SDS-PAGE : sodium dedocyl sulfate - polyacrylamide gel electroforesis xxiii sel B : sel bursa fabricius Sel T : Sel thymus TEMED : Tetra methyl ethylene diamine TMB : 3,3’,5,5’ tetra methyl benzidine dihydrochloride Tris- HCl : tris-asam chlorida tRNA : transfer ribonucleic acid USG : Ultrasonography ZP : Zona pellucida xxiv PENDAHULUAN Latar Belakang Populasi domba di Indonesia saat ini berjumlah 7.549.316 ekor sedangkan di Jawa Barat mencapai 4.221.806 ekor atau 55,92% populasi nasional. Pemotongan domba yang tercatat di Jawa Barat pada tahun 2006 mencapai 3.343.365 ekor (Disnak Prov Jabar 2008). Peningkatan populasi domba menjadi lambat karena di lapangan masih banyak ditemukan pemotongan hewan betina dalam keadaan bunting. Hal ini terjadi oleh karena belum adanya alat deteksi kebuntingan pada ruminansia kecil yang mudah dan cepat dilakukan di lapangan. Belum berkembangnya metode deteksi kebuntingan dini pada ruminansia kecil secara tidak langsung akan berakibat pada rendahnya efisiensi manajemen reproduksi. Metode deteksi kebuntingan pada ruminansia kecil khususnya domba perkembangannya belum seperti pada hewan besar. Beberapa metode deteksi kebuntingan pada ternak lain telah diadopsi untuk domba, tetapi hasilnya belum memuaskan. Penentuan kebuntingan dengan mengamati early pregnancy factor yang dapat dideteksi 24 jam setelah perkawinan dengan metode rossette inhibition sulit diterapkan di lapangan (Jainudeen & Hafez 2000). Aktivitas ovine trophoblast protein 1 (oTP-1) disebut juga ovine interferon tau (oIFN- ) adalah memperpanjang fase luteal dengan produksi yang sangat tinggi (Geisert & Malayer 2000; Ezashi & Roberts 2004) hanya berlangsung beberapa hari antara hari ke 12-21 setelah perkawinan (Roberts et al. 1992; Demmers et al. 2001, Spencer & Bazer 2004). Interferon- terutama berfungsi sebagai sinyal penanda kebuntingan (Gray et al. 2006) serta mempersiapkan endometrium untuk implantasi yang terjadi pada hari ke-18 usia kebuntingan (Klein et al. 2006; Dunlap et al. 2005). Progesteron dan estrogen sebagai penanda kebuntingan pernah dilaporkan oleh Spencer et al. (2004) tetapi konsentrasi kedua hormon tersebut yang tidak berbeda sesaat setelah implantasi. Akibatnya bunting dan tidak bunting (Spencer et al. sulit dibedakan antara domba 2004; Johnson & Everitt 2000; 2 Senger 1999). Transrectal ultrasonography (USG), merupakan metode yang aplikatif di lapangan (Pierson Wodzicka-Tomaszewka et al. 1991; & Ginther 1988; Strmśnik et al. 2002), tetapi diperlukan peralatan dan keahlian khusus serta dilakukan secara invasive yang dapat menyebabkan terjadinya stres (Karen et al 2003a). Selain itu, sekitar 35% kematian embrio dapat terjadi di awal kebuntingan sehingga pemanfaatan USG untuk deteksi kebuntingan dini akan sulit (Szafranska et al. 2006). Oleh karena itu perlu dikembangkan metode deteksi kebuntingan dini yang aplikatif di lapangan; akurat; non-invasive (Monfort et al. 1997; Karen et al 2003b; Chelini et al. 2005); cepat, dan aman (Verbeckmoes et al. 2004). Pregnancy-associated glygoprotein (PAG) merupakan famili aspartik protease yang disekresikan oleh sel binukleat trofoblastik sesaat menjelang implantasi (Wooding 1992; Sousa et al. 2006). Substansi ini telah berhasil dipurifikasi dari plasenta domba; kambing; sapi; babi; kerbau; zebu, dan dengan berat molekul berkisar antara 35 – 75,8 kDa bison (El Amiri et al. 2004; Xie et al. 1996; Garbayo et al. 1998; Zoli et al. 1991; Szafranska et al. 2003; Barbato et al. 2008; Sousa et al. 2002; Kiewisz et al. 2008). Konsentrasi PAG dapat terdeteksi dalam darah induk pada awal kebuntingan dengan akurasi 76,6 – 100% (Szafranska et al. 2006). Konsentrasi PAG meningkat sejalan dengan berkembangnya plasenta yang mengindikasikan bahwa perkembangan embrio berjalan dengan baik. Oleh sebab itu, PAG memiliki fungsi ganda yaitu sebagai indikator kebuntingan maupun kesehatan feto-plasental (Karen et al. 2003b; Boscos et al. 2003; Jonker 2004). Kerangka Pemikiran . Metode deteksi kebuntingan pada ruminansia kecil khususnya domba belum berkembang dibandingkan dengan ruminansia besar. Pregnancy- Associated Glycoprotein (PAG) merupakan protein yang disekresikan oleh sel binukleid tropoblas dari ternak diawal masa kebuntingan, dan konsentrasinya terus meningkat hingga mencapai 300-400 ng/ml pada saat sel chorion berproliferasi dan implantasi. OvinePAG merupakan substansi yang sangat 3 potensial sebagai penanda kebuntingan. Substansi ini dapat diisolasi dari plasenta pada saat melahirkan sehingga tidak ada hewan yang dikorbankan. Konsentrasinya akan mencapai basal sekitar dua minggu setelah melahirkan, dengan demikian tidak akan bias dengan PAG bunting dan dapat dideteksi sebelum siklus berikutnya Selama ini, pengukuran konsentrasi ovPAG masih memanfaatkan teknik RIA, akan tetapi teknik ini menggunakan bahan radioaktif yang saat ini sudah mulai ditinggalkan. Oleh karena itu perlu dikembangkan suatu teknik untuk mendeteksi ovPAG yang aplikatif, aman, sederhana, fleksibel, mudah dengan volume sampel yang kecil tetapi mempunyai tingkat akurasi yang tinggi seperti teknik ELISA. Berdasarkan kondisi di atas maka dilakukan serangkaian penenlitian yang dimulai dengan ekstraksi dan isolasi ovPAG dar kotiledon plasenta; dilanjutkan dengan memproduksi antibodi poliklonal pada kelinci (rabbit anti-ovPAG), serta mengembangkan teknik ELISA Termodifikasi agar dapat mengukur konsentrasi ovPAG dalam urin dan plasma (Gambar 1). Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk : (1) purifikasi ovPAG dalam kotiledon plasenta (2) memproduksi anti bodi poliklonal (Rabbit anti-ovPAG) (3) mendeterminasi ovPAG dalam urin domba bunting (4) menentukan konsentrasi ovPAG terendah dalam urin domba bunting. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan (1) dapat memurnikan ovPAG yang ada di dalam kotiledon plasenta domba garut berdasarkan berat molekulnya (2) dapat dikembangkan menjadi penanda deteksi kebuntingan (3) mendapatkan metode pengukuran ovPAG yang sederhana. 4 Sel Binukleik Trofoblas Implantasi ovPAG Ekstraksi Kotiledon Isolasi ovPAG Pembuatan Antibodi Poliklonal Deteksi ovPAG dalam urin dan plasma Gambar 1 Alur kerangka pemikiran penelitian purifikasi ovPAG Hipotesis Ovine Pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) ditemukan pada domba bunting dan dapat diisolasi dari kotiledon plasenta. OvinePAG, berdasarkan berat molekulnya berbeda pada setiap spesies. TINJAUAN PUSTAKA Aktivitas Reproduksi Domba Siklus Estrus Siklus estrus domba berkisar antara 14-19 hari (Jainudeen et al. 2000). Domba garut yang dipelihara secara intensif mempunyai siklus estrus antara 17-20 hari sedangkan yang dipelihara secara tradisional adalah 14-30 hari (Hastono & Masbulan 2001). Siklus estrus terdiri dari dua fase yaitu fase folikuler dan luteal. Fase folikuler terbagi menjadi proestrus dan estrus sedangkan fase luteal terbagi menjadi metesrus dan diestrus. Fase folikeluler paling dominan ditandai dengan produksi hormon estrogen oleh folikel sedangkan fase luteal didominasi oleh pertumbuhan korpus luteum yang ditandai dengan diproduksinya progesteron (Senger 1999). Masa Kebuntingan Kebuntingan adalah serangkaian proses fisiologis yang dimulai dari terjadinya fertilisasi dan diakhiri dengan kelahiran (Jainudeen & Hafez 2000). Lama kebuntingan pada domba bervariasi bergantung pada bangsanya yaitu berkisar antara 144 – 153 hari (Johnson & Everitt 2000; Senger 1999) dengan rata-rata 148 hari. Fertilisasi Pembentukan suatu individu baru dimulai dari penggabungan antara spermatozoa dan ovum yang dikenal dengan fertilisasi yang terjadi di dalam oviduk. Fertilisasi diakhiri dengan terbentuknya satu sel kompleks yang disebut embrio. Embrio akan mengalami pembelahan sel sampai terbentuk suatu jaringan yang berbeda disebut dengan blastosis. Blastosis memiliki dua populasi sel yang berbeda, yaitu inner cell mass (ICM) dan selapis sel trofektoderm yang 6 mengelilingi ICM. Embrio akan tumbuh dari perkembangan ICM sedangkan plasenta dan membran ekstraembrionik tumbuh dari trofektoderm. Interaksi antara blastosis dan epitel endometrium induk merupakan awal terjadinya implantasi (Senger 1999: Dey et al. 2004). Konseptus memasuki uterus pada hari ke-4, blastosit terbentuk pada hari ke-6 dan menetas dari zona pelusida pada hari ke 8-9 (Gambar 1). Blastosit berkembang dari bentuk sperikal menjadi tubuler pada hari ke-11 kemudian mengalami elongasi berbentuk filamen antara hari ke-12 dan 16. Elongasi dari blastosit menandakan terjadinya implantasi yang melibatkan proses aposisi dan penempelan (hari 12-15) serta mengalami adesi secara ketat pada hari ke-16 (Spencer et al. 2004). Pembentukan trofektoderm yang diikuti dengan perkembangan lebih lanjut menjadi trofoblas merupakan tahapan yang penting untuk dimulainya implantasi dan terjadinya kebuntingan. Sebelum embrio menempel pada dinding uterus, embrio akan mengalami tiga tahapan penting yaitu : perkembangan awal embrio, preimplantasi yang meliputi perkembangan embrio lebih lanjut serta terjadinya membran ekstraembrionik, dan terbentuknya fetus (telah mempunyai bentuk yang definitif spesies tertentu) serta plasenta (Senger 1999). Implantasi Implantasi pada ruminansia (sapi, domba, kambing) terjadi pada tahap blastosis. Waktu terjadinya implantasi berbeda-beda pada setiap spesies yaitu pada babi hari ke-13, sapi hari ke-20, domba hari ke-16 dan kambing hari ke-19 (Dey et al. 2004; Spencer & Bazer 2004). Implantasi merupakan proses yang sangat rumit dan melibatkan interaksi yang sangat dekat antara blastosit dan penerimaan uterus terhadap embrio. Tempat terjadinya implantasi terletak pada area karunkular (Johnson & Everitt 2000; Dey et al. 2004; Lee & DeMayo 2004). Blastosis berkembang dari embrio tahap awal, morula, sebagai hasil dari penyatuan dan mengisi blastocoele yang dikelilingi oleh selapis sel embrio atau trofektoderm (Gambar 2). Trofektoderm terlibat dalam adhesi dengan epitel endometrium sehingga terjadi implantasi. Penerimaan uterus yang terjadi pada periode yang terbatas didefinisikan sebagai waktu dimana lingkungan uterus 7 sangat kondusif untuk menerima blastosis dan implantasi. Interaksi dua arah antara blastosis dan epitel endometrium induk memicu terjadinya implantasi, suatu proses dimana pembuluh darah embrio berkomunikasi dengan sirkulasi darah induk untuk meneguhkan fungsi plasenta dan kebuntingan. Sirkulasi induk mempunyai barier khusus yang dapat menyeleksi dengan jalan menembus plasenta untuk melindungi dan memberi makan embrio (Dey et al. 2004; Wodzicka-Tomaszewka et al. 1991). Plasentasi pada ruminansia seperti sapi dan domba adalah superfisial, yang dikenal sebagai kotiledon sinepiteliokhorial (Wooding 1992). Sinepiteliokhorial adalah sinsisium feto-maternal yang merupakan fusi sel binukleat trofoblas dan sel epitel uterus. Sedang kotiledon merupakan struktur kasar dari plasenta dan vili trofoblas yang membentuk kripta karunkel induk. Fusi seluruhnya atau sebagian kotiledon fetus dengan karunkel induk disebut plasentom yang merupakan tempat utama terjadinya pertukaran nutrien dan gas dalam plasenta (Green et al. 1998; Xie et al. 1996). Domba dengan tipe plasenta sinepiteliochorial akan mengalami preimplantasi pada hari ke 8-15 diikuti dengan pemanjangan periode aposisi dan penempelan. Menurut Spencer et al. (2004), pada domba implantasi dan plasentasi dimulai pada hari ke 15-16 tetapi prosesnya akan terus berlanjut sampai hari ke 50-60 usia kebuntingan. Keberhasilan implantasi dapat dideteksi paling lambat 14 hari setelah ovulasi atau sekitar hari ke 5-15 (Wilcox et al. 1999; Johnson & Everitt 2000; Aplin & Kimber 2004). Sejak terjadinya fertilisasi sampai implantasi, aktivitas ini juga dipengaruhi oleh aktivitas hormonal terutama progesteron dan estrogen (Gambar 1). Estradiol mencapai konsentrasi 10 pg/ml pada saat puncak estrus yang merupakan saat yang paling baik untuk perkawinan, yang konsentrasinya berfluktuasi sampai terjadi implantasi. Sementara konsentrasi progesteron sejak terjadinya fertilisasi sampai terbentuk blastosis pada hari ke-8 mengalai peningkatan konsentrasi sampai mencapai 10 ng/ml. Konsentrasi ini tetap bertahan sampai terjadinya implantasi. Keberhasilan implantasi dan kebuntingan didukung oleh adanya interaksi antara progesteron dan estrogen yang disekresikan oleh ovarium (Spencer et al. 2004; Wen-ge Ma et al. 2003). 8 C Terlepas dari ZP Pemanjangan Aposisi Adhesi A Lumen uteri Uterotubal Kornua uteri Pertumguhan dan Perkembangan blastosis Oviduk B Progesteron Hari Sesudah Perkawinan Gambar 2 Tahapan awal kebuntingan domba (Spencer et al. 2004). Keterangan : Gambar 2 A. Tahapan awalterjadi kebuntingan domba. di dalam tuba Fertilisasi di dalam tubaFertilisasi Fallopii terjadi dan tahap morula Fallopii dan tahap morula memasuki uterus pada hari ke-4. memasuki uterus pada hari ke-4. Blastosis dibentuk pada harihari ke-6ke-6 dandan ditetaskan daridari ZP pada hari B. Blastosis dibentuk pada ditetaskan ZP pada ke hari 8-9. ke Berkembang dari bentuk spherical menjadi tubular pada 8-9. Berkembang dari bentuk spherical menjadi tubular haripada ke-11, perpanjangan ke filamenus pada 12-15. hari ke-11, perpanjangan ke filamenus padahari hari ke ke 12-15. Perpanjangan blastosis menandakan dimulainya implantasi yang C. Perpanjangan blastosis menandakan dimulainya implantasi melibatkan aposisi dan penempelan secara cepat pada hari ke 12-15 yang melibatkan aposisi dan penempelan secara cepat pada hari danke pelekatan secara kuat pada hari ke-16 et al. 2004). 12-15 dan pelekatan secara kuat pada(Spencer hari ke-16 Penanda Kebuntingan Saat yang paling kritis dalam siklus reproduksi ternak ditentukan oleh kemampuan induk untuk menerima sinyal yang dikirimkan oleh konseptus untuk menghalangi terjadinya luteolisis dan mempertahankan kebuntingan yang disebut dengan maternal recognition of pregnancy atau MRP (Senger 1999; Geisert & Malayer 2000) . Pada ruminansia sinyal penanda kebuntingan yang utama adalah interferon tau (Johnson & Everitt 2000; Spencer & Bazer 2004). Progesteron (ng/ml) Posisi Uterus Masuk ke uterus 9 Penanda kebuntingan berbeda-beda sesuai dengan bangsanya akan tetapi mempunyai fungsi yang sama yaitu mencegah terjadinya luteolisis agar tidak terjadi abortus. Pada primata (CG); manusia (HCG) maupun kuda (PMSG) sekresinya berupa choriogonadotrophin. Domba maupun sapi disekresikan interferon-tau maupun early pregnancy factor yang berfungsi untuk menekan peningkatan reseptor oksitosin, sedangkan pada babi disekresikan estrogen untuk menekan sekresi prostaglandin. Substansi penand akebuntingan ini akan menurun konsentrasinya atau bahkan menghilang pada saat implantasi telah terjadi bersamaan dengan mulai terbentuknya plasenta. Pada saat implantasi sempurna, akan diikuti dengan plasentasi yaitu proses terbentuknya plasenta (chorion, alantois dan amnion). Plasenta berfungsi sebagai pelindung konseptus dengan jalan mensekresikan cairan plasenta. Sekresi plasenta berupa steroid (progesteron dan estrogen), laktogen plasenta (Devlin 2002) serta PAG (Green et al. 1998, Xie et al. 1996). Substansi yang disekresikan oleh plasenta akan bertahan sampai kebuntingan berakhir. Sekresi Plasenta Progesteron Progesteron merupakan hormon penjaga kebuntingan. Keberadaan progesteron di dalam uterus akan menstimulir dan menjaga fungsi uterus sehingga dapat dipergunakan untuk tempat perkembangan embrio dini, implantasi, plasentasi serta keberhasilan perkembangan fetus dan plasenta sampai akhir masa kebuntingan (Spencer et al. 2004). Pada ternak domba, sudah dapat dinyatakan bunting jika konsentrasi progesteron dalam darah minimal 2,5 ng/ml (Boscos et al. 2003) sedangkan peneliti lainnya menyatakan bahwa konsentrasi tertinggi progesteron pada fase luteal pada 2-4 ng/ml dibandingkan dengan saat estrus pada 1,5-0,8 ng/ml (Ranilla et al. 1994). Peningkatan yang drastis dari 2-4 ng/ml menjadi 12-20 ng/ml terjadi pada kebuntingan hari ke 60-125 (Edqvist & Stabenfeldt 1980), karena plasenta dan atau konseptus sudah memproduksi progesteron. Hal yang 10 sama terlihat level progesteron meningkat dengan konsentrasi tertinggi 16 ng/ml (Johnson & Everitt 2000). Korpus luteum domba memproduksi progesteron dalam jumlah yang relatif rendah pada 50 hari pertama kebuntingan, tetapi setelah melewati masa ini plasenta merespon terhadap lueteinizing hormon maupun prolaktin, untuk mempersiapkan diri sebagai sumber utama progesteron sampai kebuntingan berakhir. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi progesteron baru terukur setelah hari ke-60 (Schoenecker et al. 2004). Apabila plasenta telah berfungsi dengan sempurna maka meskipun dilakukan ovariektomi produksi hormon yang menjaga kebuntingan tetap disekresikan karena fungsinya telah digantikan oleh plasenta (Gambar 3). Domba apabila dilakukan ovariektomi setelah hari ke-50 tidak akan menyebabkan terjadinya abortus (Senger 1999; Johnson & Everitt 2000). Estrogen Aktivitas utama estrogen adalah menunjukkan tanda berahi saat estrus, meningkatkan ukuran uterus, aliran darah uterus, meningkatkan ekspresi reseptor progesteron terhadap oksitosin, mendorong perkembangan organ fetus, menstimulir produksi protein hepar induk serta meningkatkan massa jaringan mammae dan adipose (Hirako et al. 2003; Senger 1999; Johnson & Everitt 2000). Estrogen merupakan hormon yang selain diproduksi oleh ovarium juga diproduksi oleh kotiledon fetus bersama-sama dengan karunkula induk (Teng et al. 2002). Salah satu produk deteksi kebuntingan (DEEA Gestdect®) dengan memanfaatkan ikatan fenol yang terikat pada gugus estrogen dalam urin, mempunyai mempunyai akurasi pada domba dan sapi berturut-turut 60-70 % dan 90 % (Samsudewa et al. 2005). Hal ini menunjukan bahwa estrogen terukur dalam urin domba bunting maupun tidak bunting. 11 0 50 100 150 200 Usia kebuntingan (hari) Gambar 3 Pola hormon dalam plasma darah domba saat bunting. Garis panah menunjukkan saat dimana ovariektomi (Johnson & Everitt 2000). Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG) Pregnancy-Associated Glycoprotein (PAG) merupakan glikoprotein asam (pI 4.4-5.4), sebagai anggota famili aspartik proteinase yang memperlihatkan sekuen yang paling dekat dengan pepsin (Green et al. 2000). Pregnancyassociated glycoprotein disintesa oleh sel mono- dan binukleat trofoblas (Gambar 3). Sel binukleik (SBN) fetus merupakan sel unik pada ruminansia, sumber utama protein plasenta seperti laktogen plasenta dan hormon steroid yang bertanggungjawab terhadap keberhasilan kebuntingan (Atkinson et al. 1993). Selanjutnya SBN migrasi melalui apical tight junction epitelium chorion, melintasi microvillar junction fetomaternal, kemudian fusi ke dalam sinsisium uterus. Sinsisium berhubungan erat dengan sirkulasi darah induk, pada fusi lebih lanjut granula SBN dilepas oleh proses eksositosis ke dalam sinsisium. Adanya perpindahan produk plasenta sepanjang kebuntingan kemungkinan erat kaitannya 12 dengan keberhasilan proses metabolisme dan atau imunologi antara induk dan fetus (Wooding 1992). Perubahan pada sistem ini akan menurunkan kapasitas konseptus dalam memproduksi sinyal biologis yang berkaitan dengan kebuntingan yang diperlukan untuk perkembangan dan pertumbuhan fetus (Regnault et al. 1999). Pada domba, sel-sel ini berdiferensiasi dari sel mononukleik trofektoderm sesaat sebelum kontak antara epitel uterus dengan plasenta yang umumnya terjadi pada hari ke-13 (Green et al. 2000) atau ke 14-15 kebuntingan (Dunlap et al. 2005). Mekanisme Sintesis Protein Ovine Pregnancy-Associated Glycoprotein (ovPAG) Asam amino bereaksi dengan ATP membentuk kompleks AMP dan pirofosfat. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim aminoacyl-tRNA synthetase dengan adanya Mg2+. Enzim yang dipergunakan berbeda untuk setiap asam amino . Pada pemisahan fosfat grup dari ATP akan melepas banyak energi yang tersimpan dalam kompleks asam amino AMP. Kompleks asam amino AMP-enzim disebut asam amino teraktivasi sementara pirofosfat dihidrolisis menjadi dua organik fosfat ( Zubay 1993; Champe et al. 2008). Kompleks asam amino AMP-enzim berikatan dengan tempat pengikatan asam amino ( AA binding site) dari spesifik tRNAnya sementara COOH berikatan dengan OH. Katalisator dari reaksi ini adalah enzim yang sama yaitu yang menghasilkan tRNA-amino acid complex disebut sebagai charged tRNA. Sementara AMP dan enzim dilepaskan yang dapat dipergunakan untuk mengaktivasi dan mengikat molekul tRNA lainnya. Selanjutnya kompleks asam amino-tRNA bergerak menuju ribosom sebagai tempat sintesa protein. Aktivasi ribosom oleh mRNA memerlukan Mg2+ pada konsentrasi yang sesuai. Sel trofoblas menyimpan protein ini dalam granula (Gambar 4) dan melepaskannya ke dalam organisme induk setelah terjadinya fusi dengan sel epitel endometrium induk (Dunlap et al. 2006). Molekul mRNA terletak pada sel monomaupun binukleat trofoblas. Dengan memanfaatkan antibodi monoklonal terdeteksi bahwa sel binukleat trofoblas mempunyai epitop terhadap karbohidrat 13 (Garbayo et al. 2008), selanjutnya melalui proses glikolisasi terbentuk PAG (Klisch et al. 2008). Pregnancy-Associated Glycoprotein dilepaskan dari sel trofoblas dan terikat pada reseptor sel permukaan spesifik pada sel target induk. Embrio memulai transkripsi gen spesifik di dalam massa sel bagian dalam blastosis, mRNA yang mengatur sintesis PAG di dalam trofoblas. Selanjutnya PAG akan mendorong respon induk melalui reseptor pada endometrium (Lambert et al. 2005). Variasi derajat glikosilasi pada PAG berbeda-beda tergantung dari kadar karbohidrat yang berkaitan dengan usia kebuntingan, yang merupakan faktor penting pada saat menentukan waktu paruhnya dalam plasma induk (Klisch et al. 2005; Sousa et al. 2006). Gambar 4 Sel binukleat, kontribusinya terhadap plasenta ruminansia yang definitif dan karakteristik endokrinnya (Wooding 1992) Keterangan : (a) Bagian plasenta matang yang memperlihatkan vili kotiledon fetus memasuki kripta karunkel induk (b) Domba dan kambing, sinsisium feto-maternal dibentuk sebagai hasil migrasi sel binukleat (tahap 1 dan 2) dan fusi (tahap 3 dan 4) 14 Pregnancy-Associated Glycoprotein, awalnya dikenal sebagai antigen plasenta yang ditemukan pada serum induk sapi sesaat setelah implantasi (Zoli et al. 1992, Sousa et al. 2006). Perkembangan lebih lanjut PAG telah berhasil dipurifikasi dari plasenta domba; kambing; sapi; babi; kerbau; zebu, dan bison (El Amiri et al. 2004; Garbayo et al. 1998; Zoli et al. 1991; Szafranska et al. 2003; Sousa et al. 2002; Kiewisz et al. 2008). Berat molekul PAG berbeda pada beberapa spesies yaitu domba pada 55-66 kDa (El Amiri et al. 2004) bahkan mempunyai berat molekul lebih tinggi pada 70 kDa (Xie et al. 1996); kambing pada 55; 59, dan 62 kDa (Garbayo et al. 1998); sapi pada 67 kDa (Zoli et al. 1992); babi pada 35-72 kDa (Szafranska et al. 2003); kerbau pada 59,5-75,8 kDa pada pertengahan kebuntingan dan 57,8-73,3 kDa pada akhir kebuntingan (Szafranska et al. 2003); zebu pada 51-69 kDa (Sousa et al. 2002), dan bison pada 50;55;60;67, dan 71 (Kiewisz et al. 2009). Profil PAG domba garut belum ditemukan oleh karena itu, sebagai pembanding dipilih domba Merino. Konsentrasi ovPAG pada domba Merino mulai terukur pada minggu ketiga yang terlihat setara konsentrasinya pada minggu ke-23 atau dua minggu setelah melahirkan (Gambar 5). Setelah minggu ke-3 , konsentrasinya terus meningkat secara signifikan dan mencapai puncak pertama pada minggu ke-9. Kemudian mengalami penurunan sampai minggu ke13, tetapi konsentrasinya masih lebih tinggi dari minggu ke-3 maupun minggu ke-23. Selanjutnya konsentrasi ovPAG meningkat kembali dan mencapai puncak kedua pada minggu ke-17. Mulai minggu ke 17-21 konsentrasinya terlihat sama dan tetap bertahan sampai seminggu setelah melahirkan kemudian menurun dan mencapai konsentrasi basal sekitar tiga minggu setelah partus (Ranilla et al. 1994) dibandingkan dengan sapi pada hari ke 80-90 (Haugejorden et al. 2006). Peneliti ini menemukan bahwa waktu paruh ovPAG dalam plasma adalah 4,5 hari setelah partus dibandingkan sapi selama 9 hari. Berdasarkan fluktuasi konsentrasi ovPAG sepanjang usia kebuntingan maka pada domba mengikuti pola sekresi dua fluktuasi (Szafranska et al. 2006) yaitu meningkat (300 – 400 ng/ml) di sepanjang dua bulan awal kebuntingan yaitu ketika sel chorion secara intensif berproliferasi serta terbentuknya plasenta. Pada pertengahan kebuntingan terjadi penurunan sampai < 100 ng/ml, kemudian 15 meningkat sampai akhir masa kebuntingan yaitu 300 ng/ml pada Merino dan 600 ng/ml pada Churra (Ranilla et al. 1994). Pregnancy-Associated Glycoprotein dikenal sebagai antigen spesifik yang disekresikan oleh plasenta sehingga keberadaannya dalam serum dapat dipergunakan sebagai metode serologis untuk menguji kebuntingan dini pada sapi dimulai dari 28 hari setelah dikawinkan (Zoli et al. 1992). Pada domba, konsentrasi ovPAG dapat didiagnosa pada hari ke-22 setelah IB menggunakan metode RIA (Karen et al. 2003), sedangkan peneliti lain menemukan bahwa analisis PAG dapat dilakukan pada saat usia kebuntingan dimulai pada minggu ke4 setelah IB menggunakan heterologous (anti-caPAG(55+59) antisera (Ledezma-Torres et al. 2006). Waktu pengukuran yang lebih cepat pada akhirnya ditemukan oleh Green et al. (2000) menggunakan metode ribonuclease protection assay pada hai ke-13 setelah dikawinkan. Gambar 5 Konsentrasi rata-rata ovPAG dalam plasama (± SEM) selama kebuntingan dan postpartus pada domba (Ranilla et al. 1994) Keterangan : (A) Churra (B) Merino 16 Green et al. (2000) melaporkan berdasarkan ekspresi gen pada cDNA menggunakan analisis filogenetik dengan metode ribonuclease protection assay (RPA) terdapat 9 ovPAG yang muncul sepanjang lapisan luar epitel. Pada saat terbentuknya PAG, sekuen DNA mengalami perubahan pada tiga kodon dari CAG AAT CTC menjadi GAG CCT GTC (Hughes et al. 2003). Ekspresi gen ini erat kaitannya dengan pembentukan granul dari sel binukleat sehingga dapat dimanfaatkan sebagai dasar deteksi kebuntingan. Teknik ini sangat sensitif dan spesifik sehingga dapat mendeteksi keberadaan ovPAG sepanjang usia kebuntingan (Gambar 6). Prinsip teknik RPA adalah mendeteksi keberadaan mRNA dengan cara melabel cDNA menggunakan bahan radio aktif. Tangan DNA yang sekuennya tidak homolog akan gagal berhibridasi dengan mRNA, dengan pemberian RNAse akan didapat satu sekuen gel yang terdiri dari RNA yang terlindungi dan tidak. Adanya pita protein yang terlindungi menunjukkan adanya mRNA yang diidentifikasi berdasarkan ukurannya. Meskipun teknik ini dapat mendeteksi keberadaan mRNA secara spesifik dan sensitif tetapi selama proses dapat terjadi denaturasi RNA serta kemungkian terjadinya kontaminasi terhadap bahan radioaktif yang dipergunakan. Berdasarkan ekspresi ovPAG (Gambar 5), ovPAG-2 terdeteksi paling cepat yaitu pada hari ke-13 (Green et al. 2000) atau hari ke-14 sebagai PAG tunggal. Pada hari ke-16, dapat terdeteksi ovPAG-1; ovPAG-5 dan ovPAG-7 (Green et al. 2000) serta pada hari ke-17, selain ovPAG-1 juga ditemukan ovPAG-10 dan ovPAG-11 (Garbayo et al. 2008). Setelah kebuntingan hari ke-88 semua ovPAG dapat terdeteksi. Metode ini memberikan gambaran bahwa ovPAG dapat dideteksi sebelum memasuki siklus berahi terutama pada ovPAG-1; ovPAG-2; ovPAG-5; ovPAG-7; ovPAG-10 dan ovPAG-11. Dengan demikian dimungkinkan untuk melakukan isolasi ovPAG pada semua fase kebuntingan. Selain bertambahnya usia kebuntingan, konsentrasi PAG dipengaruhi juga oleh jumlah maupun jenis kelamin fetus. Induk domba dan kambing yang mengandung 2 fetus mempunyai konsentrasi PAG lebih tinggi dari yang mengandung fetus satu. Perbedaannya, pada domba konsentrasi PAG meningkat dimulai dari minggu ke-12 sampai lahir sedangkan pada kambing konsentrasi PAG meningkat secara nyata pada saat implantasi seperti yang terjadi pada sapi 17 ovPAG-9 ovPAG-8 ovPAG-7 ovPAG-6 ovPAG-5 ovPAG-3 ovPAG-2 ovPAG-1 13 16 25 88 100 130 Usia Kebuntingan (hari) Gambar 6 Diagram ekspresi ovPAG sepanjang usia kebuntingan (Green et al. 2000) dimulai dari minggu ke-12 sampai lahir sedangkan pada kambing konsentrasi PAG meningkat secara nyata pada saat implantasi seperti yang terjadi pada sapi (Ranilla et al. 1994; González et al. 2004; Ledezma-Torres et al. 2006). Induk yang mengandung fetus jantan mempunyai konsentrasi PAG akan lebih tinggi pada 3 minggu terakhir masa kebuntingan dibandingkan dengan yang mengandung fetus betina (Ranilla et al. 1994 ). Sedangkan peneliti lain mengungkapkan bahwa jenis kelamin tidak mempengaruhi konsentrasi ovPAG tetapi dipengaruhi oleh total berat fetus saat dilahirkan (Vandaele et al. 2003; Bertolini et al. 2006). Konsentrasi ovPAG diukur dengan menggunakan semi-purified ovPAG sebagai standar, tracer maupun imunogen untuk memproduksi antibodi pada kelinci. Antisera R780 (campuran α-ovPAG(57+59kDa)) dan R805 (campuran αovPAG5(58+61kDa) pada metode RIA merupakan antisera homolog yang sesuai untuk mengukur konsentrasi ovPAG dalam plasma dari hari ke-18 setelah inseminasi (El Amiri et al. 2007). Konsentrasi PAG dalam air susu maupun plasma darah pada sapi (boPAG) maupun kambing (caPAG) menunjukan 18 peningkatan setelah hari ke-28 dan peningkatan konsentrasi secara cepat terjadi menjelang melahirkan (Gajewski et al. 2008). Konsentrasi ovPAG dimungkinkan untuk diukur dengan jalan memproduksi anti-ovPAG. Molekul PAG yang diuji terhadap protein lain (caPAG maupun ovPAG) memberikan hasil yang spesifik (Perényi et al. 2002; Green et al. 2000). Perkiraan waktu paruh ovPAG dalam plasma adalah 9 dan 4.5 hari pada sapi dan domba, sedangkan konsentrasi basal baru tercapai pada hari ke 80-90 pada sapi dan hari ke 17-21 domba (Haugejorden et al. 2006). Isolasi ovPAG Isolasi ovPAG meliputi pemisahan dan karakterisasi protein. Pemisahan protein dapat dilakukan menggunakan metode sentrifugasi, presipitasi garam dan kolom kromatografi. Kolom kromatografi terdiri dari filtrasi gel dan pertukaran ion (Nelson & Cox 2000; Abbas et al. 2007; Lodish et al. 2000). Filtrasi Gel Filtrasi gel merupakan metode yang umum dilakukan untuk menyeleksi protein berdasarkan ukuran dan bentuk protein (Nelson & Cox 2000; Lodish et al. 2000). Protein dengan berat molekul besar akan tertahan pada lapisan serabut yang membentuk gel sedangkan protein yang akan diisolasi akan lepas dan tertampung dalam fraksi yang dielusi dari kolom (Gambar 7). Kromatografi Pertukaran Anion Kromatografi pertukaran ion (Nelson & Cox 2000; Lodish et al. 2000). bergantung pada interaksi muatan-muatan ion antara protein dalam sampel (protein terikat pada molekul ovPAG) dengan muatan imobil dalam resin dari kolom yang dipilih. Ada dua jenis kromatografi pertukaran ion yaitu kation dan anion yang ditentukan dari karakter protein atau enzim juga pH bufer yang digunakan untuk melarutkan enzim. Kekuatan ikatan ion larutan dan total konsentrasi garam merupakan faktor penentu agar kromatografi pertukaran ion dapat bekerja dengan baik. Kromatografi pertukaran anion (KPA) ditandai dengan 19 adanya interaksi antara muatan negatif protein sampel dan muatan positif resin yang dipergunakan sedangkan kromatografi pertukaran kation bekerja sebaliknya. Gambar 7 Proses Filtrasi Gel (Lodish et al. 2000) Gambar 8 Proses Kromatografi Pertukaran Anion (Lodish et al. 2000) 20 Kromatografi pertukaran anion seperti DEAE (diethylaminoethyl) mempunyai muatan positif sehingga akan mengikat ion bermuatan negatif. Grup pertukaran anion akan terikat secara kovalen pada matriks selulosa atau sephadex (modifikasi serbuk). Protein dapat dielusi dengan konsentrasi garam bertingkat yang memungkinkan ion untuk berkompetisi pada fase ini. Oleh karena itu, seluruh hasil elusi (fraksi) harus didialis untuk menghilangkan garam yang terkandung di dalamnya. Resin diethylaminoethane merupakan salah satu resin yang umum dipergunakan sebagai kolom kromatografi pertukaran anion. Matrik resin dalam kolom DEAE dapat mengikat 10 sampai 100 mg protein per ml dan mempunyai kemampuan untuk meningkatkan kemampuan dan memisahkan fragmen protein dari ’slurry’ pembuka. Bufer yang dipergunakan mempunyai pH antara 7-10 dan larutan yang dipergunakan sebagai ’runnning gradient’ adalah 1 M NaCl. Garam dalam larutan berkompetisi untuk mengikatan muatan imobil dalam matrik dan melepas protein dari tempat ikatan pada konsentrasi yang telah dikondisikan. Variasi konsentrasi garam diperlukan untuk memisahkan muatan protein yang diisolasi dari protein kontaminan (Gambar 8). Elektroforesis Gel pada Monogel Sodium Dedocyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) Protein yang ada dalam fraksi terikat dengan SDS dalam ikatan yang telah didenaturasi. Selama elektroforesis komplek protein-SDS melewati PAGE. Protein yang lebih kecil akan lebih mudah melewati pori dan cepat dibandingkan dengan yang lebih besar. Protein terpisahkan dalam gel berdasarkan ukurannya sepanjang melewati gel. Pita protein yang terbentuk diwarnai dengan Commassie Brilliant Blue (El Amiri et al. 2004). Sodium dedocyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) berfungsi untuk menghilangkan protein yang mengkontaminasi enzim yang dipergunakan untuk purifikasi protein. Protein yang akan dipurifikasi ditambah mercaptoethanol kemudian dipanaskan dengan tujuan untuk memotong ikatan disulfid dan denaturasi protein. Sedangkan SDS sebagai suatu deterjen untuk menyamakan muatan listrik (SDS mengikat stoichiometrically, 1 SDS per 1.4 asam amino). Ketika protein dialirkan ke dalam gel kemudian aliran listrik 21 tersambung, protein akan bermigrasi melalui pori-pori di dalam gel poliakrilamid. Gel akan memisahkan protein berdasarkan kemampuan protein untuk bergerak yang setara dengan nilai logaritmik berat molekulnya (Stryer 1995; Champe et al. 2008). Pewarnaan Commassie Brilliant Blue Commassie Brilliant Blue (CBB) merupakan pewarnaan anion yang umum dipergunakan untuk pewarnaan protein. Struktur CBB adalah non-polar sehingga biasanya digunakan dalam campuran metanol 40 % dan asam asetat 7 %. Protein dalam gel difiksir oleh asam asetat dan secara simultan diwarnai. Zat warna yang berlebih dihilangkan dengan larutan yang sama tanpa ditambah CBB. Protein terdeteksi dengan terbentuknya pita biru, akan tetapi karena SDS bersifat anion juga maka untuk menghindari intervensinya pada saat pewarnaan maka volume larutan harus benar-benar merendam gel. Pita protein yang terlihat pada monogel diukur jaraknya untuk menentukan migrasi relatifnya. Selanjutnya berdasarkan berat molekul standar (Broad Range Standard®) dapat ditentukan persamaan regresinya dan dari migrasi relatif yang diperoleh dapat ditentukan estimasi berat molekul protein yang diuji. Pengukuran Konsentrasi Protein Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay merupakan metode deteksi kolorimetri dan penghitungan total protein, yang dimodifikasi dari metode Lowry. Prinsip utamanya adalah reduksi Cu2+ menjadi Cu1+ oleh protein dalam medium alkalin oleh asam bichinconinic. Tahap awal, dikenal sebagai reaksi biuret yaitu peptida yang mengandung beberapa asam amino berikatan dengan ion Cu1+ membentuk warna biru. Tahap kedua adalah reaksi perubahan warna menggunakan BCA. Warna kuning terbentuk dari pengikatan dua molekul BCA dengan satu ion Cu1+ (Pierce ®). Warna yang terbentuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 590 nm. 22 Antibodi Poliklonal Antigen adalah molekul yang bereaksi dengan antibodi sedangkan imunogen merupakan molekul yang dapat memberikan respon imum. Keduanya mempunyai makna yang sama. Substansi yang mempunyai kemampuan untuk menghasilkan respon imun yang spesifik, seperti protein. Antigen baru akan dikenali oleh limfosit B maupun T apabila epitopnya dikenali. Epitop merupakan sisi aktif antigen yang dapat berikatan dengan reseptor sel B maupun T (Goldsby et al. 2000) . Respon imun yang dihasilkan bergantung dosis dan rute penyuntikan antigen atau imunogen. Respon imun merupakan upaya inang untuk mempertahankan diri yang prosesnya terdiri atas 1) pengenalan, organisme asing dikenali oleh sel imun spesifik, 2) aktivasi, mengaktivasi sel imun untuk memproduksi respon spesifik seperti antibodi, 3) respon, yang secara spesifik merusak organisme (Goldsby et al. 2000; Lordish et al. 2000 ). Respon imun primer adalah IgM, antigen reseptor pada sel B, sedangkan IgG adalah respon imun IgG yang melintas plasenta. Respon imun primer berjalan lambat sekitar 7-10 hari tergantung kemunian dan dosis Ag serta rute penyuntikannya. Ig M levelnya lebih cepat turun dibadingkan dengan IgG. Apabila hewan diberi booster dengan antigen yang sama setelah respon primer, respon imun yang terbentuk cepat (3-5 hari) dan mempunyai level respon imun yang lebih tinggi dari respon primer. Selama respon sekunder, IgM yang diproduksi sama dengan setelah kontak dengan Ag (Gambar 9). Sementara, IgG lebih besar diproduksi dan levelnya tertahan jauh lebih lama dari respon primer (Abbas et al. 2007; Goldsby et al. 2000). Pada produksi antibodi diperlukan adjuvant untuk meningkatkan respon imun terhadap aktivitas sel imunogen. Adjuvant merupakan campuran mineral oil, linoloid dan mikrobakteria yang telah dilemahkan (Freud’s adjuvant) yang menstimulasi pembentukan granuloma lokal agar pembentukan antibodi berjalan dengan baik. Apabila hewan disuntik antigen yang telah ditambah adjuvant maka normalnya limfosit B akan menghasilkan satu tipe antibodi yang mengenali determinan spesifik atau epitop molekul antigen, disebut antibodi monoklonal. 23 Akan tetapi karena secara alami antigen mempunyai beberapa epitop sehingga apabila antigen disuntikkan pada hewan maka akan menstimulasi beberapa klonal limfosit yang berbeda dan masing-masing akan menghasilkan antibodi yang berbeda. Campuran antibodi yang dapat mengenali beberapa epitop pada antigen yang sama disebut antibodi poliklonal (Goldsby et al. 2000; Abbas et al. 2007). Kekuatan interaksi antigen dan antibodi bergantung dari seberapa dekat kecocokan antara antigen dan antibodi. Total kekuatan interaksi nonkovalen antara tempat terikatnya antigen (single antigen-binding site) pada antibodi dengan suatu epitop tersebut afinitas antibodi. Semakin tinggi afinitas antibodi, kemampuan antibodi untuk mengikat semakin kuat dan ikatannya bertahan lama, sebaliknya semakin rendah afinitas ikatan antibodi dan epitop makin lemah dan ikatannya mudah lepas. Reaksi silang (cross-reactivity ) terjadi apabila antigen yang sama muncul pada tipe sel atau jaringan yang berbeda, munculnya epitop yang identik pada permukaan dua antigen yang tidak identik, dua antigen memiliki dua epitop sama tetapi tidak identik sehingga bisa terjadi salah satu epitop akan mengikat lebih kuat daripada epitop lainnya, dua bahan yang berbeda secara kimiawi seperti protein dan karbohidrat tetapi mempunyai epitop yang sama atau bisa juga terjadi dua antibodi yang satu memiliki epitop A sedangkan yang satunya memiliki epitop A dan B (Huebner 2004). Prosedur pembuatan antibodi poliklonal sangat sederhana dibandingkan dengan antibodi monoklonal meskipun demikian antibodi yang dihasilkan sangat bermanfaat. Kelebihan antibodi poliklonal selain metode produksi yang sederhana juga dapat mengikat semua antigen yang menjadi target reaksi. Sedangkan kelemahan antibodi poliklonal yang utama adalah karena antibodinya dapat bereaksi dengan semua epitop yang ada pada antigen yang direaksikan maka akan mendapatkan reaksi silang yang tinggi. Oleh karena itu hal yang harus diperhatikan saat memproduksi antibodi poliklonal, isolat diimunisasikan harus dalam keadaan yang murni (Abbas et al. 2007). yang akan 24 B A Level Antibodi Serum Respon Anti-A Kedua Respon Anti-B Primer Respon Anti-A Primer Hari Gambar 9 9Perbedaan respon primer dandan sekunder antigen yang disuntikkan Gambar Perbedaan respon primer sekunder antigen yang disuntikkan (humoral response). Hewan disuntik antigen akan memproduksi (Goldsby et al. 2000) antibodi primer Keterangan : serum pada konsentrasi rendah dan waktu yang singkat dengan puncak pada ke 10-17 . Imunisasi kedua A. Antigen A disuntikan, akanhari diproduksi antibodi primer anti-A pada dengankonsentrasi antigen yang sama akan menghasilkan respon imunpada yanghari rendah dan waktu yang singkat dengan puncak lebih ke besar dengan puncak yang diperoleh dalam waktu lebih 10-17 . singkat hari ke dan B, lebih bertahanrespon (bulanan sampai B. Antigen A +2-7 Antigen akanlama menghasilkan imun yang lebih besar dengan puncak yang diperoleh dalam waktu lebih lama tahunan daripada antibodi primer (Goldsby et al. 2000) bertahan (bulanan sampai tahunan daripada antibodi primer (anti-A), imun respon antibodi primer anti-B lebih singkat hari ke 2-7 Determinasi Rabbit anti-ovPAG menggunakan Metode Western Blot Western Blot (WB) merupakan teknik analisis untuk mendeteksi protein spesifik yang terkandung dalam ekstrak atau jaringan. Dimulai dengan elektroforesis untuk memisahkan protein yang kemudian ditransfer ke dalam membran, umumnya digunakan membran nitroselulose (Gambar 10). Prinsipnya adalah protein dideteksi menggunakan antibodi spesifik (monoklonal maupun poliklonal) terhadap protein target (Lodish et al. 2000; Majewska et al. 2005; Bella et al. 2009). 25 Gambar 10 Prosedur Metode Western Blot (Lodish et al. 2000) Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Enzyme Linked Immunosorbent Assay secara umum dikenal sebagai ELISA atau EIA. Prinsip dasarnya sama dengan Radio immuno assay (RIA) tetapi pada ELISA digunakan enzim sedangkan pada RIA menggunakan bahan radioaktif yang dilabel. Enzim yang dikonjugasikan pada antibodi bereaksi dengan substrat untuk menghasilkan reaksi warna sehingga disebut sebagai chromogen substrat. Beberapa enzim yang umum dipakai pada ELISA antara lain alkalin fosfatase dan horseradish peroxidase (Crowther 2001; O’Connor et al. 2003; Goldsby et al. 2000). Keunggulan metode ELISA dibandingkan dengan metode RIA selain memiliki sensitifitas yang sama juga waktu pengukuran cepat karena diperlukan kira-kira 15 menit untuk 100 sampel; aman karena tidak memerlukan substansi radioaktif; relatif murah, hasil yang diperoleh setara meskipun material yang 26 dipergunakan berbeda (serum, plasma, urine maupun feses), peralatan yang diperlukan sederhana terutama untuk membaca hasil menggunakan spektrofotometer (O’Connor et al. 2003; Munro et al. 1991). Ada bermacam-macam tipe ELISA yang dikembangkan berdasarkan deteksi kualitatif dan kuantitatif terhadap antigen dan antibodi yang dikandungnya (Goldsby et al. 2000, Crowther 2001, Pier et al. 2004). Ada tiga metode yang mendasari semua metode ELISA yaitu Direct ELISA; Indirect ELISA dan Sandwich ELISA. Direct ELISA Teknik Direct ELISA merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Antigen diencerkan dalam bufer karbonat-bikarbonat atau phosphate buffer saline (PBS). Bufer yang digunakan tidak mengandung protein lain yang dapat berkompetisi dengan antigen target yang akan ditempelkan pada fase solid lempeng ELISA. Setelah diikunbasi, antigen yang tidak terikat pada fase solid dicuci menggunakan bufer. Antibodi spesifik terhadap antigen (Ab1), dilabel dengan enzim (konjugasi), ditambahkan dan diinkubasi. Antibodi terkonjugasi (Ab2) diencerkan dalam bufer yang mengandung substansi yang dapat menghambat penyerapan protein secara pasif. Substansi yang ditambahkan untuk berkompetisi dengan pori-pori dalam fase solid yang tidak terisi antigen disebut dengan bufer penahan atau blocking buffer. Selama inkubasi antibodi akan berikatan dengan antigen. Antibodi yang tidak berikatan dengan antigen dihilangkan dengan cara dicuci menggunakan bufer. Kemudin ditambahkan substrat atau chromogen antispesies. Reaksi ini bertujuan untuk mengembangkan reaksi warna melalui proses katalisis enzim. Interaksi antara antigen dan antibodi yang dideteksi dengan menggunakan konjugat (enzim yang dikonjugasikan ke antibodi), antara lain horseradish peroxidase dan substrat disebut chromogen karena mempunyai kemampuan untuk menyerap warna antara lain benzidin akan menimbulkan warna biru. Reaksi dihentikan apabila sudah terjadi perubahan warna dari biru menjadi kuning dengan menambahkan larutan yang menghambat reaksi. Perubahan warna yang 27 terjadi diukur menggunakan spektrofotometer (ELISA Reader, Biorad®) pada panjang gelombang 450 nm (O’Connor et al. 2003; Crowther 2001 ). Indirect ELISA Tahap awal teknik ini sama dengan Direct ELISA, hanya Ab1 yang ditambahkan adalah antibodi yang tidak dilabel enzim. Antibodi diencerkan menggunakan bufer penghambat untuk menjaga adanya penempelan nonspesifik dari protein antiserum. Diinkubasi dan dicuci untuk menghilangkan kelebihan antibodi yang tidak terikat agar didapatkan ikatan yang spesifik. Antibodi yang telah dilabel (Ab2 atau konjugat) berupa antibodi antispesies yang telah diencerkan dalam bufer, selanjutnya diinkubasi dan dicuci untuk mendapatkan ikatan yang spesifik. Substrat ditambahkan untuk mengikat konjugat dan setelah terjadi perubahan warna, reaksi dihentikan. Selanjutnya warna yang terjadi dibaca pada spektrofometer (O’Connor et al. 2003; Crowther 2001) . Sandwich ELISA Teknik ini dibagi menjadi dua yaitu Direct Sandwich dan Indirect Sandwich ELISA (Crowther 2001, Harlow & Lane 1988). Direct Sandwich ELISA Prinsip utamanya adalah memaksimalkan aktivitas antibodi (Ab1) yang ditempelkan pada fase solid lempeng ELISA untuk menangkap antigen. Kemudian antigen dideteksi menggunakan serum spesifik yang telah dilabel enzim (Ab2), diinkubasi dan dicuci. Antibodi yang menangkap antigen (capture antibody) dan antibodi yang mendeteksi (detecting antibody) bisa sama atau dari hewan berbeda dari spesies yang sama atau berbeda spesies. Setelah ditambahkan konjugat (Ab3 ), diinkubasi, konjugat bebas dicuci. Penambahan substrat sampai terjadi perubahan warna kemudian reaksi dihentikan dan diukur kuantitas 28 warnanya menggunakan spektrofotometer. Antigen yang dipergunakan paling tidak harus memiliki dua epitop (Crowther 2001; Harlow & Lane 1988). Indirect Sandwich ELISA Prinsip utamanya sama hanya antibodi untuk mendeteksi antigen tidak dilabel enzim. Setelah antigen berikatan dengan antibodi (Ab1) pada fase solid lempeng ELISA, ditambahkan antibodi (Ab2) yang berasal dari spesies yang berbeda dengan Ab1. Selama inkubasi terjadi ikatan Ag-Ab, antibodi bebas dicuci. Konjugat antispesies (Ab3) ditambahkan yang dapat mengikat serum yang berasal dari spesies yang sama dengan Ab2 tetapi tidak dapat bereaksi dengan antibodi fase solid ELISA. Penambahan substrat sampai terjadi perubahan warna kemudian reaksi dihentikan dan diukur kuantitas warnanya menggunakan spektrofotometer (Crowther 2001; Harlow & Lane 1988). Uji Validasi Ada beberapa uji validasi asai untuk mengukur yaitu paralelisme, efisiensi ekstraksi contoh maupun presisi asai. Uji paralelisme dilakukan dengan menguji respon konsentrasi terhadap standar. Konsentrasi diuji dengan membandingkan faktor pengencerannya. Apabila hasil yang diperoleh paralel terhadap standar maka pengenceran yang akan dilakukan dapat dipergunakan untuk mengukur konsentrasi antigen atau antibodi sampel. Efisiensi ekstraksi dilakukan dengan melakukan pelabelan radioaktif, dilakukan sebelum proses ekstraksi sampel ekskreta. Presisi ditentukan dengan menghitung nilai kontrol kualitas tinggi dan rendah pada satu asai (intra-assay coefficient of variant) dan pada beberapa asai (inter-assay coefficient of variant) yang telah dilakukan. Apabila asai menunjukan nilai koefisien variasi ≤ 15% maka asai tersebut dinyatakan memiliki nilai presisi yang baik (Maheswari 2007). EKSTRAKSI DAN ISOLASI OVINE PREGNANCY ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (ovPAG) DARI KOTILEDON PLASENTA DOMBA GARUT PADA SAAT MELAHIRKAN ABSTRAK Penelitian bertujuan untuk mengekstraksi serta mengisolasi protein (ovPAG) dari kotiledon plasenta domba garut berdasarkan berat molekulnya. Prosedur isolasi terdiri dari ekstraksi kotiledon plasenta (pencairan kotiledon, dicincang, ditambahkan PBS, kemudian dihancurkan dan sentrifus), presipitasi asam (H3PO41M, pH 4,5; sentrifus) dan garam (40% (NH4)SO4 dilanjutkan 80% (NH4)SO4, dan disentrifus), filtrasi gel (Sephadex G-75) dan kromatografi pertukaran anion (DEAE-cellulose). Absorbansi protein yang terkandung dalam fraksi yang ditampung diukur, protein dengan absorbansi tinggi diukur total proteinnya menggunakan Bichinconinic Protein Assay. Fraksi yang telah terukur total proteinnya dialirkan pada monogel SDS-PAGE, selanjutnya pita protein yang muncul diwarnai Commassie Brilliant Blue (CBB). Protein hasil ekstraksi dan isolasi pada berat molekul 30,86 kDa dapat dijadikan sebagai protein penanda kebuntingan, karena selalu muncul pada isolat S; DT; DN16, dan DN32. Kata kunci: Domba garut, pregnancy-associated glycoprotein (PAG), kotiledon, SDS-PAGE dan DEAE-cellulose. ABSTRACT The objective of the study was to extract and isolate PAG from placenta of Garut Sheep collected at parturation and to characterize their molecular weight. The procedures included extraction of protein at neutral pH (cotyledone was thawed, minced, added PBS, blended and centrifuged), acidic (H3PO41M, pH 4,5; centrifuged) and ammonium sulfate (40% and 80% (NH4)SO4, centrifuged) precipitation; gel filtration (Sephadex-G75), anion exchange chromatography (DEAE- cellulose). Cotyledone extract was subjected to Sephadex-G75 and DEAE cellulose, and their fractions were measured for absorbancies. SephadexG75 and DEAE fractions at peak absorbancy values were assayed for protein concentration (Bichinconinic protein assay). Continuously, these fractions were subjected to monogel SDS-PAGE and stained by Commassie Brilliant Blue. It could be concluded that protein at molcular weight around 30,86 kDa could be used as a protein marker of pregnancy. Since, the protein always exist at isolate S; DT; DN16, and DN32. Key words : Garut sheep, pregnancy-associated glycoprotein (PAG), cotyledone, SDS-PAGE, DEAE-cellulose.     30    PENDAHULUAN Implantasi merupakan proses yang sangat rumit dan melibatkan interaksi yang sangat dekat antara blastosit dan penerimaan uterus terhadap embrio. Tempat terjadinya implantasi terletak pada area karunkular (Jainudeen & Hafez 2000; Johnson & Everitt 2000; Dey et al. 2004; Lee & DeMayo 2004). Fusi seluruhnya atau sebagian kotiledon fetus dengan karunkel induk disebut plasentom yang merupakan tempat utama terjadinya pertukaran nutrien dan gas dalam plasenta. Plasenta berfungsi sebagai pelindung konseptus dengan jalan mensekresikan cairan plasenta. Sekresi plasenta berupa steroid (progesteron dan estrogen), laktogen plasenta (Devlin 2002) serta pregnancy-associated glycoprotein (Green et al. 1998; Xie et al. 1996). Ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) merupakan protein yang disekresikan oleh chorion atau trofektoderm plasenta spesies eutherian (Green et al. 2000). OvinePAG disintesa oleh sel mono- dan binukleat trofektoderm, yang selanjutnya disekresikan oleh induk sejak awal kebuntingan (Wooding 1992). Sekresinya akan semakin meningkat dengan semakin bertambah erat perlekatan plasenta pada saat implantasi (Sousa et al. 2006). Dengan demikian keberadaan PAG mempunyai manfaat ganda selain untuk menentukan kebuntingan juga sebagai indikator kesehatan fetus (Barbato et al. 2007). Pregnancy Associated Glycoprotein telah diisolasi pada berbagai spesies dan mempunyai kisaran berat molekul tertentu. Pada domba dan kambing, PAG mempunyai berat molekul antara 55-62 kDa (Garbayo et al. 1998; Sousa et al. 2002; El Amiri et al. 2004) ; sapi 67 kDa (Zoli et al. 1991) ; kerbau 59,5 – 75,8 kDa pada pertengahan kebuntingan dan 57,8 – 80,9 kDa pada akhir kebuntingan (Barbato et al. 2008). OvinePAG pertama diisolasi dari kotiledon fetus domba oleh Ranilla et al. (1994) dan telah terdeteksi keberadaannya dalam darah induk pada usia 3-4 minggu. OvinePAG disekresikan sepanjang usia kebuntingan dan mencapai puncaknya pada akhir masa kebuntingan. Konsentrasi ovPAG akan mulai menghilang pada hari ke 4-5 hingga 7 hari setelah melahirkan, sehingga 31    ovPAG dimungkinkan untuk menjadi penanda kebuntingan dini (El Amiri et al. 2007). Kondisi ini mendorong untuk dikembangkan metode kebuntingan sedini mungkin terutama sebelum memasuki siklus berahi berikutnya atau kurang dari 18 hari dalam upaya memperbaiki menejemen reproduksi khususnya pada domba garut. Penelitian ini bertujuan mendapatkan ovPAG , protein penentu kebuntingan dengan cara mengisolasi dari kotiledon plasenta yang dikoleksi pada saat melahirkan sehingga dengan demikian tidak ada ternak yang dikorbankan. Ekstraksi kotiledon plasenta diikuti dengan isolasi ekstrak pada kolom filtrasi gel (Sephadex-G75) dan kromatografi pertukaran anion (DEAE-cellulose). Fraksi yang terkumpul dari kedua kolom tersebut diukur absorbansinya untuk mendapatkan puncak absorbansi, selanjutnya fraksi yang memiliki absorbansi tinggi diukur total protein dan berat molekulnya sebagai isolat ovPAG (Gambar 11).   METODE PENELITIAN Penelitian ini menggunakan domba garut (Ovis aries) betina sejumlah 9 ekor yang telah dewasa kelamin serta pernah melahirkan. Domba betina berumur 2-3 tahun dengan bobot sekitar 22–36 kg serta dipelihara dalam kandang individu. Pakan yang diberikan berupa konsentrat dan hijauan. Perkawinan dilakukan menggunakan metode inseminasi buatan. Plasenta dikumpulkan pada saat melahirkan karena konsentrasi tertinggi ovPAG terjadi menjelang melahirkan dan mempunyai waktu paruh 4,5 hari setelah melahirkan (Haugejorden et al. 2003). Kotiledon dipisahkan dari karunkula kemudian dicuci bersih menggunakan NaCl 0,9 %, disimpan pada suhu – 200C (Sousa et al. 2002) sampai semua sampel terkumpul. Ekstraksi Kotiledon Ekstraksi kotiledon dilakukan dengan metode Garbayo et al. (1998), Sousa et al. (2002), dan El Amiri et al. (2007) termodifikasi. Setelah semua induk melahirkan, 32    Ekstrak kotiledon Konsentrasi Protein Ekstraksi Fraksi Fraksinasi Asai Protein Sephadex-G75 Spektrofotometer Dialisis Isolat ovPAG DEAE-cellulose SDS-PAGE Absorbansi BM ovPAG Gambar 11 Alur kerangka pemikiran penelitian ekstraksi dan isolasi ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) dari kotiledon domba garut pada saat melahirkan 33    METODE PENELITIAN Penelitian ini menggunakan domba garut (Ovis aries) betina sejumlah 9 ekor yang telah dewasa kelamin serta pernah melahirkan. Domba betina berumur 2-3 tahun dengan bobot sekitar 22–36 kg serta dipelihara dalam kandang individu. Pakan yang diberikan berupa konsentrat dan hijauan. Perkawinan dilakukan menggunakan metode inseminasi buatan. Plasenta dikumpulkan pada saat melahirkan karena konsentrasi tertinggi ovPAG terjadi menjelang melahirkan dan mempunyai waktu paruh 4,5 hari setelah melahirkan (Haugejorden et al. 2003). Kotiledon dipisahkan dari karunkula kemudian dicuci bersih menggunakan NaCl 0,9 %, disimpan pada suhu – 200C (Sousa et al. 2002) sampai semua sampel terkumpul. Ekstraksi Kotiledon Ekstraksi kotiledon dilakukan dengan metode Garbayo et al. (1998); Sousa et al. (2002), dan El Amiri et al. (2007) termodifikasi. Setelah semua induk melahirkan, ekstraksi kotiledon siap dikerjakan. Proses ekstraksi dimulai dengan mencairkan semua kotiledon yang terkumpul, ditimbang (249,19 g) , dicincang, ditambahkan phosphate buffer saline (PBS) dengan perbandingan 1 ml kotiledon : 3,5 ml PBS, diperoleh volume campuran 2 100 ml. Campuran dihomogenkan selama 5 menit lalu diputar semalaman (overnight) menggunakan stirrer pada suhu 4oC disebut larutan awal (S0). Larutan (S0) disentrifus (Refigerated High Speed Centrifuge, Himac-CR21G, R20A2) pada suhu 4oC, kecepatan 27.000 g selama 60 menit. Presipitat (PA) dikumpulkan dipisahkan dari supernatan (SA) , selanjutnya presipitat ditambah 200 ml PBS kemudian diputar semalaman (Miles et al. 2004). Keesokan harinya larutan disentrifus pada 27.000 g selama 60 menit (Sousa et al. 2002, El Amiri et al. 2007) dan presipitat (PB) dipisahkan dari supernatan (SB). Supernatan A ditambah SB, dihomogenkan dan didialisis menggunakan polietilen glikol (PEG) diperoleh supernatan 1 (S1) dengan volume 300 ml.     34    A  B  C  Gambar 12 Tipe plasenta sinepiteliochorion pada domba. Keterangan : A. Plasenta utuh B. Karunkula. C. Kotiledon Presipitasi Asam Supernatan 1 (S1) ditambah H3PO41M sampai mencapai pH 4,5 kemudian diputar selama 120 menit. Larutan disentrifus pada 27.000 g selama 60 menit, presipitat dibuang, supernatant C (SC) dikumpulkan kemudian ditambah KOH 1M sampai mencapai pH 7,6 (Garbayo et al. 1998) disebut supernatan 2 (S2). Presipitasi Garam ((NH4)2SO4) Supernatan 2 (S2) ditambah 40% (NH4)2SO4 (24,2 g/100ml), penambahan dilakukan secara hati-hati dan pelahan-pelahan sambil diputar serta disimpan semalaman pada suhu 4oC. Selanjutnya larutan disentrifus pada 27.000 g selama 60 menit, presipitat dibuang sementara supernatan D disebut supernatan 4 (S3) dikumpulkan kemudian ditambah 80% (NH4)2SO4 (28,1 g/100ml) mendapatkan perlakuan yang sama dengan pada 40% (NH4)2SO4 . Larutan disentrifus pada 27.000 g selama 90 menit, presipitat E dikumpulkan dan ditimbang (15,36 g) sedangkan supernatan E (S4) disimpan untuk pengujian keberadaan protein dalam ovPAG. Presipitat E ditambah 250 ml Tris- HCl 0,01 M, pH 7,6 (Garbayo et al. 1998; El Amiri et al. 2004). Campuran didialisis menggunakan bufer yang sama selama 48 jam. Larutan disentrifus pada 36.000 g selama 30 menit dan presipitat F dibuang sedangkan supernatan F (S5) dikumpulkan. Supernatan 5 didialisis sampai mencapai 10% volume awal disebut sebagai 35    supernatan prekolom (S6) siap untuk dialirkan pada kolom Sephadex-G75 dan DEAE-cellulose. Isolasi ovPAG dari Ekstrak Kotiledon Plasenta Isolasi ekstrak kotiledon plasenta dimurnikan dengan cara mengalirkan ekstrak kedalam kolom filtrasi gel Sephadex- G75 dan kolom kromatografi anion DEAE-cellulose (Creighton 1997; Lodish et al. 2000). Filtrasi Gel pada Kolom Sephadex-G75 Filtrasi gel menggunakan Sephadex-G75 (Sigma®) karena dapat mengisolasi protein pada berat molekul 3-80 kDa sedangkan protein yang telah berhasil diisolasi dari kotiledon plasenta domba mempunyaai berat molekul 55, 57 dan 59 kDa pada 100 hari atau lebih usia kebuntingan (El Amiri et al. 2004). Isolat prekolom dialirkan pada kolom Sephadex-G-75 yang telah diekuilibrasi menggunakan bufer NH4HCO3 0,05 M dengan kecepatan 1,25 ml/menit. Selanjutnya fraksi-fraksi ini diukur kadar total proteinnya dengan mengukur absorbansi menggunakan spektrofotometer (Hitachi U-2001®) pada panjang gelombang 280 nm, selanjutnya diplot pada grafik (Gambar 10). Fraksi yang berada pada titik puncak fluktuasi dikumpulkan untuk selanjutnya diukur konsentrasi total proteinnya menggunakan metode Bichinconinic Protein Assay (BCA , Pearce®). Kromatografi Pertukaran Anion pada Kolom DEAE-cellulose Pembuatan kolom DEAE (Sigma ®) dimulai dengan melarutkan resin (60 gr) dalam 500 ml dH2O, didiamkan selama 45 menit. Volume resin yang stabil setelah dilarutkan dalam dH2O dipergunakan sebagai standar penambahan pelarut pada saat pencucian (1 CV= 1 column volume). Suspensi disaring kemudian dalam resin (1CV) tersebut ditambahkan 2 CV 0.1 M NaOH yang mengandung 0,5 M NaCl selama 10 menit, dituangkan kedalam penyaring, selagi 36    disaring ditambahkan secara pelahan 1 CV bufer sampai seluruh suspensi tersaring. Pencucian diulang dengan larutan yang sama. Prosedur yang sama diberikan pada suspensi resin dengan mengganti pelarutnya yaitu 0,5 M NaCl; 0,1 M NaCl yang mengandung 0,5 M NaCl dan dH2O. Pencucian dilanjutkan dengan menambah 5-10 CV dH2O atau sampai pH campuran 5 atau lebih besar. Larutkan resin dalam 2 CV 1 M NaCl dan pH ditera pada 7-8 dengan menambahkan 2 M NaOH. Suspensi disaring kemudian ditambahkan 5 CV dH2O. Selanjutnya resin dilarutkan kembali dengan menambahkan 2 CV PBS . Resin dikeluarkan dari penyaring, tambahkan 5 CV PBS , disaring. Resin dilarutkan kembali menggunakan 2CV PBS. Ambil sedikit larutan resin, disaring dan diukur pHnya. Apabila pHnya berada kurang lebih 0,15 dari pH PBS (pH=7,6) maka suspensi resin siap dimasukkan dalam kolom. Kolom dibiarkan 3 hari agar kolom yang terbentuk stabil. Selanjutnya bufer yang akan dipergunakan pertama kali dialirkan untuk mengecek kelancaran aliran. Kolom DEAE diekuilibrasi menggunakan Tris-HCl 0,01M (pH 7,6). Isolat prekolom dialirkan, fraksi ditampung pada kecepatan 2,5 ml/menit. Selanjutnya kolom dielusi menggunakan bufer NaCl pada konsentrasi bertingkat yaitu 20; 40; 80; 160; 320 mM dan 1M yang pada setiap pergantian konsentrasi, fraksi ditampung dengan prosedur yang sama seperti pada kolom Sephadex-G75. Protein yang mempunyai konsentrasi protein tinggi dikumpulkan, didialisis menggunakan Polietilen glikol (PEG) terlebih dahulu sebelum diukur berat molekulnya dengan menggunakan monogel Sodium Dedocyl SulfatePolyAcrylamide Gel Elctroforesis atau SDS-PAGE (Abbas et al. 2007). Pembuatan Monogel SDS-PAGE Running Gel dibuat pada konsentrasi SDS-PAGE 14% sedangkan stacking gel pada 4%. Gel pemisah dibuat dengan menggunakan komposisi Acylamide 40%; bis-acrylamide 2%; TEMED; APS 10%; dH2O ditambah buffer Tris-HCl pH 8,8 sedangkan untuk stacking pH 6,8 (Gambar ditambahkan sebagai standar berat molekul protein yang 13). Marker dipisahkan. Setelah stacking gel mengental, protein yang akan diidentifikasi dimasukan yaitu 37    berasal dari S0; S1; S2; S3; S4; S5; S6 yang diperoleh pada saat ekstraksi kotiledon, standar berat molekul yang dipergunakan adalah Broad Range Standard dengan kisaran 7,5 – 203 kDa (Sigma®). Selanjutnya protein dengan berat molekul tertentu akan terpisah selama melewati gel pemisah pada 100 volt selama 90 menit (Creighton 1997), mengalir menuju elektrode bermuatan positif. Migrasi protein selesai setelah mencapai garis paling bawah dari monogel. Selanjutnya setelah mencapai garis paling bawah dari monogel, diwarnai dengan Commassie Brilliant Blue (CBB). Pewarnaan gel menggunakan CBB dimulai dengan melepas gel dari tempatnya, dicelupkan pada larutan CBB selama 20 menit. Kemudian untuk menghilangkan zat warna dari CBB dilakukan dengan mencelupkan gel pada larutan methanol selama 2 jam. Apabila larutan masih keruh maka pencelupan diulangi dengan menggunakan methanol baru sampai larutan menjadi bening serta pita protein terlihat jelas pada monogel. Gambar 13 Proses Pembuatan Monogel SDS-PAGE Pewarnaan Commassie Brilliant Blue. Monogel yang telah dilalui protein, direndam dalam larutan pewarnaan CBB (Merck®) selama 20 menit, kemudian larutan pewarna dibuang. Pencucian dilakukan dengan menambahkan larutan campuran methanol dengan asam asetat. Larutan CBB dibuat dengan mencampurkan 1,25 g CBB, 250 ml methanol, 50 ml 38    asam asetat serta dH2O, sampai mencapai volume 1 liter. Sedangkan larutan pencuci (destaining) dibuat dengan mencampurkan 250 ml methanol, 70 ml asam asetat dan dH2O, sampai mencapai volume 1 liter. Pengukuran Konsentrasi Protein Protein yang terlebih jelas garisnya pada monogel SDS-PAGE diukur konsentrasinya dengan metode Bicinchoninic Acid Protein Assay (BCA Protein assay). Protein yang akan diukur konsentrasinya dimasukkan ke dalam sumuran sebanyak 10 µl + 200 µl BCA (Reagent A : Reagen B = 50 : 1) kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC 30 menit. Selanjutnya absorbansi yang terbentuk dibaca menggunakan Assay Reader pada panjang gelombang 590 nm. Analisis Data Data hasil ekstraksi dan isolasi dianalisis secara deskriptif berdasarkan estimasi berat molekul protein yang ditemukan pada pita proteinnya. Demikian juga dengan data hasil pengukuran nilai absorbansi yang ditampung dari kolom Sephadex-G75 maupun DEAE-cellulose dibandingkan dengan konsentrasi total protein. HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi kotiledon menggunakan metode Garbayo et al .(1998), Sousa et al. (2002), dan El Amiri et al. (2007) termodifikasi, dari (249,19 g) setelah diekstrak dihasilkan kotiledon kasar presipitat seberat 15,36 g pada 80% (NH4)2SO4. Presipitasi garam umumnya menggunakan ammonium sulfat karena sifatnya yang sangat larut dalam air. Adapun tujuan utama dilakukan presipitasi terhadap ekstrak kasar adalah untuk menghilangkan protein besar yang mengkontaminasi sehingga hanya protein yang dibutuhkan yang terikat oleh adanya kekuatan ion tanpa merusak aktivitas enzim dari protein yang dipurifikasi. 39    Persamaan linear (Y= -0,927 X + 2,178; R2 = 0,949) didapat dengan cara menghitung migrasi relatif marker yang dipergunakan terhadap log berat molekul marker yang telah diketahui berat molekulnya (Gambar 14). Pita protein yang terlihat pada monogel SDS-PAGE dari berbagai supernatan yang dikumpulkan selama proses ekstraksi, dapat diestimasi berat molekulnya dengan mengukur migrasi relatif yang dilakukan protein pada saat melewati monogel SDS-PAGE. (Champe et al. 2008; Stryer 1995). Gambar 14 Kemiringan persamaan linear perhitungan migrasi relatif untuk menentukan berat molekul protein ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG). X=migrasi relatif, Y=logBM Perbandingan jarak migrasi sampai pita protein muncul pada monogel terhadap jarak migrasi terjauh merupakan nilai migrasi relatif protein yang diuji. Estimasi berat molekul dapat dihitung dengan memasukan nilai migrasi relatif ke dalam persamaan linear di atas. Protein yang terkandung didalam ekstrak kotiledon plasenta (Gambar 15) terbagi menjadi 3 kelompok yaitu sekitar 70 kDa sebanyak 3 pita (77,4; 73,1; 68,8), sekitar 30 kDa sebanyak 7 pita (39,92; 38,68; 37,98; 36,04; 34,1; 33,53; 32,39) dan belasan sebanyak 6 pita (17,64; 16,08; 14,56; 14,52; 13,74; 12,18 ). 40    kDa Gambar 15 Pita protein dari isolat hasil ekstraksi kotiledon yang terpapar pada monogel SDS-PAGE dengan pewarnaan Commassie Brilliant Blue Keterangan : M= marker; S0=material kasar; S1=S0 disentrifus; S2=presipitasi asam; S3= 40%(NH4)2SO4; S4=80% (NH4)2SO4; S5=TrisHCl 0,01M, dan S6=prekolom Purifikasi ovPAG dilakukan dengan mengalirkan ekstrak kotiledon pada kolom Sephadex-G75 dan DEAE-cellulose. Sephadex-G75 dipilih untuk filtrasi protein yang berada pada kisaran berat molekul 3 – 80 kDa (Sigma®) sedangkan DEAE-cellulose dimanfaatkan untuk pertukaran anion dengan menggunakan konsentrasi NaCl yang bertingkat sebagai upaya untuk mendapatkan protein yang mempunyai ikatan ion yang paling kuat. Penggunaaan NaCl pada kromatografi pertukaran anion karena ion Cl-1 dalam kondisi fisiologis normal banyak tersedia dalam membran plasma (Eggermont 2004). Hal utama dari proses purifikasi adalah untuk meningkatkan rasio aktivitas enzim terhadap protein yang dielusi. Sodium dedocyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) dipergunakan untuk memotong protein yang terkontaminasi enzim selain yang dipersiapkan untuk dievaluasi aktivitasnya. 41    Mercaptoethanol panas dipergunakan untuk memotong ikatan disulfid dan mendenaturasi protein. Sementara SDS merupakan deterjen dipergunakan untuk mencuci muatan alami protein, sehingga semua protein mempunyai muatan ion yang sama (SDS mengikat secara stoichiometrikal, 1 SDS per 1,4 asam amino). Pada saat protein dilewatkan pada gel , dan aliran listrik dijalankan maka protein akan migrasi melalui pori-pori dalam gel poliakrilamid. Gel akan memisahkan protein berdasarkan kecepatan gerakan protein yang sebanding dengan logaritmik berat molekulnya. Ada dua hal utama yang penting dilakukan selama purifikasi yaitu total protein yang dielusi serta aktivitas enzim dari protein. Seluruh fraksi yang tertampung (Tabel 1) dari kolom Sephadex-G75(S) maupun DEAE-cellulose (Tris-HCl atau DT, NaCl 20mM atau DN20, NaCl 40mM atau DN40, NaCl 80mM atau DN8, NaCl160 mM atau DN16, NaCl 320 mM atau DN32 dan NaCl 1 M atau DN1) diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer kemudian dibuat grafik (Gambar 16). Berdasarkan fluktuasi nilai absorbansi yang muncul, akan diperoleh beberapa fraksi yang memiliki nilai absorbansi tinggi. Fraksi ini dikumpulkan untuk dihitung total proteinnya. Tabel 1 Jumlah Fraksi dan Konsentrasi Protein pada Kolom Sephadex-G75 dan DEAEcellulose   ng/ml Keterangan : Negatif = nilai lebih rendah dari standar 42    Gambar 16 Absorbansi protein dalam fraksi dari kolom Sephadex-G75 (NH4HCO3) dan DEAE-cellulose Keterangan : S= Sephadex-G75; DT=DEAE-Tris-HCl 0,01 M; DN2=DEAE- NaCl 20mM; DN4=DEAE- NaCl 40 mM; DN8=DEAE- NaCl 80 mM; DN16=DEAE- NaCl 160 mM; DN32=DEAE- NaCl 320 mM dan DN1=DEAE- NaCl 1M).  43    Fraksi DN2, DN4 dan DN1, mempunyai nilai absorbansi rendah dan fluktuasi tidak terlihat jelas, sedangkan pada DN8, DN16 serta DN32 meskipun nilai absorbansi tidak terlampau tinggi tetapi masih ada fluktuasi nilai absorbansinya sehingga dapat dikumpulkan untuk diukur total proteinnya. Fraksi S mempunyai nilai absorbansi yang cukup tinggi dengan fluktuasi yang jelas. Hal ini dimungkinkan karena kolom Sephadex-G75 hanya memisahkan protein berdasarkan ukuran protein saja. Konsentrasi total protein (Tabel 1) yang terkandung didalamnya diukur dengan metode BCA Assay. Fraksi DEAE-NaCl 20 dan 40 mM serta 1M mempunyai nilai absorbansi yang rendah ternyata mempunyai konsentrasi protein yang nilainya lebih rendah dari standar sehingga tidak dipergunakan sebagai stok. Sedangkan fraksi S, DT, DN8, DN16 dan DN32 yang mempunyai total protein berturut-turut 181; 171; 2,67; 44,33 dan 86 ng/ml akan dipergunakan sebagai stok isolat murni ovPAG sebagai hasil purifikasi ekstrak kotiledon . Protein yang telah diisolasi diukur berat molekulnya dengan mengalirkan isolat (S, DT, DN2, DN4, DN8, DN16, DN32 dan DN1) ke dalam monogel SDSPAGE. Pita protein S mempunyai estimasi berat molekul 72,95; 32,16; 30,17 dan 11,73 kDa yang dihitung berdasarkan persamaan linear Y = -1,505x+2,164, R2=0,939 (Gambar 17). Estimasi berat molekul protein pada DT; DN16, dan DN32 dapat dihitung berdasarkan persamaan linear Y=-1,444X +2,315; R2=0,935, (Gambar 18), sedangkan pita protein dari isolat DN2; DN4, dan DN1 tidak muncul pada monogel SDS-PAGE. Ada dua pita protein DT yaitu 30,86 dan 11,74 kDa, sedangkan pada DN16 dan DN32 masing-masing memiliki tiga pita protein pada 71,67; 33,64 dan 30,86 kDa. Ada satu pita protein yang memiliki berat molekul yang sama pada DT, DN 16 dan DN32 yaitu pada 30,86 kDa. 44    k Da 203 118 86 7 2 ,9 5 5 1 ,6 3 4 ,1 3 2 ,1 6 3 0 ,1 7 29 1 9 ,2 1 1 ,7 4 7 ,5 M S Gambar 17 Pita protein fraksi hasil gel filtrasi Sephadex-G75 Keterangan : M= marker; S=Sephadex-G75 kDa 203 118 86 7 1,6 7 5 1 ,6 3 4 ,1 3 3,6 4 3 0 ,8 6 29 3 0 ,8 6 1 9 ,2 1 1 ,7 4 7 ,5 M M DT DT DN2 DN4 DN2 DN4 DN8 DN16 DN32 DN8 DN16 DN32 DN1 Gambar 18 Pita protein fraksi hasil kromatografi pertukaran anion DEAE Keterangan : M=Marker; DT=DEAE-TrisHCl 0,01 mM;DN2=DEAE-NaCl 20mM;DN4= DEAE-NaCl 40mM; DN8=DEAE-NaCl 80mM; DN16=DEAENaCl 160mM; DN32=DEAE-NaCl320mM; DN1= DEAE-NaCl 1M) 45    Pada penelitian ini ditemukan protein yang spesifik domba garut, karena belum dilaporkan peneliti terdahulu, yaitu protein dengan berat molekul 30,86 kDa yang lebih rendah dari El Amiri et al. (2007) yang telah berhasil mengisolasi ovPAG pada kebuntingan > 100 hari dan antara 60 – 100 hari usia kebuntingan, pada berat molekul 57-59 kDa dan 58 -61 kDa seta Szafranska et al. (2003) yang telah berhasil mengidentifikasi pada babi sebesar 35-72 kDa. Akan tetapi, protein dengan berat molekul antara 12,18 dan 17,67 kDa mendekati berat molekul Human Chorionic Gonatotrophine (HCG) yang biasa dimanfaatkan sebagai penanda kebuntingan pada manusia pada 14,5 kDa (Garn & Latiff 2005). Temuan menjadi penting karena berhasil mengisolasi protein kotiledon plasenta pada saat melahirkan dengan berat molekul sebesar 30,86 kDa. KESIMPULAN Protein pada berat molekul sekitar 30,86 kDa merupakan protein spesifik domba garut yang berhasil diisolasi dari ekstrak kotiledon plasenta pada saat melahirkan dan dapat dijadikan sebagai protein penanda kebuntingan. DAFTAR PUSTAKA Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. 2007. Cellular and Mollecular Immunlogy. Ed ke-6. Philadelphia : Elsevier Inc. hlm 3 – 17; 123-142. Barbato O, Sousa NM, Klisch K, Clerget E, Debenedetti A, Barile VL, Malfatti A, Beckers JF. 2008. Isolation of new pregnancy-associated glycoproteins from water buffalo (Bubalus bubalis) placenta by Vicia villosa affinity chromatography. Res in Vet Scie 85(3):457-466. Champe PC, Harvey RA, Ferrier DR, editor. 2008. Lippincott’s Illustrated Reviews : Biochemistry. Ed ke-4. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins. hlm 157-172. Creighton TE. 1997. Protein : Structures and Molecular Properties. Ed ke-5. New York : W.H. Freeman and Company. hlm 1-104. Devlin TM. 2002. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlation. New York : Wiley-Liss. Dey SK et al. 2004. Molecular cues to implantation. Endocrine Rev 25(3): 341-373. 46    Eggermont J. 2004. Calcium-activated chloride channels : (Un)known and (Un)loved?. Didalam : Proceedings of the Americans Thoracic Society. Vol 1:22-27. El Amiri B, Remy B , Sousa NM, Beckers JF. 2004. Isolation and characterization of eight pregnancy-associated glycoproteins present at high levels in the ovine placenta between day 60 and day 100 of gestation. Reprod Nutr Dev 44:169-181. El Amiri et al. 2007. Measurement of ovine pregnancy-associated glycoprotein (PAG) during early pregnancy in Lacaune Sheep. Reprod Dom Anim doi :10.1111/j. 1439-0531.ISSN 0936-6768. Garbayo et al. 1998. Isolation and partial characterization of pregnancy-associated glycoprotein family from the goat placenta. Biol of Reprod 58:109-115. Garn, L-H, Latiff A. 2005. SDS_PAGE electrophoretic property of human chorionic gonadotropin (HCG) and its β-subunit. Int J Biol Sci 1(3):103-109. Green JA, Xie S, Roberts RM. 1998. Pepsin-related molecule secreted by trophoblast. Rev of Reprod 3:62-69. Green et al. 2000. Pregnancy-associated bovine and ovine glycoproteins exhibits spatially and temporally distinct expression patterns during pregnancy. Biol Reprod 62:1624-1631. Haugejorden G et al. 2006. Pregnancy-associated glycoproteins (PAG) in postpartum cows, ewes, goats and their offspring. Theriogenology 66:1976-1984. Jainudeen MR, Hafez ESE. 2000. Pregnancy diagnosis. Di dalam : Hafez B, Hafez ESE, editor. Reproduction in Farm Animals. Ed ke-7. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins. hlm 395-404. Johnson MH, Everitt BJ.2000. Essential Reproduction. Ed ke-5. Cambridge : Blackwell Science. hlm 173-202. Lee KY, DeMayo FJ. 2004. Animal models of implantation (Review). Reproduction 128:679-695. Lodish et al. 2000. Molecular Cell Biology. Ed ke-4. New York : W.H. Freeman and Company. hlm : 50-137. Miles JR, Farin CE, Rodriguez KF, Alexander JE, Farin PW. 2004. Angiogenesis and morphometry of bovine placentas in late gestation from embryos produced in vivo and in vitro. Biol Reprod 71:1919-1926. 47    Ranilla MJ, Sulon J, Mantecόn AR, Beckers JF, Carro MD. 1994. Plasma pregnancy-associated glycoprotein and progesterone concentrations in pregnant Assaf ewes carrying single and twin lambs. Theriogenology : 42(3):537-45. Sousa et al. 2002. Characterization of pregnancy-associated glycoproteins extracted from zebu (Bos indicus) placentas removed at different gestational periods. Reprod Nutr Dev 42:227-241. Sousa NM, Ayad A, Beckers JF, Gajewski Z. 2006. Pregnancy-associated glycoproteins (PAG) as pregnancy markers in the ruminants. J of Phy and Pharm 57 Supp 8: 153-171. Stryer, L. 1995. Biochemistry. Ed ke-4. New York : hlm : 875-910. WH Freeman & Co. Szafranska B, Panasiewicz G, Majewska M. 2006. Biodiversity of multiple pregnancy-associated glycoprotein (PAG) family : gene cloning and chorionic protein purification in domestic and wild eutherians (placentalia) – a review. Reprod Nutr Dev 5:481-502. Wooding FBP. 1992. Current topic: the synepitheliochorial placenta of ruminants: binucleate cell fusions and hormone production. Placenta 13:101-113. Xie S, Nigel RJ, Green J, Beckers J-F, Roberts RM. 1996. Trophoblast-specific processing and phosphorylation of pregnancy-associated glycoprotein-1 in day 15 to 25 sheep placenta. Biol Reprod 54: 122-129. Zoli et al. 1991. Purification and characterization of a bovine pregnancyassociated glycoprotein. Biol Reprod 45:1-10. PEMBUATAN ANTIBODI POLIKLONAL RABBIT ANTI-OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (rabbit anti-ovPAG) ABSTRAK Tujuan dari penelitian ini adalah memproduksi antibodi poliklonal menggunakan isolat yang telah dimurnikan pada kelinci New Zealand White (n=12 ekor). Isolat dengan kandungan total protein berturut-turut 181; 171; 2,67; 44,33; 86 ng/µl dan 0,9% NaCl Fisiologis (S; DT; DN8; DN16; DN32, dan K) disuntikan secara subcutan pada bagian punggung kelinci. Sebelum diimunisasikan isolat dicampur dengan adjuvant (Freud’s Complete satu kali dan Incomplete 2 kali sebagai Booster I dan II). Interval penyuntikan dua minggu dan darah dikoleksi dalam tabung berisi antikoagulan setiap sebelum penyuntikan isolat. Hasil penelitian menunjukan, DN32 memberikan respon imun yang baik terhadap protein ovPAG yang terkandung dalam isolat yang disuntikan menggunakan teknik ELISA, diperoleh rabbit anti-ovPAG DN32. Determinasi rabbit anti-ovPAG dilakukan dengan menguji kespesifikan anti-ovPAG menggunakan metode Western Blot. Uji diferensiasi Rabbit anti-ovPAG DN32 terhadap ovPAG dalam urin domba , diperoleh pita protein yang jelas dengan berat molekul 71 dan 31 kDa pada domba bunting sedangkan domba tidak bunting hanya mempunyai satu pita dengan berat molekul 71 kDa. Kesimpulan penelitian bahwa protein dengan berat molekul 31 kDa merupakan protein penanda kebuntingan pada domba garut. Kata kunci : ovPAG, kotiledon, Western Blot, Rabbit anti-ovPAG, ELISA ABSTRACT The aim of the study was to produce polyclonal antibody ( rabbit antiovPAG) which could detect PAG in the urine of pregnant ewes. Twelve rabbits were immunized respectively against ovPG S, DT, DN8, DN 16, DN 32 and NaCl 0,9% as a placebo. Briefly, 0.5 ml of isolate was emulsified in aqual volume with Freud’s adjuvant (Complete and Incomplete). Thereafter, the mixture was injected at mutiple sites along the dorsal area of rabbits by subcutaneous route. Rabbits received the same amount at 14 day intervals over period of 8 weeks. Blood were collected from marginal ear vein, starting before first injection (baseline), and every 14 days . Rabbit anti-ovPAG were measured using Modified ELISA Technique, DN32 had the best immune response among others. Moreover, rabbit anti-ovPAG DN32 also could differenciate ovPAG in the urine of pregnant and non-pregnant ewes using Western Blot Technique,. There were two protein bands had molecular weight at 71 and 31 kDa on pregnant’s urine whereas on the non-pregnant urine only one band appeared at 71 kDa. It could be concluded that protein of ovPAG at molecular weight at 31 kDa is a marker protein on garut sheep and could be developed as a major protein for producing antisera. Key words : ovPAG, cotyledon, Western Blot, Rabbit anti-ovPAG, ELISA 49 PENDAHULUAN Deteksi kebuntingan dini menjadi penting pada ruminansia kecil karena akan sangat membantu dalam peningkatan populasi dan pengurangan biaya produksi. Pregnancy-associated glycoprotein merupakan agen yang berfungsi sebagai penanda kebuntingan juga merupakan indikator kesehatan calon anak (Wodzicka-Tomaszewka et al. 1991; Klein et al. 2006). Pregnancy-associated glygoprotein (PAG) merupakan famili aspartik proteinase yang disekresikan oleh sel binukleat trofoblastik (Wooding 1992; Perẻnyi et al. 2002; El Amiri et al. 2003; Hughes et al. 2003) dan molekulnya tampak dalam lapisan sel epitel luar plasenta spesies hewan ungulata (Green et al. 2000). Pregnancy-associated glygoprotein terdeteksi dalam darah menggunakan metode radioimmuno assay (RIA) saat penempelan plasenta fetus ketika sel binukleat trofoblastik mulai berpindah dan masuk ke dalam sel endometrium membentuk sinsisium fetomaternal ( Ranilla et al. 1994; Verberckmoes et al. 2004). Oleh sebab itu PAG merupakan indikator yang baik untuk penanda kebuntingan juga kesehatan feto-plasental (Karen et al. 2003; Boscos et al. 2003). Konsentrasi PAG terendah pada domba bunting adalah 2 ng/ml, secara signifikan dicapai pada kebuntingan hari ke-25 (Verbeckmoes et al. 2004; Gonzalez et al. 2004). Menurut Setiatin et al. (2009), purifikasi kotiledon plasenta yang dikoleksi pada saat melahirkan mempunyai protein dengan berat molekul 30,86 kDa dihitung berdasarkan migrasi relatif protein didalam monogel SDS-PAGE (Stryer 1995; Devlin 2002). Pita protein ovPAG domba garut yang paling banyak muncul mempunyai berat molekul 30.86 kDa, lebih rendah dibanding El Amiri et al. (2004) pada 55-65 kDa. Beberapa isolat ovPAG yang diperoleh pada saat pemurnian dipergunakan untuk memproduksi antibodi poliklonal (Ayad et al. 2007), dengan menyuntikannya pada kelinci. Pemanfaatan kelinci New Zealand White (NZW) sebagai hewan coba telah mendapat persetujuan dari Komisi Pengawasan dan Kesejahteraan INDOANILAB dan Penggunaan No.:03-IA-ACUC Hewan 2008, Percobaan Tanggal 15 (KPK-PHP) Nopember PT 2008 50 (Lampiran 1). Antibodi poliklonal dipergunakan untuk mendeteksi ikatan PAG dalam material biologis (Green et al. 2005). Dengan demikian dimungkinkan untuk memanfaatkannya sebagai agen yang dapat mendeteksi keberadaan PAG dalam urin. Determinasi Rabbit anti-ovPAG dilakukan menggunakan monogel SDS-PAGE yang dilanjutkan dengan metode Western Blot untuk menguji keberadaan antibodi poliklonal yang terkandung dalam plasma darah kelinci (Barbato et al. 2008; Bella et al. 2009) sedangkan konsentrasinya diukur dengan teknik ELISA termodifikasi (Gambar 19). 51 1 Koleksi darah Antibodi Baseline Isolat + FCA Antibodi Primer 2 Isolat + FICA I Antibodi Booster I 3 Isolat + FICA II Antibodi Booster II Rabbit anti-ovPAG ELISA Respon Imun Western Blot Determinasi Antibodi Ab(+) & Ab (-) Diferensiasi ovPAG dalam urin domba Bunting Tidak Bunting Gambar 19 Alur kerangka pemikiran penelitian pembuatan antibodi poliklonal rabbit anti-ovine pregnancy-associated glycoprotein (rabbit anti-ovPAG) 1. Penyuntikan ke-1; 2. Penyuntikan ke-2 atau Booster I; 3. Penyuntikan ke-3 atau Booster II ; FCA=Freud’s Complete Adjuvant ; FICA=Freud’s Incomplete Adjuvant 52 METODE PENELITIAN Pembuatan Antibodi Poliklonal Kelinci strain NZW dengan bobot rata-rata 3 kg, sejumlah 12 ekor dibagi menjadi 6 kelompok masing-masing dengan 2 ulangan tanpa ada perbedaan jenis kelamin. Pakan yang diberikan berupa pelet dan wortel sedangkan multivitamin diberikan sebelum perlakuan dan diulangi setiap selesai imunisasi. Isolat ovPAG (S,DT, DN8, DN16, DN32) yang diperoleh dari purifikasi ekstrak kotiledon plasenta dalam kolom Sephadex-G75 dan DEAE-cellulose (Tabel 2). Freud’s complete adjuvant (Sigma®) dan Freud’s Incomplete adjuvant (Sigma®) diperlukan sebagai larutan pengikat (adjuvant) ovPAG yang akan diimunisasikan pada kelinci (Goldsby et al. 2000; Erb & Hau 1994; Hendriksen & Hau 2003). Tabel 2 Isolat ovPAG dan konsentrasinya yang diimunisasikan pada kelinci New Zealand White Isolat ovPAG Jumlah (ekor) Konsentrasi (ng/µl) Sephadex-G75 (S1 & S2) 2 181.00 DEAE-Tris HCl 0,01 M (DT.1 & DT.2 2 171.00 DEAE-NaCl 80 mM (DN8.1 &DN8.2) 2 2.67 DEAE-NaCl 160 mM (DN16.1 & DN16.2) 2 44.33 DEAE-NaCl 320 mM (DN32.1 &DN32.2) 2 86.00 Kontrol (K1 & K2) 2 Isolat diimunisasikan pada bawah kulit atau subkutan bagian punggung kelinci NZW (Gambar 19). Imunisasi pertama dilakukan dengan menyuntikan campuran 0.5 ml isolat ditambah 0.5 ml Freud’s complete adjuvant atau FCA (Sigma®). Booster pertama dilakukan dengan menyuntikan campuran 0.5 ml isolat ditambah 0.5 mL dan Freud’s Incomplete adjuvant atau FICA (Sigma®) Booster kedua dilakukan dua minggu setelah booster pertama dengan menyuntikan campuran dengan komposisi yang sama dengan booster pertama. 53 Darah dari vena maupun arteri telinga (Vena dan Arteri auricularis) ditampung kedalam tabung yang telah berisi antikoagulan, setiap dua minggu sekali dengan volume maksimum 20% bobot kelinci (Ayad et al. 2007). Darah (Baseline; FCA; FICA I dan II) disentrifus pada kecepatan 2 500 rpm selama 15 menit untuk dipisahkan plasma darahnya kemudian ditempatkan dalam tabung, disimpan pada suhu – 20oC sampai seluruh plasma terkumpul. Setelah semua plasma darah tekumpul, respon imun kelinci terhadap ovPAG yang diimunisasikan, diukur dengan melihat kerapatan optik menggunakan teknik ELISA termodifikasi yang diukur pada panjang gelombang 450 nm. Pemanfaatan Teknik ELISA Termodifikasi untuk Mengukur Konsentrasi Rabbit anti-ovPAG Prinsip utamanya adalah mengukur konsentrasi antigen berdasarkan antigen yang dapat ditangkap oleh antibodi (capture antigen) dengan menggunakan antibodi yang tidak dilabel oleh enzim (Crowther 2001; Green et al. 2005; Silva et al. 2007). Antigen ovPAG hasil isolasi yaitu S, DT, DN8, DN16 dan DN32 ditambah bufer kabonat-bikarbonat (coating-buffer) dengan perbandingan 1:10 dimasukkan pada masing-masing sumuran sebanyak 100 μl, kemudian diinkubasi pada 4oC semalam. Keesokan harinya, dicuci menggunakan PBS Tween 0.1 % sebanyak 4 kali. Larutan penghambat (Blotto 5%) merupakan campuran 5 gr susu skim dengan PBS 0,1%. Setiap sumuran diisi 300 μl blotto 5% kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit (Silva et al. 2007). Setelah 60 menit, blotto dibuang dan dicuci sebanyak 4 kali. Rabbit anti-ovPAG diencerkan dalam blotto 5% (1 : 50) kemudian pada masing-masing sumuran diisi 100 μl, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 90 menit. Selanjutnya lempeng ELISA, dicuci sebanyak 4 kali menggunakan larutan pencuci yang sama. Setiap sumuran diisi campuran Goat anti-rabbit IgG peroxidase (Sigma®) dalam blotto 5% (1:2000) sebanyak 100 μl, diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit. Lempeng ELISA dicuci menggunakan PBS Tween 0.1% sebanyak 4 kali. 54 Langkah selanjutnya, setiap sumuran ditambah 100 μl TMB atau 3,3’,5,5’ tetra methyl benzidine dihydrochloride (Sigma®) kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar (warna biru). Reaksi dihentikan dengan menambahkan larutan 2N H2SO4 sebanyak 50 μl pada setiap sumuran. Perubahan warna biru menjadi kuning, menunjukan reaksi telah berakhir, selanjutnya kerapatan optik dibaca menggunakan Microplate Reader Model 3550 (Biorad®) pada panjang gelombang 450 nm (Crowther 2001; Chow et al. 2003). Determinasi Rabbit anti-ovPAG menggunakan Metode Western Blot Determinasi dilakukan untuk mengevaluasi reaksi antara ovPAG yang terdapat dalam ekstrak kotiledon plasenta dan urin domba garut bunting maupun tidak bunting terhadap rabbit anti-ovPAG yang diproduksi dalam kelinci sebagai antibodi poliklonal. Urin domba ditampung pagi hari dan dibuat alliquot untuk dapat dipergunakan juga saat mengukur konsentrasinya. Langkah awal untuk memulai teknik ini perlu dibuat monogel SDS-PAGE, Selanjutnya ovPAG dialirkan ke dalam gel yang dengan adanya elektrode yang mengalir di dalam running buffer protein bermigrasi dan berhenti sesuai dengan berat molekulnya. Kemudian gel ditransfer ke dalam membran nitroselulose (Barbato et al. 2008; Bella et al. 2009; Majewska et al. 2005; Huebner 2004). Transfer ovPAG ke dalam membran nitroseluse dilakukan dengan cara memisahkan gel dari kaca kemudian dimasukkan kedalam transfer bufer. Posisi kertas nitroselulose berada di atas gel sedangkan diantara membran nitroselulose dan gel ditambahkan kertas saring yang basah. Selanjutnya gel, membran nitroselulose dan kertas saring dimasukkan ke dalam kaset transfer yang telah ditambah spon di kedua sisinya. Setelah itu kaset transfer dicelupkan dalam transfer bufer pada 100 volt selama 60 menit . Membran nitroselulose diletakkan dalam cawan petri,dan direndam dalam larutan blotto 5% selama 1 jam (Goldsby et al. 2000; Huebner 2004). Blotto diaspirasi dan selanjutnya dicuci dengan menambahkan PBS Tween 0.1 % , pencucian dilakukan sebanyak empat kali. Kemudian rabbit anti-ovPAG ditambahkan ke dalam cawan petri dengan perbandingan rabbit anti-ovPAG dan 55 blotto 5% masing-masing 1 : 50, diinkubasi semalam. Keesokan harinya sampel dicuci dengan PBS Tween 0.1 % sebanyak 3 kali dengan interval 5 menit. Konjugat α-Rabbit Alkaline Phosphatase diencerkan dalam blotto 5% dengan perbandingan 1: 5 000, selanjutnya diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Membran nitroselulose dicuci kembali dengan PBS Tween 0.1 % sebanyak 3 kali dengan interval 5 menit, selanjutnya ditambahkan substrat berisi campuran 5bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt (BICP) dengan nitrotetrazolium blue chlorine-98% (NBT), inkubasi 20 menit kemudian dicuci dengan dH2O. Analisis Data Data respon imun, pemilihan antibodi, dan determinasi rabbit anti-ovPAG dianalisis secara deskriptif. Respon imun dianalisis dengan mengukur peningkatan nilai kerapatan optik terhadap rabbit anti-ovPAG (B; FCA; FICA1, dan FICA2) yang dihasilkan. Antibodi yang dipergunakan untuk ELISA ditentukan berdasarkan data respon imun dan konsentrasi total proteinnya, Selanjutnya, determinasi rabbit anti-ovPAG positif dan negatif terhadap ovPAG terhadap dalam K; DN32; DN16; DN8; DT, dan S maupun urin bunting dan tidak bunting dianalisis berdasarkan estimasi berat molekul yang muncul pada pita protein. HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini menggunakan kelinci produsen anti-ovPAG karena memiliki tingkat kekerabatan yang jauh dengan domba, mudah ditangani serta mudah dipelihara. Selain itu, persyaratan lain yang harus dipenuhi, kelinci tersebut belum pernah mendapat paparan ovPAG. Antigen atau imunogen dalam hal ini ekstrak ovPAG merupakan substansi yang mempunyai kemampuan untuk menghasilkan respon imun yang spesifik. Ada beberapa persyaratan agar isolat ovPAG dapat dipergunakan sebagai imunogen adalah dikenali sebagai benda asing, mempunyai berat molekul yang besar, mempunyai struktur kimia yang 56 kompleks, dosis penyuntikan, rute penyuntikan dan waktu penyuntikan serta mempunyai epitop yang dapat dikenali oleh antibodi. Ovine PregnancyAssociated Glycoprotein domba garut memiliki beberapa kriteria sebagai imunogen yaitu mempunyai tingkat kekerabatan yang jauh dengan kelinci, memiliki berat molekul antara 30,7 – 78 kDa, serta belum pernah diimunisasikan pada kelinci yang digunakan sebagai produsen antibodi (Setiatin et al. 2009). Antigen baru akan dikenali oleh limfosit B maupun T apabila epitopnya dikenali. Epitop merupakan sisi aktif antigen yang dapat berikatan dengan reseptor sel B maupun T. Respon imun yang dihasilkan bergantung dari dosis dan rute penyuntikan antigen atau imunogen. Campuran antibodi yang dapat mengenali beberapa epitop pada antigen yang sama disebut antibodi poliklonal. (Goldsby et al. 2000; Abbas et al. 2007). Kekuatan interaksi antigen dan antibodi bergantung seberapa dekat kecocokan antara antigen dan antibodi. Total kekuatan interaksi nonkovalen antara tempat terikatnya antigen (single antigen) terhadap epitop tersebut. Semakin tinggi afinitas antibodi, kemampuan antibodi untuk mengikat semakin kuat dan ikatannya bertahan lama semakin rendah afinitas ikatan antibodi dan epitop makin lemah dan ikatannya mudah lepas. Reaksi silang (cross-reactivity) terjadi apabila ada dua antigen yang memiliki epitop yang identik atau antibodi yang spesifik untuk satu epitop juga mengikat epitop lain yang tidak berhubungan tetapi memiliki sifat kimia yang sama (Huebner 2004). Pengukuran Konsentrasi Rabbit anti-ovPAG Reaksi ELISA berakhir setelah penambahan 2N H2SO4 ke dalam setiap sumuran yang ditandai dengan terjadinya perubahan warna dari biru menjadi kuning. Gradasi warna yang muncul berkaitan erat dengan banyaknya antigen (ovPAG) dalam sampel yang diikat oleh rabbit-ovPAG. Respon imun kelinci (6 perlakuan; 2 ulangan) pada percobaan memberikan hasil yang beragam sehingga perlu dilakukan seleksi terhadap antibodi yang akan diujikan kespesifikannya (Gambar 20). Sebanyak 11 ekor kelinci memberikan respon yang baik kecuali DN 8.1, setelah dilakukan pengukuran kerapatan 57 optiknya menggunakan teknik ELISA Termodifikasi. Titer awal menunjukan kerapatan optik sebelum ada pengaruh imunogen atau ovPAG ditentukan sebagai titer baseline. Penambahan adjuvant kedalam isolat yang disuntikan berfungsi untuk meningkatkan imunogenitas isolat. Adanya Mycobacterium sp dalam Freud’s Complete Adjuvant (Sigma ®) pada imunisasi pertama akan menstimulir sel B maupun T untuk membentuk respon imun (Cruse & Lewis 2002). Respon imun primer sel B teraktivasi untuk berproliferasi dan berdiferensiasi di dalam sel sekresi antibodi dan sel memori. Sebagian sel antibodi, migrasi dan bertahan di sumsum tulang dalam periode yang panjang. Imunisasi kedua (Booster I) dan ketiga (Booster II) akan menghasilkan respon imun sekunder yang konsentrasinya lebih tinggi dari imunisasi pertama. Hal ini terjadi karena memori sel B diaktivasi untuk memproduksi antibodi dalam jumlah banyak yang kerjanya distimulir oleh sel T ( Goldsby et al. 2000; Abbas et al. 2007). Berdasarkan grafik kerapatan optik rabbit anti- ovPAG , ada sembilan ekor yang dapat dipergunakan sebagai sumber antibodi yaitu S1,S2, DT1, DT2, DN8.2, DN16.1, 16.2, DN32.1 dan 32.2. Anti-ovPAG DN8.1 tidak dipergunakan pada uji selanjutnya karena telah menunjukan kerapatan optik yang tinggi dalam plasma darah baseline. Tingginya titer antibodi dapat terjadi karena kelinci yang dipergunakan kemungkinan pernah terpapar oleh protein yang mempunyai spesisitas seperti isolat DN8.1. Oleh sebab itu, memori sel B akan langsung memproduksi antibodi terhadap imunogen yang disuntikan. Sedangkan rendahnya kerapatan optik pada kelompok kontrol, merupakan hasil yang sangat penting karena kelinci tidak memberikan respon imun terhadap NaCl 0.9% dan baru memberikan respon positif terhadap penyuntikan isolat yang di dalamnya mengandung ovPAG. 58 Gambar 20 Respon imun poliklonal antibodi rabbit anti-ovPAG terhadap berbagai sumber isolat ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) B=Baseline; FCA=Freud’s Complete Adjuvant ; FICA=Freud’s Incomplete Adjuvant 59 B A M DN16 DN32 C Konsentrasi ovPAG : DN16 = 44,33 ng/ml DN32 = 86,00 ng/ml Gambar 21 Perbandingan Potensi DN16 dan DN32 sebagai sumber Rabbit Anti-ovPAG Keterangan : A= berat molekul (Setiatin et al. 2009) B = respon imun C = Konsentrasi Rabbit anti-ovPAG yang paling memenuhi syarat untuk dipergunakan sumber antibodi adalah DN16 dan DN32. Akan tetapi setelah dikaji terhadap potensi yang dimilikinya maka rabbit anti-ovPAG DN32 yang akan dipergunakan untuk uji selanjutnya karena memiliki beberapa kelebihan dibanding DN16 (Gambar 21). Pertama, berdasarkan pita protein yang terbentuk pada monogel SDS-PAGE, DN32 mempunyai intensitas yang lebih tebal yang mengindikasikan bahwa kandungan proteinnya lebih tinggi. Kedua, berdasarkan respon imun yang dimiliki DN32 memberikan respon yang lebih baik serta 60 ditunjang oleh faktor yang ketiga yaitu DN32 memiliki konsentrasi total protein 86 ng/ml dibanding DN16 sebesar 44,33 ng/ml. Determinasi Rabbit α-ovPAG Determinasi keberadaan Rabbit anti-ovPAG terhadap berbagai sumber ovPAG yang telah tersusun pada membran nitroselulose berdasarkan berat molekulnya perlu dilakukan untuk mengevaluasi keberhasilan imunisasi. Blotto 5% berfungsi sebagai larutan untuk menghambat agar pori membran yang tidak mengikat protein ovPAG tidak berikatan dengan protein lain agar reaksi yang diperoleh menjadi spesifik. Enzim terkonjugasi (Huebner 2004) dalam Konjugat anti-Rabbit Alkaline Phosphatase memiliki ikatan enzim yang berfungsi untuk melisiskan molekul yang mempunyai ikatan fosfat. Agar fosfat yang terurai oleh enzim dapat dibaca, maka ditambahkan substrat BICP + NBT pada membran nitroselulose. Pita protein yang muncul merupakan hasil reaksi yang spesifik antara enzim dengan protein rabbit anti-ovPAG yang menunjukan adanya reaksi rabbit anti-ovPAG terhadap ovPAG yang ada dalam sampel yang diuji (Gambar 22). 71 71 62 71 62 53 34 34 31 14 14 14 Gambar 22 Determinasi rabbit anti-ovPAG DN32 negatif (Ab -) maupun positif (Ab +) terhadap berbagai sumber ovPAG (K; DN32; DN16; DN8; DT; S) 61 Rabbit anti-ovPAG Negatif adalah antibodi yang diperoleh dari plasma darah sebelum kelinci disuntik ovPAG atau disebut juga Baseline (Gambar 22). Determinasi Rabbit anti-ovPAG DN32 Negatif terhadap protein ovPAG pada K tidak terbentuk pita protein. Kelompok ini juga memberikan respon imun yang rendah berarti kelinci K tidak memberikan respon imun terhadap NaCl 0.9%. Isolat DN32 dan DN16 hanya memiliki satu pita protein pada berat molekul 71 kDa sedangkan DN8 tidak mempunyai pita protein meskipun memberikan respon imun yang cukup tinggi, kemungkinan pada DN8 tidak ada epitop yang dikenali oleh antibodi DN32 negatif. Isolat DT memiliki dua pita protein pada 31 dan 14 kDa sementara S memiliki lima pita protein pada 71; 34, dan 14 kDa. Agar dapat dianalisis lebih lanjut, perlu dilakukan uji konfirmasi Rabbit anti-ovPAG DN32 positif . Hasilnya menunjukan bahwa semua isolat ovPAG mempunyai pita protein pada berat molekul 71 kDa dengan intensitas yang berbeda-beda. Hal ini dapat terjadi apabila dua antigen yang memiliki dua epitop yang sama tetapi tidak identik sehingga salah satu epitop akan mengikat lebih kuat daripada epitop lainnya (Huebner 2004). Isolat DN32 dan DN16 memiliki dua pita protein dengan berat molekul yang sama pada 71 dan 62 kDa tetapi DN32 masih mempunyai pita protein lain pada 14 kDa. Isolat ovPAG S mempunyai lima pita protein sekitar 71; 62; 53; 34, dan 14 kDa (Gambar 22). Berdasarkan uji konfirmasi Rabbit α-ovPAG DN32 negatif maupun positif, terdapat reaksi silang terhadap isolat lain yang terpapar dengan rabbit anti-ovPAG DN32. Protein dari DT maupun S saat dilakukan uji konfirmasi terhadap antiovPAG DN32 negatif maupun positif membentuk pita protein yang jelas berarti banyak terjadi reaksi silang terhadap protein yang dimiliki oleh kedua isolat sehingga DT dan S tidak dipergunakan sebagai sumber rabbit anti-ovPAG. Antibodi DN8 juga tidak dipergunakan karena pada saat uji antibodi negatif maupun positif memberikan hasil yang jelas yaitu hanya memiliki satu pita pada 71 kDa yang merupakan protein umum dari kelinci. Protein pada berat molekul 71 kDa merupakan protein umum yang dimiliki oleh kelinci sehingga bereaksi terhadap semua antibodi Rabbit α-ovPAG DN32 negatif maupun positif. 62 kDa 71 31 P1 P2 P3 N1 N2 N3 P1 P2 P3 N1 N2 Gambar 23 Determinasi rabbit anti-ovPAG DN32 negatif dan positif terhadap ovPAG dalam urin domba garut bunting dan tidak bunting. P=bunting, N=tidak bunting Determinasi Rabbit anti-ovPAG DN32 dilanjutkan dengan uji diferensiasi terhadap ovPAG dalam urin domba garut bunting dan tidak bunting. Pengujian menggunakan Ab- DN32 menunjukan tidak adanya ikatan anti-ovPAG dengan ovPAG dalam urin domba bunting (P1-3) maupun tidak bunting (N1-3). Akan tetapi pada saat Ab+ DN32 direaksikan dengan ovPAG dalam urin domba baik dalam kondisi bunting maupun tidak bunting, memberikan hasil yang lebih jelas. Pita protein pada 71 kDa terdapat pada urin domba bunting (2 bulan) maupun tidak bunting dengan intensitas yang berbeda. Perbedaan yang mendasar adalah pada urin domba bunting ditemukan pita protein pada 31 kDa sedangkan pada urin domba tidak bunting, pita protein tersebut tidak muncul (Gambar 23). Hasil ini menunjukan bahwa kemungkian besar penanda kebuntingan pada domba garut terpapar pada protein dengan berat molekul 31 kDa. Hasil ini hampir sama dengan hasil isolasi pada kotiledon plasenta domba garut yang memiliki protein dengan berat molekul 30,86 kDa (Setiatin et al. 2009). Adanya ikatan spesifik antara Rabbit anti-ovPAG DN32 terhadap ovPAG dalam urin yang dapat membedakan status kebuntingan domba garut menunjukkan bahwa produksi antibodi polilonal Rabbit anti-ovPAG berhasil. N3 63 Dengan demikian dimungkinkan untuk dilakukan eksplorasi lebih lanjut terhadap pengembangan metode deteksi kebuntingan dini menggunakan teknik Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) termodifikasi agar lebih aplikatif di lapangan. KESIMPULAN Rabbit anti-ovPAG DN32 dipergunakan sebagai sumber Rabbit antiovPAG yang paling spesifik dibandingkan dengan yang lainnya. Protein dengan berat molekul 31 kDa merupakan protein penanda kebuntingan pada domba garut. DAFTAR PUSTAKA Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. 2007. Cellular and Mollecular Immunlogy. Ed ke-6. Philadelphia : Elsevier Inc. hlm 3 – 17; 123-142. Ayad A, Sousa NM, Sulon J, Iguer-Ouada M, Beckers JF. 2007. Comparison of five radioimmunoassay systems for PAG mesurement : Ability to detect early pregnancy in cow. Reprod Dom Anim 42(4):433-440. Barbato O et al. 2008. Isolation of pregnancy-associated glycoproteins (PAG) from water buffalo (Bubalus bubalis) placenta by use of Vicia villosa bound agarose affinity chromatography. Res Vet Sci 85(3):457-466. Bella A, Sousa NM, Dehimi M, Watts J, Beckers JF. 2009. Western analyses of Pregnancy-Associaed Glycoprotein Family (PAG) in Placental Extracts of Various Mammals. Theriogenology, Volume 68 (7) : 1055-1066. Boscos CM, Samartzi FC, Lymberopoulos AG, Stefanakis A, Belibasaki S. 2003. Assessment of progesterone concentration using enzymeimmunoassay for early pregnancy diagnosis in sheep and goats. Reprod Dom Anim 38(3): Chow YA et al. 2003. Development of a microtiter plate ELISA and a dipstick ELISA for the determination of the organophosphorus insecticide fenthion. J Agric Food Chem 51 : 7854-7860. Crowther JR. 2001. The ELISA Guidebook. New Jersey : Humana Press. hlm 182. Cruse JM, Lewis RE. 2002. Illustrated Dictionary of Immunology. Ed ke-2. New York : CRC Press. Devlin TM. 2002. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlation. New York : Wiley-Liss. 64 El Amiri B et al. 2003. Isolation and partial characterization of three pregnancyassociated glycoproteins from the ewe placenta. Mol Reprod Dev 64 : 199206. El Amiri B , Remy B , Sousa NM, Beckers JF. 2004. Isolation and characterization of eight pregnancy-associated glycoproteins present at high levels in the ovine placenta between day 60 and day 100 of gestation. Reprod Nutr Dev 44:169-181. Erb K, Hau J. 1994. Monoclonal and Polyclonal Antibodies. Di dalam : Svendsen P, Hau J, editor. Handbook of Laboratory Animal Science. Vol-1. Boca Raton, Florida : CRC Press. hlm 293-309. Green JA et al. 2000. Pregnancy-associated bovine and ovine glycoproteins exhibits spatially and temporally distinct expression patterns during pregnancy. Biol Reprod 62:1624-1631. Green JA et al. 2005. The establishment of an ELISA for the detection of pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) in the serum of pregnant cows and heifers. Theriogenology 63(5):1481-1503. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. 2000. Kuby Immunology. Ed ke-4. New York : WH Freeman & Co. hlm 63-172. González F et al. 2004. A comparison of diagnosis of pregnancy in the goat via transrectal ultrasound scanning, progesterone, and pregnancy-associted glycoprotein assays. Theriogenology 62:1108-1115. Hendricksen C, Hau J. 2003. Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies. Didalam: Hau J, van Hoosier GL, editor. Handbook of Laboratory Animal Science : Essential Principles and Practices. Volume 1. Ed ke-2. Boca Raton, Florida : CRC Press. hlm 391-411. Huebner J. 2004. Antibody-antigen interactions and measurements of immunologic reactions. Di dalam : Pier GB, Lyczak JB, Wetzler LM, editor. Immunology, infection, and immunity. Washington, DC : ASM Press. hlm 207-232. Hughes AL, Green JA, Piontkivska H, Roberts. 2003. Aspartic proteinase phylogeny and the origin of pregnancy-associated glycoproteins. Mol Biol Evol 20(11) : 1940 – 1945. Karen A et al. 2003. Evaluation of false transrectal ultrasonographic pregnancy diagnoses in sheep by measuring the plasma level of pregnancy-ssociated glycoproteins. Reprod Nutr Dev 43:577-586. Klein C et al. 2006. Monozygotic twin model reveals novel embryo-induced transcriptome changes of bovine endometrium in the preattachment period. Biol Reprod 74: 253-264. Majewska M, Panasiewicz G, Dabrowski M, Gizejewski Z, Beckers JF, Szafranska B. 2005. Multiple forms of Pregnancy-Associated Glycoproteins released in vitro by porcine chorion or placentomal and interplacentomal explants of wild and domestic ruminants. Biol Reprod. 5(2):185-203. 65 Perẻnyi Z et al. 2002. Aspartic proteinase members secreted by the ruminant placenta: Specificity of three radioimmunoassay system for the measurement of pregnancy-associated glycoprotein. Reprod Dom Anim 37:324-329. Ranilla MJ, Sulon J,Mantecόn MD, Beckers JF. 1994. Plasmatic profiles of pregnancy-associated glycoprotein and progesterone levels during gestation in churra and merino sheep. Theriogenology : 537-545. Setiatin ET , Sajuthi D, Purwantara B, Talib C. 2009. Ekstraksi dan isolasi ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) dari kotildon plasenta domba garut sesaat setelah melahirkan. JITV 14(3) : 208 -215. Silva E et al. 2007. Accuracy of a pregnancy-associated glycoprotein ELISA to determine pregnancy status of lactating dairy cows twenty-seven days after timed artificial insemination. J Dairy Sci 90:4612-4622. Stryer, L. 1995. Biochemistry. Ed ke-4. New York : WH Freeman & Co. hlm 875 – 910. Verbeckmoes S et al. 2004. A new test for early pregnancy diagnosis in sheep: Determination of ovine pregnancy associated glycoprotein (ovPAG) concentration by means of a homologous radioimmunoassay Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 73:119-127. Wodzicka-Tomaszewka M, Sutama IK, Putu IG, Chaniago TD. 1991. Reproduksi, Tingkahlaku, dan Produksi Ternak di Indonesia. Jakarta : Penerbit PT Gramedia Pustaka Utama. Wooding FBP. 1992. Current topic: the synepitheliochorial placenta of ruminants: binucleate cell fusions and hormone production. Placenta 13:101-113. Zoli AP et al. 1991. Purification and characterization of a bovine pregnancyassociated glycoprotein. Biol Reprod 45:1-10. PENGUJIAN OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN (ovPAG) MENGGUNAKAN TEKNIK ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) TERMODIFIKASI ABSTRAK Tujuan penelitian ini adalah mengembangkan teknik ELISA termodifikasi untuk mengukur konsentrasi ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) dan menguji rabbit anti-ovPAG. Pengenceran ovPAG DN32 dengan pengencer 0.01 M Tris HCl sebagai standar pada pengenceran bertingkat 0.344; 0.172; 0.688; 0.0344 dan 0.0172 ng/ml, selanjutkan dilakukan uji validasi intra - maupun inter asai. dipergunakan sebagai indikator keberhasilan asai yang dilakukan. Koefisien variasi intra asai untuk kontrol kualitas konsentrasi tinggi dan terendah adalah 9.97 % (n=13) dan 5.87 % (n=19). Koefisien variasi inter asai 16.95 % (n=6) pada kontrol kualitas konsentrasi tinggi dan 13.9 % (n=6) pada kontrol kualitas konsentrasi rendah. Teknik ELISA Termodifikasi dapat dipergunakan untuk mengukur konsentrasi ovPAG dalam urin dan dapat membedakan konsentrasi ovPAG domba bunting dan tidak bunting (55,56 %). Perlu dilakukan repurifikasi ovPAG dan produksi rabbit anti-ovPAG untuk mendapatkan hasil yang signifikan. Kata kunci : ovine pregnancy-associated glycoprotein, rabbit anti-ovPAG , ELISA, koefisien variasi, intra- dan inter asai ABSTRACT The aim of research was to develop modified indirect ELISA by measuring ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) concentration and determining rabbit anti-ovPAG. OvinePAG standar was carried out by developing serial dilution 0.344; 0.172; 0.688; 0.0344 dan 0.0172 ng/ml, continued with intra- and inter asaay validation. Validation of standard showed coefficient variation intra-assay on QC-H and QC-L were 9.97 % (n=13) and 5.87 % (n=19), respectively. Moreover, coefficient variation inter-assay on QC-H and QC=L were 16.95 % and 13.9 % respectively. Modified ELISA technique could be used for measuring ovPAG concentration in urine and could diffirentiate its concentration between pregnant and non-pregnant ewes (55,56 %), more detemination especially on repurification of ovPAG and polyclonal antibody (rabbit antiovPAG) production are needed. Key words : ovine pregnancy-associated glycoprotein, rabbit anti-ovPAG , ELISA, coefficient variation intra- and inter- assay , 67 PENDAHULUAN Enzyme Linked Immunosorbent Assay secara umum dikenal sebagai ELISA atau EIA. ELISA merupakan metode yang dipergunakan untuk menentukan sensitifitas reaksi antigen-antibodi pada lempeng polisterin (Goldsby et al. 2000). Interaksi antara antigen dan antibodi yang dideteksi dengan menggunakan konjugat (enzim yang dikonjugasikan ke antibodi) dan substrat yang akan mendegradasi konjugat sehingga timbul warna yang memiliki tingkat intensitas penyerapan terhadap (absorbansi) yang berbeda – beda (Huebner 2004). Prosedur dasarnya adalah enzim dikonjugasikan dengan antibodi bereaksi dengan substrat yang tidak berwarna untuk menghasilkan suatu produk yang berwarna. Substratnya disebut chromogen, antara lain horseradish peroxidase.(HRP). Kelebihan metode ini dibandingkan dengan Radio Immuno Assay (RIA) adalah lebih aman dan lebih murah. Setiap tipe ELISA dapat dipergunakan untuk mendeteksi secara kualitatif atau mengukur konsentrasi antigen maupun antibodi (Ebrahimi 2004). Pada penelitian ini, antigen yang akan dideteksi dalam urin domba dan diukur konsentrasinya menggunakan teknik ELISA Termodifikasi (TET). Teknik ini dipilih karena dengan mengkombinasikan dua teknik ELISA tidak langsung dan sandwich akan diperoleh hasil yang optimal. Urin domba yang mengandung ovPAG akan ditempelkan lebih dahulu pada fase solid lempeng ELISA agar dapat dipergunakan untuk menguji antibodi poliklonal tanpa pelabelan dengan enzim (ELISA tidak langsung) sehingga memudahkan dalam pelaksanaan serta biaya tetapi hasil yang diperoleh tetap akurat (Crowther 2001; Lodish et al. 2000). Selain itu, teknik ini hanya memerlukan sampel dalam volume sangat kecil (10 µl/sumuran) sehingga memudahkan dalam penangan dan pengulangan (Ebrahimi 2004; Green et al. 2005). Ikatan antigen –antibodi tanpa label ditambahkan konjugat antibodi yang telah dilabel enzim (Goat anti rabbit IgG peroxidase) sebagai konjugat antispesies antibodi poliklonal (rabbit antiovPAG) kemudian diinkubasi untuk menyelesaikan proses sandwich ELISA. Pemilihan konjugat pada teknik ini lebih fleksibel bergantung pada hewan apa antibodi primer diproduksi. Keuntungann teknik TET berbagai macam 68 antisera dapat diuji interaksinya pada beberapa antigen dengan menggunakan satu jenis konjugat terutama pada saat menguji sampel dalam jumlah banyak. Kelemahan yang utama dari teknik TET adalah variasi ikatan nonspesifik yang terjadi dalam antibodi yang diuji sehingga kemungkinan akan diperoleh variasi yang tinggi (Crowther 2001; Goldsby et al. 2000). Berdasarkan hasil yang telah dicapai pada penelitian tahap I dan II berupa antigen ovPAG DN32 dan antibodi rabbit anti-ovPAG DN32 maka tahapan selanjutnya adalah pengembangan teknik ELISA Termodifikasi yang pengerjaannya dimulai dari pembuatan standar ovPAG DN32 dilanjutkan dengan uji validasi serta pengukuran konsentrasi ovPAG dalam urin maupun plasma domba bunting dibandingkan dengan domba tidak bunting (Gambar 23). ovPAG DN32 Rabbit anti-ovPAG DN32 ELISA Termodifikasi 1. Pembuatan standar ovPAG DN32 2. Uji validasi 3. Pengukuran konsentrasi ovPAG dalam urin dan plasma Gambar 24 Alur kerangka pemikiran penelitian pengujian ovine pregnancyassociated glycoprotein (ovPAG) menggunakan teknik ELISA 69 METODE PENELITIAN Pembuatan Standar ovPAG Pengenceran bertingkat untuk membentuk standar ovPAG DN32. Adapun pengencerannya dengan konsentrasi 0.344; 0.172; 0.688; 0.0344 dan 0.0172 ng/ml, menggunakan pengencer 0.01 M Tris HCl. Prosedur Teknik ELISA Termodifikasi Sampel yang akan diukur konsentrasi ovPAG berupa plasma dan urin selain itu juga dilakukan pada urin yang dikoleksi secara serial pada saat tidak bunting dan bunting (n = 9 ekor). Teknik ELISA Termodifikasi (TET) merupakan modifikasi dari metode Crowther (2001), Green et al. (2005) dan Silva et al. (2007) Antigen (ovPAG) hasil isolasi yaitu S, DT, DN8, DN16 dan DN32 ditambah bufer karbonat- bikarbonat (coating-buffer) dengan perbandingan 1 : 10 dimasukkan pada masingmasing sumuran sebanyak 100 μl, kemudian diinkubasi pada 4oC semalam. Keesokan harinya, dicuci menggunakan PBS Tween 0.1 % sebanyak 4 kali. Setiap sumuran diisi 300 μl blotto 5% kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit (Silva et al. 2007). Larutan penghambat (Blotto 5%) merupakan campuran 5 g susu skim dengan PBS 0.1%, berfungsi untuk menghambat ikatan protein nonspesifik yang menempel pada permukaan fase solid lempeng ELISA. Setelah 60 menit, blotto 5% dibuang dan dicuci sebanyak 4 kali. Rabbit antiovPAG diencerkan dalam blotto 5% (1:50) kemudian pada masing-masing sumuran diisi 100 μl, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 90 menit. Selanjutnya lempeng ELISA, dicuci sebanyak 4 kali menggunakan larutan pencuuci yang sama. Setiap sumuran diisi campuran Goat anti-rabbit IgG peroxidase (Sigma®) dalam blotto 5% (1 : 2 000) sebanyak 100 μl, diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit. Lempeng ELISA cuci menggunakan PBS Tween 0.1% sebanyak 4 kali. Selanjutnya ditambahkan 100 μl TMB (3,3’,5,5’ tetra methyl benzidine dihydrochloride (Sigma®) kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar (warna biru). Reaksi dihentikan dengan menambahkan 70 larutan 2N H2SO4 sebanyak 50 μl pada setiap sumuran. Perubahan warna biru menjadi kuning, menunjukan reaksi telah berakhir, selanjutnya kerapatan optik atau absorbansi dibaca menggunakan Microplate Reader Model 3550 (Biorad®) pada panjang gelombang 450 nm (Crowther 2001; Chow et al. 2003). Validasi Asai Pada penelitian ini, uji validasi yang akan dilakukan adalah uji presisi asai dengan menentukan koefisien variasi intra- dan inter-asai. Selanjutnya dibuat rencana kontrol kualitas yang akan diuji validasinya (intra- dan inter-assay) dengan cara menentukan letak kontrol kualitas tertinggi dan terendah (QC-H dan QC-L). Penentuan QC-H dan QC-L dilakukan dengan mengencerkan standar ovPAG DN32 kemudian dilakukan asai. Setelah didapatkan nilai kerapatan optiknnya, nilai tersebut dibuat grafik dan ditemukan kemiringannya. Berdasarkan dari persamaan linear yang diperoleh, konsentrasi sampel yang diencerkan dapat dihitung kemudian dihitung nilai koefisien variasi intra- dan inter-asainya ( Ebrahimi 2004). Analisis Data Penentuan standar ovPAG DN32 untuk dapat dipergunakan pada pengukuran konsentrasi ovPAG dalam urin domba bunting dan tidak bunting dilakukan uji validasi untuk menggunakan konsentrasi standar ovPAG DN32 bertingkat. Selanjutnya uji validasi dipergunakan untuk menentukan persamaan linear dan koefisien korelasi antara konsentrasi standar dan kerapatan optik. Data konsentrasi ovPAG dalam urin domba bunting dan tidak bunting terhadap respon antibodi positif dan negatif disajikan secara deskriptif dengan menampilkan nilai rerata. Selanjutnya untuk menentukan uji beda konsentrasi ovPAG dalam urin domba bunting dan tidak bunting dilakukan uji t-student menggunakan Program Minitab 14 (Mattjik & Sumertajaya 2002). 71 HASIL DAN PEMBAHASAN Pembuatan Standar ovPAG Standar ovPAG ditentukan dengan melakukan pengenceran bertingkat isolat ovPAG DN32 pada 0.344; 0.172; 0.688; 0.0344 dan 0.0172 ng/ml . Isolat ovPAG DN32 mempunyai konsentrasi total protein awal 86 ng/ml (Lampiran 5). Interaksi yang terbentuk antara ovPAG dan rabbit anti-ovPAG diuji validasinya diantara sumuran dalam satu lempeng ELISA (intra asai) dan antar lempeng yang berbeda (inter asai) dengan menentukan terlebih dahulu kontrol kualitas tertinggi dan terendah pada lempeng ELISA yang diuji. Gambar 25 menunjukkan bahwa ada korelasi antara standar dan kerapatan optik yang ditunjukan dengan semakin tinggi konsentrasi standar maka kerapatan optiknya semakin meningkat. Ada tiga lempeng ELISA yang diuji mempunyai nilai R2 positif bererturut-turut 0.981; 0.960, dan 0.987. Nilai ini menunjukan bahwa prosedur ELISA yang dikerjakan sudah sesuai dengan prosedur yang seharusnya serta dapat dipergunakan sebagai standar. Gambar 25 Kemiringan dan persamaan linear standar ovPAG DN32 pada tiga lempeng ELISA 72 Uji Validasi Asai dengan Menentukan Koefisien Variasi Intra- dan Inter – Asai Koefisien variasi dari intra- dan inter-asai merefleksikan presisi dari asai yang digunakan. Ada tiga lempeng ELISA untuk menguji sampel standar secara duplo , diperoleh koefisien variasi intra asai untuk kontrol kualitas konsentrasi tinggi dan rendah adalah 9.97 % (n=13) dan 5.87 % (n=19). Nilai menunjukkan bahwa proses ELISA yang dilakukan pada ketiga lempeng ELISA telah memenuhi standar prosedur asai. Selanjutnya untuk lebih mempertajam uji validasi, dilanjutkan dengan menghitung variasi diantara ketiga lempeng ELISA, diperoleh koefisien variasi inter-asai pada kontrol kualitas tinggi dan rendah adalah 16.95 % (n=6) dan 13.9 % (n=6) pada kontrol kualitas konsentrasi rendah. Kontrol kualitas tinggi mempunyai nilai koefisien variasi inter-asai 15 %, hal ini menunjukan bahwa preparasi ELISA yang dilakukan belum sempurna dan tidak spesifik sehingga perlu dilakukan uji validasi ulang. Uji validasi lebih lanjut belum dapat dilakukan karena keterbatasan rabbit anti-ovPAG yang diproduksi. Pengukuran Konsentrasi ovPAG dalam Urin Domba Garut Bunting Uji kebuntingan terhadap PAG yang terdapat dalam air susu dan darah sapi potong maupun perah menggunakan teknik ELISA secara cepat telah berhasil dikembangkan dengan tingkat (Munro et al. 1991; O’Connor sensitivitas et al. dan spesifitas yang tinggi 2003; Friedrich & Holtz 2008; Green et al. 2009). Dengan demikian dimungkinkan untuk mengukur konsentrasi PAG dalam urin karena hasil yang diperoleh setara hanya perbedaan dalam waktu munculnya substansi untuk dapat diukur atau time lag (O’Connor et al. 2003; Munro et al. 1991). Konsentrasi ovPAG dapat terukur baik pada sampel urin maupun plasma (Tabel 3), dan hasilnya sesuai dengan hipotesis bahwa urin bunting yang diduga mengandung ovPAG memberikan reaksi terhadap Ab+. Akan tetapi hasilnya kurang memuaskan karena Ab- dapat bereaksi dengan ovPAG dalam urin. Meskipun demikian, konsentrasi ovPAG dalam plasma maupun urin pada saat diuji terhadap Ab+ mempunyai nilai yang lebih besar dibanding Ab-. Hal ini, 73 dimungkinkan karena antibodi primer yang digunakan adalah antibodi poliklonal sehingga mempunyai spesifisitas yang luas akibatnya dapat berinteraksi dengan semua protein yang memiliki epitop (Green et al. 2005), seperti ovPAG yang dapat dikenali oleh rabbit anti-ovPAG. Selanjutnya agar dapat diperoleh hasil yang lebih jelas, dilakukan pengukuran konsentrasi ovPAG pada sampel urin tidak bunting dan bunting yang dikoleksi secara serial pada sembilan ekor domba garut (Tabel 4). Tabel 3 Rerata Konsentrasi ovPAG dalam Urin dan Plasma Domba Bunting dan Tidak Bunting terhadap Respon Uji Antibodi Positif dan Negatif. Status Domba Jenis sampel Konsentrasi ( ng/µl ) Ab + 0,0133 0,0973 0,0032 0,0294 Bunting U1 P1 Tidak bunting U2 P2 Keterangan : U = urin, P = plasma Ab0,0067 0,0031 0,0030 0,0030 Tabel 4 Konsentrasi ovPAG pada Urin Domba Garut Tidak Bunting dan Bunting No. 1 2 Individu Tidak Bunting Bunting Rata-rata ± sd Rata-rata ± sd A2 0,581 ± 0,053a 0,591± 0,058a 0,537 B2 a a 0,208 b 0,572 ± 0,024 a P-Value 0,561 ± 0,040 3 B3 0,548 ± 0,055 0,589 ± 0,091 0,028 4 C1 0,527 ± 0,044a 0,593 ± 0,158b 0,011 C2 a b 0,014 b 5 0,563 ± 0,033 a 0,606 ± 0,079 6 C3 0,596 ± 0,049 0,682 ± 0,122 0,004 7 D3 0,541 ± 0,037a 0,525 ± 0,031a 0,094 E1 a b 0,001 a 8 9 0,569 ± 0,059 a 0,668± 0,148 E2 0,665 ± 0,125 0,643 ± 0,104 0,519 Rerata 0,583± 0,048a 0,607 ± 0,050a 0,323 Keterangan : superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P 0,05) antara domba tidak bunting dan bunting 74 Konsentrasi ovPAG dalam urin domba tidak bunting (Tabel 4) yang diukur menggunakan standar ovPAG DN32 pada sembilan individu domba memperlihatkan adanya tiga individu yang mempunyai konsentrasi berbeda nyata (P 0,05) yaitu B3; C1; C2 dan dua individu berbeda sangat nyata (P 0,01) yaitu C3 dan E1. Namun rerata konsentrasi kesembilan individu tidak menunjukan adanya perbedaan yang nyata (P 0,05). Hal ini menunjukan bahwa teknik ELISA termodifikasi yang dipergunakan dapat dipergunakan untuk mengukur konsentrasi ovPAG dalam urin. Namun untuk membedakan konsentrasi ovPAG pada domba bunting dan tidak bunting, tingkat keberhasilannya masih rendah (55,56 %) dari sembilan individu yang diuji. Ketidak spesifikan hasil asai (Tabel 3 dan Tabel 4) yang dilakukan erat kaitannya dengan adanya reaksi silang antara rabbit anti-ovPAG dengan material yang terkandung dalam urin. Hal ini dapat terjadi apabila urin mengandung antigen yang tidak identik tetapi mempunyai epitop yang identik, atau dapat juga dua antigen yang memiiki dua epitop sama tapi tidak identik sehingga intensitas yang muncul menjadi berbeda. Dapat juga urin mengandung dua bahan yang berbeda secara kimiawi seperti protein dan karbohidrat tetapi memiliki epitop yang sama (Huebner 2004). Agar diperoleh hasil yang lebih akurat perlu dilakukan uji immunoreactivity terhadap antibodi yang digunakan untuk menentukan faktor penyebab ketidak spesifikan tersebut. Selain itu, diperlukan penambahan jumlah sampel serta antibodi yang lebih murni. Oleh karenanya hasil ini belum dapat dijadikan sebagai rekomendasi produksi kit deteksi kebuntingan. KESIMPULAN 1. Pengenceran ovPAG 0.344; 0,172; 0,688; 0,0344 dan 0,0172 ng/ml dapat digunakan sebagai standar. 2. Koefisien variasi intra-asai dan inter-asai rendah telah memenuhi kriteria presisi (≤ 15%) pada 9.97 %; 5.87 % dan 13.9 %, sedangkan koefisien variasi inter-asai tinggi adalah 16.95 % . 3. Teknik ELISA Termodifikasi sudah dapat membedakan konsentrasi konsentrasi ovPAG pada hewan bunting atau tidak bunting (55,56 %). 75 DAFTAR PUSTAKA Chow et al. 2003. Development of a microtiter plate ELISA and a dipstick ELISA for the determination of the organophosphorus insecticide fenthion. J Agric Food Chem 51 : 7854-7860. Crowther JR. 2001. The ELISA Guidebook. New Jersey : hlm 1 – 82. Humana Press. Ebrahimi M. 2004. A Rapid ELISA method for 17, 20β-dihydroxy-4-pregenen-3one (17, 20βP) hormone using acetylcholinesterase enzyme as tracer. J of Res Med Sci 3 : 1-8. Friedrich M, Holtz W. 2008. Establishment of an ELISA for Measuring Bovine Pregnancy-Associated Glycoprotein in Serum or Milk and Its Application for Early Pregnancy Detection. Reprod Domest Anim 30 Oktober 2008 (Epub). Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. 2000. Kuby Immunology. Ed ke-4. New York : WH Freeman & Co. hlm 63-172. Green JA et al. 2005. The establishment of an ELISA for the detection of pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) in the serum of pregnant cows and heifers. Theriogenology 63(5):1481-1503. Green JA et al. 2009. Technical note : A rapid enzyme-linked immunosorbent assay blood test for pregnancy in dairy and beef cattle. J Dairy Sci 92:3819-3824. Huebner J. 2004. Antibody-Antigen Interactions and Measurements of Immunologic reactions. Didalam : Pier GB, Lyczak JB, Wetzler LM, editor. Immunology, Infection, and Immunity. Washington, DC : ASM Press. hlm 207-232. Lodish et al. 2000. Molecular Cell Biology. Ed ke-4. New York : WH Freeman & Co. hlm 50-137. Mattjik AA, Sumertajaya M. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. Jilid I. Ed ke-2. Bogor : IPB Press. hlm 21-52. Munro et al. 1991. Relationship of serum estradiol and progesterone concentrations to the excretion profiles of their major urinary metabolites as measured by enzyme immunoassay and radioimmunoassay. Clin Chemist 37 : 838-844. O’Connor et al. 2003. Urinary estrone conjugate and pregnanediol 3glucuronide enzyme immunoassays for population research. Clinical Chemistry 49:1139-1148. Silva et al. 2007. Accuracy of a pregnancy-associated glycoprotein ELISA to determine pregnancy status of lactating dairy cows twenty-seven days after timed artificial insemination. J Dairy Sci 90:4612-4622.     PEMBAHASAN UMUM Pregnancy-associated glygoprotein (PAG) merupakan famili aspartik proteinase yang disekresikan oleh sel binukleat trofoblastik sesaat menjelang implantasi. Konsentrasi PAG sejalan dengan semakin berkembangnya plasenta yang mengindikasikan bahwa perkembangan embrio berjalan baik sehingga PAG merupakan indikator kebuntingan maupun kesehatan feto-plasental. Konsentrasi PAG dapat terdeteksi dalam darah induk pada awal kebuntingan dengan akurasi 76,6 – 100% (Szafranska et al. 2006). Diagnosa kebuntingan yang yang mempertimbangkan beberapa aspek yaitu kemudahan mendapatkan bahan bakunya; mudah dilakukan; cepat diperleh hasilnya, dan akurat. Berdasarkan kelebihan di atas maka dilakukan purifikasi terhadap kotledon plasenta sebagai tempat pertukaran nutrisi antara induk dan foetus. Dlam perkembangannya ovPAG disekresikan sepanjang usia kebuntingan yang konsentrasinya meningkat sesaat menjelang partus, kemudian akan mencapai basal kembali setelah 4,5 hari kelahiran. Proses purifikasi diperlukan untuk meningkatkan rasio aktivitas enzim terhadap protein yang dielusi. Pemanfaatan kolom Sephadex-G75 memisahkan protein berdasarkan ukuran proteinnyaantara 3 – 80 kDa sedangkan kolom DEAE-cellulose dimanfaatkan untuk pertukaran anion dengan menggunakan konsentrasi NaCl yang bertingkat sebagai upaya untuk mendapatkan protein yang mempunyai ikatan ion yang paling kuat. Penggunaaan NaCl pada kromatografi pertukaran anion karena ion Cl-1 dalam kondisi fisiologis normal banyak tersedia dalam membran plasma. Sementara monogel SDS-PAGE diperlukan untuk memisahkan protein berdasarkan kemampuan protein untuk bergerak yang setara dengan nilai logaritmik berat molekulnya. Berat molekul protein yang paling spesifik yang berhasil dimurnikan berada di sekitar 30 kDa.  Konsentrasi ovPAG berdasarkan pelarut yang digunakan untuk mengelusi ada lima yang memberikan nilai positif atau lebih tinggi dari standar yaitu berturut-turut 181; 171; 2,67; 44,33 dan 86 ng/µL (S; DT; DN8; DN16, dan DN32) yang akan dipergunakan sebagai stok isolat murni ovPAG sebagai hasil purifikasi ekstrak kotiledon.   77    Selanjutnya isolat yang diperoleh dipergunakan untuk memproduksi antibodi poliklonal. Produksi antibodi dilakukan dengan mengimunisasi isolat pada bagian punggung kelinci. Kelinci dipilih sebagai hewan percobaan karena memiliki tingkat kekerabatan yang jauh dengan ruminansia sedangkan kelinci monogastrik sebagai salah satu persyaratan agar diperoleh respon imun yang tinggi dalam produksi antibodi poliklonal. Selain belum pernah adanya paparan ovPAG terhadap kelinci yang dipergunakan. Ada sembilan ekor yang dapat dipergunakan sebagai sumber antibodi yaitu S1 dan S2 (kolom Sephadex-G75), DT1, DT2, DN8.2, DN16.1 dan 16.2, DN32.1 dan 32.2. Sementara DN8.1 tidak dipergunakan pada uji selanjutnya karena telah menunjukan absorbansi yang tinggi dalam plasma darah baseline sehingga dimungkinkan akan banyak reaksi silang akan terjadi. Pada kelompok kontrol absorbansi sangat rendah, hal ini dapat terjadi karena disuntik plasebo (NaCl Fisiologis 0,9 %). Hasil ini penting untuk menunjukan bahwa ekstrak kotiledon plasenta, yang didalamnya mengandung ovPAG berhasil diisolasi. Berdasarkan pita protein yang terbentuk, konsentrasi ovPAG serta respon imunnya ada kesamaan antara DN16 dan DN32 akan tetapi DN32 mempunyai beberapa kelebihan yaitu intensitas pita protein yang lebih tebal; konsentrasi ovPAG DN32 sebesar 86 ng/ml sedangkan DN16 sebesar 44,33 ng/ml, serta respon imun yang lebih tinggi. Uji spesifikasi Rabbit anti-ovPAG DN32 dilakukan dengan menggunakan teknik Western Blot yang dikenal sebagai Gold Standard. Determinasi Rabbit anti-ovPAG DN32 Negatif terhadap protein ovPAG pada K tidak terbentuk pita protein, berarti dalam kelinci tersebut tidak ada reaksi terhadap NaCl 0,9%. Sementara pada DN32, DN16 dan S terdapat pita protein pada 71 kDa. Akan tetapi pada S 71 kDa masih ada dua pita protein 34 dan 14 kDa. Pita protein pada DT berada pada sekitar 31 dan 14 sedangkan DN8 tidak mempunyai pita protein setelah reaksi berakhir. Uji konfirmasi Rabbit α-ovPAG DN32 positif menunjukan bahwa pita protein 71 kDa terdapat di semua sumber ovPAG (K; DN32; DN16; DN8; DT, dan S). OvinePAG DN32 dan DN16 memiliki dua pita pada 71 dan 62 kDa (2 pita) tetapi DN32 masih memiliki satu pita lagi yaitu 14 kDa.   78    Protein pada 71 kDa dapat diikat oleh Rabbit anti-ovPAG negatif maupun positif, hal ini menunjukan bahwa protein ini merupakan protein umum, sedangkan protein lainnya masih perlu dilakukan determinasi lebih lanjut. OvinePAG S dan DT memberikan reaksi terhadap Rabbit anti-ovPAG negatif maupun positif sehingga tidak dipergunakan sebagai sumber Rabbit anti-ovPAG karena banyak mempunyai reaksi silang. Hal ini menunjukan bahwa RabbitantiαovPAG memberikan reaksi yang lebih spesifik terhadap OvinePAG DN32. Oleh karena Rabbit anti-ovPAG merupakan antibodi poliklonal maka selain ovPAG DN32, juga dapat mengenali protein dengan epitop sama dari ovPAG lainnya. Berdasarkan hasil tersebut, Rabbit anti-ovPAG DN32 dapat dipergunakan sebagai sumber Rabbit anti-ovPAG . Urin domba bunting menunjukan adanya pita protein pada 71 dan 31 kDa berdasarkan perhitungan migrasi protein. Temuan menarik terjadi pada saat Ab+ DN32 beraksi dengan ovPAG dalam urin domba tidak bunting, pita protein yang muncul hanya satu yaitu pada 71 kDa sedangkan pada 31 kDa tidak ada pita protein yang terbentuk. Hasil ini menunjukan bahwa rabbit anti-ovPAG secara spesifik berikatan dengan ovPAG dalam urin, kemungkian besar penanda kebuntingan dini pada domba garut terpapar pada protein dengan berat molekul sekitar 31 kDa. Dengan demikian dimungkinkan untuk dilakukan eksplorasi lebih lanjut terhadap pengembangan metode deteksi kebuntingan dini menggunakan metode Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). Teknik ini perlu dikembangkan agar lebih aplikatif di lapangan. Meskipun demikian, konsentrasi ovPAG terukur baik pada sampel urin maupun plasma, dan hasil didapat sesuai dengan hipotesis bahwa urin bunting yang diduga mengandung ovPAG memberikan reaksi terhadap Ab+ tetapi hasilnya kurang memuaskan karena tidak konsensisten. Antibodi negatif dapat bereaksi dengan ovPAG dalam urin, hal ini menunjukan bahwa ada epitop dari ovPAG yang dapat dikenali oleh Ab+ maupun Ab-. Kemungkinan terbesar disebabkan oleh pemanfaatan antibodi poliklonal sebagai antibodi primer. Pada dasarnya antibodi poliklonal mempunyai spesifisitas yang luas sehingga dimungkinkan untuk berinteraksi dengan protein PAG dalam sampel yang diuji.   79    Pada sampel plasma dari hewan yang sama perbedaan konsentrasi ovPAG yang duji menggunakan Ab+ dan Ab- memperlihatkan hasil yang konsisten karena kandungan ovPAG dalam darah mencerminkan level yang sama dengan kondisi fisiologis saat diukur. Pemakaian sampel darah merupakan metode invasive, meskipun memberikan hasil yang lebih baik tetapi sulit dikembangkan pada saat sampel yang akan diuji merupakan serial (saat dikawinkan sampai melahirkan). Oleh sebab itu urin masih merupakan pilihan yang paling baik karena dengan menggunakan teknik ELISA, hasil yang diperoleh akan memberikan gambaran yang sama dengan darah hanya berbeda dalam masa pengukuran (time lag). Konsentrasi ovPAG dalam urin domba tidak bunting (Tabel 4) yang diukur menggunakan standar ovPAG DN32 pada sembilan individu domba memperlihatkan adanya tiga individu yang mempunyai konsentrasi berbeda nyata (P 0,05) yaitu B3; C1; C2 dan dua individu berbeda sangat nyata (P 0,01) yaitu C3 dan E1. Namun rerata konsentrasi kesembilan individu tidak menunjukan adanya perbedaan yang nyata (P 0,05). Hal ini menunjukan bahwa teknik ELISA termodifikasi yang dipergunakan dapat dipergunakan untuk mengukur konsentrasi konsentrasi ovPAG ovPAG dalam urin. Namun untuk membedakan pada domba bunting dan tidak bunting, tingkat keberhasilannya masih rendah (55,56 %) dari sembilan individu yang diuji. Pengembangan teknik ELISA Termodifikasi, masih perlu optimasi dalam pemurnian ovPAG DN32 sebagai standar, karena hal ini erat kaitannya dengan kespesifikan rabbit anti-ovPAG yang diproduksi. Tahapan yang harus dilalui untuk mendapatkan kit yang dapat diproduksi secara masal maka perlu dilakukan pemurnian ulang terhadap ovPAG DN32 dengan sumber pembanding ovPAG DN16. Fraksi yang dielusi difokuskan pada fraksi yang mengandung protein dengan berat molekul sekitar 30 kDa. Penyuntikan ovPAG yang lebih spesifik diharapkan akan menghasilkan antibodi poliklonal yang lebih spesifik pula. Imunisasi isolat ovPAG DN32 maupun DN16 dilakukan dengan mempertimbangkan dosis penyuntikan; jumlah kelinci sebagai ulangan; adjuvant yang akan dipilih, serta kemungkian dicari hewan coba yang dapat memproduksi antibodi yang lebih banyak seperti kambing sehingga antibodi yang dihasilkan   80    akan lebih banyak lagi. Selanjutnya dilakukan purifikasi terhadap antibodi yang dihasilkan. Antibodi poliklonal (rabbit anti-ovPAG) diuji spesifisitas terhadap ovPAG urin domba saat estrus; bunting, dan setelah melahirkan. Optimasi teknik ELISA Termodifikasi akan sangat bermanfaat dalam pembuatan prototipe kit deteksi kebuntingan dini.       KESIMPULAN DAN SARAN UMUM KESIMPULAN 1. Isolat ovPAG dapat diisolasi dari kotiledon plasenta yang dikoleksi sesaat setelah melahirkan 2. Respon imun terbaik berasal dari DN32 3. Rabbit anti-ovPAG DN32 dipergunakan sebagai sumber antibodi 4. Protein 31 kDa hanya terdapat pada urin domba bunting sedangkan protein sekitar 71 kDa sebagai protein umum 5. Pengenceran seri ovPAG DN32 dengan konsentrasi 0,344; 0,172; 0,0688; 0,0344 dan 0,0172 ng/ml dapat digunakan sebagai standar 6. Koefisien variasi intra-asai tinggi dan rendah adalah 9,97 % dan 5,87 % 7. Koefisien variasi inter-asai tinggi dan rendah adalah 16,95% dan 13,9 %. 8. Teknik ELISA Termodifikasi dapat membedakan ovPAG dalam urin domba bunting dan tidak bunting (55,56%). SARAN   1. Perlu dilakukan purifikasi ulang ovPAG DN32 2. Perlu evaluasi dosis ovPAG yang diimunisasikan 3. Pemurnian rabbit anti-ovPAG DN32 4. Perlu uji spesifisitas antibodi DAFTAR PUSTAKA Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. 2007. Cellular and Molecular Immunology. Ed ke-6. Philadelphia : Elsevier Inc. hlm 3-17, 123-142. Aplin JD, Kimber SJ. 2004. Trophoblast-uterine (Review). Rep Biol&Reprod 2:48. interactions at implantation Atkinson YH et al. 1993. Characterization of placentation-spesifik binucleate cell glycoprotein possessing a novel carbohydrate: Evidence for a new family of pregnancy-associated molecules. J of Biol Chemist 268(35):26679-26685. Ayad A, Sousa NM, Sulon J, Iguer-Ouada M, Beckers JF. 2007. Comparison of five radioimmunoassay systems for PAG mesurement : Ability to detect early pregnancy in cow. Reprod Dom Anim 42(4):433-440. Barbato O et al. 2008. Isolation of pregnancy-associated glycoproteins (PAG) from water buffalo (Bubalus bubalis) placenta by use of Vicia villosa bound agarose affinity chromatography. Res Vet Sci 85(3):457-466. Bella A, Sousa NM, Dehimi M, Watts J, Beckers JF. 2009. Western analyses of Pregnancy-Associaed Glycoprotein Family (PAG) in Placental Extracts of Various Mammals. Theriogenology, Volume 68 (7) : 1055-1066. Bertolini M, Wallace CR, Anderson GB. 2006. Expression profile and protein levels of placental production in in vitro-derived bvine pregnancies. Reproduction 131:163-173. Boscos CM, Samartzi FC, Lymberopoulos AG, Stefanakis A, Belibasaki S. 2003. Assessment of progesterone concentration using enzymeimmunoassay for early pregnancy diagnosis in sheep and goats. Reprod Dom Anim 38(3): 170. Champe PC, Harvey RA, Ferrier DR, editor. 2008. Lippincott’s Illustrated Reviews : Biochemistry. Ed ke-4. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins. hlm 157-172. Chelini MOM, Sousa NM, Rocha AM, Fielippe ECG, Oliveira CA. 2005. Quantification of fecal oestradiol and progesterone metabolites in Syrian hamsters (Mesocricetus auratus). Braz J Med Biol Res 38(11):1711-1717. Chow et al. 2003. Development of a microtiter plate ELISA and a dipstick ELISA for the determination of the organophosphorus insecticide fenthion. J Agric Food Chem 51 : 7854-7860. Creighton TE. 1997. Protein : Structures and Molecular Properties. Ed ke-5. New York : W.H. Freeman and Company. hlm 1-104. Crowther JR. 2001. The ELISA Guidebook. hlm 1-82. New Jersey : Humana Press. Cruse JM, Lewis RE. 2002. Illustrated Dictionary of Immunology. Ed ke-2. New York : CRC Press. 83 Demmers KJ, Derecka K, Flint A. 2001. Trophoblast interferon and pregnancy. Reproduction 121: 41-49. Devlin TM. 2002. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlation. New York : Wiley-Liss. Dey SK et al. 2004. Molecular cues to implantation. 341-373. Endocrine Rev 25(3): Dinas Peternakan Propinsi Jawa Barat. 2008. Perkembangan Populasi Domba dan Kambing 2004-2008. http: www.disnak.jabarprov.go.id. [17 Juli 2009]. Dunlap KA et al. 2005. Endogenous retroviruses regulate periimplantation placental growth and differentiation. PNAS 103(339) : 14390-14395. Dunlap KA, Palmarini M, Adelson DL, Spencer TE. 2005. Sheep endogenous betaretroviruses (enJSRVs) and the hyaluronidase 2 (HYAL2) receptor in the ovine uterus and conceptus. Biol Reprod 73: 272-279. Ebrahimi M. 2004. A Rapid ELISA method for 17, 20β-dihydroxy-4-pregenen-3one (17, 20βP) hormone using acetylcholinesterase enzyme as tracer. J of Res Med Sci 3 : 1-8. Edqvist L-E, Stabenfeldt GH. 1980. Reproductive hormone Di dalam : Kaneko JL, editor. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. Ed-7. New York : Academic Press. hlm : 513-544. Eggermont J. 2004. Calcium-activated chloride channels : (Un)known and (Un)loved?. Didalam : Proceedings of the Americans Thoracic Society. Vol 1:22-27. El Amiri B , Remy B , Sousa NM, Beckers JF. 2004. Isolation and characterization of eight pregnancy-associated glycoproteins present at high levels in the ovine placenta between day 60 and day 100 of gestation. Reprod Nutr Dev 44:169-181. El Amiri B et al. 2007. Measurement of ovine pregnancy-associated glycoprotein (PAG) during early pregnancy in Lacaune sheep. Reprod Dom Anim ISSN 0936-6768. El Amiri B et al. 2003. Isolation and partial characterization of three pregnancyassociated glycoproteins from the ewe placenta. Mol Reprod Dev 64 : 199206. El Amiri B et al. 2004. Purification and characterization of a pregnancyassociated glycoprotein (ovPAG-6) from sheep placenta removed between 66 to 100 days of gestation. Biotechnol Agro Soc Environ 6(1):5-16. Erb K, Hau J. 1994. Monoclonal and Polyclonal Antibodies. Di dalam : Svendsen P, Hau J, editor. Handbook of Laboratory Animal Science. Vol-1. Boca Raton, Florida : CRC Press. hlm 293-309. Ezashi T, Roberts RM. 2004. Regulation of interferon- (IFN- ) gene promoters by growth factors that target the Ets-2 composite enhancer: A Possible model for maternal control of IFN- production by the conceptus during early pregnancy . Endocrinology 145(10): 4452-4460. 84 Friedrich M, Holtz W. 2008. Establishment of an ELISA for Measuring Bovine Pregnancy-Associated Glycoprotein in Serum or Milk and Its Application for Early Pregnancy Detection. Reprod Domest Anim 30 Oktober 2008 (Epub). Gajewski Z et al. 2008. Concentration of bovine pregnancy associated glycoprotein in plasma and milk : its application for pregnancy diagnosis in cows. J Physiol Pharmacol 59(9):55-64. Garbayo et al. 1998. Isolation and partial characterization of pregnancy-associated glycoprotein family from the goat placenta. Biol of Reprod 58:109-115. Garbayo JM, Serrano B, Lopez-Gatius F. 2008. Identification of novel pregnancyassociated glycoprotein (PAG) expressed by the peri-implantation conceptus of domestic ruminants. Anim Reprod Sci 103(1-2):120-134. Garn, L-H, Latiff A. 2005. SDS_PAGE electrophoretic property of human chorionic gonadotropin (HCG) and its β-subunit. Int J Biol Sci 1(3):103109. Geisert RD, JR Malayer. 2000. Implantation. Di dalam : Hafez B, Hafez ESE, editor. Reproduction in Farm Animals. Ed ke-7. Philadelphia : Lippincott. Williams & Wilkins. hlm : 126-139. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. 2000. Kuby : immunology. Ed ke-4. New York : W.H. Freeman and Company. hlm 1-172. González F et al. . 2004. A comparison of diagnosis of pregnancy in the goat via transrectal ultrasound scanning, progesterone, and pregnancy-associated glycoprotein assays. Theriogenology 62:1108-1115. Gray CA et al. 2006. Identification of endometrial genes regulated by early pregnancy, progesterone and interferon tau in the ovine uterus. Biol Reprod 74 : 383-394. Green JA et al. 2000. Pregnancy-associated bovine and ovine glycoproteins exhibits spatially and temporally distinct expression patterns during pregnancy. Biol Reprod 62:1624-1631. Green JA et al. 2009. Technical note : A rapid enzyme-linked immunosorbent assay blood test for pregnancy in dairy and beef cattle. J Dairy Sci 92:3819-3824. Green JA et al. 2005. The establishment of an ELISA for the detection of pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) in the serum of pregnant cows and heifers. Theriogenology 63(5):1481-1503. Green JA, Xie S, Roberts RM. 1998. Pepsin-related molecule secreted by trophoblast. Rev of Reprod 3:62-69. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies : A Laboratory Manual. New York : Cold Spring Harbor Laboratory. hlm 23 - 35. 85 Hastono, Masbulan E. 2001. Keragaan reproduksi domba rakyat di kabupaten garut. Di dalam : Haryanto B et al. Prosiding. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. 17-18 September 2001. Bogor: Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan. hlm 100-105. Haugejorden G et al. 2006. Pregnancy-associated glycoproteins (PAG) in postpartum cows, ewes, goats and their offspring. Theriogenology 66:19761984. Hendricksen C, Hau J. 2003. Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies. Didalam: Hau J, van Hoosier GL, editor. Handbook of Laboratory Animal Science : Essential Principles and Practices. Volume 1. Ed ke-2. Boca Raton, Florida : CRC Press. hlm 391-411. Hirako M, Takahashi T, Takahashi H, Patel OV, Domeki I. 2003. Changes in plasma estrogen concentration during the first trimester of gestation in dairy cows: Comparison with the origin of embryos and fetal number. JARQ 37(3): 195-200. Huebner J. 2004. Antibody-Antigen Interactions and Measurements of Immunologic reactions. Didalam :Pier GB, Lyczak JB, Wetzler LM, editor. Immunology, Infection, and Immunity. Washington, DC : ASM Press. hlm 207-232. Hughes AL, Green JA, Piontkivska H, Roberts RM. 2003. Aspatic proteinase phylogeny and the origin of pregnancy-associated glycoprotein. Mol Biol Evol 20(11):1940-1945. Jainuddeen MR, Wahid H, Hafez ESE. 2000. Sheep and Goats. Di dalam : Hafez B, Hafez ESE, editor. Reproduction in Farm Animals. Ed ke-7. Philadelphia : Lippincott. Williams & Wilkins. hlm : 172-181. Jainudeen MR, Hafez ESE. 2000. Pregnancy diagnosis. Di dalam : Hafez B, Hafez ESE, editor. Reproduction in Farm Animals. Ed ke-7. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins. hlm 395-404. Johnson MH, Everitt BJ.2000. Essential Reproduction. Ed ke-5. Cambridge : Blackwell Science. hlm 173-202. Jonker FH. 2004. Fetal death : comparative aspects in large domestic animals. Anim Reprod Scie 82-83 : 415-430. Karen A et al. 2003a. Early pregnancy diagnosis in sheep by progesterone and pregnancy-associated glycoprotein test. Theriogenology 59: 1941-1948. Karen A et al. 2003b. Evaluation of false transrectal ultrasonographic pregnancy diagnoses in sheep by measuring the plasma level of pregnancy-associated glycoproteins. Reprod Nutr Dev 43:577-586. Kiewisz et al. 2009. Identification of multiple pregnancy-associated gglycproteins (PAGs) purified from theeuropean bison (Eb; Bison bonasus L) placentas. Anim Reprod Scie 112(3-4):229-250. 86 Kiewisz J, de Sousa NM, Beckers JF, Vervaecke H, Panasiewicz G, Szafranska B. 2008. Isolation of pregnancy-associated gglycproteins from placenta of the american bison (Bison bison) at first half of pregnancy. Gen & Comp Endo 155(1):164-175. Klein C et al. 2006. Monozygotic twin model reveals novel embryo-induced transcriptome changes of bovine endometrium in the preattachment period. Biol Reprod 74: 253-264. Klisch K et al. 2008. A tetraantennary glycan with bisecting N-acetylglucosamine and the Sda antigen is the predominant N-glycan on bovine pregnancyassociated glycoproteins. Glycobiology 18(1) : 42-52. Klisch K, de Sousa NM, Beckers J-F, Leiser R, Pich A. 2005. Pregnancyassociated glycoprotein-1, -6, -7, and -17 are major products of bovine binucleate trophoblast giant cells at midpregnancy. Mol reprod Dev 71(4) : 453 – 460. Lambert RT, Racey PA, Ashworth CJ. 2005. A pregnancy-associated glycoprotein (PAG) unique to the roe deer (Capreolus capreolus) and its role in the termination of embryonic diapause and maternal recognition of pregnancy. Israel J of Zoo 51(1):1-11. Ledezma-Torres RA, Beckers J-F, Holtz W. 2006. Assessment of plasma profile of pregnancy-associated glycoprotein (PAG) in sheep with a heterologous (anti-caPAG(55+59)) RIA and its potential for diagnosing pregnancy. Theriogenology 66(4):906-12. 1941-1948 Lee KY, DeMayo FJ. 2004. Animal models of implantation (Review). Reproduction 128:679-695. Lodish et al. 2000. Molecular Cell Biology. Ed ke-4. New York : WH Freeman & Co. hlm 50-137. Maheswari H. 2007. Profil Metabolit Steroid sebagai Indikator dalam Penentuan Siklus Ovarium Owa Jawa (Hylobates moloch AUDEBERT, 1797). [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Majewska M, et al. 2005. Multiple forms of Pregnancy-Associated Glycoproteins released in vitro by porcine chorion or placentomal and interplacentomal explants of wild and domestic ruminants. Biol Reprod. 5(2):185-203. Mattjik AA, Sumertajaya M. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. Jilid I. Ed ke-2. Bogor : IPB Press. hlm 21-52. Miles JR, Farin CE, Rodriguez KF, Alexander JE, Farin PW. 2004. Angiogenesis and morphometry of bovine placentas in late gestation from embryos produced in vivo and in vitro. Biol Reprod 71:1919-1926. Monfort SI et al. 1997. Steroid metabolism and validation of non-invasive endocrine monitoring in the African wild dog (Lycaon pectus). Zoo Biol 16: 533-548. 87 Munro et al. 1991. Relationship of serum estradiol and progesterone concentrations to the excretion profiles of their major urinary metabolites as measured by enzyme immunoassay and radioimmunoassay. Clin Chemist 37 : 838-844. Nelson DL, Cox MM. 2000. Lehninger : Principles of Biochemistry. Ed ke-3. New York : Worth Publishers. hlm 311-319. O’Connor et al. 2003. Urinary estrone conjugate and pregnanediol 3glucuronide enzyme immunoassays for population research. Clinical Chemistry 49:1139-1148. Perẻnyi Z et al. 2002. Aspartic proteinase members secreted by the ruminant placenta: Specificity of three radioimmunoassay system for the measurement of pregnancy-associated glycoprotein. Reprod Dom Anim 37:324-329. Pier GB, Lyczak JB, Wetzler LM. 2004. Immunology, Infection, and Immunity. Washington DC : ASM Press. hlm 113-258. Pierson RA, Ginther OJ. 1988. Ultrasonic imaging of the ovaries and uterus in cattle. Theriogenology 29(1):21-37. Ranilla MJ, Sulon J, Mantecόn AR, Beckers JF, Carro MD. 1994. Plasma pregnancy-associated glycoprotein and progesterone concentrations in pregnant Assaf ewes carrying single and twin lambs. Theriogenology : 42(3):537-45. Regnault TRH, Orbus RJ, Battaglia FC, Wilkening RB, Anthony RV. 1999. Altered arterial concentrations of placental hormones during maximal placental growth in a model of placental insufficiency. J of Endocrin 162 : 433-442. Roberts RM, Cross JC, Leaman DW. 1992. Interferons as hormone of pregnancy. Endocrine Reviews 13(3):432-452. Samsudewa D, Setiatin ET, Sugiyanto E, Lukman A. 2005. Identifikasi fenol dalam urine sebagai alternatif metode deteksi kebuntingan ternak. Agromedia 23(1):61-70. Schoenecker KA, Lyda RO, Kirkpatrick J. 2004. Comparison of three fecal steroid metabolites for pregnancy detection used with single sampling in bighorn sheep (Ovis canadensis). J of Wildlife Diseases 40(2) : 273-281. Senger PL. 1999. Pathway to Pregnancy and Parturition. Pullman, Washington DC : Current Conceptions, Inc. hlm 219-248. Setiatin ET , Sajuthi D, Purwantara B, Talib C. 2009. Ekstraksi dan isolasi ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) dari kotildon plasenta domba garut sesaat setelah melahirkan. JITV 14(3) : 208 -215. Silva et al. 2007. Accuracy of a pregnancy-associated glycoprotein ELISA to determine pregnancy status of lactating dairy cows twenty-seven days after timed artificial insemination. J Dairy Sci 90:4612-4622. 88 Sousa et al. 2002. Characterization of pregnancy-associated glycoproteins extracted from zebu (Bos indicus) placentas removed at different gestational periods. Reprod Nutr Dev 42:227-241. Sousa NM, Ayad A, Beckers JF, Gajewska Z. 2006. Pregnancy-associated glycoprotein (PAG) as pregnancy markers in the ruminants. J of Phys Phar 57 (Supp 8): 153-171. Spencer TE, Bazer F W. 2004. Conceptus signals for establishment and maintenance of pregnancy. Reprod Biol Endocrinol 2: 49. Spencer TE, Johnson GA, Burghardt RC, Bazer FW. 2004. Progesterone and placental hormone actions on the uterus: Insight from domestic animals. Bio of Reprod 71:2-10. Strmśnik I, Pogaćnik M, Kadunc NC, Kosec M. 2002. Examination of oestrus cycle and early pregnancy in sheep using transrectal ultrasonography. Slov Vet Res 39(1):47-58. Stryer, L. 1995. Protein Synthesis. Di dalam : Biochemistry. Ed ke-4. New York : W.H. Freeman and Company. hlm : 875-910. Szafranska B, Panasiewicz G, Majewska M, Beckers JF. 2003. Chorionic expression of heterogeneous products of the PAG (pregnancy-associated glycoprotein) gene family secreted in vitro throughout embryonic and foetal development in the pig. Reprod Nutr Dev 43:497-516. Szafranska B, Panasiewicz G, Majewska M. 2006. Biodiversity of multiple pregnancy-associated glycoprotein (PAG) family : gene cloning and chorionic protein purification in domestic and wild eutherians (placentalia) – a review. Reprod Nutr Dev 5:481-502. Teng J, Zun-Yi W, Bjorling DG. 2002. Estrogen-induced proliferation of urothelial cell is modulated by nerve growth factor. Am J Physiol Renal Physiol 282: F1075-F1083. Vandaele L et al. 2003. Effect of number of lambs, their sex, and birth weight on ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) concentrations. Repro Fertl Dev 16(2) : 192–193. Verbeckmoes et al. 2004. A new test for early pregnancy diagnosis in sheep : Determination of ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) concentration by means of a homologous radioimmunoassay. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 73:119-127. Wen-ge Ma, Song H, Das SK, Paria BC, Dey SK. 2003. Estrogen is a critical determinant that specifies the duration of the window of uterine receptivity for implantation. PNAS 100(5): 2963-2968. Wilcox AJ, Baird DD, Wienberg CR. 1999. Time of implantation of the conceptus and loss of pregnancy. NEJM 340(23): 1796-1799. Wodzicka-Tomaszewka M, Sutama IK, Putu IG, Chaniago TD. 1991. Reproduksi, Tingkahlaku, dan Produksi Ternak di Indonesia. Jakarta: Penerbit PT Gramedia Pustaka Utama. hlm 102-105. 89 Wooding FBP. 1992. Current topic: the synepitheliochorial placenta of ruminants: binucleate cell fusions and hormne production. Placenta 13:101-113. Xie S, Nigel RJ, Green J, Beckers J-F, Roberts RM. 1996. Trophoblast-specific processing and phosphorylation of pregnancy-associated glycoprotein-1 in day 15 to 25 sheep placenta. Biol Reprod 54: 122-129. Zoli AP et al. 1991. Purification and characterization of a bovine pregnancyassociated glycoprotein. Biol Reprod 45:1-10. Zoli AP, Guilbault LA, Delahaut P, Ortiz B, Beckers JF. 1992. Radioimmunoassay of a bovine pregnancy associated glycoprotein in serum: Its application in pregnancy diagnosis. Biol Reprod 46: 83-92. Zubay G. 1993. Protein Synthesis : Targeting and Turnover. Di dalam : Biochemistry. USA : Win C Brown Communications, Inc. hlm 830-863.                                                 LAMPIRAN 90    Lampiran 1 Persetujuan Komisi ACUC 91    Lampiran 2 Sodium Dedocyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDSPAGE)   RUNNING GEL, MONOGEL SDS-PAGE   No.  1  2 3   4  5 6  7 Reagen Acrylamide 40% Bis- Acrylamide 2% SDS 10% Tris-HCl pH : 8.8 Aquadest TEMED APS 10% 7.5% 2.73 mL 1.50 mL 150.00 µL 3.75 mL 6.78 mL 7.50 µL 75.00 µL 10% 3.65 mL 2.01 mL 150.00 µL 3.75 mL 5.40 mL 7.50 µL 75.00 µL 12% 4.38 mL 2.40 mL 150.00 µL 3.75 mL 4.24 mL 7.50 µL 75.00 µL 14% 5.1 mL 2.80 mL 150.00 µL 3.75 mL 3.12 mL 7.50 µL 75.00 µL 15% 5.47 mL 3.02 mL 150.00 µL 3.75 mL 2.53 mL 7.50 µL 75.00 µL     STACKING GEL 4%   No. 1 2 3 4 5 6 7           Reagen Acrylamide 40% Bis- Acrylamide 2% SDS 10% Tris-HCl pH : 6.8 Aquadest TEMED APS 10% RUNNING BUFFER 10x 4% 0.48 mL 0.26 mL 50.00 µL 1.26 mL 2.92 mL 5.00 µL 25.00 µL PH   BROAD RANGE MARKER, #161-0318 SAMPLE BUFFER   SDS10 % (b/v) Tris-HCL PH 6,8 Gliserol Brompenol biru 8.5% (b/v) Aquades B-mercaptoethanol           Aquades 30.3 g 144 g 10 g hingga 1 L 8.3       Trisma-base Glisin SDS   2 mL 1.25 mL 2.5 mL 0.2 mL 3.55 mL 0.05 mL No. 1 2 3 4 5 PROTEIN Myosin β-galactosidase Bovine Serum Albumin Ovalbumin Carbonic Anhydrase Soybean Trypsin 6 Inhibitor 7 Lysozyme 8 Aprotivin BM (kDa) 203.0 118.0 86.0 51.6 34.1 29.0 19.2 7.5 92    Lampiran 3 Pewarnaan Commassie Brilliant Blue STAINING COMMASSIE BRILLIANT BLUE 1 CBB 2 Methanol 3 Acetic Acid 1.25 gr 250.00 mL 50.00 mL 4 dH2O s.d Diamkan 4 jam/o.n. 500.00 mL DESTAINING 1 Methanol 2 Acetic Acid 3 dH2O s.d                           250.00 mL 70.00 mL 1.00 Lt 93    Lampiran 4 Perhitungan Berat Molekul Protein dalam Monogel SDS-PAGE M S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 BM Marker logBM jarak Rf = X 203 2,3075 0,35 0,0636 118 2,0719 0,65 0,1182 86 1,9345 1 0,1818 51,6 1,7126 2,1 0,3818 34,1 1,5328 3,2 0,5818 29 1,4624 4,3 0,7818 19,2 1,2833 5,9 1,0727 7,5 0,8751 7,7 1,4000 9 Jarak = garis awal gel sampai mulai munculnya pita protein Rf = X = migrasi relatif adalah jarak munculnya protein dibagi garis akhir gel 94    Lampiran 5 Makalah Publikasi Setiatin ET , Sajuthi D, Purwantara B, Talib C. 2009. Ekstraksi dan isolasi ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) dari kotildon plasenta domba garut sesaat setelah melahirkan. JITV 14(3) : 208 -215.                                 95                                                    96                                                    97                                                    98                                                    99                                                    100                                                    101                                                    102                                                    103                                                    104                                                    105                                                    106                                                    107    Lampiran 6 Uji Beda t-student antara Konsentrasi ovPAG dalam Urin Domba Tidak Bunting dan Bunting Two-Sample T-Test and CI: A2, TDK BNTG; A2, BUNTING Two-sample T for A2, TDK BNTG vs A2, BUNTING A2, TDK BNTG A2, BUNTING N 17 34 Mean 0,5809 0,5910 StDev 0,0528 0,0580 SE Mean 0,013 0,010 Difference = mu (A2, TDK BNTG) - mu (A2, BUNTING) Estimate for difference: -0,010118 95% CI for difference: (-0,043071; 0,022836) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,62 34 P-Value = 0,537 Two-Sample T-Test and CI: B2, TDK BNTG; B2, BUNTING Two-sample T for B2, TDK BNTG vs B2, BUNTING B2, TDK BNTG B2, BUNTING N 15 48 Mean 0,5717 0,5608 StDev 0,0243 0,0400 SE Mean 0,0063 0,0058 Difference = mu (B2, TDK BNTG) - mu (B2, BUNTING) Estimate for difference: 0,010921 95% CI for difference: (-0,006343; 0,028184) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 1,28 DF = 39 P-Value = 0,208 Two-Sample T-Test and CI: B3, TDK BNTG; B3, BUNTING Two-sample T for B3, TDK BNTG vs B3, BUNTING B3, TDK BNTG B3, BUNTING N 19 46 Mean 0,5477 0,5895 StDev 0,0550 0,0911 SE Mean 0,013 0,013 Difference = mu (B3, TDK BNTG) - mu (B3, BUNTING) Estimate for difference: -0,041720 95% CI for difference: (-0,078658; -0,004781) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -2,26 DF = 54 P-Value = 0,028 Two-Sample T-Test and CI: C1, TDK BNTG; C1, BUNTING Two-sample T for C1, TDK BNTG vs C1, BUNTING C1, TDK BNTG C1, BUNTING N 17 49 Mean 0,5269 0,593 StDev 0,0442 0,158 SE Mean 0,011 0,023 Difference = mu (C1, TDK BNTG) - mu (C1, BUNTING) Estimate for difference: -0,065712 95% CI for difference: (-0,115577; -0,015847) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -2,63 DF = 62 P-Value = 0,011 DF = 108    Two-Sample T-Test and CI: C2, TDK BNTG; C2, BUNTING Two-sample T for C2, TDK BNTG vs C2, BUNTING C2, TDK BNTG C2, BUNTING N 17 31 Mean 0,5634 0,6055 StDev 0,0330 0,0796 SE Mean 0,0080 0,014 Difference = mu (C2, TDK BNTG) - mu (C2, BUNTING) Estimate for difference: -0,042131 95% CI for difference: (-0,075179; -0,009083) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -2,57 DF = 43 P-Value = 0,014 Two-Sample T-Test and CI: C3, TDK BNTG; C3, BUNTING Two-sample T for C3, TDK BNTG vs C3, BUNTING C3, TDK BNTG C3, BUNTING N 12 25 Mean 0,5957 0,682 StDev 0,0491 0,122 SE Mean 0,014 0,024 Difference = mu (C3, TDK BNTG) - mu (C3, BUNTING) Estimate for difference: -0,086613 95% CI for difference: (-0,144083; -0,029143) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -3,06 DF = 34 P-Value = 0,004 Two-Sample T-Test and CI: D3, TDK BNTG; D3, BUNTING Two-sample T for D3, TDK BNTG vs D3, BUNTING D3, TDK BNTG D3, BUNTING N 20 49 Mean 0,5411 0,5247 StDev 0,0374 0,0314 SE Mean 0,0084 0,0045 Difference = mu (D3, TDK BNTG) - mu (D3, BUNTING) Estimate for difference: 0,016406 95% CI for difference: (-0,002977; 0,035789) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 1,73 DF = 30 P-Value = 0,094 Two-Sample T-Test and CI: E1, TDK BNTG; E1, BUNTING Two-sample T for E1, TDK BNTG vs E1, BUNTING E1, TDK BNTG E1, BUNTING N 12 44 Mean 0,5692 0,668 StDev 0,0597 0,148 SE Mean 0,017 0,022 Difference = mu (E1, TDK BNTG) - mu (E1, BUNTING) Estimate for difference: -0,098765 95% CI for difference: (-0,155516; -0,042014) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -3,51 DF = 45 P-Value = 0,001 109    Two-Sample T-Test and CI: E2, TDK BNTG; E2, BUNTING Two-sample T for E2, TDK BNTG vs E2, BUNTING E2, TDK BNTG E2, BUNTING N 18 49 Mean 0,665 0,643 StDev 0,125 0,104 SE Mean 0,029 0,015 Difference = mu (E2, TDK BNTG) - mu (E2, BUNTING) Estimate for difference: 0,021536 95% CI for difference: (-0,046154; 0,089227) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,65 DF = 26 P-Value = 0,519 Two-Sample T-Test and CI: A-E,TB; A-E,B Two-sample T for A-E,TB vs A-E,B A-E,TB A-E,B N 9 9 Mean 0,5829 0,6066 StDev 0,0480 0,0503 SE Mean 0,016 0,017 Difference = mu (A-E,TB) - mu (A-E,B) Estimate for difference: -0,023667 95% CI for difference: (-0,073060; 0,025727) T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,02 DF = 15   P-Value = 0,323
Dokumen baru
Aktifitas terbaru
Penulis
123dok avatar

Berpartisipasi : 2017-04-15

Dokumen yang terkait
Tags

Ovine Pregnancy Associated Glycoprotein (ovPA..

Gratis

Feedback