Effect of gotu kola (Centella asiatica (L.) Urban) leaf extract on the cognitive functions of rats

 0  4  266  2017-05-18 15:21:21 Report infringing document
PENGARUH PENGGUNAAN EKSTRAK DAUN PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban) TERHADAP FUNGSI KOGNITIF TIKUS ISKANDAR MIRZA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Pengaruh Penggunaan Ekstrak Daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap Fungsi Kognitif Tikus adalah karya saya dengan arahan dari Komisi Pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir disertasi ini. Bogor, Juli 2012 Iskandar Mirza NIM I162070111 ABSTRACT ISKANDAR MIRZA. Effect of Gotu Kola (Centella asiatica (L.) Urban) Leaf Extract on the Cognitive Functions of Rats. Supervised by HADI RIYADI, ALI KHOMSAN, SRI ANNA MARLIYATI, EVY DAMAYANTHI, and ADI WINARTO The aim of the study was to explore the mechanism of Centella asiatica leaf extract in improvement of cognitive function. The study used Wistar male rats, Centella asiatica and reagents for extraction. The evaluated levels are 0, 100, 300 and 600 mg extract/kg body weight. The design was randomized block design with five replicates. The statistical analyzes method of variance with F-test was used in this study. The result indicated that the Centella asiatica extract contains P, K, Mg, Ca, Zn, Mn, and asiaticoside. The daily body weight rats gain of treatment group was not significantly different (p>0.05). The group on level of 300 mg/kg body weigh of ethanol extract gives a better hematological profile. The rats with level 2 and 3 showed more activitve from week to week, but not for those in level 1, as it was markly found stable. On T-maze test there are no control rats member reached the finish point, while the percentage of treated rats that reached the finish is various and the highest one is found on level 3 group. The rat activities of the level of 300 and 600 mg/kg body weigh showed significant increase compare to those in control (p<0.05). Further more, the extract also promoted treated rat to have better orientation in T-maze test. In this study, although the time to reach the finish was significantly different but did not describe the level of learning activity of each experimental group. While percentage and frequency on reaching the finish point and activity pattern seem to be more appropriate as indicator of activity level and learning process compare to the time limit in achievement of the finish point. The rat activity increased with increasing level treatment of Centella asiatica extract. Immunohistochemical staining showed that the population of neuronal cells positive for calbindin antibodies in the ethanol extract group was higher compared to control. Those results strongly indicated that the ethanol extract of Centella asiatica can improve cognitive function through enhance the nerves cells mechanism. Keywords: Centella asiatica, activity, cognitive, rats RINGKASAN ISKANDAR MIRZA. Pengaruh Penggunaan Ekstrak Daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap Fungsi Kognitif Tikus. Dibimbing oleh HADI RIYADI, ALI KHOMSAN, SRI ANNA MARLIYATI, EVY DAMAYANTHI, dan ADI WINARTO. Pegagan adalah salah satu jenis tanaman obat dari ordo Umbelliferae, famili Apiaceae. Pegagan adalah suatu tanaman merambat yang banyak dijumpai mulai dataran rendah sampai dataran tinggi, pada lahan terbuka maupun ternaungi dan tanah basah sampai kering. Manfaat pengobatan dari ekstrak pegagan mungkin berhubungan dengan keberadaan senyawa fenolik. Penggunaan pegagan untuk tujuan peningkatan fungsi kognitif telah lama digunakan. Berdasarkan bukti empiris dan hasil pengujian pra klinis menunjukkan bahwa pegagan mempunyai suatu reputasi untuk membangun kembali kemunduran fungsi kognitif. Penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengkaji pengaruh penggunaan ekstrak daun pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap peningkatan fungsi kognitif pada tikus dengan melihat pola aktivitas tikus, kepadatan neuroglia pada region hipokampus CA3 dan penanda biologisnya. Penelitian ini diawali dengan pengumpulan bahan baku dan analisis kandungan kimia dari berbagai bagian tanaman pegagan segar. Selanjutnya dilakukan ekstraksi terhadap masing-masing bagian tersebut dengan menggunakan pelarut air dan etanol 70%. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer dan dilanjutkan dengan menganalisis kandungan kimianya. Bagian tanaman pegagan yang terbaik kandungan kimianya dari masing-masing pelarut ditetapkan sebagai bahan uji pada hewan model. Level ekstrak pegagan yang digunakan pada penelitian ini 0 (kontrol), 100, 300 dan 600 mg ekstrak/kg bobot badan yang diuji pada tikus selama 8 minggu. Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok yang terdiri dari satu perlakuan pada empat tingkatan level dan lima ulangan. Unit percobaan terdiri dari 40 ekor tikus yang berumur lebih kurang 2 bulan yang diuji dengan ekstrak air dan ekstrak etanol daun pegagan. Pengujian ekstrak air dan etanol dilakukan pada waktu yang berbeda. Variabel yang diukur adalah konsumsi pakan, bobot badan, aktivitas dan tingkah laku dengan menggunakan metoda modifikasi Multiple T-maze dan profil darah rutin yang terdiri dari analisis kadar Hb, Packet Cell Volume (PCV), benda darah putih (BDP) dan benda darah merah (BDM) differensial leukosit. Untuk melihat perbedaan respon antar kelompok perlakuan digunakan analisis varian (ANOVA), dan apabila terdapat perbedaan respon antar kelompok perlakuan maka analisis dilanjutkan dengan uji beda Duncan. Analisis morfologi hipokampus diawali dengan mengorbankan tikus dan selanjutnya dilakukan pemanenan jaringan otak, lalu dimasukkan dalam larutan paraformaldehid 4%. Selanjutnya diproses lebih lanjut yang terdiri dari trimming, dehidrasi, clearing, parafinisasi, embedding, dan blocking. Jaringan yang telah diblok selanjutnya dipotong dengan mikrotom dengan ketebalan lebih kurang 5 µm dan selanjutnya dilakukan pemeriksaan dengan metoda imunohistokimia. Variabel yang diukur adalah sel-sel yang positif terhadap masing-masing antibodi yang digunakan dan juga kepadatan sel-sel glial. Secara kualitatif daun, tangkai daun dan keseluruhan tanaman pegagan mempunyai senyawa alkaloid, flavonoid, dan glikosida yang sama kuatnya, sedangkan untuk senyawa steroid bagian tangkai daun dan keseluruhan tanaman mempunyai kualitas yang lebih tinggi daripada di bagian daun. Kadar air pegagan segar berkisar antara 87-88%. Kadar abu pada bagian daun dan keseluruhan tanaman lebih baik dibandingkan dengan pada bagian tangkai daun. Kandungan protein pada pegagan segar berkisar antara 7-16%. Kadar sari dalam air tertinggi dijumpai di bagian tangkai daun. Kadar sari dalam alkohol tertinggi dijumpai pada bagian campuran (daun dan tangkai daun). Hampir semua unsur kimia lebih banyak dijumpai di bagian daun kecuali kandungan K yang lebih banyak dijumpai di bagian tangkai daun. Kandungan asiatikosida di bagian daun juga lebih banyak dibandingkan dengan tangkai daun. Jumlah mineral yang paling banyak dijumpai di dalam bahan segar adalah unsur K dan Ca. Di dalam ekstrak banyak ditemukan mineral makro dan mikro kecuali unsur Fe dan Cu. Semua jenis mineral yang dianalisis lebih banyak ditemukan di dalam ekstrak air dibandingkan di dalam ekstrak etanol, sedangkan kandungan asiatikosida lebih banyak ditemukan di dalam ekstrak etanol. Unsur Ca dan P di dalam ekstrak ditemukan dalam perbandingan yang ideal. Kadar asiatikosida dalam ekstrak dari masing-masing bagian tanaman berkisar antara 15,59-16,44%. Selama periode percobaan semua tikus yang diberikan ekstrak etanol dan ekstrak air pegagan tidak menunjukkan tanda-tanda sakit dan juga tidak menunjukkan penurunan bobot badan. Respon pertambahan bobot badan harian antar perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Total asupan pakan antar kelompok perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Hasil analisis darah lengkap menunjukkan bahwa gambaran darah berada dalam batasan normal dan bahkan menunjukkan kecenderungan yang lebih baik dibandingkan dengan kontrol. Jumlah benda darah merah (BDM) dan eosinofil pada kelompok tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak etanol menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05). Terdapat 3 jenis tingkah laku yang dominan yang dijumpai pada tikus yaitu berjalan, memanjat dan membaui. Tikus yang aktif menunjukkan aktivitas berjalan, membaui dan memanjat dinding maze yang sangat tinggi. Diduga bahwa motivasi tikus untuk bergerak melewati setiap lorong adalah karena tikus berusaha untuk keluar dari lorong yang ada di depannya yang belum dilaluinya, dan apabila lorong yang di depannya telah buntu, maka tikus akan bergerak dengan sangat cepat kembali ke kotak start dan tidak kembali lagi ke titik finish. Aktivitas tikus yang diberi ekstrak etanol dari kelompok level 1, pada minggu pertama dan ketiga, aktivitasnya tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p>0,05), dan berbeda nyata dengan kelompok level 2 dan 3 pada minggu ketiga dan keempat (p<0,05). Tikus kontrol pada kelompok yang diberi ekstrak etanol tidak ada yang mencapai titik finish. Pada kelompok level 1, persentase tikus yang mencapai titik finish cenderung stabil, sedangkan pada kelompok level 2 dan 3 terjadi peningkatan dari minggu ke minggu. Persentase tikus yang mencapai titik finish dari kelompok level 2 dan 3 berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p<0,05) dan tidak berbeda nyata dengan kelompok level 1 (p>0,05). Frekuensi pencapaian titik finish pada kelompok tikus yang diberikan ekstrak air tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (p>0,05), namun demikian kelompok level 2 frekuensi pencapaian titik finish lebih baik dibandingkan dengan kelompok level lainnya. Tikus yang aktif, aktivitas memanjat di dalam maze dapat mencapai lebih dari 20 kali selama 5 menit. Tikus yang diberikan ekstrak air kurang aktif dibandingkan dengan aktivitas tikus yang diberikan ektrak etanol. Aktivitas tikus yang diberikan ekstrak air tidak menunjukkan perbedaan antar kelompok (p>0,05) kecuali pada minggu ketiga, dan secara umum tikus pada kelompok level 2 lebih baik daripada kelompok level lainnya. Hasil pewarnaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi GFAP menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan kepadatan sel-sel glial antar kelompok perlakuan. Pada kelompok yang diberi ekstrak etanol, penampakan populasi sel neuron yang positif terhadap antibodi calbindin D28k lebih banyak dibandingkan dengan control. Pewarnaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi dopamine, TNF dan CRP tidak menghasilkan reaksi positif. © Hak Cipta milik IPB, tahun 2012 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB PENGARUH PENGGUNAAN EKSTRAK DAUN PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban) TERHADAP FUNGSI KOGNITIF TIKUS ISKANDAR MIRZA Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Gizi Manusia SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2 0 12 Penguji pada Ujian Tertutup : 1. Prof. Dr. Ir. Faisal Anwar, MS 2. drh. Min Rahminiwarti, MS, Ph.D Penguji pada Ujian Terbuka : 1. Dr. Haryono 2. drh. Ekowati Handharyani, MS, Ph.D Judul Disertasi: Pengaruh Penggunaan Ekstrak Daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap Fungsi Kognitif Tikus Nama : Iskandar Mirza NIM : I162070111 Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir. Hadi Riyadi, MS Ketua Prof. Dr. Ir. Ali Khomsan, MS Dr. Ir. Sri Anna Marliyati, MSi Anggota Anggota drh. Adi Winarto, Ph.D Prof. Dr. Ir. Evy Damayanthi, MS Anggota Anggota Mengetahui Ketua Program Studi Ilmu Gizi Manusia drh. M.Rizal M. Damanik, MRepSc, Ph.D Tanggal Ujian : 27 Juli 2012 Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr Tanggal Lulus : 31 Agustus 2012 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT karena atas qudrah dan iradahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan disertasi yang berjudul “Pengaruh Penggunaan Ekstrak Daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap Fungsi Kognitif Tikus”. Terima kasih yang tidak terhingga disampaikan kepada Dr. Ir. Hadi Riyadi, MS selaku ketua komisi pembimbing, serta anggota komisi pembimbing yaitu Prof. Dr. Ir. Ali Khomsan, MS, Dr. Ir. Sri Anna Marliyati, MSi, Prof. Dr. Ir. Evy Damayanthi, MS dan drh. Adi Winarto, Ph.D. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada penguji prelim lisan Prof. Dr. Ir. Faisal Anwar, MS dan Dr. Ir. Lilik Kustiyah, MSi dan penguji proposal Dr. Rimbawan, serta penguji pada ujian tertutup Prof. Dr. Ir. Faisal Anwar, MS dan drh. Min Rahminiwati, MS, Ph.D. Ucapan yang sama juga disampaikan kepada Bapak dan Ibu dosen mayor Ilmu Gizi Manusia Departemen Gizi Masyarakat atas bekal ilmu pengetahuan yang diberikan. Terimakasih juga disampaikan kepada Rektor dan Dekan Fakultas Ekologi Manusia Institut Pertanian Bogor. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Ketua Departemen dan Ketua Program Studi Ilmu Gizi Masyarakat Institut Pertanian Bogor. Kepada Balai Pengkajian Teknoogi Pertanian NAD yang telah memberi izin dan Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Kementerian Pertanian yang telah memberikan beasiswa dan biaya penelitian melalui proyek KKP3T juga penulis ucapkan terima kasih. Terimakasih kepada Laboratorium Histologi FKH IPB dan Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian atas fasilitas laboratorium yang disediakan selama penulis melaksanakan penelitian. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada temanteman angkatan 2007 GMA, dan teman-teman lainnya atas semangat kebersamaan dan persaudaraan selama ini. Kepada isteri tercinta Ir. Farhani Zakaria dan anak-anak tercinta Muna Ulfia, Farah Rizkina dan Nur Faizah, atas kasih sayang, pengertian, serta dukungan moril yang tidak pernah berhenti, penulis sampaikan terimakasih yang sedalam-dalamnya. Tak lupa juga kepada Kakanda dan Adinda sekalian penulis ucapkan terima kasih. Sembah dan sujud serta doa yang tidak pernah berhenti penulis sampaikan kepada guru rohani Abu Muhammad ‘Alimin dan Abuya Syekh H. Amran Waly Al-Khalidy, kepada Ibunda Salamiah Arsyad/Hj. Chairani, dan Ayahanda Mahmud Ali (Alm)/Ir. H. Zakaria Ibrahim yang telah mendoakan dan mengikhlaskan penulis untuk melanjutkan pendidikan ini. Kepada semua pihak yang telah membantu dengan tulus, penulis sampaikan terimakasih. Semoga tulisan ini bermanfaat bagi pembaca. Bogor, Juli 2012 Iskandar Mirza RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Pidie Aceh pada tanggal 16 Maret 1963 sebagai putra keenam dari dua belas bersaudara dari ayahanda Mahmud Ali (Alm) dan ibunda Salamiah Arsyad. Pendidikan sarjana ditempuh di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala lulus tahun 1989. Pada tahun 1999 penulis melanjutkan pendidikan program Strata-2 di Universitas Gadjah Mada Yogjakarta dengan beasiswa Badan Litbang Pertanian dan menamatkannya pada tahun 2001. Pada tahun 2007 mendapatkan kesempatan untuk melanjutkan ke pendidikan doktor pada program studi Ilmu Gizi Manusia Fakultas Ekologi Manusia Institut Pertanian Bogor dengan beasiswa dari Badan Litbang Pertanian. Penulis bekerja di Sub Balai Penelitian Ternak Sei Putih Sumatera Utara dari tahun 1992-1996. Sejak tahun 1996-sekarang, penulis bekerja di Balai Pengkajian Teknologi Pertanian NAD. Selama menempuh program doktor, penulis pernah mengikuti Program Sandwich Depdiknas di International Islamic University Malaysia selama 4 bulan pada tahun 2009. Karya ilmiah yang merupakan bagian dari disertasi yaitu “Pengaruh Ekstrak Etanol Daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap Gambaran Darah, Aktivitas dan Fungsi Kognitif Tikus”, akan diterbitkan pada Jurnal Kedokteran Hewan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala Darussalam Banda Aceh pada volume 7 No. 1 Maret 2013. DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI ……………………………………………………………........... xix DAFTAR TABEL …………………………………………………………....... xxiii DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………...... xxv DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………….. xxvi PENDAHULUAN …………………………………………………………...... Latar Belakang …………………………………………………………...... Tujuan …………………………………………………………………….. Tujuan Umum ………………………………………………………….. Tujuan Khusus ………………………………………………………….. Manfaat ………….………………………………………………………… Hipotesis Penelitian ……………………………………………………....... 1 1 4 4 4 4 4 TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………………………. Pengobatan alternatif ……………………………………………………… Obat Herbal sebagai Obat Tradisional …………………………………....... Pasar dan Permintaan Tanaman Obat ……………………………………… Penelitian tentang Manfaat pegagan ……………………………………… Pegagan ……………………………………………………………….......... Kandungan Kimia ………………………………………………………… Manfaat pegagan …………………………………………………………… Antibakteri, anticestoda dan larvicidal ………………………………....... Antiinflamasi dan antinosiseptif ………………………………………… Aktivitas antioksidan …………………………………………………… Antiproliferatif …………………………………………………………… Antithrombotik ………………………………………………………....... Sitotoksisitas …………………………………………………………....... Pangan Fungsional………………………………………………………… Otak Hipokampus ………………………………………………………… Kognitif …………………………………………………………………..... 7 7 8 10 11 15 16 19 19 20 21 23 24 24 26 27 32 KERANGKA PEMIKIRAN…………………………………………………… METODE PENELITIAN ……………………………………………………… Penelitian 1. Penyiapan Ekstrak Pegagan dan Analisa Kandungan Zat Gizi ……………………………………………………………………. Tempat dan Waktu …………………………………………………….. .. Bahan dan Alat ………………………………………………………....... Sumber pegagan ………………………………………………………… Penyiapan bahan ekstrak dan skrining ………………………………….. Ekstraksi dan Maserasi ………………………………………………....... Variabel yang diukur ……………………………………………………. 35 39 39 39 39 39 40 40 42 xx Analisis Fitokimia ……………………………………………………. Analisis Proksimat …………………………………………………… Analisis Kadar air ………………………………………………… Kadar Abu ………………………………………………………… Kadar Sari Larut dalam Air ……………………………………....... Kadar Sari Larut dalam Alkohol ………………………………........ Analisis Kandungan Kimia Pegagan ………………………………… Analisis Mineral …………………………………………………… Pengolahan dan Analisis Data …………………………………………… 42 43 43 44 44 45 45 45 46 Penelitian 2. Pengujian Ekstrak Pegagan pada Hewan Model ……………. Tempat dan Waktu ……………………………………………………… Bahan dan Alat ………………………………………………………....... Penentuan Level Pegagan ……………………………………………....... Desain Penelitian ………………………………………………………… Variabel yang Diukur …………………………………………………… Konsumsi Pakan ……………………………………………………… Bobot Badan ………………………………………………………...... Aktivitas dan Tingkah Laku ………………………………………....... Analisis Darah Rutin …………………………………………………. Pengolahan dan Analisis Data …………………………………………… 46 46 46 47 48 49 49 49 49 50 51 Penelitian 3. Analisis Morfologi Hipokampus …………………………….. Tempat dan Waktu ………………………………………………………. Bahan dan Alat ………………………………………………………....... Penyiapan Preparat ……………………………………………………… Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) …………………………………. Pewarnaan Imunohistokimia …………………………………………. Variabel yang Diukur ……………………………………………………. Pengolahan dan Analisis Data …………………………………………… 51 51 51 52 52 52 53 53 HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………………………....... Penelitian 1. Penyiapan Ekstrak Pegagan dan Analisa Kandungan Zat Gizi ……………………………………………………………………. Hasil Analisis Kualitatif Komponen Kimia Pegagan Segar ……….............. Kandungan Zat Gizi Pegagan Segar ………………………………………. Kadar Air ………………………………………………………………… Kadar Abu ……………………………………………………………....... Kadar Protein ……………………………………………………………. Kadar Sari dalam Air dan Sari dalam Alkohol ……………………………. Analisis Mineral …………………………………………………………… Kandungan Komposisi Kimia Ekstrak Pegagan …………………………… Hasil Analisis Proksimat Ekstrak Kering ………………………………... Mineral ……………………………………………………………....... Kandungan Asiatikosida ……………………………………………… 55 55 55 58 59 59 60 61 61 64 65 65 66 xxi Penelitian 2. Pengujian Ekstrak Pegagan pada Hewan Model ……………. Pertambahan Bobot Badan dan Asupan Pakan ……………………………. Gambaran Darah Lengkap ………………………………………………… Pola Aktivitas ……………………………………………………………… Perlakuan Pemberian Ekstrak Etanol ……………………………………. Perlakuan Pemberian Ekstrak Air ……………………………………….. Penelitian 3. Analisis Morfologi Hipokampus …………………………….. Imunohistokimia Jaringan Otak …………………………………………… Profil Sel Neuroglia ……………………………………………………… Ekspresi Sel yang Positif Terhadap Antibodi Calbindin D28k ……………. Ekspresi Sel yang Positif Terhadap Antibodi Dopamin …………………. Ekspresi Sel yang Positif Terhadap Antibodi CRP dan TNF ……………. 67 67 70 74 75 79 80 80 81 83 87 88 PEMBAHASAN UMUM………………………………………………...... 91 KESIMPULAN DAN SARAN ……………………………………………. Kesimpulan ………………………………………………………………. Saran …………………………………………………………………....... 97 97 98 DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………… LAMPIRAN ……………………………………………………………….. 99 109 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 2 Tanaman pegagan ........................................ Error! Bookmark not defined. Struktur dari asiatikosida, madekassosida, asam madekassik, dan asam asiatik…....................................... Error! Bookmark not defined. 3 Jalur biosintesis asiatikosida di dalam tanaman pegagan.Error! Bookmark not defined. 4 Anatomi otak pada posisi pandangan coronalError! Bookmark not defined. 5 Struktur sel neuron ...................................... Error! Bookmark not defined. 6 Kerangka Pemikiran .................................... Error! Bookmark not defined. 7 Diagram alir pembuatan ekstrak pegagan ... Error! Bookmark not defined. 8 Desain penelitian ......................................... Error! Bookmark not defined. 9 Model modifikasi multiple T-maze.............. Error! Bookmark not defined. 10 Kurva pertambahan bobot badan dari masing-masing kelompok yang diberi ekstrak etanol............................ Error! Bookmark not defined. 11 Kurva pertambahan bobot badan dari masing-masing kelompok yang diberi ekstrak air ................................. Error! Bookmark not defined. 12 Hasil pewarnaan dengan antibodi GFAP pada bagian hipokampus pada kelompok kontrol yang diberi ekstrak etanol daun pegagan.Error! Bookmark not defined. 13 Hasil pewarnaan dengan antibodi GFAP pada bagian hipokampus pada Kelompok level 3 yang diberi ekstrak etanol daun pegagan.Error! Bookmark not defined. 14 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok kontrol yang diberi ekstrak etanol.Error! Bookmark not defined. 15 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok level 1 yang diberi ekstrak etanol.Error! Bookmark not defined. 16 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok level 2 yang diberi ekstrak etanol.Error! Bookmark not defined. 17 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok level 3 yang diberi ekstrak etanol.Error! Bookmark not defined. 18 Hasil pewarnaan dengan antibodi dopamin pada bagian hipokampus kelompok level 2 yang diberi ekstrak daun etanol.Error! Bookmark not defined. 19 Hasil pewarnaan dengan antibodi TNF pada bagian hipokampus kelompok level 1 yang diberi ekstrak daun etanol.Error! Bookmark not defined. 20 Hasil pewarnaan dengan antibodi CRP pada bagian hipokampus kelompok level 2 yang diberi ekstrak daun etanol.Error! Bookmark not defined. 21 22 23 24 Mekanisme penyerapan Ca dari usus .......... Error! Bookmark not defined. Mekanisme terjadinya kontraksi otot yang diperantarai oleh penggunaan Ca dan ATP ............................ Error! Bookmark not defined. Penggunaan ATP pada kontraksi ............... Error! Bookmark not defined. Skema peningkatan fungsi kognitif setelah pemberian ekstrak daun pegagan selama 8 minggu................... Error! Bookmark not defined. DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Data bobot badan (gr) kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan ....................................... Error! Bookmark not defined. 2 Data bobot badan (gr) kelompok tikus yang diberi ekstrak air daun pegagan ............................................. Error! Bookmark not defined. 3 Data total konsumsi pakan (gr) dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegaganError! Bookmark not defined. 4 Data total konsumsi pakan (gr) dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak air daun pegagan .... Error! Bookmark not defined. 5 Data skor aktivitas dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan ................ Error! Bookmark not defined. 6 Data skor aktivitas dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak air daun pegagan ...................... Error! Bookmark not defined. DAFTAR TABEL Halaman 1 Beberapa hasil penelitian tentang pegagan ... Error! Bookmark not defined.2 2 Rumus kimia, rumus molekul dan berat molekul dari senyawa asiatikosida, madekassosida, asam madekassik dan asam asiatik .......... Error! Bookmark not defined.7 3 Kandungan asiatikosida dan persentase distribusi dari setiap jaringan dari keseluruhan bagian tanaman pegagan ... Error! Bookmark not defined.8 4 Aktivitas larvicidal dari ekstrak daun pegagan terhadap Culex quinquefasciatus pada lima temperatur yang berbeda................................... 20 5 Kandungan nutrisi pakan tikus ...................................................................... 47 6 Kandungan fitokimia dari masing-masing bagian pegagan Error! Bookmark not defined.7 7 Hasil analisis kandungan zat gizi pegagan segar .......... Error! Bookmark not defined.8 8 Data hasil analisis kandungan mineral dan asiatikosida di dalam bagian yang berbeda dari pegagan segar ....................................................... 62 9 Hasil analisis proksimat dan komposisi kimia per 100 g bahan segar ... Error! Bookmark not defined.3 10 Hasil analisis proksimat dari ekstrak kering daun pegagan . Error! Bookmark not defined.5 11 Kandungan mineral dari ekstrak kering daun pegagan Error! Bookmark not defined.6 12 Kadar asiatikosida dari bahan ekstrak yang berbeda .... Error! Bookmark not defined.7 13 Respon pertambahan bobot badan (g) dan asupan mingguan (g) pada perlakuan dengan ekstrak etanol .......... Error! Bookmark not defined.9 14 Respon pertambahan bobot badan dan asupan pakan mingguan pada perlakuan dengan ekstrak air................................................................. 70 15 Rata-rata gambaran darah lengkap tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak etanol ................................................................................................. 71 16 Rata-rata gambaran darah lengkap tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak air ...................................................................................................... 73 17 Rata-rata gambaran differensial benda darah putih pada tikus yang diberi ekstrak etanol....................................................................................... 73 18 Rata-rata gambaran differensial benda darah putih pada tikus yang diberi ekstrak air ........................................... Error! Bookmark not defined.4 ii 19 Distribusi tikus dari masing-masing kelompok perlakuan berdasarkan skor kategori aktivitas dan rataan skor kategori ........... Error! Bookmark not defined.6 20 Persentase tikus yang mencapai titik finish setelah diberi ekstrak etanol ................................................ Error! Bookmark not defined.7 21 Rata-rata frekuensi dan waktu pencapaian titik finish setelah pemberian ekstrak etanol selama 10 kali pengamatan.. Error! Bookmark not defined.8 22 Distribusi tikus dari masing-masing kelompok perlakuan berdasarkan skor kategori aktivitas dan rataan skor kategori ........... Error! Bookmark not defined.9 23 Persentase tikus yang mencapai titik finish setelah diberi ekstrak air........... 80 24 Rata-rata frekuensi dan waktu pencapaian titik finish setelah pemberian ekstrak air selama 10 kali pengamatan ........................................ 80 iii 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perkembangan ilmu pengetahuan tentang mekanisme kerja otak mengalami lompatan yang luar biasa. Hasil penelitian yang telah diperoleh saat ini sangat bermanfaat untuk kehidupan manusia dan juga dapat dijadikan sebagai acuan untuk penelitian lebih lanjut yang berkaitan dengan kemampuan fungsi kognitif (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Kognitif adalah kemampuan berfikir dan memberikan rasional, termasuk proses mengingat, menilai, orientasi, persepsi dan memperhatikan. Kemampuan berfikir erat kaitannya dengan fungsi otak, karena kemampuan seseorang untuk berfikir dapat dipengaruhi oleh keadaan otak. Dengan demikian, kelainan pada fungsi otak dapat berpengaruh secara langsung kepada fungsi kognitif seseorang. Daya ingat adalah sesuatu yang sangat penting dari fungsi kognitif manusia. Daya ingat akan mengalami kemunduran dengan bertambahnya usia pada sebagian orang berusia setengah baya dan lanjut. Masalah penuaan dan kapasitas kerja semakin penting untuk didiskusikan karena kapasitas kerja pada usia tua sering tidak sepadan dengan tuntutan-tuntutan pekerjaan sehingga dapat mengakibatkan stress, masalah-masalah kesehatan dan angka kematian yang tinggi, misalnya karena penyakit kardiovaskular, bunuh diri atau kecelakaan (Hartanto 1996). Pada proses otak menjadi tua terjadi perubahan anatomi sel-sel neuron atau sel-sel otak, dan jumlah sel neuron mengalami penurunan di berbagai bagian otak. Di bagian hipokampus yang merupakan pusat pantauan memori juga terjadi penurunan jumlah sel neuron dalam jumlah besar. Secara klinis, pada orang usia lanjut kemunduran fungsi memori digolongkan ke dalam gangguan memori fisiologis dan gangguan memori patologis yang disebabkan oleh penyakit otak misalnya Alzheimer (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Dengan demikian, memahami mekanisme kerja otak akan memudahkan untuk memahami bagianbagian fungsinya serta cara penanggulangannya apabila terjadi gangguan dan menjadi dasar dalam penerapan penanggulangan kemampuan kognitif (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Pengobatan pada kelainan fungsi kognitif dapat dilakukan dengan pendekatan medis moderen atau gizi/pangan fungsional atau kombinasinya. Pada kondisi normal, fungsi kognitif dapat dioptimalkan dengan mengkonsumsi pangan fungsional yang bermanfaat terhadap fungsi kognitif secara tepat disamping mengkonsumsi zat gizi lainnya secara berimbang dan menerapkan pola hidup sehat. Demikian juga pada kondisi dimana fungsi kognitif tidak dicapai secara maksimal, pemberian pangan fungsional juga dapat membantu memperbaiki fungsi kognitif. Salah satu pangan fungsional yang bermanfaat untuk meningkatkan fungsi kognitif adalah pegagan (Centella asiatica). Pegagan adalah salah satu jenis tanaman obat dari ordo Umbelliferae (Babu et al. 1995), famili Apiaceae (Sharma & Jaimala 2003) mempunyai manfaat pengobatan yang tinggi (Babu et al. 1995). Tanaman obat tersebut pada umumnya dikenal sebagai Gotukola dan Marsh Pennywort (AS) (Sharma & Jaimala 2003). Pegagan adalah suatu tanaman merambat, tumbuh di tempat lembab di India dan negara Asia lainnya (Rao et al. 2007) terutama ditemukan di Asia bagian selatan (Wang et al. 2005). Di Indonesia, pegagan banyak dijumpai mulai dataran rendah sampai dataran tingggi, pada lahan terbuka maupun ternaungi dan tanah basah sampai kering (Widowati et al. 1992). Pegagan telah digunakan berabad-abad sebagai tanaman obat dan tercantum di dalam Pharmacopoeia Perancis tahun 1884, demikian pula pada tradisi kuno Chinese Shennong Herbal sekitar 2000 tahun yang lalu, dan juga pada Indian Ayurvedic Medicine sekitar 3000 tahun yang lalu. Pegagan juga dikenal sebagai rasayana pada penggunaan Ayurveda sebagai tonikum otak dan penyembuh luka (Sharma & Jaimala 2003). Manfaat pengobatan dari ekstrak pegagan mungkin berhubungan dengan keberadaan senyawa fenolik (Zainol et al. 2003). Dengan demikian, pegagan menjadi sangat penting berdasarkan atas peran kritisnya pada pencegahan penyakit (Shetty et al. 2008). Penggunaan pegagan untuk tujuan peningkatan fungsi kognitif telah lama dilakukan. Pada pengobatan sistem ayurvedic, yang merupakan pengobatan sistem alternatif di India, menggunakan daun pegagan untuk meningkatkan memori (Rao et al. 2007). Berdasarkan bukti empiris dan hasil pengujian pra klinis menunjukkan bahwa pegagan mempunyai suatu reputasi untuk membangun kembali kemunduran fungsi kognitif pada pengobatan tradisional dan pada hewan model (Wattanathorn et al. 2008). Pada pengujian daya ingat, dilaporkan bahwa pemberian jus daun segar pegagan selama periode pertumbuhan cepat pada tikus neonatal dapat meningkatkan kemampuan mengingat. Tikus yang diberi jus daun segar pegagan dengan dosis yang lebih tinggi (4 dan 6 mL) dengan lama pemberian 2-6 minggu menghasilkan jumlah alternasi yang lebih tinggi dan juga memberikan peningkatan prosentase respon alternasi yang benar dibandingkan dengan kontrol (Rao et al. 2005). Hasil pemeriksaan secara histologis menunjukkan terjadinya peningkatan pada panjang dendritik (intersection) dan jumlah titik percabangan dendritik, yaitu pada dendrit apikal dan dendrit basal pada tikus muda pada masa pertumbuhan cepat yang diberi pegagan 4 dan 6 mL/kg bobot badan per hari untuk periode waktu yang lebih panjang (4 dan 6 minggu). Dengan demikian, ekstrak daun segar pegagan dapat digunakan untuk meningkatkan dendrit neuronal pada keadaan stres dan neurodegeneratif serta kelainan memori (Rao et al. 2006). Pengujian pada orang tua yang sehat yang diberi ekstrak pegagan sebanyak 750 mg/hari selama 2 bulan dapat meningkatkan persentase akurasi kerja memori dan berpotensi untuk mengurangi kemunduran yang berhubungan dengan umur pada fungsi kognitif dan ketidakteraturan suasana hati pada orang tua yang sehat. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak tanaman pegagan memberikan pengaruh pada kecepatan dan kualitas kerja memori (Wattanathorn et al. 2008). Uraian tersebut di atas menunjukkan bahwa pegagan berpotensi sebagai tanaman obat untuk meningkatkan fungsi kognitif, namun mekanismenya belum jelas dan bahkan sebagian peneliti menyebutnya tidak diketahui. Oleh karena itu, melalui penelitian ini diharapkan dapat menjelaskan sebagian dari serangkaian mekanisme peningkatan fungsi kognitif akibat penggunaan ekstrak pegagan pada tikus. Tujuan Tujuan Umum Penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengkaji pengaruh penggunaan ekstrak daun pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap peningkatan fungsi kognitif dengan menggunakan tikus sebagai model. Tujuan Khusus Secara khusus penelitian ini bertujuan untuk: 1. Mengetahui komposisi kandungan gizi dan bahan aktif pegagan. 2. Mengetahui efek/peran ekstrak pegagan terhadap: a. Parameter umum metabolisme tubuh (bobot badan dan profil darah perifer) b. Aktivitas dan tingkat pembelajaran dalam pengenalan jalur finish T-maze c. Populasi neuron positif terhadap calbindin dan glial pada area CA3 d. Mengetahui perubahan bahan aktif seluler pada area CA3 3. Mengetahui level efektif terhadap peningkatan fungsi kognitif Manfaat Manfaat yang diharapkan dari hasil penelitian ini adalah: 1. Menghasilkan jenis ekstrak yang sesuai untuk tujuan penggunaan sebagai material peningkatan memori dan penghambat kemunduran fungsi memori. 2. Menghasilkan data kandungan bahan aktif dan bahan gizi lainnya dari pegagan. 3. Menghasilkan data gambaran darah rutin, kimia darah, histologi neuroglia dan penanda biologis. 4. Menjelaskan sebagian dari serangkaian mekanisme peningkatan fungsi kognitif karena penggunaan ekstrak daun pegagan pada tikus. Hipotesis Rumusan hipotesis yang dapat diajukan dari penelitian ini adalah sebagai berikut: H1: Perlakuan ekstrak daun pegagan dapat meningkatkan fungsi kognitif. H1: Terdapat perbedaan antar perlakuan ekstrak air daun pegagan dan ekstrak etanol daun pegagan terhadap gambaran darah, bobot badan, aktivitas dan gambaran histokimia hipokampus. 7 TINJAUAN PUSTAKA Pengobatan Alternatif Pengobatan alternatif didefinisikan sebagai terapi atau praktek di luar dari praktek medis konvensional sebagai mana yang diajarkan dalam sebagian besar sekolah medis. Perhatian terhadap praktek penggunaan obat alternatif saat ini telah meningkat, baik di tingkat konsumen maupun di lingkungan ilmiah. National Institutes of Health, Office of Alternative Medicine telah ditetapkan pada tahun 1992 untuk menguji dan meneliti sebagian dari kebanyakan peluang terapi alternatif. Sasaran dari Office of Alternative Medicine adalah untuk memodifikasi konsep dari “alternatif,” ke arah istilah “komplementer” untuk menggambarkan terapi yang mungkin saja berguna untuk suatu intervensi yang menyeluruh di dalam praktek medis yang konvensional. Beberapa penanganan yang dianggap sebagai praktek medis outside mainstream US, misalnya akupunktur, telah menjadi bagian dari perawatan medis standar di beberapa Negara eropa (Borchers et al. 1997). Jenis lain dari complementary or alternative medicine (CAM), seperti acupressure, botanical remedies, homeopathy, dan mind-body therapies, juga diterima di berbagai tingkat dengan ketetapan medis, demikian pula di masyarakat umum dari berbagai negara (Farnsworth 1993 Dalam Borchers et al. 1997). Hasil estimasi World Health Organization (WHO) bahwa pada awal tahun l990-an 80% populasi dunia tinggal di negara-negara berkembang dan 80% tidak mempunyai akses untuk atau memilih menggunakan obat berstandar Barat (Borchers et al. 1997). Sebagai gantinya, mereka diarahkan ke obat tradisional, dengan kata lain, CAM adalah untuk pelayanan kesehatan primer mereka (Farnsworth 1993 Dalam Borchers et al. 1997). Jumlah orang yang menggunakan atau bentuk lain dari CAM dengan cepat meningkat di seluruh dunia, bahkan diantara mereka terdapat orang yang mampu untuk menggunakan obat berstandar Barat (Goldbeck-Wood et al. 1996 Dalam Borchers et al. 1997). Efek zat gizi terhadap penyakit degeneratif kronis telah menjadi salah satu wilayah penelitian yang menarik, yang menyempurnakan konsep dari zat gizi optimal, dari hanya mencegah terjadinya penyakit karena defisiensi nutrisi ke mengurangi resiko penyakit kronis (Shils & Rude 1996 Dalam Borchers et al. 1997). Suatu kelompok zat gizi yang berperan penting dalam hal pencegahan penyakit adalah antioksidan (Borchers et al. 1997). Terkecuali manfaat antioksidatifnya, tanaman mengandung banyak senyawa yang mempunyai efek yang berpotensi baik terhadap banyak penyakit dan hal ini adalah salah satu dari alasan utama mengapa para ilmuwan, menunjukkan peningkatan minat pada medicinal botanicals. Sadar akan banyak pertanyaan yang tidak terjawab di sekitar penggunaan obat herbal, National Institutes of Health’s Office of Alternative Medicine bekerjasama dengan Food and Drug Administration mensponsori suatu pertemuan dari orang-orang yang terlibat dalam manufaktur serta distribusi CAM untuk mendiskusikan 1) keamanan dan kemanjuran medicinal botanicals, dan 2) bukti yang diperlukan untuk mengijinkan pemberian label efektif dalam penanganan dari penyakit spesifik. Hal ini menegaskan bahwa pengalaman dari negara lain mungkin memberikan suatu model demikian pula petunjuk untuk regulasi dari beberapa klaim kesehatan (Borchers et al. 1997). Obat Herbal sebagai Obat Tradisional Obat herbal adalah campuran kompleks, sekurang-kurangnya pemrosesannya (misalnya bagian-bagian tanaman yang direbus untuk dibuat teh). Bersama dengan komponen lainnya seperti akupunktur atau pijatan yang juga termasuk dalam katagori penyembuhan tradisional, obat herbal digunakan untuk pengobatan dalam suatu jangkauan yang lebih luas terhadap gejala dan penyebab penyakit (Plaeger 2003). Penggunaan herbal untuk pengobatan penyakit dalam suatu tradisi penyembuhan kuno itu dimulai di Asia lebih dari 3,000 tahun yang lalu (Nestler 2002 Dalam Plaeger 2003). Oleh praktisi abad ke-19 dan 20 pengobatan tersebut sebagian besar telah diabaikan karena pengaruh pengobatan ala Barat. Memasuki abad ke-21 praktek penyembuhan ramuan obat herbal, seperti obat tradisional Cina (Traditional Chinese Medicine/TCM), Kampo Jepang, dan Ayurveda India, dengan cepat meningkat penerimaannya di Barat (Plaeger 2003). Kebangkitan kembali praktek pengobatan tradisional telah banyak dijelaskan (Ernst & Pittler 2002 Dalam Plaeger 2003), tetapi kenyataannya bahwa obat herbal dan obat alami lainnya atau pengobatan alternatif dengan cepat berasimilasi menjadi praktek medis ala Barat (Plaeger 2003). Pada tahun 1998, dalam suatu survey dilaporkan bahwa 75% dari dokter Jepang telah meresepkan obat Kampo, dan dalam asuransi kesehatan nasional Jepang (Japanese National Health Insurance) sekarang ini juga tercakup pengobatan Kampo (Borchers el al. 2000 Dalam Plaeger 2003). Walaupun pada abad ke-20 Cina dengan cara yang sama mengadopsi pengobatan ala Barat sebagai pengobatan ortodoks, Institute of Chinese Medicine senilai $64 juta, sekarang ini sedang dibangun di Hong Kong, dan Taiwan serta daratan Cina juga sedang memompa dana ke penelitian formula tradisional (Normile 2003 Dalam Plaeger 2003). Diperkirakan bahwa pada tahun 1997 dan 1998, orang Amerika telah menghabiskan lebih dari $4 milyar terhadap obat herbal (Ernst & Pittler 2002 Dalam Plaeger 2003). Minat Amerika terhadap pengobatan dengan obat tradisional bukan semata-mata hanya untuk penggemar makanan kesehatan atau penduduk West Coast saja (Plaeger 2003). Untuk menambah dorongan lebih lanjut pada beberapa penelitian telah tersedia dana penelitian yang sangat memadai untuk penelitian obat herbal tradisional. Pada tahun 1998, National Institutes of Health mendirikan National Center for Complementary and Alternative Medicine, yang merupakan suatu ekspansi yang sebelumnya Office of Alternative Medicine, dengan 2002 anggaran penelitian lebih dari $100 juta. National Center for Complementary and Alternative Medicine sekarang ini telah membiayai empat pusat penelitian yang mengkhususkan pada penelitian botanikal dan banyak menginisiasi untuk membiayai pelatihan penelitian dari pengobatan alternatif (http://nccam.nih.gov/). Selain dari pada itu, National Institute of Allergy and Infectious Diseases telah mendanai penelitian manfaat imunomodulatori dari obat herbal serta efek terapeutiknya terhadap penyakit infeksi. National Institutes of Health didirikan yang berminat pada penyakit spesifik (misalnya National Cancer Institute and the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases) untuk mendukung penelitian tentang pengobatan herbal (Plaeger 2003). Sehubungan dengan keterbatasan ekonomi, sediaan modern medical healthcare di negara-negara berkembang seperti India adalah masih suatu pencapaian yang sulit untuk dijangkau. Sehingga penggunaan obat alternatif menjadi sangat penting dalam penanganan berbagai penyakit. Fenomena ini juga dialami di Indonesia yang masyarakatnya masih banyak yang miskin. Obat- obatan yang paling umum digunakan dari obat modern seperti aspirin, antimalaria, anti-kanker, digitalis, dan lain-lain awalnya berasal dari sumber tanaman. Ke depan, harus dapat dilihat pengobatan terintegrasi dan diharapkan bahwa penelitian obat alternatif akan membantu mengidentifikasikan mana obat yang aman serta efektif daripada marginalnya, klaim dan penemuan medis yang tak lazim (Sagrawat & Khan 2007). Dalam pengobatan tradisional, bagian tanaman yang berbeda dipercaya mempunyai manfaat pengobatan yang spesifik termasuk kemampuan untuk menstimulasi mekanisme melawan penyakit (Craig 1999; Jones 1996 Dalam Punturee et al. 2005). Pasar dan Permintaan Tanaman Obat Permintaan produk bahan alam untuk tujuan kesehatan dan kebugaran terus meningkat. Menurut laporan Convention on Biological Diversity (CBD), pasar herbal dunia tahun 2000 mencapai 43 miliar US$, nilai penjualan suplemen bahan alam mencapai 20 M US$ (Dennin 2000 dalam Komarawinata 2007) atau 30% dari nilai penjualan produk yang berasal dari bahan alam. Kontribusi Indonesia terhadap pasar herbal dunia baru 100 juta US$. Nilai perdagangan dunia meningkat menjadi 60 miliar US$ tahun 2002, pada tahun 2010 diprediksi menjadi 300 miliar US$ (Bodecker 2003 dalam Komarawinata 2007). Omset penjualan produk tanaman obat Indonesia saat ini baru mencapai 3 triliun rupiah dan diharapkan meningkat menjadi 8 triliun rupiah pada tahun 2010. Di Amerika Serikat, konsumsi tanaman obat naik hampir mendekati 15% setiap tahunnya (Marwick 1995 Dalam Borchers et al. 1997). Sebagian botanikal dapat diperoleh atau dibeli, baik keseluruhan dari tanaman, atau bagian-bagian daripadanya, atau dapat diperoleh sebagai teh, serbuk, ekstrak cair, kapsul, atau tablet (Wuest & Gossel 1995 Dalam Borchers et al. 1997). Di Amerika Serikat, ekstrak tanaman secara umum dijual sebagai food supplements sehingga pertimbangan konsumen untuk memenuhi kebutuhan zat gizi kelihatannya terjamin (Borchers et al. 1997). Dalam konteks ini adalah menarik untuk dicatat bahwa hal itu telah diketahui untuk beberapa dekade dimana zat gizi dan kesehatan adalah saling berhubungan (Feigin 1997 Dalam Borchers et al. 1997). Indonesia mempunyai keragaman hayati yang cukup luas, mempunyai prospek yang cukup cerah dalam pengembangan produk obat-obatan dan pangan fungsional berbasis bahan alami. Potensi Indonesia untuk menghasilkan obatobatan atau pangan fungsional berbasis bahan alami sangat tinggi, mengingat Indonesia kaya akan kekayaan hayati tumbuhan obat yang mencapai 7000 jenis dan pengetahuan tradisional untuk pemanfaatan tumbuhan obat dari berbagai etnis yang mencapai 370 etnis. Di negara lain, penggunaan ekstrak tanaman untuk tujuan pengobatan dan kebugaran telah banyak dilakukan, karena di dalam ekstrak tanaman mengandung beberapa senyawa, yang dapat memainkan peran penting terhadap fungsi fisiologis dengan cara spesifik yang dimilikinya (Sharma & Jaimala 2003). Namun di Indonesia, penelitian tentang tanaman obat serta pengetahuan tradisional untuk produk alam masih sangat terbatas. Oleh karena itu investigasi yang luas dan mendalam tentang khasiat berbagai macam tanaman obat termasuk diantaranya tanaman obat pegagan atau pegagan perlu dilakukan. Penelitian tentang Manfaat Pegagan Dilaporkan bahwa pegagan bermanfaat untuk berbagai keadaan klinis misalnya sebagai antibakteri (Taemchuay et al. 2008), antisestoda (Temjenmongla & Yadav 2005) larvasida (Rajkumar & Jebanesan 2005), anti-inflamasi dan antinosiseptif (Somchit et al. 2004) antioksidan (Hamida et al. 2002; Veerendra & Gupta 2002; Zainol et al. 2003; Gnanapragasam et al. 2007; Hussin et al. 2007; Shetty et al. 2008), antitumor (Babu et al. 1995; Punturee et al. 2005), imunostimulan (Punturee et al. 2005; Wang et al. 2004; Wang et al. 2005), penyembuhan luka (Rao Vishnu et al. 1996; Shukla et al. 1999; Hong et al. 2005; Shetty et al. 2008; Suwantong et al. 2008), radio protektif (Sharma & Jaimala 2003), dan fungsi kognitif (Veerendra & Gupta 2002; Rao et al. 2005; Rao et al. 2006; Rao et al. 2007; Wattanathorn et al. 2008). Tabel 1 berikut ini menyajikan sebagian dari hasil penelitian tentang manfaat pegagan terhadap kesehatan. Tabel 1 Beberapa hasil penelitian tentang pegagan Indikasi o Anti-inflamasi Ekstrak air pegagan pada level 10, 30, 100 dan 300 mg/kg bobot badan memperlihatkan aktivitas antinociceptive dan aktivitas antiinflamasi o Imunostimulasi Deasetilasi dan carboxyl-reduction, pektin dan produk turunannya yang terdapat di dalam pegagan menunjukkan aktivitas imunostimulasi o Antithrombotik Ekstrak metanol (45 mg/kg) dan etanol pegagan (14 mg/kg bobot badan) bermanfaat untuk pencegahan penyakit yang berhubungan dengan gaya hidup seperti hipertensi, kardiopati dan apopleksia serebral yang disebabkan oleh pengapuran pembuluh darah (arteriosclerosis). o Tulang dan Sendi Pengujian in vitro, fraksi pegagan 10 µg/mL dapat menghambat degradasi tulang rawan, menghambat pelepasan IL-1ß dan produksi nitric okside oleh eksplan tulang rawan o Tumor Pengujian dengan metoda brine shrimp lethality test, ekstrak etanol pegagan 100, 500 dan 1000 µg/mL tidak menunjukkan aktivitas sitotoksik. Peneliti Somchit et al. 2004 Wang et al. 2005 Satake et al. 2007 Hartog et al. 2009 Padmaja et al. 2002 Ekstrak metanol pegagan dapat memperlambat perkembangan tumor solid dan tumor asites dan mempunyai tingkat keracunan selektif terhadap sel tumor serta memberikan manfaat anti-tumor yang potensial dengan cara menstimulasi sistem kekebalan. Level efektif dari fraksi aseton ekstrak metanol adalah 17 µg/mL untuk Ehrlich ascites tumour cells, 22 µg/mL untuk Dalton’s lymphoma ascites tumour cells dan 8 µg/mL untuk mouse lung fibroblast. Babu et al. 1995 Di samping sitotoksik langsung terhadap sel tumor, ekstrak air pegagan 100 mg/kg bobot badan juga dapat mencegah karsinogenesis dengan cara memodulasi respon imun (meningkatkan produksi IL-2 dan TNF-α), sedangkan ekstrak etanol menunjukkan aktivitas imunosuppressif (menurunkan produksi IL-2 dan TNF-α) Punturee et al. 2005 Indikasi  Antisestoda Aktivitas antisestoda yang moderat telah dilaporkan untuk ekstrak etanol daun pegagan pada konsentrasi 5 - 40 mg/mL, dengan waktu rata-rata kematian parasit berkisar dari 4 – 14,66 jam  Larvisidal Ekstrak etanol daun pegagan pada konsentrasi 6,84 ppm (19 °C) dan 1,12 ppm (31°C) dapat membunuh 50% larva Culex quinquefasciatus Peneliti Temjenmongla & Yadav 2005 Rajkumar & Jebanesan 2005  Antibakteri Ekstrak air pegagan mempunyai nilai minimum inhibitory Taemchuay et al. concentration pada konsentrasi 2-3 mg/ml terhadap bakteri 2008 Staphylococcus aureus  Penyembuhan Luka Pemberian ekstrak etanol daun pegagan 800 mg/kg bobot badan selama 10 hari dapat memacu penyembuhan luka pada tikus dan juga mampu mengatasi reaksi hambatan penyembuhan luka oleh steroid Shetty et al. 2008 Senyawa asitikosida dari tanaman pegagan diyakini sebagai senyawa aktif yang berhubungan dengan penyembuhan luka Suwantong et al. 2008 Pemberian ekstrak air pegagan dalam bentuk suspensi propylene glycol 5% secara topikal dapat meningkatkan kandungan kolagen pada jaringan luka Rao Vishnu et al. 1996 Aplikasi larutan yang mengandung 0,2% dan 0,4% asiatikosida secara topikal pada marmut normal demikian pula pada yang diabetik atau pemberian 1 mg/kg bobot badan secara oral dapat meningkatkan tingkat penyembuhan luka yang ditandai dengan peningkatan sintesa kolagen dan kekuatan tensil dari jaringan yang luka Shukla et al. 1999 Ekstrak pegagan telah digunakan di Eropa untuk penanganan penyembuhan luka Maquart et al. 1999  Perlukaan Lambung Pemberian ekstrak air pegagan pada tikus dengan dosis 10 dan 20 mg/kg bobot badan mempu mencegah terjadinya tukak lambung karena pemakaian obat anti inflamasi (indomethacin)  Kecerdasan Sripanidkulchai et al. 2007 Indikasi Pemberian ekstrak air pegagan pada level 200 dan 300 mg/kg bobot badan tikus selama 14 hari dapat meningkatkan kinerja belajar dan memori Peneliti Veerendra & Gupta 2002 Pemberian jus daun segar pegagan selama periode pertumbuhan cepat pada tikus neonatal dapat meningkatkan kinerja memori Rao et al. 2005 Pemberian ekstrak daun segar pegagan 0,158-0,474 g/kg bobot badan tikus dapat menstimulus pertumbuhan dendritik neuronal, sehingga dapat digunakan untuk meningkatkan dendrit neuronal pada stres dan neurodegeneratif serta kelainan memori Rao et al. 2006 Pemberian jus daun segar pegagan dapat meningkatkan arborisasi dendritik di neuron amygdaloid tikus Rao et al. 2007 Pemberian ekstrak pegagan 750 mg per hari selama 2 bulan Wattanathorn et berpotensi untuk mengurangi kemunduran fungsi kognitif al. 2008 yang berhubungan dengan umur dan ketidakteraturan suasana hati pada orang tua yang sehat  Antioksidan Ekstrak etanol dari semua bagian pegagan memperlihatkan aktivitas antioksidatif yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak air. Bagian akar menunjukkan aktivitas tertinggi daripada bagian lainnya Hamida et al. 2002 Pemberian ekstrak air 100-300 mg/kg bobot badan tikus dapat meningkatkan kemampuan belajar dan memori serta manfaat antioksidan dengan cara mengurangi peroksidasi lemak dan memperbanyak enzim antioksidan endogenus di dalam otak Veerendra & Gupta 2002 Aksesi pegagan yang berbeda mempunyai aktivitas antioksidatif yang berbeda pula. Bagian daun mempunyai aktivitas antioksidatif yang tinggi, diikuti bagian akar dan tangkai Zainol et al. 2003 Ekstrak air pegagan 200 mg/kg bobot badan tikus efektif menetralkan perubahan enzim mitokhondria dan sistem pertahanan mitokhondria (mengurangi kardiomiopati mitokhondria) Gnanapragasam et al. 2007 Pemberian 5% tepung dan 0,3% ekstrak pegagan dalam Hussin et al. Indikasi makanan dapat memperbaiki stres oksidatif dengan cara mengurangi peroksidasi lemak melalui perubahan sistem pertahanan antioksidan Ekstrak alkohol pegagan 800 mg/kg bobot badan tikus dapat menigkatkan konsentrasi antioksidan, protein dan lysyl oxidase dan mengurangi peroksidasi lemak Peneliti 2007 Shetty et al. 2008 Pegagan Pegagan merupakan tanaman merambat yang tumbuh di tempat lembab di India dan negara Asia lainnya (Rao et al. 2007), terutama ditemukan di Asia bagian selatan (Wang et al. 2005). Ekstrak tanaman pegagan mengandung beberapa senyawa yang dapat berperan pada fungsi fisiologi dengan cara spesifik yang dimilikinya (Sharma & Jaimala 2003). Pegagan adalah tanaman obat dari famili Apiaceae/Umbelliferae (Sharma & Jaimala 2003), dan menurut Babu et al. (1995), pegagan merupakan salah satu tanaman dari famili Umbelliferae yang mempunyai manfaat pengobatan yang tinggi. Tanaman obat ini pada umumnya dikenal sebagai Gotukola dan Marsh Pennywort (AS) (Sharma & Jaimala 2003). Gambar 1 Tanaman pegagan Di Thailand, tanaman ini umumnya dikenal sebagai Buabok dan biasanya diminum sebagai teh atau jus (Farnsworth & Bunyapraphatsara 1992 Dalam Punturee et al. 2005). Di Indonesia, pegagan banyak dijumpai mulai di dataran rendah sampai di dataran tinggi, pada lahan terbuka maupun ternaungi dan tanah basah sampai kering (Widowati et al. 1992). Pegagan dapat diklasifikasikan sebagai berikut: Klas : Dicotyledenae Sub-Klas : Polypetalae Series : Calyciflorae Order : Umbellales Famili : Umbelliferae (Apiaceae) Genus : Centella Spesies : asiatica Pegagan telah digunakan berabad-abad sebagai tanaman obat dan tercantum di dalam Pharmacopoeia Perancis tahun 1884, demikian pula pada tradisi kuno Chinese Shennong Herbal sekitar 2000 tahun yang lalu, dan juga pada Indian Ayurvedic Medicine sekitar 3000 tahun yang lalu (Sharma & Jaimala 2003). Menurut Satake et al. (2007) pegagan juga telah digunakan di seluruh dunia untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit. Pegagan juga dikenal sebagai rasayana pada penggunaan Ayurveda sebagai tonikum otak dan penyembuh luka (Sharma & Jaimala 2003), dan juga pegagan menjadi sangat penting berdasarkan peran kritisnya pada pencegahan penyakit (Shetty et al. 2008). Manfaat pengobatan dari ekstrak pegagan mungkin berhubungan dengan keberadaan senyawa fenolik yang dikandungnya (Zainol et al. 2003). Kandungan Kimia Ekstrak air pegagan mengandung senyawa asiatikosida, asam asiatik, triterpines, centoic acid, centellic acid dan esternya. Ekstrak tanaman ini juga kaya akan vitamin, mineral dan nutrien yang secara umum tidak beracun terhadap tubuh. Disamping senyawa tersebut, juga banyak dijumpai senyawa lainnya termasuk asam askorbik (Sharma & Jaimala 2003), dan senyawa pektin yang mengandung arabinose, rhamnose, galactose, xylose serta galacturonic acid (Wang et al. 2005), serta sterol bebas (Mangas et al. 2008). Di dalam pegagan juga ditemukan senyawa flavonoid lainnya seperti castilliferol, castillicetin, dan isochlorogenic acid (Subban et al. 2008). Menurut Zhang et al. (2009), selain asiatikosida, pegagan juga mengandung madekassosida, brahmosida, brahminosida dan thankunisida yang merupakan komponen utama dari triterpene dalam bentuk saponin triterpenoid. Diantara senyawa aktif tersebut, asam asiatik merupakan suatu senyawa triterpin yang digunakan dalam penanganan demensia dan dapat meningkatkan kognisi (Rao et al. 2005). Asam asiatik tersebut adalah suatu metabolit aktif dari asiatikosida, dan juga merupakan senyawa ionik (Thongnopnua 2008). Rumus kimia, rumus molekul dan berat molekul dari senyawa asiatikosida, madekassosida, asam madekassik dan asam asiatik disajikan pada Tabel 2 (Aziz et al. 2007). Tabel 2 Rumus kimia, rumus molekul dan berat molekul dari senyawa asiatikosida, madekassosida, asam madekassik dan asam asiatik Senyawa aktif Rumus molekul Asiatikosida C 48 H 78 O 19 Madekassosida C 48 H 78 O 20 Asam madekassik C 30 H 48 O 6 Asam asiatik C 30 H 48 O 5 Sumber: (Aziz et al. 2007) Berat molekul 958 974 504 488 Gambar berikut menjelaskan struktur asiatikosida, madekassosida, asam madekassik dan asam asiatik (Aziz et al. 2007). Gambar 2 Struktur dari asiatikosida, madekassosida, asam madekassik, dan asam asiatik. Asiatikosida (R1 = H; R2 = O-glu-glu-rham), Madekassosida (R1 = OH; R2 = O-glu-glu-rham), Asam madekassik (R1 = OH; R2 = OH), Asam asiatik (R1 = H; R2 = OH) (Aziz et al. 2007). Distribusi senyawa asiatikosida dan madekassosida di dalam bagian organ spesifik pegagan adalah berbeda, dimana bagian daun mengandung senyawa tersebut yang lebih tinggi (Aziz et al. 2007). Zainol et al. (2003) juga melaporkan bahwa ekstrak daun mengandung senyawa fenolik yang tertinggi pada semua aksesi tanaman pegagan, diikuti oleh akar sementara konsentrasi paling rendah adalah pada bagian tangkai daun, dengan aktivitas antioksidatif yang serupa. Sedangkan menurut Kim et al. (2007), asiatikosida dan madekassosida dihasilkan dalam jumlah yang sedikit di dalam bagian akar (Tabel 3). Tabel 3 Kandungan asiatikosida dan persentase distribusi dari setiap jaringan dari keseluruhan bagian tanaman pegagan Asiatikosida Kandungan (mg/g BK) Distribusi (%) Daun 9,56 + 0,91 82,6 Tangkai daun 1,85 + 0,07 15,9 Akar 0,17 + 0,01 1,5 ND Node 0 Keseluruhan tanaman 4,32 + 0,35 Sumber: Kim et al. (2007). BK = Berat Kering, ND = Tidak ada data Jaringan Pegagan dari dua fenotip yang berbeda memperlihatkan perbedaan pada kandungan asiatikosida dan madekassosida. Pada phenotype-Smoot kandungan asiatikosida dan madekassosida lebih tinggi dibandingkan dengan phenotypeFringed. Kandungan asiatikosida dan madekassosida pada tanaman yang diregenerasi bervariasi sesuai dengan medium regenerasi yang digunakan. Kandungan rata-rata dari kedua senyawa tersebut paling banyak dijumpai di dalam daun (Aziz et al. 2007). Variasi kandungan kimia juga dijumpai di antara populasi pegagan (Zhang et al. 2009). Peningkatan senyawa target yang dihasilkan pada pegagan dapat dilakukan dengan suatu protokol transformasi genetik yang efisien menggunakan strain R1000 dari Agrobacterium rhizogenes yang mengandung encoding pCAMBIA1302 gen hygromycin phosphotransferase (hpt) dan green fluorescence protein (mgfp5) (Kim et al. 2007). Kandungan senyawa aktif tersebut juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan, dimana kondisi lingkungan harus optimal untuk memaksimalkan sintesa senyawa aktif tersebut. Variasi kandungan asiatikosida di dalam pegagan juga berhubungan dengan asal tanaman. Tanaman yang diperoleh dari ketinggian 609 m di atas permukaan laut mengandung 0,11 % asiatikosida per daun kering, sedangkan yang diperoleh dari ketinggian yang lebih rendah yaitu 5 m di atas permukaan laut mengandung hampir setengah nilai tersebut (Aziz et al. 2007). Jalur biosintesis senyawa asiatikosida dan madekassosida masih belum diketahui secara pasti (Aziz et al. 2007), namun diduga bahwa sintesis asiatikosida adalah melalui jalur squalene (Gambar 3). Gambar 3 Jalur biosintesis asiatikosida di dalam tanaman pegagan. HMGCoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A), MVA (mevalonic acid), IPP (isopentenyl diphosphate), DMAPP (dimethylallyl diphosphate), FPP (farnesyl diphosphate), CYS (cycloartenol synthase), bAS (βamyrin synthase), LUS (lupeol synthase) (Aziz et al. 2007). Manfaat Pegagan Antibakteri, Antisestoda dan Larvisidal Pemanfaatan pegagan sebagai phytochemical telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Dinyatakan bahwa pegagan dapat bertindak sebagai alternatif yang tepat untuk insektisida sintetis pada masa mendatang karena relatif aman, tidak mahal, dan banyak tersedia di banyak area (Rajkumar & Jebanesan 2005). Ekstrak kasar pegagan, terutama sekali yang diekstrak dengan air, mempunyai efek antibakteri terhadap Staphylococcus aureus (Taemchuay et al. 2008), antisestoda (Temjenmongla & Yadav 2005), larvisida dan menghambat munculnya Culex quinquefasciatus serta dapat digunakan secara langsung dalam volume yang kecil di habitat air atau pada tempat pembiakan ukuran terbatas di sekitar manusia (Rajkumar & Jebanesan 2005). Aktivitas biologis dari ekstrak tanaman ini berhubungan dengan senyawa phenol, terpenoid, dan alkaloid yang ada di dalam tanaman tersebut. Senyawa ini secara bersama-sama atau secara terpisah berperan untuk menghasilkan aktivitas larvisidal dan menghambat munculnya nyamuk dewasa Culex quinquefasciatus. Ekstrak ini dapat digunakan untuk mengontrol larva Culex quinquefasciatus pada cakupan temperatur yang luas (Rajkumar & Jebanesan 2005). Ekstrak daun pegagan dapat menyebabkan kematian larva Culex quinquefasciatus pada semua temperature yang diuji. Pada 24 jam, LC 50 (Lethal Concentration) adalah 1,12 ppm pada 31°C dan nilai LC 50 meningkat mencapai 6,84 ppm dengan menurunnya temperatur menjadi 19°C (Tabel 4) (Rajkumar & Jebanesan 2005). Tabel 4 Aktivitas larvisidal dari ekstrak daun pegagan terhadap Culex quinquefasciatus pada lima temperatur yang berbeda. Temperatur (oC) 19 22 25 28 31 Sumber: LC 50 (ppm) 6,84+1,32a 5,64+1,57b 3,92+1,23c 2,79+1,43d 1,12+1,23e 95% Confidence limit (ppm) 4,85-8,79 3,78-7,56 2,22-4,82 1,37-3,57 0,22-2,08 LC 90 (ppm) 9,12+2,12a 8,32+1,82b 6,78+1,47c 5,28+1,43d 3,63+1,57e 95% Confidence limit (ppm) 5,92-12,57 4,98-11,39 4,06-8,71 3,32-7,19 2,68-4,52 Rajkumar & Jebanesan (2005). Nilai dalam kolom dengan superscript yang berbeda adalah perbedaan signifikan pada tingkat P<0,05 (DMRT test). Anti-inflamasi dan Antinosiseptif Ekstrak air pegagan memperlihatkan aktivitas antinosiseptif. Aktivitas antinosiseptif tersebut sama dengan aspirin tetapi tidak lebih kuat dibandingkan dengan morfin. Ekstrak pegagan juga memperlihatkan aktivitas anti-inflamatori. Efek antiinflamatori tersebut sama dengan asam mefenamat yaitu sejenis obat antiinflamatori non-steroid. Pemberian ekstrak pegagan 2 mg/kg menunjukkan aktivitas antiinflamatori dan pemberian dengan dosis yang lebih besar memberikan aktivitas yang lebih efektif dari asam mefenamat. Penemuan ini memberikan alasan penggunaan secara tradisional dari tanaman ini pada penanganan peradangan atau rheumatik (Somchit et al. 2004). Aktivitas Antioksidan Aktivitas antioksidan dari suatu tanaman sangat ditentukan oleh kandungan senyawa aktif yang dijumpai di dalam tanaman tersebut. Dilaporkan bahwa antioksidan alami dari tanaman memperkuat pertahanan antioksidan endogenus dari kerusakan reactive oxygen species (ROS) dan membangun kembali keseimbangan optimal dengan cara menetralkan reactive species (Shetty et al. 2008) juga dapat memberikan perlindungan dari kerusakan oksidatif (Hussin et al. 2007). Ekstrak air dari keseluruhan tanaman pegagan mempunyai dua efek yaitu untuk meningkatkan kemampuan belajar dan memori serta sebagai antioksidan dengan cara mengurangi peroksidasi lemak serta memperbanyak enzim antioksidan endogenus di dalam otak (Veerendra & Gupta 2002). Laporan lainnya menyebutkan bahwa pemberian ekstrak pegagan dapat meningkatkan konsentrasi antioksidan, protein dan lysyl oxidase serta mengurangi kadar lipid peroksidasi (Shetty et al. 2008). Efek ini kemungkinan berhubungan dengan kehadiran senyawa flavonoid, quersetin, katekhin dan rutin, yang diketahui adalah sebagai antioksidan yang kuat (Hussin et al. 2007). Aktivitas enzim penanda kardiak (laktat dehydrogenase, kreatin fosfokinase, amino transferase), enzim siklus TCA (isositrat dehydrogenase, αketoglutarat dehydrogenase, malat dehydrogenase), enzim penanda respirasi (NADH-dehydrogenase, sytochrom-C-oksidase), dan enzim antioksidan mitokhondria (glutathion peroksidase, glutathione, superokside dismutase, katalase) pada tikus yang diinduksi dengan adriamycin dapat diturunkan dan tingkat peroksidasi lemak dapat ditingkatkan dengan pemberian pegagan. Aktivitas protektif dari pegagan terhadap kardiotoksisitas menunjukkan bahwa efek protektif ini merupakan efek yang utama dari manfaat antioksidannya (Gnanapragasam et al. 2007). Data ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak air pegagan sebanyak 200 mg/kg bobot badan secara oral, efektif menetralkan perubahan pada enzim mitokhondria dan sistem pertahanan mitokhondria. Dilaporkan juga bahwa ekstrak air dari pegagan tidak hanya memiliki keuntungan antioksidan tetapi juga mengurangi tingkat kerusakan mitokhondria. Manfaat dari pegagan tersebut menawarkan sesuatu yang penting untuk mengurangi kardiomiopati mitokhondria yang merupakan faktor pembatas dalam terapi antineoplastik (Gnanapragasam et al. 2007). Pegagan juga mempunyai efek stimulatori terhadap antioksidan seluler serta sistem kekebalan yang mungkin dapat dimanfaatkan untuk penggunaan profilaktik terhadap sejumlah penyakit pada manusia seperti penyakit kardiovaskuler dan kelainan yang berhubungan dengan stres (Shetty et al. 2008). Veerendra & Gupta (2002) melaporkan bahwa diantara dosis ekstrak air yang diuji terhadap parameter stres oksidatif, hanya dosis 200 dan 300 mg/kg menunjukkan penurunan malondialdehyde (MDA) pada otak dengan meningkatkan simultan pada level glutathione. Kadar MDA yang rendah pada tikus yang diberi ekstrak dan tepung pegagan juga dilaporkan oleh Hussin et al. (2007), yang mengindikasikan telah terjadi pengurangan peroksidasi lemak pada tikus tersebut. Pengurangan produksi MDA tersebut menunjukan terjadinya hambatan peroksidasi lemak. Pengurangan MDA membuktikan bahwa pegagan mempunyai aktivitas antioksidasi yang baik sekali (Hussin et al. 2007). Pemberian 300 mg/kg bobot badan ekstrak air pegagan dapat memberikan peningkatan level katalase tetapi tidak ada perubahan pada level superoxide dismutase (SOD) (Veerendra & Gupta 2002), sedangkan pada laporan lainnya menyebutkan bahwa pemberian pegagan dapat mengurangi aktivitas superoxide dismutase pada minggu ke 25 (Hussin et al. 2007). Peningkatan aktivitas katalase adalah sebagai respon terhadap akumulasi H 2 O 2 , sedangkan penurunan aktivitas superoxide dismutase kemungkinan karena kemampuan senyawa antioksidan yang terdapat di dalam pegagan (Hussin et al. 2007). Penurunan aktivitas superoxide dismutase pada tikus yang disupplementasi dengan pegagan menunjukkan kebutuhan yang lebih rendah akan enzim dan ini mengindikasikan efek protektif dari tanaman ini dalam serangan stres oksidatif (Hussin et al. 2007). Pemberian 100 mg/kg bobot badan, tidak memberikan perubahan pada parameter antioksidan kecuali terhadap level glutathione (Veerendra & Gupta 2002). Laporan lainnya menyebutkan bahwa ekstrak etanol dari semua bagian pegagan memperlihatkan aktivitas antioksidatif yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak air, sementara pegagan yang diekstrak dengan light petroleum ether menunjukkan aktivitas yang lebih rendah (Hamida et al. 2002). Aktivitas antioksidatif juga ditentukan oleh jenis aksesi (Zainol et al. 2003). Selain aksesi, bagian yang berbeda dari pegagan (daun, tangkai daun, dan akar) juga memperlihatkan aktivitas antioksidatif yang berbeda pula (Hamida et al. 2002). Bagian daun dari pegagan mempunyai aktivitas antioksidatif yang tinggi, diikuti bagian akar dan tangkai daun (Zainol et al. 2003), sedangkan Hamida et al. (2002) melaporkan bahwa bagian akar menunjukkan aktivitas antioksidatif tertinggi daripada bagian lainnya. Perbedaan aktivitas antioksidatif dari bagian yang berbeda dari pegagan mungkin saja sehubungan dengan reduksi hidroperoksida, inaktivasi radikal bebas, selasi dari ion logam atau kombinasi daripadanya (Zainol et al. 2003). Perbedaan aktivitas antioksidatif juga ditentukan oleh beberapa faktor lainnya seperti mekanisme yang berbeda dari metoda yang berbeda, struktur dari senyawa fenolik yang berbeda, dan mungkin juga sehubungan dengan efek sinergistik dari senyawa yang berbeda. Faktor lainnya yang menentukan aktivitas antioksidatif potensial dari senyawa fenolik adalah stabilitas dari bentuk radikal aroxy dalam struktur dari senyawa itu sendiri (Zainol et al. 2003). Mekanisme, demikian pula senyawa spesifik yang bertanggungjawab terhadap manfaat oksidatif yang diamati dari pegagan masih belum jelas. Diduga bahwa terdapat hubungan yang kuat antara aktivitas antioksidatif dan senyawa fenolik, sehingga dapat dikatakan bahwa senyawa fenolik tersebut mungkin bertanggungjawab terhadap aktivitas antioksidatif dari pegagan. Walaupun senyawa fenolik tersebut mempunyai kontribusi utama terhadap aktivitas antioksidatif pada pegagan, namun ciri-ciri dari senyawa tersebut masih belum diketahui (Zainol et al. 2003). Antiproliferatif Dilaporkan bahwa telah diperoleh 10 senyawa antiproliferatif dari ekstrak pegagan dari bagian aerialnya. Sepuluh senyawa antiproliferatif tersebut adalah 11,12-dehydroursolic acid lactone, asam ursolik, asam pomolik, 2α ,3αdihydroxyurs-12-en-28-oic acid, 3-epimaslinic acid, asam asiatik, asam korosolik, 8-acetoxy-1,9-pentadecadiene-4,6-diyn-3-ol, β-sitosterol 3-O-β-glucopyranoside, dan asam rosmarinik (Yoshida et al. 2005). Antithrombotik Pegagan adalah tanaman obat yang juga bermanfaat untuk pencegahan penyakit yang berhubungan dengan gaya hidup seperti hipertensi, kardiopati dan apopleksia serebral yang disebabkan oleh pengapuran pembuluh darah (arteriosclerosis). Efek dari pemberian kronis yaitu dengan frekuensi pemberian dua kali sehari untuk 14 hari terhadap hambatan kereaktivan platelet dan koagulasi dinamis dapat memicu sirkulasi darah untuk menghilangkan stasis darah. Fase larutan EtOAc dari ekstrak MeOH memperlihatkan aktivitas hambatan yang paling kuat untuk menghambat kereaktifan platelet dan koagulasi dinamis, sedangkan fase larutan n-BuOH juga memperlihatkan hambatan kereaktifan platelet tetapi tidak mempengaruhi koagulasi dinamis (Satake et al. 2007). Senyawa 3,5-di-O-caffeoylquinic acid menunjukkan kemampuan untuk menghambat aktivasi platelet (anti-thrombotic) dan hambatan koagulasi dinamis, sehingga mendukung fakta bahwa senyawa ini mempunyai efek antihipertensi. Komponen aktif lainnya seperti asiatikosida yang merupakan saponin utama dari tanaman ini, tidak menghambat kereaktifan platelet dan koagulasi dinamis, demikian juga dengan senyawa 1,5-disubstituted isomer dan flavonoid. Efek hambatan terhadap reaksi platelet dan koagulasi dinamis menunjukkan aktivitas yang maksimum pada konsentrasi 0,4 mg/kg bobot badan, dan menurun pada konsentrasi 4 mg/kg bobot badan serta 0,2 mg/kg bobot badan (Satake et al. 2007). Sitotoksisitas Manfaat pegagan terhadap anti tumor masih belum konsisten. Terdapat laporan yang mengatakan bahwa ekstrak etanol pegagan tidak menunjukkan aktivitas sitotoksik (Padmaja et al. 2002) sedangkan pada laporan lainnya dinyatakan bahwa pegagan mempunyai efek sitotoksisitas (Babu et al. 1995). Pegagan memberikan manfaat sitotoksik dan anti-tumor yang potensial (Babu et al. 1995). Aktivitas kemopreventif atau antikanser tersebut mungkin diperoleh melalui aktivitas imunostimulasi (Punturee et al. 2005). Stimulasi sistem kekebalan ini secara langsung menyebabkan sitotoksik terhadap sel tumor serta diyakini bahwa ekstrak kasar dan fraksi yang dipurifikasi mempunyai tingkat keracunan selektif terhadap sel tumor (Babu et al. 1995). Di samping sitotoksik langsung terhadap sel-sel tumor, pegagan dapat mencegah karsinogenesis dengan cara memodulasi respon imun. Dilaporkan juga bahwa ekstrak air pegagan mendesak aktivitas imunostimulasi terhadap proliferasi mitogenstimulasi dari human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Ekstrak air pegagan juga meningkatkan produksi IL-2 dan TNF-α pada human PBMCs (Punturee et al. 2005). Penelitian secara in vivo, menunjukkan bahwa tikus yang diberi ekstrak air pegagan (100 mg/kg bobot badan) menunjukkan respon yang lebih tinggi terhadap antibodi primer dan sekunder. Berbeda dengan ekstrak air, ekstrak etanol pegagan menunjukkan aktivitas imunosupresif. Hal itu ditandai dengan pengurangan proliferasi mitogen-stimulated human PBMCs dan produksi IL-2 serta TNF-α. Produksi TNF-α yang berlebihan berhubungan dengan berbagai penyakit termasuk penyakit infeksi, penyakit autoimun dan kanker. Dengan demikian, hambatan produksi TNF-α oleh ekstrak etanol dari pegagan mungkin saja penting. Walaupun, mekanisme yang tepat dari efek ini tidak jelas, namun mekanisme tersebut mungkin saja dimediasi oleh interaksi antara komponen aktif dari ekstrak dan sel molekul atau faktor-faktor pertumbuhan yang terlibat dalam aktivasi mitogen. Kemungkinan aktivitas yang lain adalah mungkin saja interferensi dengan sel signaling (Punturee et al. 2005). Berbeda dengan pengujian secara in vivo, pengujian sitotoksisitas secara in vitro menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan fraksi yang dipurifikasi menunjukkan efek sitotoksisitas terhadap berbagai line yang ditransformasikan, demikian juga aktivitas terhadap sel fibroblast. Efek cell sitotoksisitas terhadap multiplikasi sel mouse lung fibroblast (L-929) secara in vitro dari ekstrak metanol pegagan dan fraksi aseton dari kolom khromatografi memberikan hasil yang bermanfaat pada konsentrasi 100 µg/mL. Demikian juga dengan pemberian secara oral dari ekstrak metanol pegagan dan fraksi aseton dapat memperlambat perkembangan tumor solid dan tumor asites. Konsentrasi ekstrak etanol yang diperlukan untuk menghasilkan 50% kematian sel adalah 62 µg/mL untuk EAC (Ehrlich ascites tumour cells) dan 75 µg/mL untuk DLA (Dalton’s lymphoma ascites tumour cells) dan untuk fraksi yang dipurifikasi adalah 17 µg/mL untuk EAC dan 22 µg/mL untuk DLA (Babu et al. 1995). Pemberian ekstrak kasar dan fraksi yang dipurifikasi dapat mengurangi perkembangan murine solid tumour. Fraksi yang dipurifikasi dan senyawa fluorescent juga menghambat proliferasi sel L-929 di dalam kultur pada konsentrasi 8 dan 3,5 µg/mL. Fraksi yang dipurifikasi dan senyawa fluorescent menghambat sintesa DNA dengan pengurangan produksi (3H)-thymidine dan tidak mempunyai peran terhadap hambatan sintesa protein dan sintesa RNA. Fraksi yang dipurifikasi dan senyawa fluorescent kurang menyebabkan peningkatan (3H)-leucin dan (3H)-uridine, mungkin karena terjadi peningkatan transkripsi dan translasi sel tumor selama kematian sel (Babu et al. 1995). Pangan Fungsional Berdasarkan bukti ilmiah bahwa pegagan mengandung berbagai macam zat gizi dan juga dapat memberikan berbagai manfaat kesehatan maka pegagan dapat dikatagorikan sebagai nutraceutical dan pangan fungsional karena telah terbukti dapat mengobati dan mencegah terjadinya penyakit disamping sebagai gizi dasar. Terdapat beberapa definisi tentang pangan fungsional yang dikeluarkan oleh lembaga Internasional. Menurut International Food Information Council (IFIC), pangan fungsional adalah makanan atau komponen makanan yang dapat memberikan manfaat kesehatan di luar gizi dasar. International Life Sciences Institute of North America (ILSI), mendefinisikan pangan fungsional adalah pangan yang secara fisiologis komponen bahan aktifnya memberikan manfaat kesehatan di luar gizi dasar. Health Canada mendefinisikan bahwa pangan fungsional adalah makanan yang mirip dalam hal tampilannya dengan makanan konvensional, dikonsumsi sebagai bagian dari diet biasa, dengan manfaat fisiologis mengurangi risiko penyakit kronis diluar fungsi gizi dasar. Nutrition Business Journal mengklasifikasikan pangan fungsional sebagai makanan yang diperkaya dengan bahan-bahan tambahan atau konsentrat yang dapat meningkatkan kesehatan atau kinerja. Pangan fungsional termasuk sereal yang diperkaya, roti, minuman olahraga, makanan ringan fortifikasi, makanan bayi, makanan siap saji, dan banyak lagi yang lainnya (Wildman & Kelley, 2007). Tren terbaru dalam pemasaran pangan fungsional menunjukkan bahwa beberapa manfaat produk menjadi hal yang paling umum yang ditawarkan oleh produsen kepada konsumen. Ketertarikan konsumen untuk mengkonsumsi pangan fungsional untuk tujuan kesehatan tidak lepas dari bukti ilmiah dari khasiat pangan fungsional, penetahuan gizi, promosi dan penawaran produk yang lebih beragam untuk dijual. Konsumen cenderung akan merespon dengan berbagai latar belakang misalnya kondisi kesehatan dan tingkat pengetahuan. Teratanavat & Hooker (2006) melaporkan bahwa manfaat kesehatan dan kealamihan produk pangan fungsional lebih dipilih oleh konsumen, namun preferensi tersebut tergantung pada tingkat pendidikan individu, pendapatan, dan perilaku pembelian makanan. Berdasarkan bentuk produk pangan fungsional, zat gizi alami lebih disukai oleh konsumen daripada produk fortifikasi. Produk pangan fungsional yang diterima oleh konsumen biasanya melibatkan beberapa tahap yang berbeda dari suatu konsep untuk pelaksanaan pasar yang berhasil. Dimulai dengan menterjemahkan konsep penting menjadi prototipe yang diterima dan bermanfaat. Prototipe tersebut kemudian memerlukan penilaian untuk efikasi dan pengujian keamanan melalui hewan coba dan manusia. Publikasi data efikasi dan keamanan pangan merupakan tahap akhir dari suatu proses pengembangan pangan fungsional (Jones & Jew 2007). Pengembangan dan pemasaran produk pangan fungsional agak rumit, mahal dan berisiko. Selain hambatan teknologi, aspek legislatif, serta tuntutan konsumen perlu dipertimbangkan ketika mengembangkan pangan fungsional. Penerimaan konsumen adalah faktor kunci untuk sukses dalam bernegosiasi peluang pasar (Siró et al. 2008). Otak dan Hipokampus Otak adalah pusat dari sistem saraf pada semua hewan vertebrata, dan merupakan organ yang paling kompleks dari tubuh. Secara visual, bagian dalam otak terdiri dari daerah yang warna gelap (grey matter) yang dipisahkan oleh warna lebih terang (white matter). Otak dari semua spesies terutama terdiri dari dua jenis sel yaitu sel neuron dan sel glial. Sel glial juga dikenal sebagai glia atau neuroglia ada beberapa jenis, dan melakukan sejumlah fungsi penting, namun neuron biasanya dianggap sebagai sel yang paling penting di otak. Jumlah sel neuron dan sel glial pada pria lebih banyak 24% dari wanita. Pada wanita jumlah keseluruhan neuron neokorteks dan sel glial adalah 49,3 miliar dan pada pria 65,2 miliar (Pelvig 2008). Neuron memiliki manfaat yang unik karena mampu mengirim sinyal ke sel target yang jauh sekalipun. Neuron berkomunikasi dengan neuron lainnya melalui serabut protoplasma panjang yang disebut akson yang membawa potensial aksi ke bagian yang jauh dari otak atau tubuh. Neuron menghasilkan sinyal listrik yang berjalan di sepanjang akson. Ketika sinyal listrik mencapai persimpangan (sinaps), mengakibatkan neurotransmiter dilepaskan dan mengikat pada reseptor pada sel lain dan dengan demikian mengubah aktivitas listriknya. Sinaps merupakan elemen fungsional utama dari otak. Sumber: www.loni.ucla.edu/data/rat/ Gambar 4 Sumber: synapses.bu.edu/anatomy/hippo/hippo2.stm Anatomi otak pada posisi pandangan coronal. Inside adalah bagian hipokampus yang dibagi menjadi subdevisi CA1, CA2 dan CA3 (CA = Cornu Ammonis) Fungsi penting dari otak adalah membangun komunikasi sel ke sel, dan sinaps merupakan titik dimana komunikasi terjadi. Fungsi otak sangat tergantung pada kemampuan neuron untuk mengirim sinyal elektrokimia ke sel lain, dan kemampuan sel neuron untuk merespon dengan tepat terhadap sinyal-sinyal elektrokimia yang diterima dari sel lain. Sifat listrik dari neuron dikendalikan oleh berbagai proses biokimia dan metabolik, terutama interaksi antara neurotransmiter dan reseptor yang terjadi pada sinaps. Jaringan otak memerlukan sejumlah besar energi dan tergantung pada volume otak. Sebagian besar spesies vertebrata memerlukan antara 2-8% metabolisme basal ke otak dan pada manusia meningkat hingga 20-25%. Gambar 5 Struktur sel neuron (http://en.wikipedia.org/wiki/File: Chemical_ synapse_schema_cropped.jpg Hipokampus adalah komponen utama dari otak manusia dan vertebrata lainnya. Hipokampus mempunyai sistem limbik dan memainkan peran penting dalam konsolidasi informasi dari memori jangka pendek ke memori jangka panjang dan navigasi spasial. Manusia dan mamalia lainnya memiliki dua hipokampus, satu di setiap sisi otak. Hipokampus sangat erat kaitannya dengan korteks serebral, dan pada primata terletak di lobus temporal medial, di bawah permukaan kortikal. Hipokampus terdiri dari dua bagian utama yaitu Ammon's horn dan dentate gyrus, yang pada awalnya digambarkan sebagai pes hippocampi major dan pes hippocampi minor. Kerusakan pada hipokampus juga bisa terjadi akibat kekurangan oksigen (hipoksia), ensefalitis, atau epilepsi lobus temporal medial. Orang yang mengalami kerusakan hipokampus bilateral akan mengalami anterograde amnesia yaitu mempertahankan memori baru. ketidakmampuan untuk membentuk atau Pada hewan pengerat, hipokampus telah dipelajari secara ekstensif sebagai bagian dari sistem otak yang bertanggung jawab untuk memori spasial dan navigasi. Oleh karena berbagai jenis sel saraf yang tersusun rapi di dalam lapisan di hipokampus, sehingga sering digunakan sebagai model untuk mempelajari neurofisiologi. Secara historis, pada awalnya diduga bahwa hipokampus berfungsi dalam sistem penciuman, namun hanya sedikit orang yang percaya bahwa penciuman adalah fungsi utamanya. Saat ini sudah ada kesepakatan umum bahwa hipokampus memainkan peran penting dalam memori, namun sifat yang tepat dari peran ini masih banyak diperdebatkan. Peran hipokampus dalam fungsi kognitif dipopulerkan oleh O'Keefe dan muridnya Dostrovsky pada tahun 1971 yang menemukan neuron di hipokampus tikus yang menjelaskan tentang aktivitas tikus dalam lingkungannya. Selanjutnya pada tahun 1978 O'Keefe & Lynn Nadel menyusun buku yang diberi judul The Hipokampus as a Cognitive Map. Sel di hipokampus yang bertanggung jawab dalam memberi respon adalah sel pyramidal dan sel granula di dentate gyrus yang terdapat di hipokampus lapisan padat. Tipe sel neuronal utama dari hipokampus adalah sel piramidal. Walaupun neuron piramidal sebagian besar neuron pada CA3, namun ada juga kelompok dari interneuron yang heterogen. Pada tingkat dorsal, sel-sel kecil (dengan ukuran diameter soma ~300 µm2 atau 20 µm) terletak di dalam otot dentate gyrus dan mempunyai total panjang dendritik 8–11 mm. Sel-sel besar (dengan ukuran diameter soma ~700 µm2 atau 30 µm), terletak di bidang distal, mempunyai total panjang dendritik 16–19 mm. Total panjang dendritik tidak berhubungan dengan panjang aksonal karena sel piramidal di bagian proksimal dari CA3, dengan keseluruhan poros tempat dendritik yang paling pendek, mempunyai pohon aksonal yang paling besar (Witter 2007). Stres sosial yang kronis mendorong penurunan jumlah titik percabangan dan total panjang dendritik di pohon dendritik apikal dari neuron CA3 piramidal (Mckittrick et al. 2000). Banyak sel piramidal ventral mempunyai pohon dendritik yang besar juga cenderung mempunyai pohon aksonal yang lebih besar dibandingkan dengan yang di posisi dorsal. Distribusi dari pohon dendritik sel CA3 piramidal lebih lanjut bervariasi tergantung pada dimana badan sel terletak sepanjang poros melintang (Witter 2007). Secara bilateral ukuran soma CA3 secara positif berhubungan dengan umur. Somata CA3 lebih kecil dibandingkan dengan somata CA2. Variabilitas pada bentuk soma atau ukuran meningkat dengan bertambahnya umur di kedua sub bidang, sementara variabilitas pada orientasi soma kurang berhubungan dengan pertumbuhan otak. Di awal perkembangan terdapat persamaan dalam pola pertumbuhan hemisfer di CA3 dan CA2. Somata CA2 adalah 34% dan 32% lebih besar dari somata CA3 di sisi kiri dan kanan. Secara bilateral, ukuran soma meningkat secara linear dengan pertumbuhan otak. Demikian juga variabilitas ukuran soma meningkat secara sistematis ketika otak bertumbuh. Di sisi lain, secara bilateral variabilitas dalam orientasi soma kurang berhubungan dengan berat otak, dan secara konsisten ke arah negatif. Korelasi antara kepadatan neuronal dan berat otak mengungkapkan satu pola konsisten yang kuat di kedua sub bidang. Hubungan yang kuat antara ukuran soma dan kepadatan hanya ditemukan pada CA3 kanan. Pola pertumbuhan yang serupa diamati di dua sisi berkenaan dengan ukuran soma dan variabilitas dari ukuran, bentuk, dan orientasi. Ketika neuron pada sub bidang hipokampus ini tumbuh lebih besar, kepadatan merosot, yang menunjukkan kematangan dari neuron. Rendahnya nilai korelasi mengisyaratkan laju maturasi neuronal lambat. Secara bilateral, ukuran neuron dan perbedaan bentuk meningkat dengan berat otak (umur), sedangkan keteraturan di dalam orientasi neuronal adalah sama (Zaidel 1999). Neuron pada CA3, baik sel piramidal demikian pula interneuron, menerima input masif dari sel granul di dentate gyrus, yang disebut sistem serat mossy. Secara proksimal di dalam CA3, serat mossy didistribusikan ke superfisial lapisan sel piramidal. Bagian distal dari CA3 menerima input serat mossy secara preferensial dari sel granul pada blade tertutup dari dentate gyrus. Permulaan input dari bagian berbeda dari dentate gyrus dapat juga menggunakan pengaruh yang berbeda sepanjang pohon dendritik dari CA3 piramidal individual demikian pula dapat secara selektif menginervasi kelompok tertentu dari neuron CA3. Pada kebanyakan ujung distal dari bagian dorsal dari CA3, populasi sel CA3 piramidal sebagian besar mengintegrasikan input dari keseluruhan dorsal ujung dentate gyrus, fitur itu tidak ada pada level proksimal dan pertengahan transversal demikian pula pada level CA3 ventral. Dalam hal keterkaitan fungsional, peran CA3 di luar jejaring yang autoasosiatif menyediakan input ke CA1. Di bagian distal CA3, dan lebih khususnya pada level dorsal, neuron CA3 individual menerima input serat mossy yang berasal dari bagian dorsal yang tersebar luas ke lokasi neuron penerima. Dengan demikian distal CA3 neuron ini mengintegrasikan output dari bagian yang cukup besar dari dentate gyrus. Bagian proksimal dari CA3 mungkin saja secara fungsional berbeda dari bagian distal. Distribusi transversal dari input serat mossy infrapiramidal dapat berubah tergantung pada pengalaman behavioral (Witter 2007). Restrukturisasi morfologis dari pohon dendrit sel CA3 piramidal mungkin saja bagian dari respon adaptip normal terhadap stres, dari langkah pertama dalam kaskade yang mendorong ke arah kematian sel pyramidal. Beberapa observasi mendukung hipotesis bahwa remodeling dendritik tidak perlu merepresentasikan suatu respon mengenai patologis terhadap stres. Penyusutan pohon dendritik dengan stres berpotensi memberikan fungsi adaptip dengan cara membatasi input ke neuron CA3 piramidal, dengan demikian penyaringan informasi ekstraneous keluar selama waktu stress. Penyusunan kembali vesikel kecil dekat zona aktif sinaptik adalah disertai dengan hipertropi mitokhondrial, menegaskan bahwa, setelah stres kronis, terminal serat mossy meningkatkan output eksitatori. Beberapa kemungkinan manfaat dari remodeling dapat terjadi bersama dengan pengurangan yang kecil pada spasial learning (Mckittrick et al. 2000). Kognitif Kognitif adalah kemampuan berfikir dan memberikan rasional, termasuk proses mengingat, menilai, orientasi, persepsi dan memperhatikan. Kemampuan berfikir erat kaitannya dengan fungsi otak, karena kemampuan seseorang untuk berfikir dipengaruhi oleh keadaan otak. Hampir semua makhluk mampu memodifikasi perilakunya sebagai hasil dari pengalaman. Perilaku didorong oleh aktivitas otak, sehingga perubahan perilaku juga diikuti dengan perubahan dalam otak. Hipokampus dan korteks serebral sangat berperan pada fungsi tersebut. Pada proses otak menjadi tua terjadi perubahan anatomi sel-sel neuron atau sel-sel otak, dan jumlah sel neuron mengalami penurunan di berbagai bagian otak. Di bagian hipokampus yang merupakan pusat pantauan memori juga terjadi penurunan jumlah sel neuron dalam jumlah besar. Tulving & Markowitsch (1998) melaporkan bahwa hipokampus sangat berperan pada kemampuan memori seseorang. Orang yang mengalami kerusakan pada hipokampus dapat menimbulkan gangguan pada memori episodik yaitu ketidakmampuan untuk mengingat rincian peristiwa tertentu. Secara klinis, pada orang usia lanjut kemunduran fungsi memori digolongkan ke dalam gangguan memori fisiologis dan gangguan memori patologis yang disebabkan oleh penyakit otak misalnya Alzheimer (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Dilaporkan juga bahwa penuaan yang normal juga akan memberi perubahan pada struktur hipokampus dan biokimia hipokampus (Driscoll et al. 2003). Dengan demikian, kelainan pada fungsi otak akan berpengaruh secara langsung kepada fungsi kognitif seseorang. Perkembangan ilmu pengetahuan tentang mekanisme kerja otak saat ini mengalami lompatan yang luar biasa, dan hasil penelitian yang telah diperoleh saat ini sangat bermanfaat untuk kehidupan manusia dan juga dapat dijadikan sebagai acuan untuk penelitian lebih lanjut yang berkaitan dengan kemampuan fungsi kognitif (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Dengan demikian, memahami mekanisme kerja otak akan memudahkan untuk memahami bagian-bagian fungsinya serta cara penanggulangannya apabila terjadi gangguan dan menjadi dasar dalam penerapan penanggulangan kemampuan kognitif (Sidiarto & Kusumoputro 2003) dan peningkatan fungsi kognitif. 35 KERANGKA PEMIKIRAN Kemampuan fungsi kognitif sangat dipengaruhi oleh keadaan otak. Asupan zat gizi yang baik dan berimbang selama masa kehamilan sampai dengan usia periode emas, sangat membantu untuk mengoptimalkan fungsi kognitif. Apabila pada periode tersebut kecukupan zat gizi tidak terpenuhi maka fungsi kognitif tidak dapat dicapai secara maksimal. Penyakit atau kelainan pengembangan kemampuan kognitif baik karena perolehan atau karena faktor lingkungan, atau karena faktor bertambahnya usia juga merupakan salah satu faktor predisposisi terjadinya penurunan fungsi kognitif. Pada kondisi normal, fungsi kognitif dapat dioptimalkan dengan mengkonsumsi pangan fungsional yang bermanfaat terhadap fungsi kognitif secara tepat disamping mengkonsumsi zat gizi lainnya secara berimbang dan menerapkan pola hidup sehat. Demikian juga pada kondisi dimana fungsi kognitif tidak dicapai secara maksimal, pemberian pangan fungsional juga dapat membantu memperbaiki fungsi kognitif. Kemunduran fungsi kognitif dapat dicegah atau diatasi dengan cara pendekatan medis moderen atau pendekatan gizi terutama penggunaan pangan fungsional. Penanganan dengan cara pendekatan medis moderen biasanya terdapat beberapa hambatan, diantaranya belum ada teknologi yang benar-benar sesuai, memerlukan biaya yang cukup mahal, tingkat keamanannya rendah, dan efektifitasnya masih dipertanyakan. Pendekatan dengan cara gizi terutama dengan menggunakan pangan fungsional memberikan beberapa keuntungan diantaranya tidak memerlukan biaya yang tinggi, tingkat keamanan yang tinggi dan dapat diaplikasi secara langsung oleh masyarakat. Berdasarkan bukti empiris pegagan telah digunakan secara meluas di India untuk semua golongan umur pada pengobatan sistem ayurvedic, yaitu suatu sistem pengobatan alternatif untuk meningkatkan memori. Di Indonesia, pegagan umumnya digunakan untuk sayur sebagai lalapan, sedangkan untuk tujuan meningkatkan memori belum dikenal secara meluas. Perbaikan fungsi kognitif karena penggunaan pegagan belum diketahui secara pasti Data sebelumnya menyatakan bahwa di dalam pegagan mengandung mineral makro dan mikro, asiatikosida dan zat gizi lainnya. Diantara senyawa tersebut, asiatikosida diduga berperan pada perbaikan fungsi kognitif, namun mekanismenya belum diketahui, apakah mekanismenya langsung melalui kinerja neuron atau melalui aktivitas antioksidan. Keberadaan mineral makro dan mikro serta zat gizi lainnya yang terdapat di dalam pegagan juga belum diketahui secara pasti, apakah keberadaan senyawa tersebut dapat memperbaiki sistem metabolism umum yang pada akhirnya memperbaiki fungsi kognitif, atau senyawa tersebut langsung memperbaiki kinerja saraf. Oleh karena itu, kajian tentang mekanisme peningkatan fungsi kognitif dan analisis kandungan bahan aktif yang terdapat di dalam pegagan sangat diperlukan sebelum pangan fungsional tersebut direkomendasikan kepada masyarakat luas untuk tujuan meningkatkan memori. Lebih jauh, sebelum pegagan direkomendasikan untuk tujuan sebagaimana disebut di atas, perlu dilakukan uji empiris menggunakan hewan model. Beberapa variabel penting yang menjadi fokus pengamatan dalam penelitian ini guna menjelaskan mekanisme peningkatan memori adalah sebagai berikut: a. Penentuan jenis ekstrak dan bahan ekstrak yang potensial untuk tujuan meningkatkan fungsi memori. b. Analisis komponen bahan aktif dan unsur kimia lainnya yang terdapat dalam masing-masing bahan ekstrak. c. Pengamatan tingkah laku dan keaktifan hewan model dengan menggunakan metode labirin. d. Analisis terhadap gambaran darah yang meliputi defferensial leukosit, Hb, Packet Cell Volume (PCV), total leukosit dan eritrosit e. Analisis penanda biologis yang mengindikasikan keadaan fungsi memori seperti, GFAP, calbindin, dopamin, CRP, TNF-α dengan metode imunohistokimia f. Pertumbuhan neuronal pada region CA3 dari hipokampus yang mencakup struktur kepadatan neuronal dengan metode histokimia. Data tentang pertumbuhan neuronal karena pemberian pegagan sudah tersedia namun masih parsial sehingga belum menjawab pengaruh dari pegagan terhadap peningkatan fungsi memori. Oleh karena itu sangat diperlukan data yang menggambarkan mekanisme yang berhubungan dengan peningkatan fungsi kognitif, sehingga mampu menjawab sebagian dari mekanisme peningkatan kecerdasan. Dengan demikian, penelitian ini diharapkan mampu memberikan kontribusi terhadap manfaat pegagan pada peningkatan fungsi memori. Data yang diperoleh diharapkan dapat menjadi acuan untuk program pengembangan dan pemanfaatan tanaman pegagan sebagai tanaman obat atau pangan fungsional. Kerangka pemikiran disajikan pada Gambar 6. • Penyakit • Kelainan pengembangan (perolehan/lingkungan) • Usia • Asupan makanan KUALITAS FUNGSI KOGNITIF Peningkatan fungsi kognitif Pendekatan medis modern Pendekatan gizi (pangan fungsional) • Blm ada teknologi yang sesuai • Biaya cukup mahal • Tingkat keamanannya rendah • Efektivitasnya? • Mineral makro • Mineral mikro • Zat gizi lainnya • • • • • Telah diketahui secara meluas Biaya rendah Tingkat keamanan tinggi Dapat diaplikasi langsung Efektifitasnya? Pegagan Metabolisme umum Kinerja saraf Kinerja Otot Kognitif Gambar 6 Kerangka Pemikiran Asiatikosida Antioksidan 39 METODE PENELITIAN Penelitian 1. Penyiapan Ekstrak Pegagan dan Analisis Kandungan Zat Gizi Tujuan: Mendapatkan bahan ekstrak dan data kandungan kimia yang terdapat pada berbagai bagian tanaman pegagan yang bermanfaat untuk kesehatan. Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro) Bogor. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari pegagan segar, etanol teknis 70%, aquades, dan bahan untuk analisis kimia. Untuk analisis fitokimia bahan yang digunakan terdiri dari daun pegagan segar, kloroform, amoniak, H 2 SO 4 , pereaksi Dragendorf, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, metanol, air, etanol, eter, pereaksi Liebermen Burchard dan FeCl 3 . Bahan yang digunakan untuk analisis bahan aktif terdiri dari etanol p.a, metanol, asetonitrit, toluene, oli vacuum dan silica gel 60F 254. Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari alat yang digunakan untuk melakukan ekstraksi yang terdiri dari ekstraktor destilasi, rotavapor, blender, eksikator, oven, kertas dan kain saring. Untuk analisis fitokimia dan analisis bahan aktif, alat yang digunakan terdiri dari Thin Layer Chromatography (TLC) Scanner, cawan porselen, aufhauser, hot plate, labu didih, kondensor, eksikator, oven, tanur, alat pendorong dan hitter mantel. Sumber Pegagan Jenis pegagan yang digunakan pada penelitian ini adalah aksesi Bojolali yang berasal dari kebun percobaan Balittro, Gunung Putri, Cipanas yang ditanam pada hamparan terbuka pada kondisi tanah yang seragam. Lokasi kebun tersebut berada pada ketinggian 1500 m dpl. Pegagan yang digunakan pada penelitian ini berumur lebih kurang 90 hari dan telah dipanen beberapa kali. Penyiapan Bahan Ekstrak dan Skrining Penyiapan bahan ekstrak diawali dengan pemanenan pegagan yang dilakukan pada pagi hari dan selanjutnya segera dilakukan penyortiran di lokasi untuk menghindari kerusakan bahan baku pegagan. Kegiatan penyortiran yang dilakukan adalah memisahkan tanaman pegagan menjadi 3 bagian yaitu daun, tangkai daun dan keseluruhan bagian tanaman (kecuali stolon dan akar). Selanjutnya bagian tanaman yang telah disortir tersebut dimasukkan ke dalam kantong plastik yang terpisah. Jumlah masing-masing bagian tanaman pegagan tersebut adalah sebanyak 3 kg. Sebelum diekstraksi, terlebih dahulu pegagan tersebut dicuci ringan agar tidak banyak zat gizi yang hilang. Setelah pencucian selanjutnya dilakukan pemeriksaan fitokimia untuk mengetahui mutu awal dari pegagan dalam keadaan segar. Ekstraksi dan Maserasi Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengektraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua pelarut diuapkan dan serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Proses ekstraksi bahan nabati atau tumbuhan dapat dilakukan berdasarkan teori penyarian. Penyarian merupakan suatu proses pemindahan massa dari bahan ke cairan penyari. Beberapa metode penyarian antara lain: maserasi, perkolasi, dan soxhletasi. Maserasi merupakan proses penyarian yang paling sederhana dan banyak digunakan untuk menyari bahan obat yang berupa serbuk simplisia halus. Simplisia ini direndam dalam cairan penyari sampai meresap dan melemahkan susunan sel sehingga zat-zat akan larut. Serbuk simplisia yang akan disari ditempatkan dalam wadah atau bejana bermulut besar, ditutup rapat kemudian dikocok berulang-ulang sehingga memungkinkan pelarut masuk ke seluruh permukaan serbuk simplisia. Masing-masing bagian pegagan sebanyak 3 kg dicampur dengan pelarut air (aquades) untuk mendapatkan ekstrak air, dan pelarut etanol 70% untuk mendapatkan ekstrak etanol dengan perbandingan 1 bagian daun dan 5 bagian Bahan baku segar, disortasi (daun, tangkai daun, gabungan) Pencucian (Air) Ekstraksi Aquadest Penghancuran 4 jam, 250-500 rpm Maserasi Penyaringan Bahan: Pelarut = 1:5 Etanol Penghancuran Pengadukan Analisis mutu awal (analisis proksimat, skrining fitokimia, analisis bahan aktif, analisis mineral) Pengadukan Maserasi Ampas Penyaringan Filtrat Filtrat Penguapan (rotavapor) Penguapan (rotavapor) Ekstrak kental (oleoresin) Ekstrak kental (oleoresin) Analisis mutu Analisis mutu Pengujian pada tikus Gambar 7 Diagram alir pembuatan ekstrak pegagan pelarut, lalu dihancurkan dengan menggunakan blender. Kemudian masingmasing campuran tersebut diekstrak (diaduk) selama 4 jam. Setelah 4 jam, mixer dimatikan dan didiamkan (dimaserasi) selama 24 jam, lalu disaring secara bertahap menggunakan kain dan kertas saring. Hasil saringan berupa filtrat selanjutnya diuapkan menggunakan alat rotavapor pada 60 oC sehingga dihasilkan ekstrak kental. Selanjutnya ekstrak kental tersebut dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer. Kemudian dilakukan analisis kandungan bahan aktif pada masing-masing ekstrak dengan menggunakan TLC Scanner. Dua jenis ekstrak dari bagian tanaman yang mempunyai kandungan bahan aktif asiatikosida yang paling tinggi dipilih sebagai bahan uji untuk diuji ke tikus model. Semua proses dilakukan sesuai dengan prosedur standar Laboratorium Balittro. Diagram alir penyiapan ekstrak disajikan pada Gambar 7. Variabel yang Diukur Analisis Fitokimia Analisis fitokimia dilakukan berdasarkan Harborne (1987) untuk mengetahui mutu awal dari pegagan segar. Alasan lain melakukan analisis fitokimia ialah untuk menentukan ciri senyawa aktif (Harborne, 1996). Identifikasi yang dilakukan adalah uji alkaloid, tannin, flavonoid, saponin, steroid, dan triterpenoid. Uji Alkaloid: Sebanyak 1 gram daun digerus dan ditambahkan 1,5 mL kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 5 tetes H 2 SO 4 2M. Fraksi asam dibagi menjadi 3 tabung kemudian masing-masing ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner. Uji Flavonoid dan Fenolik Hidrokuinon. Sebanyak 1 g contoh ditambah metanol 30% sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditaruh kedalam spot plate (papan uji) dan kemudian ditambahkan NaOH 10% (b/v) atau H2SO4 pekat. Terbentuknya warna merah karena penambahan NaOH menunjukkan adanya senyawa fenolik hidrokuinon sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan adanya flavonoid. Uji Saponin: Setengah gram daun ditambahkan air secukupnya dan dipanaskan selama lima menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok selama ± 10 menit. Timbulnya busa yang bertahan lebih dari 10 menit menunjukkan adanya saponin. Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 2 g contoh ditambah 25 mL etanol 30% lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambah eter. Lapisan eter dipipet dan diujikan pada spot plate dengan menambahkan pereaksi Liebermen Buchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid. Uji Tannin: Lima gram daun ditambahkan air kemudian dididihkan selama beberapa menit. Disaring dan filtrat ditambahkan dengan 3 tetes FeCl3. Warna biru tua atau hitam kehijauan yang terbentuk menunjukkan adanya tanin. Analisis Proksimat Analisis proksimat merupakan analisis kandungan makro zat dalam suatu bahan makanan. Analisis proksimat dilakukan dengan menggunakan metode grafimetri dan untuk analisis kadar abu dan abu tak larut asam dilanjutkan dengan menggunakan alat Muffel Furnase. Analisis kadar sari yang terlarut dalam air dan alkohol juga dilakukan dengan menggunakan metode grafimetri. Analisis Kadar Air Analisis kadar air dilakukan untuk mengukur banyaknya kadar air yang terkandung di dalam bahan yang dianalisis yang dinyatakan dalam persen. Penentuan kadar air dalam bahan uji dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu metode pengeringan dengan oven biasa, metode destilasi, metode kimia dan metode khusus (kromatografi dan nuclear magnetic resonance/NMR). Pada penelitian ini pengujian kadar air dilakukan dengan metode aufhauser. Sepuluh gram pegagan segar dihaluskan dan selanjutnya dimasukkan ke dalam labu didih 250 mL. seluruhnya. Ditambah toluena hingga bahan terendam Labu didih tersebut dihubungkan dengan alat aufhauser dan kondensor yang dipasang secara seri. Labu dipanaskan di atas hot plate selama 3 jam, selanjutnya didinginkan. Setelah dingin, tetesan air yang menempel di dinding kondensor dan di dinding alat aufhauser didorong dengan menggunakan alat pendorong hingga air berada di dalam leher skala alat aufhauser. Selanjutnya dilakukan pembacaan skala yang menunjukkan jumlah mL air yang dihasilkan. Kadar air adalah volume air yang dihasilkan (mL) dibagi dengan bobot contoh, dikali dengan 100%. Kadar Abu Penentuan abu total digunakan untuk berbagai tujuan, yaitu selain sebagai parameter nilai gizi dalam bahan makanan juga untuk mengetahui baik tidaknya suatu proses pengolahan, serta untuk mengetahui jenis bahan yang digunakan. Pengukuran kadar abu bertujuan untuk mengetahui besarnya kandungan mineral yang terdapat dalam bahan uji. Mineral sebagai senyawa anorganik dapat ditetapkan dengan cara pengabuan. Pembakaran akan menghancurkan senyawasenyawa organik ke dalam bentuk gas yang mudah terbang, sedangkan mineral sebagai senyawa anorganik akan tinggal dalam bentuk abu yang kadarnya dapat diketahui melalui penimbangan. Terlebih dahulu cawan porselen dipanaskan selama 15 menit di dalam oven. Selanjutnya didinginkan dalam eksikator selama 15-20 menit, lalu ditimbang bobot cawan kosong. Ke dalam cawan kosong ditambah contoh sebanyak 2 gram, lalu dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 400 oC dan setelah asapnya hilang suhu dinaikkan menjadi 800 oC dan didiamkan selama 5-8 jam. Selanjutnya didiamkan di dalam eksikator lalu ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu adalah berat cawan kosong yang ditambah contoh setelah dipanaskan dikurangi dengan berat cawan kosong, dibagi dengan berat contoh, dikali 100%. Kadar Sari Larut dalam Air Pengukuran sari larut dalam air dilakukan untuk mengetahui seberapa banyak komponen dalam bahan uji yang terlarut dalam air. Lima gram bahan contoh dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. Selanjutnya ditambahkan kloroform-air dengan perbandingan 1:1 sebanyak 1/3 volume labu ukur. Didiamkan selama 24 jam dan sesekali dikocok. Dihimpitkan dengan kloroformair hingga batas tera, lalu disaring dengan kertas saring kasar. Filtratnya dipipet sebanyak 25 mL, dimasukkan ke dalam cawan penguap lalu diuapkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama 3-4 jam. Didinginkan dalam eksikator selama 20 menit, lalu ditimbang sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air adalah berat cawan kosong yang ditambah dengan contoh setelah dipanaskan dikurangi dengan berat cawan kosong, dibagi dengan berat contoh, dikali dengan faktor pengeceran, dikali dengan 100%. Kadar Sari Larut dalam Alkohol Pengukuran kadar sari yang larut dalam alkohol dilakukan untuk mengetahui seberapa banyak komponen dalam bahan uji yang terlarut dalam alkohol. Lima gram bahan contoh dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. Selanjutnya ditambahkan alkohol 96% sebanyak 1/3 volume labu ukur. Didiamkan selama 24 jam dan sesekali dikocok. Dihimpitkan dengan alkohol sampai tanda tera, lalu disaring dengan kertas saring kasar. Filtratnya dipipet sebanyak 25 mL, dimasukkan ke dalam cawan penguap lalu diuapkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama 3-4 jam. Didinginkan dalam eksikator selama 20 menit, lalu ditimbang sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam alkohol adalah berat cawan kosong yang ditambah dengan contoh setelah dipanaskan dikurangi dengan berat cawan kosong, dibagi dengan berat contoh, dikali dengan faktor pengeceran, dikali dengan 100%. Analisis Kandungan Kimia Pegagan Analisis kimia yang dilakukan terhadap bahan segar dan ekstrak pegagan terdiri dari analisis kadar mineral (K, Na, Mg, Ca, Cu, Zn, Fe, Mn dan P) dan analisis bahan aktif (asiatikosida) dengan metoda TLC Scanner. Analisis Mineral Analisis mineral dilakukan dengan metoda Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) yang merupakan salah satu teknik analisis untuk mengukur jumlah unsur berdasarkan jumlah energi cahaya yang diserap oleh unsur tersebut dari sumber cahaya yang dipancarkan. Prinsip kerja alat ini berdasarkan penguapan larutan sampel, kemudian logam yang terkandung di dalamnya diubah menjadi atom bebas. Atom tersebut mengabsorpsi radiasi dari sumber cahaya yang dipancarkan dari lampu katoda (hollow cathode lamp) yang mengandung unsur yang akan dianalisis. Banyaknya penyerapan radiasi kemudian diukur pada panjang gelombang tertentu menurut jenis unsur yang dianalisis. Pengolahan dan Analisis Data Setiap data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dan dianalisis secara diskriptif dengan kaidah yang telah ditetapkan guna menjawab pertanyaan dan tujuan yang telah ditetapkan. Pengolahan dan analisis data dilakukan secara bertahap yang diawali dengan pengumpulan dan entri data. Penelitian 2. Pengujian Ekstrak Pegagan pada Hewan Model Tujuan: Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun pegagan terhadap pertambahan bobot badan, asupan pakan, gambaran darah, aktivitas dan fungsi kognitif pada tikus. Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari ekstrak etanol dan ekstrak air pegagan, tikus jantan breed Wistar yang berumur lebih kurang 2 bulan sebanyak 40 ekor, sonde lambung, kandang dan peralatannya serta maze model Multiple T yang telah dimodifikasi. Pakan tikus yang digunakan adalah pakan standar (PT Indofeed) yang sesuai dengan status fisiologis hewan coba. Kandungan nutrisi pakan yang diberi untuk semua tikus disajikan pada Tabel 5. Sebelum dimulai penelitian, semua tikus terlebih dahulu diadaptasi dengan pakan yang digunakan dalam penelitian ini selama 7 hari. Selama masa adaptasi, pakan dan air minum diberi secara ad libitum dan pada masa perlakuan jumlah pakan yang diberi adalah sebanyak 10% dari bobot badan. Setiap tikus dari masing-masing perlakuan diberi kesempatan untuk memperoleh pakan dan minuman secara bebas. Pakan diberi dalam wadah khusus dan terhindar dari pencemaran. Bentuk kandang yang digunakan adalah bentuk kandang kelompok yang terpisah, yang dilengkapi dengan wadah pakan, minuman, dan tempat penampungan kotoran. Tabel 5 Kandungan nutrisi pakan tikus Komposis nutrisi Protein Lemak Serat Abu TDN Ca:P Kandungan 23% 4% 5% 9% 2 650 ME/kkal 1:0,8 Penentuan Level Pegagan Penentuan level yang digunakan mengacu kepada jumlah pegagan yang layak dikonsumsi per hari, dan juga berdasarkan kepada level yang telah digunakan oleh peneliti sebelumnya. Level yang pernah digunakan oleh peneliti sebelumnya tidak mengacu kepada kandungan bahan aktifnya. Level yang digunakan adalah berdasarkan gram bahan ekstrak per kg bobot badan hewan coba. Level pemberian oral yang telah pernah dicoba berkisar antara 0,5 – 300 mg per kg bobot badan dengan lama pemberian paling sedikit satu kali dan paling lama 4 bulan. Rao et al. (2006) menggunakan level 0,158 – 0,474 mg ekstrak daun segar per kg bobot badan per hari untuk melihat pengaruhnya terhadap pertumbuhan neuron dendritik hipokampus CA3. Dilaporkan bahwa level tertinggi dengan waktu pemberian yang paling lama memberi pengaruh yang lebih baik terhadap pertumbuhan neuron dendritik dibandingkan dengan level rendah dengan waktu pemberian yang singkat (Rao et al. 2006). Oleh karena terdapat variasi level yang sangat tinggi, maka pada penelitian ini terlebih dahulu dilakukan penelitian pendahuluan untuk mendapatkan level yang tepat. Setelah diperoleh level yang tepat, selanjutnya ditetapkan 4 level perlakuan yaitu level 0 (kontrol), 100, 300 dan 600 mg ekstrak/kg bobot badan yang diuji pada tikus selama 8 minggu. Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok yang terdiri dari satu perlakuan pada empat tingkatan level dan lima ulangan. Desain penelitian dimaksud seperti disajikan Gambar 8. Unit percobaan terdiri dari 40 ekor tikus yang berumur lebih kurang 2 bulan yang diuji dengan ekstrak air dan ekstrak etanol pegagan. Pengujian ekstrak air dan etanol dilakukan pada waktu yang berbeda. Tikus n = 40 ekor Ekstrak Air Ekstrak Etanol Kontrol 0 mg/kg BB n=5 Kontrol 0 mg/kg BB n=5 Level 1 100 mg/kg BB n=5 Level 1 100 mg/kg BB n=5 Level 2 300 mg/kg BB n=5 Level 2 300 mg/kg BB n=5 Level 3 600 mg/kg BB n=5 Level 3 600 mg/kg BB n=5 Gambar 8 Desain penelitian Untuk mendapatkan validitas eksternal yang tinggi maka masing-masing set percobaan (kontrol dan perlakuan) didesain atas 5 ulangan. Hewan percobaan dan ekstrak pegagan diperoleh dari sumber yang seragam sehingga dapat mengurangi pengaruh variabel lain selain variabel yang diteliti atau variabel perlakuan. Penempatan tikus di masing-masing set percobaan didasarkan kepada pola aktivitasnya yaitu aktif dan tidak aktif. Tikus-tikus yang aktif dan tidak aktif ditempatkan pada masing-masing set percobaan secara acak sehingga semua tikus dari masing-masing blok tersebut mendapat kesempatan yang sama terhadap setiap set percobaan. Ekstrak pegagan diberi secara oral dengan menggunakan sonde lambung dan ekstrak tersebut terlebih dahulu dilarutkan dengan air suling dalam volume yang sama yaitu 1 mL untuk setiap set percobaan. Untuk kelompok kontrol juga diberi air suling sebanyak yang diberi atau yang digunakan pada kelompok perlakuan yaitu 1 mL. Variabel yang Diukur Konsumsi Pakan Total pakan yang dikonsumsi diukur pada setiap harinya dan direkap dalam asupan mingguan. Rata-rata konsumsi pakan per ekor tikus per hari pada masing-masing kelompok percobaan adalah total pakan yang dikonsumsi dibagi dengan jumlah tikus pada masing kelompok percobaan dan selang waktu pengukuran (g/ekor/hari). Bobot Badan Penimbangan bobot badan masing-masing tikus dilakukan pada setiap 2 hari dengan menggunakan timbangan standar. Pertambahan bobot badan harian (g/hari) adalah total bobot badan dikurangi dengan bobot badan awal kemudian dibagi dengan selang waktu pengukuran. Aktivitas dan Tingkah Laku Pengamatan aktivitas dan tingkah laku dilakukan terhadap semua tikus. Kategori aktivitas dibagi atas 4 kategori dengan memberi skor 1-4 yaitu sangat aktif = 4; aktif = 3; kurang aktif = 2 dan tidak aktif = 1. Diskripsi untuk masingmasing skor kategori adalah sebagai berikut: Sangat Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze secara terus-menerus melakukan aktivitas membaui dan berjalan, memanjat dinding T-maze dan mencapai titik finish kurang dari 5 menit. Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze secara terus-menerus melakukan aktivitas membaui dan berjalan, memanjat dinding T-maze namun tidak mencapai titik finish. Kurang Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze, aktivitas membaui dan berjalan dilakukan berkisar 0,5 menit, memanjat dinding Tmaze jarang dilakukan, selanjutnya diam dan tidak mencapai titik finish. Tidak Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze, aktivitas membaui dan berjalan dilakukan berkisar 0,5 menit, memanjat dinding Tmaze tidak dilakukan, selanjutnya diam dan tidak mencapai titik finish. Pengamatan dilakukan dengan selang waktu 2 hari sekali dengan menggunakan metoda modifikasi Multiple T-maze (http://www.ratbehavior.org) (Gambar 9). Gambar 9 Model modifikasi multiple T-maze (http://www.ratbehavior.org) Data yang diamati adalah waktu yang dibutuhkan untuk melewati alat tersebut, persentase tikus yang mencapai titik finish serta data aktivitas dan tingkah laku lainnya yang mungkin muncul selama percobaan tersebut berlangsung. Analisis Darah Rutin Analisis darah rutin terdiri dari pemeriksaan differensial leukosit, kadar Hb, Packet Cell Volume (PCV), benda darah putih (BDP) dan benda darah merah (BDM). Pemeriksaan darah rutin ini dilakukan terhadap semua tikus dari masingmasing blok perlakuan yang dilakukan. Pemeriksaan darah rutin ini dilakukan setelah hewan coba dikorbankan. Pengolahan dan Analisis Data Setiap data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dan dianalisis secara statistik dengan kaidah yang telah ditetapkan guna menjawab pertanyaan dan tujuan yang telah ditetapkan. Pengolahan dan analisis data dilakukan secara bertahap yang diawali dengan pengumpulan dan entri data. Untuk melihat perbedaan antar kelompok perlakuan digunakan analisis varian (ANOVA). Untuk mengetahui perbedaan antar kelompok perlakuan dilanjutkan dengan uji beda Duncan. Penelitian 3. Analisis Morfologi Hipokampus Tujuan: Mendapatkan data tentang pengaruh pemberian ekstrak daun pegagan terhadap gambaran morfologi hipokampus tikus. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari jaringan otak yang telah difiksasi dengan paraformaldehid 4%, antibodi PGF, antibodi monoclonal anti human calbindin (Novocastra. Lab), antibodi anti-tumor necrosis factor/TNF (Boster (Boster Biological Technology Ltd), antibodi anti-C-reactive protein/CRP (Boster (Boster Biological Technology Ltd), antibodi poliklonal anti-dopamine (Abcam Inc), antibodi anti- glial fibrillary acidic protein (GFAP), antibodi anti-vimentin (VIM), antibodi anti-desmin (DES), antibodi serotonin, antibodi toludin, larutan untuk dehidrasi, larutan untuk clearing, parafin, mikrotom dan mikroskop. Penyiapan Preparat Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) Pewarnaan HE dilakukan untuk mengamati struktur umum jaringan otak. Tahapan yang dilakukan dalam pewarnaan ini dimulai dengan deparafinisasi, yaitu penghilangan parafin dengan memasukkan preparat ke dalam larutan xylol III, II, I secara berseri. Tahap selanjutnya adalah rehidrasi, yaitu dengan memasukkan jaringan otak ke dalam larutan alkohol absolut sampai dengan alkohol 70% secara berseri. Selanjutnya jaringan otak direndam di dalam air keran, kemudian di dalam aquadest. Jaringan otak selanjutnya diwarnai dengan pewarna hematoxylin dan dilanjutkan dengan perendaman dalam aquadest. Selanjutnya jaringan otak diwarnai dengan menggunakan eosin alcohol, dan dilanjutkan dengan perendaman kembali dalam aquadest. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat serta penjernihan (clearing) dengan menggunakan xylol. Selanjutnya jaringan otak ditutup dengan cover glass (mounting). Pewarnaan Immunohistokimia Pewarnaan immunohistokimia diawali dengan memasukkan preparat jaringan otak ke dalam inkubator 65 oC selama 5 menit dan selanjutnya didinginkan pada suhu kamar lebih kurang selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan deparafinisasi secara berseri dimulai dari xylol III sampai dengan xylol I masing-masing 3 menit. Berikutnya dilakukan rehidrasi secara berseri dimulai dari alkohol absolut III sampai dengan alkohol absolut I dan alcohol teknis 96% sampai dengan alcohol teknis 70%, dan kemudian preparat direndam di dalam dionize water masing-masing 10-15 menit. Langkah selanjutnya adalah menghilangkan peroksidase endogen pada preparat dengan cara mencelupkan preparat dalam 50 mL larutan metanol yang dicampur dengan 0,5 mL H 2 O 2 dalam keadaan gelap selama 15 menit. Penghilangan peroksidase harus dilakukan dengan segera, kalau terlambat hasilnya positif semua. Selanjutnya preparat dicuci dengan distilled water (DW) sebanyak 2 kali masing-masing 5-10 menit, dilanjutkan mencuci dengan phosphate buffer saline (PBS) sebanyak 2 kali masing-masing 5-10 menit. Preparat selanjutnya diinkubasi dengan normal serum (10% dalam PBS) selama 30-60 menit untuk memblok antigen non spesifik agar tidak mengacaukan reaksi. Setelah itu, preparat dicuci kembali dengan menggunakan PBS sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit. Langkah berikutnya preparat diinkubasi dengan antibodi primer yang telah ditetapkan pada suhu 4°C (disimpan di dalam refrigerator) selama 1-2 malam. Selanjutnya dikeluarkan dari refrigerator dan dibiarkan pada suhu kamar lebih kurang 1 jam, kemudian dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali masing-masing 10 menit. Langkah berikutnya preparat diinkubasi dalam antibodi sekunder dako envision peroxydase system (DEPS) (50-60 µl/preparat pada suhu 37 oC dalam keadaan gelap selama 30-60 menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit. Kemudian divisualisasi dengan diaminobenzidin (DAB) 10 mg dalam 50 mL tris buffer dan 50 µl H 2 O 2 . Selanjutnya dicuci dengan DW (stoping point). Jika dianggap perlu dapat juga dilakukan counterstain dengan hematoxylin. Langkah akhir pewarnaan ini adalah dehidrasi, clearing, dan mounting. Variabel yang Diukur Data yang diamati pada penelitian ini adalah sel-sel yang positif terhadap masing-masing antibodi yang digunakan dan juga kepadatan sel-sel astrosit. Pengolahan dan Analisis Data Setiap data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dan dianalisis secara diskriptif dengan kaidah yang telah ditetapkan guna menjawab pertanyaan dan tujuan yang telah ditetapkan. 55 HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian 1. Penyiapan Ekstrak Pegagan dan Analisis Kandungan Zat Gizi Hasil Analisis Kualitatif Komponen Kimia Pegagan Segar Fitokimia atau kimia tumbuhan telah berkembang menjadi disiplin ilmu tersendiri, berada diantara kimia organik bahan alam dan biokimia tumbuhan, serta berkaitan erat dengan keduanya. Bidang perhatian fitokimia adalah keanekaragaman senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh tumbuhan, yaitu mengenai struktur kimia, biosintesis, perubahan serta metabolismenya, penyebaran secara alamiah dan fungsi biologis. Analisis fitokimia atau uji fitokimia merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik seperti alkaloid, senyawa fenol (termasuk flavonoid), steroid, saponin, dan terpenoid. Uji ini sangat bermanfaat untuk memberikan informasi jenis senyawa kimia yang terdapat pada tumbuhan. Senyawa-senyawa ini merupakan metabolit sekunder yang mungkin dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat. Analisis ini merupakan tahapan awal dalam isolasi senyawa bahan alam sehingga menjadi panduan bersama-sama dengan uji aktivitas biologis senyawa tersebut. Salah satu tujuan pengelompokan senyawa-senyawa aktif ini adalah untuk mengetahui hubungan biosintesis dan famili tumbuhan. Informasi ini sangat berguna bagi ahli sintesis kimia organik untuk memprediksi senyawa aktif tersebut sehingga dapat lebih berkhasiat. Tanaman yang diuji fitokimianya dapat berupa tanaman segar, kering yang berupa rajangan, serbuk, ekstrak atau dalam bentuk sediaan (Harborner, 1996). Uji fitokimia yang dilakukan berdasarkan pada reaksi yang menghasilkan warna atau endapan. Selama bertahun-tahun uji warna sederhana dan reaksi tetes dikembangkan untuk menunjukkan adanya senyawa tertentu atau golongan tertentu karena sudah terbukti khas dan peka. Uji fitokimia masih sering digunakan dalam pencirian senyawa karena mudah dan tidak memerlukan peralatan yang rumit akan tetapi kadang kala tidak dapat memberikan hasil yang memuaskan (Harborner, 1996). Hasil analisis fitokimia secara kualitatif terhadap masing-masing bagian pegagan segar aksesi Boyolali disajikan pada Tabel 6. Dipilihnya aksesi Boyolali dalam penelitian ini karena aksesi ini merupakan salah satu dari nomor harapan yang mempunyai potensi hasil dan mutu yang baik dan telah direkomendasikan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik, Cimanggu Bogor. Bermawie et al. (2008) dan Nugroho (2009) melaporkan bahwa terdapat keragaman pada sifat morfologi kualitatif dan kuantitatif antar aksesi dan masing-masing aksesi mempunyai keunggulan yang berbeda. Data pada Tabel 6 menunjukkan bahwa secara kualitatif daun, tangkai daun dan campuran tanaman pegagan mengandung senyawa alkaloid yang sama kuatnya. Alkaloid merupakan golongan zat tumbuhan sekunder yang terbesar, pada umumnya mencakup senyawa yang bersifat basa dan mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan sebagai bagian dari sistem siklik. Banyak alkaloid bersifat terpenoid dan yang lainnya berupa senyawa aromatic yang mengandung gugus basa sebagai gugus rantai samping. Fungsi alkaloid dalam tumbuhan masih sangat kabur, meskipun masing-masing senyawa telah dinyatakan terlibat sebagai pengatur tumbuh, penghalau atau penarik serangga (Harborner, 1996). Senyawa alkaloid juga bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan parasit plasmodium falciparum (Lusiana 2009) dan anti mikroba (Kurniasari 1999) Flavonoid di bagian daun, tangkai daun dan campuran tanaman pegagan juga ditemukan dalam kualitas yang sama yaitu positif lemah. Berdasarkan strukturnya, semua flavonoid merupakan turunan senyawa induk flavon yang terdapat berupa tepung putih dan semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama. Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air dan dapat diekstrak dengan etanol 70%. Flavonoid berupa senyawa fenol, sehingga warnanya berubah bila ditambah basa atau ammonia. Flavonoid umumnya terdapat dalam tumbuhan yang berpembuluh, dan terikat pada gula sebagai glikosida serta aglikon flavonoid yang manapun yang mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida (Harborner, 1996). Fungsi flavonoid adalah sebagai antioksidan penangkap radikal bebas, dan kemampuan daya antioksidan dari setiap isolat adalah berbeda (Sunarni et al. 2007). Zainol et al. (2008) melaporkan bahwa bagian yang berbeda dari pegagan menghasilkan kandungan fitokimia yang berbeda pula. Keberadaan senyawa flavonoid dan senyawa fenolik lainnya di dalam pegagan sangat penting karena mempunyai efek multifungsi dengan donor hidrogen yang efektif (Zainol et al. 2003) dan juga sebagai antioksidan yang kuat (Hussin et al. 2007). Keberadaan flavonoid di dalam daun kemungkinan dipengaruhi oleh proses fotosintesis sehingga pada daun muda tidak banyak ditemukan senyawa tersebut. Keberadaan senyawa alkaloid dengan senyawa fenol dan terpenoid memberikan efek biologis yang baik dari tanaman ini (Rajkumar & Jebanesan 2005). Tabel 6 Kandungan fitokimia dari masing-masing bagian pegagan No Senyawa 1 Alkaloid 2 Saponin 3 Tanin 4 Fenolik 5 Flavonoid 6 Triterpenoid 7 Steroid 8 Glikosida Keterangan: + ++ +++ Daun ++ + + + Hasil pemeriksaan Tangkai Daun Campuran ++ ++ + + +++ +++ + + : Negatif : Positif lemah : Positif : Positif kuat Hasil analisis juga menunjukkan bahwa kandungan steroid di bagian daun lebih lemah (+) dibandingkan dengan bagian tangkai daun (+++) dan keseluruhan tanaman (+++). Steroid adalah molekul kompleks yang larut di dalam lemak dengan empat cincin yang saling bergabung. Steroid yang paling banyak dijumpai adalah sterol yang merupakan steroid alkohol (Lehninger 1982). Sterol adalah triterpena yang kerangka dasarnya adalah sistem cincin siklopentana perhidrofenantrena. Sterol yang terdapat pada tumbuhan tinggi terdapat dalam bentuk bebas dan sebagai glukosida sederhana (Harborne 1996). Kandungan steroid pada tanaman pegagan juga dipengaruhi oleh tingkat naungan. Pegagan yang ditanam di bawah naungan 55% lebih banyak mengandung steroid dibanding dengan naungan 65% (Musyarofah et al. 2007). Di samping tingkat naungan, ketersedian unsur hara juga berpengaruh terhadap kandungan steroid (Kristina et al. 2009). Hasil analisis terhadap kandungan glikosida di bagian daun, tangkai daun dan campuran tanaman pegagan menunjukkan kualitas yang sama yaitu positif lemah. Kandungan glikosida yang diperoleh dalam penelitian ini berbeda dengan laporan sebelumnya yang menyebutkan bahwa glikosida di dalam pegagan terdeteksi sangat kuat (++++) (Kristina et al. 2009; Nugroho 2009; Bermawie et al. 2008). Untuk senyawa saponin, tanin, fenolik dan triterpenoid tidak terdeteksi secara kualitatif. Samy et al. (2011), melaporkan bahwa tannin dan flavonoid tidak terdeteksi pada analisis fitokimia. Sementara Kristina et al. (2009) melaporkan bahwa senyawa tersebut terdeteksi pada analisis fitokimia. Tidak terdeteksinya senyawa tersebut dalam proses pengujian fitokimia dapat disebabkan karena jumlah material yang dianalisis tidak mencapai jumlah minimal yang dibutuhkan di dalam bahan yang dianalisis (Zainol et al. 2008), asal bahan yang berbeda, dan mungkin juga karena waktu pengambilan sampel yang berbeda. Kandungan Zat Gizi Pegagan Segar Hasil analisis kandungan zat gizi dari pegagan segar secara rinci disajikan pada Tabel 7. Tabel 7 Hasil analisis kandungan zat gizi pegagan segar No 1 2 3 4 5 6 7 Jenis Pemeriksaan Kadar air Kadar abu Kadar abu tak larut asam Kadar sari dalam air Kadar sari dalam alkohol Kadar serat Kadar Protein Daun 88,13 1,27 0,05 3,20 2,65 1,85 16,27 Hasil analisis (%) Tangkai Daun Daun + T. Daun 88,39 87,15 1,01 1,31 0,11 0,03 5,14 4,25 3,67 4,18 2,45 2,19 14,49 7,01 Kadar Air Kadar air merupakan salah satu karakteristik yang sangat penting pada bahan pegagan karena kandungan air dalam bahan pangan menentukan acceptability (penerimaan), kesegaran dan daya tahan bahan pangan (Winarno 1997). Kadar air yang tinggi mengakibatkan mudahnya bakteri, kapang dan khamir untuk berkembang biak, sehingga akan terjadi perubahan pada bahan Buckle et al. (2007). Menurut Pramono (2005) jika kadar air dalam bahan masih tinggi dapat mendorong enzim melakukan aktivitasnya mengubah kandungan kimia yang ada dalam bahan menjadi produk lain yang mungkin tidak lagi memiliki efek farmakologi seperti senyawa aslinya. Hasil analisis kadar air pada pegagan segar berkisar antara 87-88%, dan bagian daun serta tangkai daun mempunyai persentase sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan keseluruhan bagian tanaman. Nurjanah (2008) melaporkan bahwa terdapat perbedaan kadar air pada tanaman pegagan dari aksesi yang berbeda. Kadar air tertinggi dijumpai pada aksesi Cilember (87,25%) dan terendah pada aksesi Smukren (75,18%), sedangkan aksesi Boyolali 81,45%. Data ini menunjukkan bahwa terdapat variasi pada nilai kadar air meskipun dari aksesi yang sama. Afrida (2009) melaporkan bahwa tanaman pegagan yang dipupuk dengan fosfor tidak memberi pengaruh terhadap kandungan kadar air. Kadar Abu Abu adalah zat anorganik sisa hasil pembakaran suatu bahan organik. Penentuan abu total digunakan untuk berbagai tujuan, yaitu selain sebagai parameter nilai gizi dalam bahan makanan juga untuk mengetahui baik tidaknya suatu proses pengolahan, serta untuk mengetahui jenis bahan yang digunakan. Penentuan kadar abu dilakukan dengan cara mengoksidasikan semua zat organik pada suhu yang tinggi, yaitu sekitar 600 oC sekitar 3-5 jam dan kemudian dilakukan penimbangan zat yang tertinggal setelah proses pembakaran tersebut dan berat abu yang tertinggal menunjukkan kadar abu (Indrayan et al. 2005). Hasil analisis kadar abu menunjukkan bahwa pada bagian daun dan keseluruhan tanaman mempunyai persentase yang lebih baik dibandingkan dengan pada bagian tangkai daun. Data ini sejalan dengan hasil analisis mineral, bahwa sebagian besar kandungan mineral banyak dijumpai dibagian daun dan keseluruhan tanaman. Hasil analisis kadar abu yang diperoleh pada penelitian ini lebih rendah dibandingkan dengan laporan Odhav et al. (2007). Kadar Protein Protein merupakan makromolekul yang terdiri dari polipeptida yang mempunyai rantai yang amat panjang, tersusun atas banyak unit asam amino. Masing-masing asam amino tersebut dihubungkan oleh suatu ikatan kovalen yang disebut ikatan peptida. Sebanyak dua puluh jenis asam amino berbeda terdapat secara alami dalam protein. Setiap protein dibedakan satu sama lain karena masing-masing mempunyai sekuen unit asam amino sendiri-sendir. Protein dibagi menjadi dua golongan utama yaitu protein globular dan protein serabut. Penggolongan ini berdasarkan bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu. Protein globular rantai atau rantai-rantai polipeptida berlipat rapat-rapat menjadi bentuk globular atau bulat yang padat. Protein globular biasanya larut di dalam air dan hampir semua mempunyai fungsi gerak atau dinamik. Protein serabut bersifat tidak larut di dalam air, merupakan molekul serabut panjang, dengan rantai polipeptida yang memanjang pada satu sumbu dan tidak berlipat menjadi bentuk globular. Hampir semua protein serabut memberikan peranan strukturan atau pelindung (Lehninger 1982). Salah satu cara yang paling banyak digunakan untuk menentukan kandungan protein suatu sediaan tumbuhan adalah berdasarkan reaksi warna antara pereaksi Folin-Ciocalteu dan ikatan polipeptida. Kandungan protein dapat juga ditentukan berdasarkan serapan UV pada panjang gelombang tertentu. Jumlah protein juga dapat dianalisis dengan cara mikro-Kjeldahl, berdasarkan penguraian dengan H 2 SO 4 yang mengandung K 2 SO 4 -CuSO 4 , kemudian titrasi ammonia yang dibebaskan (Harborne 1996). Hasil analisis kandungan protein pada pegagan segar berkisar antara 716%, dan bagian daun serta keseluruhan bagian tanaman mempunyai persentase yang lebih tinggi dibandingkan dengan bagian tangkai daun. Kandungan protein yang diperoleh pada penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan laporan Odhav et al. (2007) dan Kormin (2005). Lailani (2008) melaporkan bahwa kandungan protein total pada tanaman pegagan in vitro lebih tinggi dibanding dengan pegagan lapang. Diduga bahwa perbedaan kandungan protein tersebut karena perbedaan unsur hara pada media atau tanah. Kadar Sari dalam Air dan Sari dalam Alkohol Analisis kadar sari dalam air menunjukkan bahwa persentase tertinggi dijumpai di dalam bagian tangkai daun. Data ini menunjukkan bahwa bagian tangkai daun mempunyai kelarutan yang lebih baik di dalam air dibandingkan dengan dua bagian lainnya. Untuk analisis kadar sari dalam alkohol menunjukkan bahwa persentase tertinggi dijumpai pada keseluruhan bagian tanaman. Data secara keseluruhan menunjukkan bahwa kadar sari dalam air lebih baik dibandingkan dengan kadar sari dalam alkohol. Analisis Mineral Komposisi kandungan zat gizi mempunyai peran penting untuk meningkatkan kesehatan. Data hasil analisis kandungan mineral dan asiatikosida pegagan disajikan pada Tabel 8. Zainol et al. (2008) melaporkan bahwa bagian yang berbeda dari pegagan menghasilkan kandungan fitokimia yang berbeda pula. Laporan tersebut sejalan dengan hasil yang diperoleh dari penelitian ini, dimana di bagian daun kandungan asiatikosida lebih banyak dibandingkan dengan bagian tangkai daun. Hampir semua unsur kimia lebih banyak dijumpai di bagian daun kecuali kandungan K yang lebih banyak dijumpai di bagian tangkai daun. Rasyid et al. (2011) melaporkan bahwa kandungan K pada pegagan segar adalah sebesar 2,19%. Kandungan K tersebut lebih rendah dibandingkan dengan hasil yang diperoleh pada penelitian ini. Perbedaan nilai ini mungkin saja disebabkan karena metoda analisis yang digunakan berbeda atau karena aksesi pegagan yang berbeda. Kandungan asiatikosida di bagian daun juga lebih banyak dibandingkan dengan tangkai daun. Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini sejalan dengan laporan Aziz et al. (2007) yang melaporkan bahwa distribusi asiatikosida lebih banyak dijumpai di bagian daun, dibandingkan akar dan tangkai daun meskipun kandungan asiatikosida juga dipengaruhi oleh jenis pegagan, dan keadaan ini dijumpai pada semua aksesi pegagan (Zainol et al. 2008), demikian juga pada tanaman pegagan hasil kultur jaringan (Kim et al. 2004). Tabel 8 No Data hasil analisis kandungan mineral dan asiatikosida di dalam bagian yang berbeda dari pegagan segar Unsur kimia 1 P 2 K 3 Na 4 Mg 5 Ca 6 Cu 7 Zn 8 Fe 9 Mn 10 Asiatikosida Keterangan: ttd: Tidak terdeteksi Daun 0,0249 2,36 ttd 1,58 2,06 0,0062 0,0091 0,0801 0,0046 2,48 Hasil pemeriksaan (%) Daun+T. Daun Tangkai Daun 0,0139 0,0334 2,72 2,69 ttd ttd 1,49 0,83 2,14 1,00 0,0087 0,0137 0,0055 0,0051 0,0505 0,0660 0,0008 0,0009 2,46 2,39 Kandungan asiatikosida sangat ditentukan oleh asal dan jenis (aksesi) pegagan. Bermawie et al. (2008) melaporkan bahwa kandungan asiatikosida dari 16 aksesi yang dianalisis berkisar antara 0,15-1,49%, kandungan asiatikosida yang tertinggi diperoleh dari pegagan asal Ungaran Jawa Tengah (1,49%) dan Sumedang Jawa Barat (1,37%), sedangkan aksesi Gunung Putri hanya mengandung 0,23%. Kandungan asiatikosida dari pegagan aksesi Gunung Putri yang diperoleh dalam penelitian ini lebih tinggi dari pada yang dilaporkan oleh Bermawie et al. (2008). Bermawie et al. (2008) melaporkan bahwa kandungan asiatikosida pada pegagan aksesi Manoko yang ditanam di Cicurug Sukabumi adalah sebesar 0,15%, sedangkan hasil penelitian Riyadi et al. (2011) melaporkan bahwa kandungan asiatikosida dari pegagan aksesi Manoko yang ditanam di Manoko adalah sebesar 0,66%. Data ini menunjukkan bahwa kandungan asiatikosida juga sangat dipengaruhi oleh tempat penanamannya terutama ketinggian tempat penanamannya. Cicurug dan Manoko adalah dua lokasi yang sangat berbeda ketinggian tempatnya, dimana Cicurug berada pada ketinggian 550 m dpl, sedangkan Manoko berada pada ketinggian 1200 m dpl. Data ini juga mengindikasikan bahwa kandungan asiatikosida di dalam pegagan kemungkinan akan diperoleh secara maksimal jika ditanam di tempat asalnya. Data di atas menunjukkan bahwa kandungan asiatikosida sangat dipengaruhi oleh faktor genetik dan lingkungan. Tabel 9 Hasil analisis proksimat dan komposisi kimia per 100 g bahan segar Kandungan zat gizi Hasil analisis Referensi Kadar air (g) 87,15 ND Kadar abu (g) 1,31 2,06 a; 2,54f Kadar abu tak larut asam (g) 0,03 ND Kadar sari dalam air (g) 4,25 ND Kadar sari dalam alkohol (g) 4,18 ND Kadar serat (g) 2,19 18,33d; 1,92f Protein (g) 14,49 2,4a; 4,58c; 9,94d; 3f 174 a; 1.994,28c; 1.060d; 2.425f Ca (mg) 2.140 17 a; 370d; 327f P (mg) 13,9 345 a K (mg) 2.720 107,8 a Na (mg) ttd Mg (mg) 87 a; 271f 1.490 Fe (mg) 14,86 a; 43,26 c; 32d; 18f 50,5 Zn (mg) 0,97 a; 3,93b; 20f 5,5 Cu (mg) 0,24 a; 0,55 b; 7f 8,7 Cr (mg) 0,046 a NA Mn (mg) 23f 4,6 Asiatikosida ( %) 2,46 1,04e; 0,66c Keterangan: ttd: Tidak terdeteksi NA: Tidak dianalisis ND: Tidak ada data a. Gupta et al, 2005 b. Atukorala & Waidyanatha, 1987 c. Riyadi et al, 2011 d. KIRDI 2009- Laboratory analysis report on Centella asiatica Dalam Kiuru et al. 2010 e. Bermawie et al, 2008 f. Odhav et al, 2007 Kandungan triterpenoid dan steroid juga sangat dipengaruhi oleh tingkat naungan. Meskipun tingkat naungan 75% dapat menghasilkan panjang tangkai daun yang cukup maksimal, namun secara kualitatif, kandungan triterpenoid dan steroid pada jenis pegagan tertentu sangat kuat terdeteksi pada tingkat naungan 25% sedangkan pada jenis pegagan lainnya tingkat naungan tidak mempunyai pengaruh yang negatif (Kurniawati et al. 2005). Hampir semua mineral yang dianalisis paling banyak dijumpai di dalam bagian daun dan keseluruhan tanaman, sedangkan pada bagian tangkai daun semua unsur kimia yang dianalisis juga dijumpai namun jumlahnya lebih sedikit dibandingkan dengan dua bagian tanaman lainnya kecuali terhadap unsur K, Cu dan Fe. Jumlah mineral yang paling banyak dijumpai di dalam bahan segar (daun, tangkai dan keseluruhan tanaman) adalah unsur K dan Ca. Kadar protein juga paling banyak dijumpai di dalam daun dan keseluruhan bagian tanaman, sedangkan kadar asiatikosida relatif sama di semua bagian daun. Perbandingan kandungan antara komposisi kimia hasil analisis seluruh bagian tanaman pegagan segar dengan referensi disajikan pada Tabel 9. Data pada Tabel 9 menunjukkan bahwa terdapat variasi yang cukup tinggi antara hasil analisis dengan data referensi. Perbedaan nilai ini dapat saja terjadi karena perbedaan cara analisis, penanganan pascapanen, asal dan jenis (aksesi) bahan yang digunakan. Kandungan Komposisi Kimia Ekstrak Pegagan Ekstrak merupakan kumpulan senyawa-senyawa dari berbagai golongan yang terlarut di dalam pelarut yang sesuai, termasuk didalamnya senyawasenyawa aktif atau yang tidak aktif (Sidik & Mudahar 2000). Ekstraksi bahan tumbuhan obat dengan pelarut yang sesuai (air, alkohol dan pelarut organik lain) menjadi ekstrak cair atau ekstrak kering banyak dilakukan untuk tujuan standarisasi sediaan obat herba sekaligus memberi keuntungan dari segi formulasi sediaannya (Sinambela 2003). Pemilihan pelarut sangat penting dalam proses ekstraksi sehingga bahan berkhasiat yang akan ditarik dapat tersari secara sempurna. Departemen Kesehatan merekomendasikan air, dan alkohol untuk cairan penyari ekstrak untuk keperluan bahan baku obat tradisional (Farouq 2003). Hasil Analisis Proksimat Ekstrak Kering Hasil analisis proksimat dari ekstrak etanol dan ekstrak air daun pegagan disajikan pada Tabel 10. Tabel 10 Hasil analisis proksimat dari ekstrak kering daun pegagan No 1 2 3 4 5 Jenis pemeriksaan Kadar air Kadar abu Kadar lemak Kadar karbohidrat Protein Hasil pemeriksaan (%) Ekstrak etanol Ekstrak air b/b b/k b/b b/k 2,16 6,44 3,26 3,33 3,21 3,43 2,14 2,19 2,13 2,28 89,82 91,80 85,54 91,43 2,61 2,67 2,68 2,86 Perbandingan hasil analisis proksimat antara basis basah dan basis kering terhadap kadar air, kadar abu, kadar lemak dan protein dari masing-masing ekstrak cenderung tidak terlalu berbeda kecuali terhadap kadar karbohidrat pada ekstrak air. Kadar karbohidrat menunjukkan nilai yang paling tinggi dibandingkan dengan parameter proksimat lainnya, dengan demikian kadar dalam basis kering juga menjadi lebih tinggi dibandingkan dengan nilai pada basis basah. Kadar karbohidrat di dalam ekstrak etanol pada basis basah cenderung lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak air, namun pada basis kering kadarnya cenderung sama karena kadar air dalam ekstrak air cenderung lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol sehingga pengaliannya juga menjadi lebih tinggi. Mineral Berdasarkan hasil analisis dapat diketahui bahwa di dalam bahan ekstrak banyak ditemukan mineral makro dan mikro kecuali unsur Fe dan Cu. Odhav et al. (2007), Gupta et al. (2005) dan Atukorala & Waidyanatha (1987) juga melaporkan bahwa di dalam pegagan banyak dijumpai mineral makro dan mikro seperti Ca, P, K, Na, Mg, Fe, Zn, Cu dan Mn. Manfaat klinis dari pegagan ini mungkin saja bukan hanya karena senyawa asiatikosida tapi juga mungkin karena unsur makro dan mikro mineral tersebut. Linder (2006) melaporkan bahwa makro dan mikromineral memegang peranan penting dalam berbagai reaksi dan sistim metabolisme tubuh. Kadar mineral yang terdapat di dalam bahan ekstrak dipengaruhi oleh jenis pelarut yang digunakan. Semua mineral lebih banyak ditemukan di dalam ekstrak air dibandingkan di dalam ekstrak etanol (Tabel 11), sedangkan kandungan asiatikosida (di dalam daun) cenderung lebih banyak ditemukan di dalam ekstrak etanol (16,03% vs 15,77%) (Tabel 12). Berdasarkan hasil analisis dapat diketahui bahwa di dalam ekstrak air dan etanol tidak ditemukan unsur Fe dan Cu (Tabel 11) sedangkan hasil dari analisis bahan segar, unsur tersebut ada ditemukan (Tabel 8). Artinya, proses ekstraksi kemungkinan dapat menyebabkan hilangnya sebagian dari mineral penting di dalam bahan baku. Unsur Ca dan P di dalam ekstrak ditemukan dalam perbandingan yang ideal, dimana kadar Ca lebih tinggi dibandingkan dengan P kecuali pada ekstrak air kering pada bagian tangkai daun dijumpai dalam imbangan yang tidak ideal (0,19% vs 0,11%). Tabel 11 Kandungan mineral dari ekstrak kering daun pegagan Jenis mineral Fe P K Na Ca Mg Cu Mn Zn Ekstrak air (%) b/b b/k 0 0 0,25 0,27 5,83 6,23 0,0370 0,0396 11,11 11,87 2,07 2,21 0 0 0,0030 0,0032 0,0042 0,0045 Ekstrak etanol (%) b/b b/k 0 0 0,11 0,11 5,09 5,20 0,0294 0,0301 0,78 0,80 1,23 1,26 0 0 0,0012 0,0012 0,0010 0,0010 Kandungan Asiatikosida Kandungan asiatikosida disajikan pada Tabel 12. Kadar asiatikosida dari masing-masing bagian tanaman berkisar antara 15,59-16,44%. Asiatikosida adalah senyawa yang paling aktif dari 3 triterpen lainnya (Maquart et al. 1999) dan merupakan unsur utama dari tanaman pegagan (Zhang et al. 2009). Di dalam pegagan banyak ditemukan senyawa triterpenoid, dan senyawa utama yang mempunyai aktivitas antioksidan yang kuat adalah senyawa asiatikosida (Zainol et al. 2008). Dilaporkan bahwa pemberian pegagan dapat meningkatkan kemampuan memori dan pembelajaran pada tikus muda. Hal ini mungkin saja berhubungan dengan aktivitas antioksidan, anti inflamasi, neuroprotektif, prokolinergik dan anti-kolinergik dari berbagai komponen yang terdapat di dalam tanaman pegagan (Joshi & Parle 2006). Hasil analisis menunjukkan bahwa kandungan asiatikosida di masingmasing bagian tanaman berbeda, dan tertinggi dijumpai di bagian daun. Hasil analisis ini sejalan dengan yang dilaporkan oleh Kim et al. (2004) dan Aziz et al. (2007) bahwa bahwa produksi asiatikosida terutama terjadi di bagian daun. Kandungan asiatikosida dari bagian tanaman yang berbeda disajikan pada Tabel 12. Tabel 12 Kadar asiatikosida dari bahan ekstrak yang berbeda Jenis Bahan Ekstrak etanol kering (daun) Ekstrak air kering (daun) Ekstrak air kental (tangkai) Keterangan: ND (Tidak dianalisis) Kadar asitikosida (%) b/b b/k 16,03 16,38 15,77 16,66 15,59 ND Penelitian 2. Pengujian Ekstrak Pegagan pada Hewan Model Pertambahan Bobot Badan dan Asupan Pakan Selama periode percobaan semua tikus yang diberi ekstrak etanol dan ekstrak air pegagan tidak menunjukkan tanda-tanda sakit dan juga tidak menunjukkan penurunan bobot badan (Gambar 10 dan 11). Respon pertambahan bobot badan harian antar perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Hasil penelitian ini sama dengan Anand et al. (2012) dan Meutia & Ibrahim (2008) tapi tidak sejalan dengan Rao et al. (2006) dan Babu et al. (1995) yang melaporkan bahwa tikus yang diberi pegagan meningkat bobot badannya dibandingkan dengan kontrol. Gambar 10 Kurva pertambahan bobot badan dari masing-masing kelompok yang diberi ekstrak etanol Hasil pertambahan bobot badan yang didapat menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun pegagan tidak mengubah pola pertumbuhan yang terdapat pada kontrol. Kondisi demikian mungkin dapat diartikan bahwa ekstrak etanol pegagan aman terhadap pola pertumbuhan karena tidak berpotensi menurunkan atau menaikkan bobot badan. Pola yang sama juga ditemukan pada pemberian ekstrak air pegagan yang pola pertumbuhannya juga sama, hal ini menegaskan bahwa pemberian ekstrak pegagan tidak merubah pola dasar pertumbuhan hewan coba. Gambar 11 Kurva pertambahan bobot badan dari masing-masing kelompok yang diberi ekstrak air Total asupan pakan antar kelompok perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Hal yang sejalan juga dilaporkan oleh Meutia & Ibrahim (2008). Semua kelompok menunjukkan penurunan asupan mingguan. Tabel 13 Respon pertambahan bobot badan (g) dan asupan mingguan (g) pada perlakuan dengan ekstrak etanol Level (mg ekstrak/kg BB) 0 100 300 (Kontrol) Level 1 Level 2 270 + 25a Bobot Badan Awal (g) 266 + 13a 287 + 42a Bobot Badan Akhir (g) 362 + 32a 369 + 18a 391 + 67a a a Pertambahan BB Harian (g/hr) 1,42 + 0,19 1,59 + 0,34 1,61 + 0,39a a a Asupan Minggu 1 (g) 27,71 + 1,06 21,64 + 2,54 21,96 + 2,07a Asupan Minggu 2 (g) 22,46 + 2,05a 19,36 + 2,01a 21,82 + 2,86a Asupan Minggu 3 (g) 18,43 + 1,77a 17,61 + 2,05a 21,25 + 1,10a Asupan Minggu 4 (g) 18,79 + 3,29a 16,05 + 2,97a 19,50 + 3,26a Asupan Minggu 5 (g) 19,76 + 1,10a 19,57 + 0,90a 21,10 + 1,44a Asupan Minggu 6 (g) 23,76 + 4,78a 25,62 + 3,86a 25,05 + 5,87a Asupan Minggu 7 (g) 22,71 + 7,44a 22,10 + 6,58a 22,29 + 4,97a Asupan Minggu 8 (g) 24,29 + 5,30a 24,57 + 5,44a 24,57 + 6,41a Asupan Minggu 9 (g) 22,56 + 0,51a 22,67 + 1,73a 22,89 + 3,83a Total asupan (g) 145,90+4,64a 137,06+4,59a 145,71+4,05a Keterangan: Huruf superskrip yang sama pada baris yang sama menyatakan tidak (p>0,05). Parameter 600 Level 3 268 + 26a 368 + 42a 1,54 + 0,25a 19,61 + 2,68a 19,00 + 2,20a 19,07 + 1,79a 19,64 + 2,44a 20,38 + 1,15a 24,52 + 5,40a 21,95 + 6,83a 24,24 + 5,65a 20,67 + 1,67a 137,88+4,23a berbeda nyata Pada kelompok kontrol, penurunan asupan mingguan terjadi sampai akhir pengamatan, kelompok level 1 dan 2 sampai minggu kelima sedangkan pada kelompok level 3 sampai minggu ketiga. Untuk kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol (Tabel 13), pada minggu pertama, asupan tertinggi dijumpai pada kelompok kontrol yaitu mencapai 10% dari bobot badan, sedangkan pada kelompok level 1 dan 2 sebesar 8%, dan pada kelompok level 3 sebesar 7% dari bobot badan. Pada minggu ketiga, semua kelompok hanya mengkonsumsi pakan sekitar 6% dari bobot badan. Asupan pakan mingguan dan total asupan antar kelompok perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Kaitan antara total asupan pakan dengan aktivitas tidak menunjukkan hubungan yang linier karena tikus perlakuan level 1 dan 3 mengkonsumsi jumlah pakan yang lebih sedikit dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol dan cenderung sama dengan tikus perlakuan level 2, sedangkan data aktivitas menunjukkan bahwa tikus pada perlakuan level 1, 2 dan 3 lebih aktif dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol. Data ini mengindikasikan bahwa peningkatan aktivitas tikus pada penelitian ini tidak mengakibatkan peningkatan asupan pakan. Pada umumnya, peningkatan aktivitas akan mengakibatkan peningkatan penggunaan energi. Pada penelitian ini, diduga bahwa pemberian ekstrak etanol daun pegagan dapat menyebabkan efisiensi penggunaan energi. Tabel 14 Respon pertambahan bobot badan dan asupan pakan mingguan pada perlakuan dengan ekstrak air Level (mg ekstrak/kg BB) 0 100 300 600 (Kontrol) Level 1 Level 2 Level 3 Bobot Badan Awal (g) 163+22a 162+7a 157+14a 165+17a a a a Bobot Badan Akhir (g) 292+41 315+5 299+15 296+35a a a a Pertambahan BB Harian (g) 2,07+0,38 2,46+0,08 2,29+0,28 2,13+0,41a Asupan Minggu 1 (g) 18,46+0,93a 18,11+0,96a 17,49+0,99a 19,14+1,06a a a a Asupan Minggu 2 (g) 20,69+0,88 20,29+0,76 19,46+0,94 21,97+1,10a a a a Asupan Minggu 3 (g) 22,74+0,70 22,46+0,75 21,74+0,66 23,63+0,78a Asupan Minggu 4 (g) 24,57+0,57a 24,77+0,80a 23,83+0,63a 25,51+0,58a a a a Asupan Minggu 5 (g) 25,19+0,45 26,44+0,32 25,03+0,39 26,04+0,57a a a a Asupan Minggu 6 (g) 25,82+0,59 27,64+0,43 26,04+0,39 26,43+0,40a Asupan Minggu 7 (g) 27,11+0,35a 28,86+0,35a 27,18+0,28a 27,57+0,40a a a a Asupan Minggu 8 (g) 27,86+0,13 29,86+0,13 28,43+0,35 28,25+0,25a a a a Asupan Minggu 9 (g) 28,50+0,31 30,60+0,34 29,20+0,11 28,95+0,11a a a a Total asupan (g) 297,90+3,21 308,40+4,16 294,06+3,82 306,92+3,06a Keterangan: Huruf superskrip yang sama pada baris yang sama menyatakan tidak berbeda nyata (p>0,05). Parameter Pada kelompok yang diberi ekstrak air (Tabel 14), asupan pakan dari minggu pertama sampai dengan minggu ke sembilan juga tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (p>0,05) antar kelompok perlakuan. Jumlah asupan pakan dari masing-masing kelompok perlakuan yang diberi ekstrak air meningkat dari minggu ke minggu. Hal ini disebabkan karena meningkatnya bobot badan sehingga jumlah asupan pakannya juga meningkat. Gambaran Darah Lengkap Semua tikus yang diberi ekstrak pegagan dalam jumlah yang tinggi (600 mg/kg bobot badan per hari) selama periode percobaan tidak menunjukkan tandatanda toksik. Keadaan ini didukung oleh hasil analisis darah lengkap yang menunjukkan bahwa gambaran darah dari tikus tersebut berada dalam batasan normal dan bahkan menunjukkan kecenderungan yang lebih baik dibandingkan dengan kontrol. Data gambaran darah lengkap (Tabel 15 dan 16) tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak etanol dan ekstrak air daun pegagan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05), kecuali terhadap jumlah benda darah merah (BDM) dan eosinofil (Tabel 17). Tabel 15 Rata-rata gambaran darah lengkap tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak etanol Kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) BDM (Juta/mm3) 7,02+2,1a 7,58+0,5ab 8,22+0,3c 7,90+4,4bc PCV (%) 37,33+11,8a 47,83+0,6a 44,67+0,8a 43,67+25,2a Hb (g%) 14,77+1,8a 15,28+0,9a 17,04+1,7a 15,32+7,81 a BDP (Ribu/mm3) 7,18+4,9a 8,72+2,0a 10,33+1,3a 8,40+4,7a Keterangan: Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (p<0,05), BDM (Benda Darah Merah), PCV (Packet Cell Volume), Hb (hemoglobin), BDP (Benda Darah Putih) Secara statistik, jumlah BDM pada tikus level 2 dan 3 berbeda nyata (p<0,05) dengan kelompok kontrol, level 2 tidak berbeda nyata dengan level 3 (p>0,05) namun berbeda nyata dengan level 1 (p<0,05), sedangkan PCV, Hb dan BDP tidak berbeda nyata (p>0,05) antar kelompok perlakuan. Data benda darah putih yang diperoleh pada penelitian ini berbeda dengan yang dilaporkan Jayathirtha dan Mishra (2004), bahwa tikus yang diberi ekstrak metanol dapat meningkatkan jumlah sel darah putih. Tikus pada kelompok yang diberi ekstrak etanol, meskipun nilai PCV, Hb dan total benda darah putih tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05) dengan kontrol, namun nilai gambaran darah tersebut cenderung lebih baik dibandingkan dengan nilai pada kelompok kontrol. Terdapat variasi antara hasil yang diperoleh pada penelitian ini dengan laporan sebelumnya. Sihombing & Tuminah (2011) melaporkan bahwa tikus Wistar jantan yang berumur 3 bulan dengan rata-rata bobot badan 156 g mempunyai nilai BDM 8,46 juta/mm3, PCV 45,12%, Hb 14,94 g/dL dan BDP 5,74 ribu/mm3. Data gambaran darah tersebut menunjukkan bahwa kelompok level 2 (300 mg/kg bobot badan) yang diberi ekstrak etanol cenderung lebih baik dibandingkan dengan kelompok lainnya. Hal ini ditandai dengan nilai BDM, Hb dan BDP yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok lainnya, sedangkan nilai PCV lebih baik pada kelompok level 1. Tingginya nilai BDM pada kelompok perlakuan berkonsekuensi pada peningkatan nilai PCV dan Hb menuju nilai normal atas, terutama pada level 300 mg/kg bb. Smith & Mangkoewidjojo dalam Anwar 1988 melaporkan bahwa nilai BDM, Hb dan BDP tikus putih adalah berturut-turut 7,2-9,6 juta/mm3, 15-16 g/100 mL, dan 5-13 ribu/mm3. Rendahnya nilai BDM pada level 600 mg/kg bb sangat mungkin mengindikasikan ketepatan level 300 mg/kg bb dalam pemakaian 8 minggu. Hubungan antara nilai Hb dan fungsi kognitif telah dilaporkan oleh Jacobsen et al. (2004), bahwa terdapat perubahan yang negatif pada kinerja kognitif pasien kanker yang mengalami penurunan nilai Hb. Jumlah BDP tikus yang diberi perlakuan level 2 adalah tertinggi diantara kelompok yang ada. Keadaan demikian mengindikasikan dengan kuat bahwa ekstrak pegagan yang diberi menginduksi pengeluaran sel darah ke sirkulasi. Peningkatan nilai BDP pada tikus yang diberi ekstrak etanol menandakan bahwa pegagan juga bermanfaat sebagai imunostimulan. Peran pegagan sebagai imunostimulan juga pernah dilaporkan oleh Wang et al. (2005) dan Punturee et al. (2005). Imunostimulan adalah suatu istilah yang menunjukkan adanya suatu perubahan yang memperkuat penekanan dari indikator faktor kekebalan seluler dan humoral serta faktor pertahanan nonspesifik (Sagrawat & Yaseen 2007). Tikus yang diberi ekstrak air nilai BDP lebih rendah dibandingkan dengan kontrol. Data ini mengindikasikan bahwa ekstrak air kemungkinan kurang bermanfaat sebagai imunostimulan. Hal ini berbeda dengan laporan Punturee et al. (2005) yang melaporkan bahwa ekstrak air pegagan dengan level 100 mg/kg BB menunjukkan respon yang tinggi terhadap antibodi primer dan sekunder dibandingkan dengan kelompok kontrol. Ekstrak etanol pegagan menunjukkan aktivitas imunosupresif yang ditandai dengan pengurangan proliferasi mitogenstimulated human PBMCs dan produksi IL-2 serta TNF-α. Tabel 16 Rata-rata gambaran darah lengkap tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak air kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) BDM (Juta/mm3) 7,38+0,3a 7,05+0,8a 7,92+1,7a 7,94+0,7a PCV (%) 42,06+4,5a 39,81+5,7a 39,56+9,8a 43,56+3,1a Hb (g%) 14,81+1,3a 13,76+1,9a 13,99+3,4a 15,14+1,3a BDP (Ribu/mm3) 12,09+1,5a 6,71+4,3a 8,31+4,9a 9,20+2,7a Keterangan: Huruf superskrip yang sama pada kolom yang sama menyatakan tidak berbeda nyata (p>0,05). BDM (Benda Darah Merah), PCV (Packet Cell Volume), Hb (hemoglobin), BDP (Benda Darah Putih) Tabel 17 Rata-rata gambaran differensial benda darah putih pada tikus yang diberi ekstrak etanol kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) L 73+18,0a 78+9,0a 70+0,6a 86+52,6a Differensial BDP (%) N M a 25+17,8 2+1,0a 19+8,6a 2+1,0a 26+2,7a 4+2,0a 12+3,9a 2+1,2a E 1+1,2ab 1+1,0b 0a 1+0,5ab Keterangan: Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (p<0,05), L (limfosit), N (netrofil), M (monosit) dan E (eosinofil) Perbedaan ini mungkin saja disebabkan oleh perbedaan kandungan senyawa kimia yang berperan pada sistem imun. Wang et al. (2005) melaporkan bahwa pektin yang merupakan kompleks polisakarida heterogen yang terdapat di dalam tanaman pegagan berperan sebagai imunostimulan. Punturee et al. (2005) tidak melaporkan kandungan karbohidrat dari masing-masing ekstrak yang digunakan. Pada penelitian ini, kandungan karbohidrat di dalam ekstrak etanol cenderung lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak air (89,82% vs 85,54%), sehingga perbedaan pada sistem imun seluler ini sangat dimungkinkan karena perbedaan pada kandungan karbohidrat, dengan asumsi jika kandungan pektin ekivalen dengan kandungan karbohidrat dari masing-masing ekstrak tersebut. Perbedaan pada respon imun seluler ini berkontribusi pada nilai differensial leukosit. Pada tikus yang diberi ekstrak etanol (kecuali pada level 2) nilai limfosit cenderung lebih tinggi, sedangkan nilai netrofil lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol. Sebaliknya pada tikus yang diberi ekstrak air nilai limfosit lebih rendah, sedangkan nilai netrofil lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol. Lebih tingginya nilai netrofil pada tikus yang diberi ekstrak air sangat mungkin terkait dengan keberadaan mikroba yang mudah tumbuh dalam ekstrak air. Secara umum dapat ditegaskan bahwa ekstrak etanol lebih baik dari pada ekstrak air dalam meningkatkan profil hematologi. Volume darah merah dan nilai hematokrit juga dipengaruhi oleh jenis kelamin dan bobot badan. Tikus Wistar dengan bobot badan 114,22 g, memiliki volume darah merah sebanyak 2,12 mL/100 g dan hematokrit 40%, sedangkan tikus dengan bobot badan 270,19 memiliki volume darah merah sebanyak 2,27 mL/100 g dan hematokrit 43,94% (Lee & Blaufox, 1985). Tabel 18 Rata-rata gambaran differensial benda darah putih pada tikus yang diberi ekstrak air kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) L 82+4,4a 74+6,1a 76+3,9a 78+4,3a Differensial BDP (%) N M a 14+3,3 4+2,7a 20+5,3a 4+1,0a 20+2,5a 3+1,6a 15+4,2a 6+2,2a E 1+1,5a 1+1,0a 1+0,6a 1+1,2a Keterangan: L (limfosit), N (netrofil), M (monosit) dan E (eosinofil) Pola Aktivitas Tikus Pengamatan aktivitas tikus dilakukan setiap 2 hari sekali terhadap semua tikus dari setiap kelompok dengan menggunakan lorong T-maze, dan aktivitas tersebut direkap dalam aktivitas mingguan. Terdapat 3 jenis tingkah laku yang dominan dijumpai pada tikus yang diuji yaitu berjalan, memanjat dan membaui. Aktivitas perawatan tubuh juga dijumpai selama di dalam kotak Maze, namun aktivitas ini tidak umum dijumpai. Aktivitas perawatan tubuh hanya sesekali dijumpai pada tikus-tikus yang termasuk dalam kategori aktif. Aktivitas perawatan tubuh dilakukan dengan menggunakan kedua kaki depan dengan cara menjilati kedua kaki depan tersebut, lalu mulai mengusap-usap bagian muka dan dilanjutkan pada bagian tubuh lainnya. Tikus yang aktif menunjukkan aktivitas berjalan, membaui dan memanjat dinding maze yang sangat tinggi. Aktivitas memanjat dinding maze yang sangat tinggi dijumpai pada saat tikus baru dilepaskan dari kotak start, setelah melewati kotak maze bagian start, aktivitas memanjat berkurang. Aktivitas membaui dari tikus yang aktif sangat tinggi, dan aktivitas membaui ini dilakukan terus menerus selama tikus berada di dalam kotak maze. Aktivitas membaui ini dilakukan ke segala arah, dan lebih sering dilakukan ke lantai kotak maze, diduga bahwa aktivitas membaui ini dilakukan untuk mengenal lorong-lorong yang akan dilaluinya. Motivasi tikus untuk melewati setiap lorong belum diketahui secara pasti. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pakan yang disediakan di titik finish bukan faktor utama yang menyebabkan tikus bergerak untuk melewati lorong, karena setiap tikus yang telah mencapai titik finish tidak pernah mengambil pakan yang telah disediakan. Diduga bahwa motivasi tikus untuk bergerak melewati setiap lorong adalah karena tikus berusaha untuk keluar dari lorong yang ada di depannya yang belum dilaluinya, dan apabila lorong yang di depannya telah buntu, maka tikus akan bergerak dengan sangat cepat kembali ke kotak start dan tidak kembali lagi ke titik finish. Tikus yang aktif akan terus bergerak di dalam kotak maze selama di depannya belum ditemukan lorong yang buntu. Perlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Distribusi tikus dari masing-masing kelompok perlakuan berdasarkan skor kategori aktivitas dan rataan skor kategori disajikan pada Tabel 19. Hasil pengamatan aktivitas pada masing-masing kelompok perlakuan menunjukkan bahwa tikus dari kelompok kontrol menunjukkan aktivitas yang tidak konsisten dan secara umum menunjukkan tingkah laku yang tidak aktif. Pada minggu pertama dan ketiga skor rata-rata kategori aktivitas kelompok level 1 tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p>0,05), dan berbeda nyata dengan kelompok level 2 dan 3. Di seluruh minggu kelompok level 2 dan 3 lebih aktif dari pada kelompok level 1 dan kontrol. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Rao et al. (2006) yang melaporkan bahwa tikus yang diberi ekstrak daun lebih aktif dibandingkan dengan tikus kontrol dan kalau diberi dengan level yang lebih tinggi dalam periode yang lama dapat memberikan pengaruh yang positif terhadap proses pembelajaran dan memori. mengindikasikan adanya peningkatan kekuatan otot. Tikus yang aktif Mato et al. (2011) melaporkan bahwa pemberian ekstrak pegagan sebanyak 500 dan 750 mg/hari selama 2 bulan dapat meningkatkan performa fisik pada manula sehat yang ditandai dengan meningkatnya kekuatan otot pada bagian ekstremitas bawah. Tabel 19 Distribusi tikus dari masing-masing kelompok perlakuan berdasarkan skor kategori aktivitas dan rataan skor kategori Kelompok 4 (Sangat aktif) Minggu I Kontrol 0 Level 1 12,5 Level 2 62,5 Level 3 25,0 Minggu II Kontrol 0 Level 1 25,0 Level 2 50,0 Level 3 37,5 Minggu III Kontrol 0 Level 1 25,0 Level 2 58,3 Level 3 75,0 Minggu IV Kontrol 0 Level 1 33,3 Level 2 83,3 Level 3 91,7 Huruf superskrip yang berbeda pada Distribusi tikus (%) 3 2 (Aktif) (Kurang aktif) 1 (Tidak aktif) Skor rata-rata katagori 0 12,5 0 25,0 50,0 50,0 25,0 50,0 50,0 25,0 12,5 0 1,1+1,1b 1,4+0,9ab 2,1+0,9a 1,7+1,2a 0 25,0 12,5 25,0 0 25,0 12,5 25,0 100,0 25,0 25,0 12,5 1,0+1,2b 1,6+0,7a 1,9+0,9a 1.9+1,4a 8,3 0 0 16,7 33,3 25,0 16,7 8,3 58,3 50,0 25,0 0 1,1+1,0b 1,3+1,3b 1,9+1,2a 3,1+1,4a 0 8,3 91,7 1,0+0,8c 25,0 25,0 16,7 1,7+1,1b 8,3 0 8,3 3,1+1,2a 8,3 0 0 3,6+1,1a kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (P<0,05); 4 = Sangat aktif; 3 = Aktif; 2 = Kurang aktif; 1 = Tidak aktif Pengaruh yang positif ini mungkin karena perubahan struktural, neurokimia dan neurofisiologikal di dalam otak tikus (Rao et al. 2005). Laporan lainnya menyebutkan bahwa peningkatkan kemampuan memori dan pembelajaran pada tikus muda mungkin berhubungan dengan aktivitas antioksidan, anti inflamasi, neuroprotektif, pro-kholinergik dan anti-kholinergik dari berbagai komponen yang terdapat di dalam tanaman pegagan (Joshi & Parle 2006). Dilaporkan bahwa senyawa aktif yang terdapat di dalam pegagan efektif dalam melindungi neuron dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh paparan akibat kelebihan glutamat (Lee et al. 2000). Peningkatan aktivitas tikus seiring dengan meningkatnya level ekstrak yang diberikan mengindikasikan adanya peningkatan asupan zat gizi yang berpengaruh terhadap kontraksi otot. Linder (2006) melaporkan bahwa kalsium merupakan mineral makro yang juga berperan pada kontraksi otot. Kontraksi otot terutama diatur oleh konsentrasi Ca++ bebas di dalam sitosol. Berbagai stimulus yang menginduksi kontraksi otot memicu peningkatan Ca++ bebas di dalam sitosol. T-maze yang digunakan untuk mengukur pola aktivitas merupakan stimulus yang menyebabkan peningkatan Ca++ di dalam sitosol. Oleh karena kandungan kalsium pada level 3 lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok lainnya, maka peningkatan aktivitas pada level 3 sangat dimungkinkan. Persentase tikus dari masing-masing kelompok yang mencapai titik finish setelah diberi ekstrak etanol disajikan pada Tabel 20. Tabel 20 Persentase tikus yang mencapai titik finish setelah diberi ekstrak etanol Kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) Minggu I 0,00 12,50 37,50 12,50 % tikus yang mencapai finish Minggu II Minggu III Minggu IV 0,00 0,00 0,00 37,50 25,00 33,33 50,00 58,33 83,33 50,00 66,67 91,67 Data yang diperoleh menunjukkan bahwa tidak ada satu ekorpun dari tikus kontrol yang mencapai titik finish, sedangkan pada kelompok level 1, 2 dan 3 persentase tikus yang mencapai titik finish bervariasi. Pada kelompok level 1, persentase tikus yang mencapai titik finish cenderung stabil, sedangkan pada kelompok level 2 dan 3 terjadi peningkatan dari minggu ke minggu. Hal ini sesuai dengan laporan Rao Mohandas (2005) bahwa tikus yang diberi pegagan dengan level yang lebih rendah selama 2 minggu belum memberikan efek yang berarti, namun tikus yang diberi pegagan dengan level yang lebih tinggi menunjukkan adanya perbaikan yang signifikan dalam perilaku belajar. Pola aktivitas tikus juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Suaskara et al. (2007) melaporkan bahwa pemaparan cahaya dapat mengubah pola aktivitas tikus dan aktivitas tikus cenderung meningkat sebanding dengan lama cahaya. Dalam penelitian ini digunakan pencahayaan yang sama sehingga semua tikus berada dalam keadaan lingkungan yang sama. Dari 10 kali pengamatan (Tabel 21), frekuensi tikus yang mencapai titik finish dari kelompok level 2 dan 3 berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p<0,05) dan tidak berbeda nyata dengan kelompok level 1 (p>0,05). Rata-rata waktu yang diperlukan untuk mencapai titik finish (Tabel 21) dari tikus yang diberi ekstrak etanol menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0,05) antara kelompok level 2 dan 3 dengan kelompok kontrol, namun tidak berbeda nyata dengan level 1 (p>0,05). Meskipun waktu mencapai titik finish berbeda nyata namun tidak menggambarkan tingkat aktivitas dari masing-masing kelompok percobaan, karena pola aktivitas tikus di dalam kotak maze tidak hanya berjalan, dan bahkan waktu di dalam maze banyak digunakan untuk aktivitas memanjat. Tabel 21 Rata-rata frekuensi dan waktu pencapaian titik finish setelah pemberian ekstrak etanol selama 10 kali pengamatan Pencapaian finish Frekuensi Persentase a Kontrol 0,00+0,00 0 Level 1 (100 mg/kg bb) 2,75+3,59ab 27,5 Level 2 (300 mg/kg bb) 6,00+4,08b 60,0 Level 3 (600 mg/kg bb) 6,00+2,45b 60,0 Kelompok Waktu pencapaian (menit) 0,00+0,00a 0,98+1,06ab 1,69+0,94b 1,49+0,64b Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (P<0,05). Tikus yang aktif, aktivitas memanjat di dalam maze dapat mencapai lebih dari 20 kali selama 5 menit. Dengan demikian, waktu yang diperlukan untuk mencapai titik finish bukan merupakan indikator yang baik untuk mengukur aktivitas dan kecerdasan tikus coba. Berdasarkan data pola aktivitas yang diperoleh, data persentase dan frekuensi pencapaian titik finish serta pola aktivitas di dalam maze lebih tepat digunakan sebagai indikator untuk mengukur tingkat aktivitas dan kecerdasan dibandingkan waktu yang diperlukan untuk pencapaian titik finish, karena pola aktivitas, persentase dan frekuensi pencapaian titik finish konsisten di masing-masing kelompok percobaan. Data gambaran darah pada kelompok yang diberi ekstrak etanol sejalan dengan gambaran aktivitasnya. Data gambaran aktivitas menunjukkan bahwa kelompok yang diberi ekstrak etanol lebih aktif dibandingkan dengan kelompok yang diberi ekstrak air. Data ini menggambarkan bahwa aktivitas sangat terkait dengan gambaran darah umum terutama dengan total benda darah merah, PCV, Hb dan total benda darah putih. Perlakuan Pemberian Ekstrak Air Aktivitas tikus yang diberi ekstrak air tidak lebih baik dibandingkan dengan aktivitas tikus yang diberi ektrak etanol (Tabel 22). Tabel 22 Kelompok Distribusi tikus dari masing-masing kelompok perlakuan berdasarkan skor kategori aktivitas dan rataan skor kategori 4 (Sangat aktif) Skor katagori aktivitas (%) 3 2 (Aktif) (Kurang aktif) Minggu I Kontrol 37,5 Level 1 12,5 Level 2 75,0 Level 3 37,5 Minggu II Kontrol 50,0 Level 1 12,5 Level 2 62,5 Level 3 37,5 Minggu III Kontrol 41,7 Level 1 25,0 Level 2 66,7 Level 3 41,7 Minggu IV Kontrol 16,7 Level 1 41,7 Level 2 41,7 Level 3 25,0 Huruf superskrip yang berbeda pada 1 (Tidak aktif) Skor rata-rata katagori 25,0 25,0 0 37,5 25,0 50,0 25,0 0 12,5 12,5 0 25,0 1,9 +1,1a 1,5 +0,9a 2,7 +0,9a 1,9 +1,2a 0 12,5 12,5 12,5 37,5 75,0 25,0 12,5 12,5 0 0 37,5 1,9 +1,2a 1,5 +0,7a 2,5 +0,9a 1,6 +1,4a 16,7 16,7 16,7 16,7 41,7 16,7 0 8,3 0 41,7 16,7 33,3 2,0+1,0ab 1,5 +1,3b 2,4 +1,2a 1,7 +1,4ab 33,3 50,0 0 1,7 +0,8a 0 50,0 8,3 1,8 +1,1a 16,7 25,0 16,7 1,8 +1,2a 16,7 41,7 16,7 1,6 +1,1a kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (P<0,05); 4 = Sangat aktif; 3 = Aktif; 2 = Kurang aktif; 1 = Tidak aktif Data pengamatan menunjukkan bahwa aktivitas tikus yang diberi ekstrak air tidak menunjukkan perbedaan antar kelompok (p>0,05) kecuali pada minggu ketiga, aktivitas tikus kelompok level 2 berbeda (p<0,05) dengan aktivitas tikus kelompok level 1, namun tidak berbeda dengan kontrol dan level 3 (p>0,05). Secara umum tikus pada kelompok level 2 lebih baik daripada kelompok level lainnya. Data aktivitas tikus yang diberi ekstrak air tidak menunjukkan hasil yang memuaskan, karena hampir semua parameter aktivitas yang diamati tidak menunjukkan hasil yang berbeda nyata dengan kontrol. Data ini mengindikasikan bahwa ekstrak air pegagan kurang bermanfaat jika digunakan untuk memperbaiki aktivitas dan pembelajaran pada tikus. Data ini tidak sejalan dengan laporan Veerendra & Gupta (1995) yang mengatakan bahwa ekstrak air pegagan memiliki efek meningkatkan fungsi kognitif. Laporan lainnya menyebutkan bahwa ekstrak etanol mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih baik dibandingkan dengan ekstrak air (Hamid et al. 2002). Data ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol mempunyai efek yang konsisten terhadap fungsi kognitif, sedangkan ekstrak air sebaliknya. Tabel 23 Persentase tikus yang mencapai titik finish setelah diberi ekstrak air Kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) % tikus yang mencapai finish Minggu I Minggu II Minggu III Minggu IV 50,00 37,50 33,33 16,67 12,50 12,50 25,00 41,67 62,50 62,50 66,67 41,67 50,00 37,50 41,67 25,00 Hasil pengamatan mengindikasikan bahwa ekstrak air pegagan lebih bermanfaat terhadap penambahan bobot badan dibandingkan terhadap aktivitas. Frekuensi pencapaian titik finish pada kelompok tikus yang diberi ekstrak air (Tabel 24) tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (p>0,05), namun demikian kelompok level 2 frekuensi pencapaian titik finish lebih baik dibandingkan dengan kelompok level lainnya. Tabel 24 Rata-rata frekuensi dan waktu pencapaian titik finish setelah pemberian ekstrak air selama 10 kali pengamatan Kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) Pencapaian finish Frekuensi Persentase 3,25+2,75 32,5 2,50+1,91 25,0 6,00+4,24 60,0 3,75+2,87 37,5 Waktu pencapaian (menit) 0,57+0,11a 0,55+0,32a 0,97+0,48a 0,96+0,16a Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (P<0,05). Penelitian 3. Analisis Morfologi Hipokampus Imunohistokimia Jaringan Otak Pewarnaan imunohistokimia dilakukan dengan tujuan untuk mendeteksi kandungan atau komponen aktif yang ada dalam jaringan atau sel dengan penggunaan antibodi tertentu. Prinsip dasar pewarnaan ini adalah adanya ikatan antara antigen dan antibodi. Pada penelitian ini menggunakan beberapa jenis antibodi yang dianggap dapat memberi keterangan tentang mekanisme terjadinya peningkatan aktivitas (kognitif) pada tikus. Antibodi dimaksud adalah Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), calbindin-28k, dopamin, TNF-α, dan CRP. Profil Sel Neuroglia Terdapat 3 tipe sel glial di sistem susunan saraf pusat, dan ketiga sel glial tersebut dijumpai lebih dari setengah dari semua sel yang ada di otak. Sel glial berperan dalam pengolahan informasi di sistem susunan saraf pusat (Newman 2003). Berbagai kelainan klinis dapat mengurangi jumlah sel glial diantaranya keadaan depresi (Cotter et al. 2001) dan stres hipoksia (Sturrock 1976). Dilaporkan bahwa stres dapat meningkatkan kompleksitas internal dari mikroglia yaitu meningkatkan ramifikasi (percabangan) tanpa mengubah area keseluruhan yang ditempati oleh sel dan efek ini lebih jelas dalam sel yang lebih besar (Hinwood 2012). ED0 Gambar 12 Hasil pewarnaan dengan antibodi GFAP pada bagian hipokampus pada kelompok kontrol yang diberi ekstrak etanol daun pegagan. Skala bar = 30 µm Sel mikroglial adalah sel makrofag dalam sistem susunan saraf pusat. Selsel ini berasal dari mesodermal/mesenchymal dan bermigrasi ke seluruh wilayah dari sistem susunan saraf pusat, lalu menyebar melalui parenkim otak. Melalui signaling pathways sel-sel mikroglia bisa berkomunikasi dengan sel neuron dan sel-sel sistem kekebalan tubuh. Setelah terdeteksi adanya tanda-tanda lesi otak atau disfungsi sistem saraf, selanjutnya sel mikroglial menjalani proses, aktivasi kompleks, dan seterusnya sel-sel mikroglia berubah menjadi “sel mikroglial yang diaktifkan." Bentuk sel mikroglia yang telah diaktifkan memiliki kapasitas untuk melepaskan sejumlah besar substansi yang dapat bertindak merugikan atau bermanfaat bagi sel-sel sekitarnya. Sel mikroglial yang telah diaktifkan dapat bermigrasi ke lokasi cedera, berproliferasi, menfagosit sel dan kompartemen selular (Kettenmann et al. 2011). ED3 Gambar 13 Hasil pewarnaan dengan antibodi GFAP pada bagian hipokampus pada Kelompok level 3 yang diberi ekstrak etanol daun pegagan. Skala bar = 30 µm Pada penelitian ini, untuk melihat ekspresi dan kepadatan sel glial pada masing-masing kelompok perlakuan digunakan antibodi GFAP. Hasil pewarnaan secara imunohistokimia menunjukkan bahwa perbedaan kepadatan sel-sel glial antar kelompok perlakuan tidak jauh berbeda (Gambar 12 dan 13). Jumlah sel glial bahwa kelompok kontrol 691, kelompok yang diberi ekstrak air 624 dan kelompok yang diberi ekstrak etanol 678. Kemungkinan jumlah sel glial akan sangat berbeda apabila otak dalam keadaan tidak sehat, karena salah satu fungsi sel glial adalah sebagai makrofag. Data ini menunjukkan bahwa pada penelitian ini ekstrak pegagan tidak memberi pengaruh kepada populasi glial meskipun secara klinis pemberian ekstrak pegagan memberi pengaruh yang positif terhadap pola aktivitas dan gambaran darah. Diduga bahwa peningkatan kognitif yang ditandai dengan peningkatan aktivitas karena pemberian ekstrak etanol daun pegagan tidak melalui neuroglial pathways. Meskipun sel glial berperan dalam pengolahan informasi di sistem susunan saraf pusat (Newman 2003) dan juga pada sistem kekebalan tubuh (Kettenmann 2011), namun pada penelitian ini tidak menunjukkan perubahan pada kepadatan populasinya. Ekspresi Sel yang Positif terhadap Antibodi Calbindin D28k Penelitian tentang kemampuan Ca2+ untuk mengikat protein calbindin D28k untuk memodulasi peningkatan konsentrasi ion Ca2+ bebas intraseluler di ganglion tikus telah dilakukan oleh Chard et al. (1993), dan dilaporkan bahwa calbindin D28k efektif sebagai buffer ion Ca2+ dalam lingkungan seluler sehingga dapat mengatur Ca2+-dependent dari fungsi neuron. Dilaporkan bahwa persentase calbindin D28k endogen di ganglia dewasa mencapai lebih kurang 10% (Chard et al. 1993). Antibodi calbindin biasanya digunakan untuk melihat diferensiasi neuroblas menjadi sel neuron dewasa dan mengevaluasi kehilangan sel neuron di daerah hipokampus. Pewarnaan immuno dengan calbindin memperlihatkan gradasi dalam intensitas antara neuron dari populasi yang berbeda. Hal ini merupakan suatu fenomena yang kompatibel dengan keberadaan berbagai konsentrasi protein tersebut. Calbindin sangat baik sebagai penanda anatomi neuron yang dapat dimanfaatkan untuk memvisualisasikan secara selektif neuron tertentu dan pathways dalam sistem saraf pusat dan sistem saraf perifer. Calbindin terbentuk di semua jalur utama dari sistem limbik kecuali di forniks. Calbindin terutama berhubungan dengan neuron dengan akson yang panjang (sel Golgi tipe I) seperti pada neuron talamus, neuron strionigral, neuron Meynert nucleus basalis, sel Purkinje serebelum, dan sel ganglion vestibular. Gambar 14 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok kontrol yang diberi ekstrak etanol. Skala bar = 30 µm Gambar 15 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok level 1 yang diberi ekstrak etanol. Skala bar = 30 µm Calbindin juga ditemukan di beberapa sel akson yang pendek sel (Golgi tipe II), misalnya di interneuron sumsum tulang belakang di lapisan II dan interneuron dari korteks serebral. Calbindin juga terdeteksi di beberapa sel ependymal dan paling banyak di pusat vegatatif dari hipotalamus (Celio 1990). Pada penelitian ini, ekspresi sel neuron yang positif terhadap calbindin dari masing-masing kelompok perlakuan menunjukkan perbedaan (Gambar 14, 15, 16 dan 17). Hasil Imunohistokimia pada area hipokampus CA3 kelompok penerima ektraks etanol daun pegagan menunjukan angka rata-rata populasi sel yang positif terhadap Calbindin lebih besar (39,56 vs 34,75) dengan kontrol. dibandingkan Peningkatan yang terjadi sangat mungkin mengindikasikan terjadinya peningkatan pembentukan ATP yang terkait dengan peningkatan aktivitas dan pencapaian titik finish pada T-maze test yang dilakukan. Gambar 16 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok level 2 yang diberi ekstrak etanol. Skala bar = 30 µm Mekanisme peningkatan aktivitas tikus yang diberi ekstrak etanol diduga terkait dengan pembentukan calbindin. Calbindin akan menjadi bentuk aktif apabila terikat dengan protein allosteric effector. Selanjutnya calbindin bentuk aktif tersebut akan merangsang pembentukan ATP dari glikogen otot dengan bantuan glycogen posporilasekinase yang pada akhirnya akan merangsang terjadinya kontraksi otot. Mekanisme peningkatan aktivitas juga terkait dengan aktivitas metabolisme di dalam jaringan otot. Aktivitas metabolisme di dalam jaringan otot harus disertai dengan suplai darah yang optimal dan pada setiap serat otot juga harus dilengkapi dengan beberapa kapiler untuk memperkaya vaskularisasi (deVries & Housh 1994). Dengan demikian dapat dipahami bahwa pencapaian peningkatan aktivitas tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan juga terkait dengan terjadinya perbaikan pada sistem sirkulasi darah (profil hematologi). Gambar 17 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok level 3 yang diberi ekstrak etanol. Skala bar = 30 µm Calbindin dipahami sebagai calcium binding protein yang terkait dengan metabolisme seluler terkait dengan pertukaran dan pengaturan Ca dalam sel. Pada sel saraf Calbindin dilaporkan dapat berperan sebagai buffer untuk ion Ca2+ (Chard et al. 1993) yang dapat mencegah kerusakan sel karena peningkatan konsentrasi Ca+ baik pada sel saraf maupun sel lain yang mengandung protein ini (Leranth & Ribak 1991). Chard et al. (1993) juga melaporkan bahwa Calbindin dapat juga berperan sebagai neurotransmiter. Peningkatan populasi sel positif calbindin pada kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol dapat dipahami bahwa sel yang mengalami peningkatan metabolisme meningkat dan sangat mungkin bermakna bahwa sel-sel yang dalam kondisi siap kerja (standby) juga miningkat. Ekspresi Sel yang Positif terhadap Antibodi Dopamin Reseptor dopamin adalah target utama untuk neuroleptik tipikal dan atipikal. Untuk memahami kontribusi fungsionalnya dari neuron yang mengandung dopamin maka dapat digunakan antibodi anti-peptida. Dilaporkan bahwa reseptor dopamine terdistribusi di korteks serebral, hipokampus, ganglia basalis, serebelum, dan otak tengah (Khan et al. 1998). Defagot (1997) juga melaporkan bahwa reseptor dopamin terdistribusi secara meluas di dalam sistem saraf pusat tikus dan tertinggi dijumpai di dalam korteks frontal hipokampus (CA1, CA2, CA3 dan dentate gyrus), korteks entorhinal, putamen kaudatus, nukleus akkumbens, tuberkulum olfaktorius, otak kecil, nukleus supraoptik dan sustansia nigra. Gambar 18 Hasil pewarnaan dengan antibodi dopamin pada bagian hipokampus Kelompok level 2 yang diberi ekstrak daun etanol. Skala bar = 30 µm Pada penelitian ini, pewarnaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi dopamin tidak menghasilkan reaksi positif (Gambar 18). Artinya, pemberian ekstrak etanol daun pegagan tidak berpengaruh pada penampakan selsel yang positif terhadap dopamine. Dengan demikian, diduga bahwa peningkatan aktivitas tikus pada penelitian tidak melalui mekanisme neurotransmiter dopamin. Ekspresi Sel yang Positif terhadap Antibodi CRP dan TNF Hasil pewarnaan dengan antibodi TNF (Gambar 19) dan CRP (Gambar 20) tidak menunjukkan reaksi positif pada semua kelompok perlakuan. Artinya, pada penelitian ini pemberian ekstrak etanol daun pegagan tidak berpengaruh pada ekspresi sel-sel yang positif terhadap CRP dan TNF. Gambar 19 Hasil pewarnaan dengan antibodi TNF pada bagian hipokampus kelompok level 1 yang diberi ekstrak daun etanol. Skala bar = 30 µm Gambar 20 Hasil pewarnaan dengan antibodi CRP pada bagian hipokampus kelompok level 2 yang diberi ekstrak daun etanol. Skala bar = 30 µm Hal ini mungkin saja karena tikus yang digunakan pada penelitian ini masih berumur muda (berumur lebih kurang 4 bulan pada saat dikorbankan) dan sel neuron belum mengalami degenerasi sehingga ekspresi sel neuron yang positif terhadap antibodi tersebut tidak ditemukan. Dilaporkan bahwa TNF endogen memainkan peran penting dalam fungsi kognitif pada saat usia tua (McAfoose et al. 2009), sedangkan pada kondisi non-inflamasi kadar TNF yang rendah tampaknya penting untuk fungsi kognitif normal (Baune et al. 2008). 92 PEMBAHASAN UMUM Berdasarkan bukti empiris menunjukkan bahwa pegagan yang kaya mineral, bahan gizi dan bahan aktif telah lama digunakan untuk tujuan meningkatkan fungsi memori. Hasil analisa kandungan kimia dan fitokimia dari daun pegagan yang digunakan dalam penelitian mengandung mineral baik yang makro maupun mikro cukup beragam, demikian juga kandungan zat gizi seperti karbohidrat dan protein serta bahan aktif lain seperti senyawa asiatikosida ditemukan dalam jumlah yang relative cukup tinggi, sebagaimana dilaporkan oleh hasil peneliti-peneliti sebelumnya. Diantara senyawa tersebut, asiatikosida diduga berperan pada perbaikan fungsi kognitif. Keberadaan mineral makro dan mikro serta zat gizi lainnya yang terdapat di dalam pegagan belum banyak digali perannya dalam perbaikan metabolism sel. Berdasarkan hasil analisis fitokimia atau uji fitokimia yang merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik maka dapat diketahui bahwa di dalam pegagan ditemukan senyawa alkaloid, flavonoid, steroid dan glikosida. Laporan lainnya menyebutkan bahwa, selain senyawa tersebut juga ditemukan senyawa lainnya seperti saponin, tannin, triterpenoid dan fenolik. Tidak terdeteksinya beberapa senyawa tersebut dalam proses pengujian fitokimia dapat disebabkan karena jumlah material yang dianalisis tidak mencapai jumlah minimal yang dibutuhkan di dalam bahan yang dianalisis (Zainol et al. 2008), atau asal tanaman yang berbeda, dan mungkin juga karena waktu pengambilan sampel yang berbeda. Fungsi senyawa-senyawa yang ada dilaporkan selain terkait dengan fungsi kognitif dapat sebagai insektisida, anti parasit, anti mikroba, antioksidan penangkap radikal bebas dan juga berfungsi sebagai donor hidrogen yang efektif. Hasil pengamatan aktivitas proses pengenalan lorong dalam T-maze pada kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol sebanyak 300 mg/kg bobot badan memberikan peningkatan aktivitas yang tidak berbeda nyata dengan tikus yang diberi ekstrak etanol sebanyak 600 mg/kg bobot badan. Gambaran peningkatan persentase dari tikus yang mencapai finish juga peningkatan aktivitas dalam lorong T-maze dapat dipahami sebagai keberhasilan individu dalam mengenali lorong buntu dan keberhasilan mengingat jalur menuju titik finish. Hasil demikian menggambarkan dengan jelas adanya pengaruh pemberian ekstrak pegagan, mengingat pada periode yang sama perubahan tidak ditemukan pada kelompok kontrol. Bila mengenali lorong dan mengingat jalur menuju finish dapat dipahami sebagai proses belajar maka hasil pengamatan aktivitas menegaskan bahwa pemeberian ekstrak pegagan dapat meninngkatkan fungsi kognitif. Hasil analisa darah pada tikus yang diberi ekstrak etanol sebanyak 300 mg/kg bobot badan, cenderung memiliki Hb yang lebih tinggi dan peningkat seiring dengan meningkatnya nilai persen hematokrit/PCV yang disebabkan oleh meningkatanya jumlah sel darah merah yang beredar pada sirkulasi perifer. Gambaran darah demikian sangat mungkin menjelaskan bahwa pemberian ektrak pegagan pengeluaran darah merah ke sirkulasi perifer, sehingga meningkatkan nilai Hb yang secara fisiologis menggambarkan tingkat kecukupan asupan gizi. Peningkatan nilai Hb yang pada akhirnya akan meningkatkan kemampuan mengikat jumlah O2 untuk didestribusikan ke seluruh sel dalam jaringan tubuh.. Peningkatan jumlah O2 terangkut akan menjamin pemenuhan kebutuhan metabolisme aerob dalam sel yang terjadi dalam pemenuhan energi untuk Gambar 21 Mekanisme penyerapan Ca dari usus (Sumber: http://quizlet.com/ 4867071/16-calcium-physiology-flash-cards/) aktivitas. Hal ini selaras dengan hasil pengamatan aktivitas yang meningkat pada kelompok tikus yang diberi ekstrak pagagan. Peningkatan aktivitas otot motorik tentunya ada beberapa faktor yang berperan di dalamnya selain ketersediaan O2, diantaranya ketersediaan Ca++, mineral makro secaara umum (Ca, F dan Mg) sangat dominan peranannya pada aktivitas neuromuskular yang mencakup penyediaan energi dan transmisi impuls syaraf. Demikian juga halnya dengan aktivitas fungsi syaraf, mineral makro juga mempunyai peran yang cukup penting. Ketersediaan Ca++ tentunya dipengaruhi oleh penyerapan Ca++ di dalam usus, dan penyerapan Ca++ tersebut dipengaruhi oleh keberadaan calcium binding protein. Gambar 21 menjelaskan mekanisme penyerapan Ca++ dari usus yang difasilitasi oleh calcium binding protein. Linder (2006) melaporkan bahwa kalsium merupakan mineral makro yang juga berperan pada kontraksi otot. Kontraksi otot terutama diatur oleh konsentrasi Ca++ bebas di dalam sitosol. Berbagai stimulus yang menginduksi kontraksi otot memicu peningkatan Ca++ bebas di dalam sitosol. Funsi Ca++ intraseluler selain berperan pada kontraksi otot, juga terlibat dalam sekresi neurotransmiter, hormon dan enzim, aktivasi limfosit dan proliferasi. Gambar 22 Mekanisme terjadinya kontraksi otot yang diperantarai oleh penggunaan Ca dan ATP (Sumber: http://www.easyvigour.net.nz/ trigger_ points/h_triggerpoint4.htm) Peran Ca++ dalam mekanisme terjadinya kontraksi otot secara umum terkait dengan ketersediaan energy (ATP) di dalam sel otot. Secara singkat proses kontraksi terjadi karena pemendekan unit sarkomir otot lurik yang disusun oleh serat aktin dan myosin. Ketersediaan Ca++ dan energi yang tinggi dalam myosin akan mengikat aktin dan terjadi kontraksi. Secara skematis proses terjadinya kontraksi dijelaskan pada gambar 22. Kontraksi otot juga dirangsang oleh calcium binding protein yang sudah terikat dengan protein allosteric effector. Selanjutnya calcium binding protein bentuk aktif tersebut merangsang pembentukan ATP dari glikogen otot dengan bantuan glycogen posporilasekinase yang pada akhirnya merangsang terjadinya kontraksi otot. Pembentukan ATP pada mekanisme kontraksi otot tidak hanya berasal dari glikogen otot, tapi dapat juga dari sumber lainnya (Gambar 23). Gambar 23 Penggunaan ATP pada kontraksi (Sumber: http://users.rcn.com/ Jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/M/Muscle.htm1) Hasil Imunohistokimia pada area hipokampus CA3 kelompok penerima ektraks etanol daun pegagan menunjukan angka rata-rata populasi sel yang positif terhadap Calbindin lebih besar (39,56 %) dibandingkan dengan control (34,75 %) Berdasarkan penjelasan tentang mekanisme terjadinya kontraksi otot maka dapat dipahami bahwa peningkatan populasi sel yang positif terhadap Calbindin yang terjadi sangat mungkin mengindikasikan terjadinya peningkatan pembentukan ATP yang terkait dengan peningkatan aktivitas dan pencapaian titik finish pada Tmaze test yang dilakukan. Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa calbindin merupakan faktor utama yang menyebabkan terjadinya peningkatan aktivitas. Pada penelitian ini, pengaruh calbindin tidak hanya pada pemanfaatan ATP sebagai sumber energi untuk kontraksi otot tapi juga efektif sebagai buffer ion Ca2+ dalam lingkungan seluler sehingga dapat mengatur Ca2+-dependent dari fungsi neuron, dengan demikian kerja neuron di bagian CA3 hipokampus lebih optimal. Keberadaan asiatikosida yang terkandung di dalam ekstrak pegagan dan gambaran hematologi yang didapat setidaknya dapat diajukan dua pendekatan mekanisme yang mungkin dapat menjelaskan kerja ekstrak pegagan dalam meningkatkan fungsi kognitif. Kemungkinan mekanisme pertama terkait dengan fungsi pegegan sebagai tonikum seperti yang dipahami berkemampuan dalam memperbaiki metabolism sel secara umum. Peningkatan metabolisme pada sel otot kerangka berdampak pada kesiapan tikus dalam beraktivitas di dalam Tmaze sebagaimana terlihat pada kelompok yang diberi ekstrak pegagan. Pada kemungkinan mekanisme ke dua sangat mungkin terkait dengan fungsi senyawa asiatikosida yang dapat berperan sebagai anti-oksidan yang mampu mengamankan sel saraf dari kerusakan oksidatif. Gambar 24 Skema peningkatan fungsi kognitif setelah pemberian ekstrak daun pegagan selama 8 minggu Berdasarkan data yang diperoleh pada penelitian dengan menggunakan tikus usia produktif dapat dijelaskan bahwa peningkatan fungsi kognitif yang diperoleh karena pemberian ekstrak etanol daun pegagan dicapai melalui peningkatan kinerja neuron hipokampus di region CA3 yang ditandai dengan meningkatnya populasi sel yang positif terhadap calbindin dan kinerja otot melalui peningkatan aktivitas (neuro muskular). Peningkatan tersebut diperoleh melalui perbaikan metabolisme secara umum yang ditandai dengan adanya unsur mineral makro dan mikro serta pengaruh dari asiatikosida dan senyawa flavonoid yang berfungsi sebagai antioksidan penangkap radikal bebas. Secara skematis peningkatan fungsi kognitif dijelaskan pada Gambar 24. Data ini mengindikasikan bahwa penggunaan sebanyak 300 mg/kg bobot badan untuk jangka waktu pemakaian 8 minggu adalah lebih tepat. Berdasarkan data tersebut dapat dipahami bahwa efek klinis yang ditimbulkan pada penggunaan ekstrak etanol daun pegagan tidak menggambarkan hubungan linier dengan jumlah pemberian. Laporan sebelumnya menyebutkan bahwa ekstrak air pegagan bermanfaat untuk fungsi kognitif sedangkan ekstrak etanol tidak memberi pengaruh yang positif, namun sebaliknya pada penelitian ini. Jika dilihat dari keberadaan jenis mineral yang dianalisis, di dalam ekstrak air semua mineral yang dianalisis kandungannya lebih banyak dibandingkan dengan ekstrak etanol. Berdasarkan kandungan mineral, seharusnya ekstrak air pegagan memberikan pengaruh yang lebih baik dibandingkan dengan ekstrak etanol, namun pada penelitian ini hasil yang diperoleh sebaliknya. Berdasarkan data tersebut dapat dipahami bahwa efek dari suatu sediaan tidak hanya dipengaruhi oleh kandungan zat gizinya tapi juga dipengaruhi oleh faktor lainnya misalnya kemampuan usus untuk menyerap zat gizi tersebut. 98 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Di dalam ekstrak etanol dan ekstrak air daun pegagan terkandung mineral makro dan mikro serta senyawa asiatikosida. Ekstrak etanol daun pegagan bermanfaat untuk meningkatkan profil hematologi dan aktivitas. Ekstrak etanol dan ekstrak air daun pegagan tidak berpengaruh terhadap pertambahan bobot badan harian. Profil hematologi pada kelompok level 2 yang diberi ekstrak etanol cenderung lebih baik dibandingkan dengan kelompok lainnya. Terdapat 3 jenis tingkah laku yang dominan pada tikus yaitu berjalan, memanjat dan membaui. Tikus yang aktif cenderung mempunyai gambaran darah lengkap yang lebih baik. Tikus kontrol menunjukkan tingkah laku yang tidak aktif. Tikus dari kelompok yang diberi ekstrak etanol menunjukkan peningkatan aktivitas dari minggu ke minggu. Tikus kontrol tidak ada yang mencapai titik finish, sedangkan pada kelompok perlakuan persentase tikus yang mencapai titik finish bervariasi dan tertinggi di jumpai pada level 3. Pada penelitian ini, waktu untuk mencapai titik finish tidak menggambarkan tingkat aktivitas dari masingmasing kelompok percobaan. Persentase dan frekuensi pencapaian titik finish serta pola aktivitas di dalam maze lebih tepat digunakan sebagai indikator untuk mengukur tingkat aktivitas dan kecerdasan. Secara imunohistokimia, populasi sel neuron yang positif terhadap antibodi calbindin pada kelompok yang diberi ekstrak etanol lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol. Ekstrak pegagan tidak berpengaruh terhadap populasi sel glial pada hipokampus di region CA3. Dengan demikian dapat ditegaskan bahwa salah satu mekanisme peningkatan fungsi kognitif karena pemberian ekstral etanol daun pegagan yang digambarkan dengan peningkatan aktivitas adalah melalui mekanisme calbindin pathways. Berdasarkan parameter profil hematologi, aktivitas dan populasi neuron yang positif terhadap calbindin maka kelompok level 2 yang diberi ekstrak etanol daun pegagan (300 mg ekstrak/kg bobot badan, ekivalen dengan 48,09 mg asiatikosida/kg bobot badan) memberi pengaruh yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok lainnya. Ekstrak etanol daun pegagan bermanfaat untuk meningkatkan aktivitas dan pembelajaran pada tikus. Saran Perlu dilakukan penelitian yang lebih luas tentang mekanisme, aplikasi pada manusia dan peluang pasar yang mencakup: 1. Penelitian praklinis pada kelompok umur yang lebih muda (1-2 minggu) dan kelompok umur tua (>2 tahun). 2. Pengujian klinis sebagai pangan fungsional atau suplemen pada semua kelompok umur dengan berbagai macam varian produk berbasis pegagan. 3. Uji efikasi pada berbagai macam keadaan klinis. 4. Kajian potensi pegagan sebagai pangan fungsional dan obat tradisional. 5. Uji daya terima dan keamanan produk dari berbagai macam varian produk. 100 DAFTAR PUSTAKA Afrida A. 2009. Pengaruh pemupukan fosfor terhadap pertumbuhan dan produksi tanaman pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) di dataran tinggi. Skripsi. Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor, Bogor. Anand T, Kumar GP, Ilaiyaraja N, Khanum F, Bawa AS. 2012. Effect of asiaticosida rich extract from Centella asiatica (L.) Urb. on physical fatigue induced by weight-loaded forced swim test. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances, 7(9):832-841. Anwar R. 1988. Pengaruh pemberian ekstrak daun gamal Gliricidia sepium (Jacq) Steud. Terhadap beberapa nilai hematologis tikus putih (Rattus norvegicus strain albino. Disertasi. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor. Atukorala, TMS, Waidyanatha US de S. 1987. Zinc and copper content of some common foods. J. Natn. Sci. Coun. Sri Lanka, 15(1): 61-69. Aziz ZA et al. 2007. Production of asiaticoside and madecassoside in Centella asiatica in vitro and in vivo. Biologia Plantarum, 51 (1): 34-42. Babu TD, Kuttan G, Padikkala J. 1995. Cytotoxic and anti-tumour properties of certain taxa of umbelliferae with special reference to Centella asiatica (L.) Urban. Journal of Ethnopharmacology, 48: 53-57. Baune BT, Wiede F, Braun A, Golledge J, Arolt V, Koerner H. 2008. Cognitive dysfunction in mice deficient for TNF- and its receptors. American Journal of Medical Genetics Part B: Neuropsychiatric Genetics, 147B(7):10561064. Bermawie N, Purwiyanti S, Mardiana. 2008. Keragaan sifat morfologi, hasil dan mutu plasma nutfah pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.). Bul. Littro, 19(1):1- 17. Borchers AT et al. 1997. Complementary Medicine: A review of immunomodulatory effects of Chinese herbal medicines. Am J Clin Nutr, 66: 1303-12. Buckle KA, Edward RA, Fleet GH, Wootton M. 2007. Ilmu Pangan. Purnomo H, Adiono, Penerjemah; Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Food Science. Celio MR. 1990. Calbindin D-28k and parvalbumin in the rat nervous system. Neuroscience, 35:375-47. Chard PS, Bleakman D, Christakost S, Fullmer CS, Miller RJ. 1993. Calcium buffering properties of calbindin D28k and parvalbumin in rat sensory neurones. Journal of Physiology, 472:341-357. Cotter D, Mackay D, Landau S, Kerwin R, Everall I. 2001. Reduced glial cell density and neuronal size in the anterior cingulate cortex in major depressive disorder. Arch Gen Psychiatry, 58:545-553. Defagot MC, Malchiodi EL, Villar MJ, Antonelli MC. 1997. Distribution of D4 dopamine receptor in rat brain with sequence-specific antibodies. Molecular Brain Research, 45:1-12. devRies HA, Housh TJ. 1994. Physiology of exercise for physical education, athletics and exercise science. 5th ed. Brown & Benchmark Publishers, Medison, Wisconsin Dubuque, Iowa. Driscoll et al. 2003. The Aging Hippocampus: Cognitive, biochemical and structural findings. Cerebral Cortex, 13:1344-1351. Farouq. 2003. Ekstrak sebagai salah satu pengembangan bentuk obat tradisional. Seminar POKJANAS TOI XXIII. Unversitas Pancasila, Jakarta. hal. 12. Gnanapragasam et al. 2007. Adriamycin induced myocardial failure in rats: Protective role of Centella asiatica. Molecular and Cellular Biochemistry, 294: 55–63. Gupta S, Lakshmi AJ, Manjunath MN, Prakash J. 2005. Analysis of nutrient and antinutrient content of underutilized green leafy vegetables. LWT, 38: 339– 345. Hamid AA, Shah ZM, Muse R, Mohamed S. 2002. Characterisation of antioxidative activities of various extracts of Centella asiatica (L) Urban. Food Chemistry, 77: 465–469. Harborne JB. 1987. Metode fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. K Padmawinata, I Sudiro, penerjemah; Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Method. Harborne JB. 1996. Metode Fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. K Padmawinata, I Sudiro, Penerjemah; Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Method. Hartanto H. 1996. Penuaan dan Kapasitas Kerja. Doewes M, penerjemah; Jakarta: EGC Penerbit Buku Kedokteran. Terjemahan dari: Aging and working capacity. Hartog A, Smit HF, M van der KV, Hoijer MA, Garssen J. 2009. In vitro and in vivo modulation of cartilage degradation by a standardized Centella asiatica fraction. Experimental Biology and Medicine, first published online March 23, as doi:10.3181/0810-RM-298. Hinwood M, Ross JT, Janine LC, Sarah BB, Trevor AD, Walker FR. 2012. Chronic Stress Induced Remodeling of the Prefrontal Cortex: Structural reorganization of microglia and the inhibitory effect of minocycline. Cereb. Cortex, June 17 Hong SS, Kim JH, Hong L, Shim CK. 2005. Advanced formulation and pharmacological activity of hydrogel of the titrated extract of C. asitica. Arch Pharm Res, 28 (4): 502-508. Hussin et al. 2007. Protective effect of Centella asiatica extract and powder on oxidative stress in rats. Food Chemistry, 100: 535–541. Indrayan AK, Sharma S, Durgapal D, Kumar N, Kumar M. 2005. Determination of nutritive value and analysis of mineral elements for some medicinally valued plants from Uttaranchal. Current Science, 89(7): 1252-1255. Jacobsen et al. 2004. Relationship of hemoglobin levels to fatigue and cognitive functioning among cancer patients receiving chemotherapy. Journal of Pain and Symptom Management, 28(1):7–18. Jayathirtha MG, S H Mishra. 2004. Preliminary immunomodulatory activities of methanol extracts of Eclipta alba and Centella asiatica. Hytomedicine International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology, 11(4):361365. Jones PJ, Jew S. 2007. Functional food Development: Concept to reality. Trends in Food Science & Technology, 18(7): 387-390. Joshi, H, Parle M. 2006. Brahmi rasayana improves learning and memory in mice. eCAM, 3(1):79–85. Kettenmann H, Hanisch UK, Noda M, Verkhratsky A. 2011. Physiology of microglia. Physiol Rev, 91: 461-553. Khan ZU, Gutierrez A, Martin R, Penafiel A, Rivera A, Calle ADL. 1998. Differential Regional and Cellular Distribution of Dopamine D2-Like Receptors: An immunocytochemical study of subtype-specific antibodies in rat and human brain. The Journal Of Comparative Neurology, 402:353-371. Kim et al. 2007. Enhanced production of asiaticoside from hairy root cultures of Centella asiatica (L.) Urban elicited by methyl jasmonate. Plant Cell Rep, 26: 1941–1949. Kim OT, Kim MY, Hong MH, Ahn JC, Hwang B. 2004. Stimulation of asiaticoside accumulation in the whole plant cultures of Centella asiatica (L.) Urban by elicitors. Plant Cell Rep, 23:339–344. Kiuru P, Kirigua VO, Mukiama TK, Mathini K, Cheluget W, Manyeki L. 2010. Effect of media substrates on growth and yield of pennywort (Centella asiatica (L.). 12th KARI Scientific Conference Proceeding. 593-596. Komarawinata HD. 2007. Budidaya dan pascapanen tanaman obat untuk meningkatkan kadar bahan aktif. Unit Riset Pengembangan PT. Kimia Farma. Kormin S. 2005. The effect of heat processing on triterpene glycosides and Antioxidant activity of herbal pegaga (Centella asiatica L. Urban) drink. Thesis. Engineering (Bioprocess) Faculty of Chemical and Natural Resources Engineering Universiti Teknologi Malaysia. Kristina NN, Kusumah ED, Lailani PK. 2009. Analisis fitokimia dan penampilan polapita protein tanaman pegagan (Centella asiatica) hasil konservasi in vitro. Bul. Littro, 20(1):11 – 20. Kurniasari D. 1999. Identifikasi dan uji senyawa alkaloid daun tembakau terinfeksi Virus Mozaik. Skripsi. Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Diponegoro, Semarang. Kurniawati A, Darusman LK, Rachmawati RY. 2005. Pertumbuhan, produksi dan kandungan triterpenoid dua jenis pegagan (Centella asiatica L. (Urban) sebagai bahan obat pada berbagai tingkat naungan. Bul. Agron, 33(3): 62 – 67. Lailani PK. 2008. Analisis keragaman protein dan fitokimia tanaman pegagan (Centella asiatica) hasil perbanyakan in vitro. Skripsi. Program Studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Lee, HB, Blaufox MD. 1985. Blood volume in the rat. J Nucl Med, 25:72-76. Lee et al. 2000. Asiatic acid derivatives protect cultured cortical neurons from glutamate-induced excitotoxicity. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 108: 75–86. Lehninger AL. 1982. Dasar-dasar biokimia. Thenawidjaya M, Penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry. Leranth C, Ribak CE. 1991. Calcium-Binding Proteins are Concentrated in the CA2 Field of the Monkey Hippocampus: A possible key to this region's resistance to epileptic damage. Exp Brain Res, 85(1):129-36. Linder MC. 2006. Biokimia nutrisi dan metabolism dengan pemakaian secara klinis. Ed. M.C. Linder. (Penerjemah Aminuddin Parakkasi). UI-PRESS. Lusiana H. 2009. Isolasi dan uji anti plasmodium secara in vitro senyawa alkaloid dari Albertisia papuana Becc. Tesis. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor. Mangas et al. 2008. Triterpenoid saponin content and the expression level of some related genes in calli of Centella asiatica. Biotechnol Lett. 30:1853– 1859. Mato L et al. 2001. Centella asiatica improves physical performance and healthrelated quality of life in healthy elderly volunteer. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 1-7 Maquart et al. 1999. Triterpenes from Centella asiatica stimulate extracellular matrix accumulation in rat experimental wounds. European Journal of Dermatology. 9 (4): 289-96. McAfoose J, Koerner H, Baune BT. 2009. The effects of TNF deficiency on agerelated cognitive performance. Psychoneuroendocrinology, 34(4): 615-619. Mckittrick et al. 2000. Chronic social stress reduces dendritic arbors in CA3 of hippocampus and decreases binding to serotonin transporter sites. Synapse, 36:85–94. Meutia N, Ibrahim N. 2008. Pengaruh pemberian ekstrak daun pegagan (Centella asiatica) peroral pada nafsu makan kadar glukosa dan kadar ghrelin dalam plasma darah tikus. http://repository.usu.ac.id/handle/123456789/6172. Musyarofah N, Susanto S, Aziz SA, Kartosoewarno S. 2007. Respon tanaman pegagan (Centella asiatica L. Urban) terhadap pemberian pupuk alami di bawah naungan. Bul. Agron. 35(3): 217-224 Newman EA. 2003. Glial cell inhibition of neurons by release of ATP. The Journal of Neuroscience, 23(5):1659-1666. Nugroho AA. 2009. Evaluasi potensi hasil dan mutu enam nomor harapan pegagan (centella asiatica L. (urban)) pada dua lokasi dataran rendah. Skripsi. Program Studi Pemuliaan Tanaman dan Teknologi Benih, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor Nurjanah NN. 2008. Studi karakter agronomi pada 17 aksesi pegagan (Centella asiatica (L.) Urban). Skripsi. Program Studi Agronomi, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor, Bogor. Odhav B, Beekrum S, Akula U, Baijnath H. 2007. Preliminary assessment of nutritional value of traditional leafy vegetables in KwaZulu-Natal, South Africa. Journal of Food Composition and Analysis, 20:430-435. Padmaja et al. 2002. Brine shrimp lethality bioassay of selected Indian medicinal plants. Fitoterapia, 73: 508–510. Pelvig DP, Pakkenberg H, Stark AK, Pakkenberg B. 2008. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiol Aging, 29(11):1754-62. Plaeger SF. 2003. Clinical immunology and traditional herbal medicines. Clin. and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (3): 337–338. Pramono S. 2005. Penanganan pasca panen dan pengaruhnya terhadap efek terapi obat alam. Seminar Pokjanas TOI XXVIII. Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. Bogor. Hal.1-6. Punturee K, Christopher PW, Watchara K, Usanee V. 2005. Immunomodulatory activities of Centella asiatica and Rhinacanthus nasutus extracts. Asian Pacific J Cancer Prev, 6: 396-400. Rajkumar S, Jebanesan A. 2005. Larvicidal and adult emergence inhibition effect of Centella asiatica Brahmi (Umbelliferae) against mosquito Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). African Journal of Biomedical Research, 8: 31 – 33. Rao MKG, Rao MS, Rao GS. 2005. Centella asiatica (Linn) induced behavioural changes during growth spurt period in neonatal rats. Neuroanatomy, 4: 18–23. ______, et al. 2006. Centella asiatica (L.) leaf extract treatment during the growth spurt period enhances hippocampal CA3 neuronal dendritic arborization in rats. eCAM, 3 (3): 349–357. ______, et al. 2007. Enhancement of amygdaloid neuronal dendritic arborization by fresh leaf juice of Centella asiatica (Linn) during growth spurt period in rats. eCAM Advance Access published August 13. Rao VG, Shivakumar HG, Parthasarathi G. 1996. Influence of aqueous extract of Centella as/at/ca (Brahmi) on experimental wounds in albino rats. Indian Journal of Pharmacology, 28 : 249-253. Rasyid R, Mahyuddin, Agustin M. 2011. Pemeriksaan kadar kalium dan natrium pada herba Centella asiatica (L) Urban dengan metoda fotometri nyala. Scientia, 1(2): 12-16. Riyadi H, Marliyati SA, Yuliani S, Mulyawanti I, Mirza I. 2011. Pengembangan produk pangan fungsional berbasis pegagan (Centella asiatica) sebagai peningkat daya ingat. Laporan KKP3T, Institut Pertanian Bogor Bekerjasama dengan Sekretariat Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Sagrawat H, Yaseen KM. 2007. Immunomodulatory Plants: phytopharmacological review. Pharmacognosy Reviews. 1: 248-260. A Samy RP, Ignacimuthu, Vincent TKC. 2011. Antimicrobial and phytochemical analysis of Centella asiatica (L.). Nature Precedings: hdl:10101/npre. 2011.6033.1. Satake T, Kamiya K, Yin A, Oishi T, Yamamoto J. 2007. The anti-thrombotic active constituents from Centella asiatica. Biol. Pharm. Bull. 30(5): 935— 940. Sharma R, Jaimala. 2003. Alteration of acid phosphatase activity in the liver of gamma irradiated mouse by Centella asiatica. Asian J. Exp. Sci, 17 (1&2): 1-9. Shetty BS, Udupa SL, Udupa AL. 2008. Biochemical analysis of granulation tissue in steroid and Centella asiatica (Linn) treated rats. Pharmacologyonline, 2: 624-632. Shukla et al. 1999. In vitro and in vivo wound healing activity of asiaticoside isolated from Centella asiatica. Journal of Ethnopharmacology, 65: 1–11. Sidiarto LD, Kusumoputro S. 2003. Memori anda setelah usia 50. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press). Sidik, Mudahar H. 2000. Ekstraksi tumbuhan obat, metode dan faktor-faktor yang mempengaruhi mutunya. Makalah pada seminar sehari Perhipba Komasariat jakarta. Universitas 17 Agustus 1945. Jakarta 8 hal. Sihombing M, Tuminah S. 2011. Perubahan nilai hematologi, biokimia darah, bobot organ dan bobot badan tikus putih pada umur berbeda. Jurnal Veteriner, 12(1): 58-64 Sinambela JS. 2003. Standarrisasi sediaan obat herba. Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXIII. Universitas Pancasila, Jakarta. Hal.10. Siró I, Kápolna E, Kápolna B, Lugasi A. 2008. Functional food product development, marketing and consumer acceptance: A review. Appetite, 51(3): 456-467. Somchit et al. 2004. Antinociceptive and antiinflammatory effects of Centella asiatica. Indian J Pharmacol, 36: 377-380. Sripanidkulchai K, Techataweewan N, Tumsan Y, Pannangrong W, Sripanidkulchai B. 2007. Prevention of indomethacin-induced gastric ulcers in rats by extract from leaves of Centella asiatica. Siriraj Med J, 59: 122-124. Sturrock RR. 1976. Changes in the total number of neuroglia, mitotic cells and necrotic cells in the anterior limb of the mouse anterior commnissure following hypoxic stress. J. Anat. 122( 2):447-453. Suaskara IBM, Kusumorini N, Nurhidayat. 2007. Pertumbuhan dan aktivitas anak tikus pada pemaparan Cahaya yang berbeda. http://ejournal.unud.ac.id/ abstrak/naskah%20i%20b%20suaskara%20tikus%20_3_%20rtf.pdf. Subban R, Veerakumar A, Manimaran R, Hashim KM, Balachandran I. 2008. Two new flavonoids from Centella asiatica (Linn.). J Nat Med. 62: 369– 373. Sunarni T, Pramono S, Asmah R. 2007. Flavonoid antioksidan penangkap radikal dari daun kepel (Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook f. & Th.). Majalah Farmasi Indonesia, 18(3):111-116. Suwantong O, Ruktanonchai U, Supaphol P. 2008. Electrospun cellulose acetate fiber mats containing asiaticoside or Centella asiatica crude extract and the release characteristics of asiaticoside. Polymer, 49: 4239–4247. Taemchuay D, Rukkwamsuk T, Sukpuaram T, Ruangwises N. 2008. A study on antibacterial activity of crude extracts of Asiatic Pennywort and Water Pennywort against Staphylococcus aureus. 34th Congress on Science and Technology of Thailand. Temjenmongla, Arun KY. 2005. Anticestodal efficacy of folklore medicinal plants of Naga tribes in North-East India. Afr. J. Trad. CAM, 2 (2): 129 – 133. Teratanavat R, Hooker NH. 2006. Consumer valuations and preference heterogeneity for a novel functional food. Journal of Food Science, 71(7): S533–S541. Thongnopnua P. 2008. High-performance liquid chromatographic determination of asiatic acid in human plasma. Thai J. Pharm. Sci. 32: 10-16. Tulving E, Markowitsch HJ. 1998. Episodic and Declarative Memory: Role of the hippocampus. Hippocampus, 8:198–204. Veerendra KMH, Gupta YK. 2002. Effect of different extracts of Centella asiatica on cognition and markers of oxidative stress in rats. J. Ethnopharmacol. 79: 253–260. Wang XS, Duan JY, Fang JN. 2004. Structural features of a polysaccharide from Centella asiatica. Chinese Chemical Letters, 15 (2): 187 – 190. Wang XS, Liu L, Fang JN. 2005. Immunological activities and structure of pectin from Centella asiatica. Carbohydrate Polymers, 60 : 95–101. Wattanathorn et al. 2008. Positive modulation of cognition and mood in the healthy elderly volunteer following the administration of Centella asiatica. Journal of Ethnopharmacology, 116: 325–332. Widowati L, Pudjiastuti D, Idrari, Sundari D. 1992. Beberapa informasi khasiat keamanan dan fitokimia tanaman pegagan (Centella asiatica L. Urban). Warta Tumbuhan Obat Indonesia. 1 (2): 39-42. Wildman REC, Kelley M. 2007. Nutraceuticals and Functional Foods. Handbook of nutraceuticals and functional foods. 2nd ed. Edited by Robert E.C. Wildman. CRC Press-Boca Raton London New York. 1-21. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia. Witter MP. 2007. CA3 and Memory/Review: Intrinsic and extrinsic wiring of CA3: Indications for connectional heterogeneity. Learn. Mem. 14: 705-713. Yoshida et al. 2005. Antiproliferative constituents from umbelliferae plants VII. Active triterpenes and rosmarinic acid from Centella asiatica. Biol. Pharm. Bull. 28(1) 173—175. Zaidel DW. 1999. Quantitative morphology of human hippocampus early neuron development. The Anatomical Record, 254:87–91. Zainol MK, Abd-Hamid A, Yusof S, Muse R. 2003. Antioxidative activity and total phenolic compounds of leaf, root and petiole of four accessions of Centella asiatica (L.) Urban. Food Chemistry, 81: 575–581. Zainol NA, Voo SC, Sarmidi MR, Aziz RA. 2008. Profiling of Centella asiatica (L.) Urban Extract. The Malaysian Journal of Analytical Sciences, 12 (2): 322 -327. Zhang et al. 2009. Chemical fingerprinting and hierarchical clustering analysis of Centella asiatica from different locations in China. Chromatographia, 69 (1/2): 51–57. LAMPIRAN Lampiran 1 Data bobot badan (gr) kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan Tanggal Penimbangan 9-10-10 No Tikus 1 2 3 4 Kontrol 273 293 281 243 Level 1 278 283 253 266 Level 2 304 240 299 322 Level 3 243 266 295 268 11-10-10 1 2 3 4 259 275 268 234 276 281 239 260 299 236 289 321 246 264 310 276 13-10-10 1 2 3 4 248 263 257 224 263 266 230 245 286 227 278 310 236 257 292 266 15-10-10 1 2 3 4 255 277 270 237 299 298 259 278 318 248 307 346 255 283 327 292 17-10-10 1 2 3 4 266 289 279 247 307 309 266 282 331 258 319 356 257 294 328 302 19-10-10 1 2 3 4 277 303 305 262 318 316 275 294 341 263 324 368 264 302 335 308 21-10-10 1 2 3 4 276 304 292 255 322 324 280 295 339 269 328 372 270 307 342 318 23-10-10 1 2 3 4 289 310 266 309 321 332 282 291 349 274 332 377 277 314 348 324 25-10-10 1 2 3 4 295 321 317 276 328 336 286 299 365 287 339 387 283 319 351 329 Tanggal Penimbangan 27-10-10 No Tikus 1 2 3 4 Kontrol 304 328 313 278 Level 1 333 342 291 304 Level 2 362 288 344 393 Level 3 282 329 356 342 29-10-10 1 2 3 4 315 331 322 284 337 347 296 306 365 292 350 395 288 328 360 342 31-10-10 1 2 3 4 320 335 325 285 338 349 296 306 369 294 354 402 293 336 362 344 2-11-10 1 2 3 4 318 338 320 288 340 335 302 309 376 301 360 403 296 337 367 350 4-11-10 1 2 3 4 323 345 327 290 341 303 328 312 378 303 355 406 293 335 362 354 6-11-10 1 2 3 4 322 334 327 293 340 301 321 309 378 305 360 411 295 335 373 360 8-11-10 1 2 3 4 332 343 336 291 349 306 313 317 376 310 364 416 301 340 379 360 10-11-10 1 2 3 336 345 298 344 309 321 318 354 412 309 339 373 12-11-10 1 2 3 335 340 295 346 309 319 313 356 416 304 338 378 14-11-10 1 2 3 343 351 303 350 321 332 319 370 424 312 340 392 16-11-10 1 2 3 1 346 355 303 354 348 327 330 349 320 367 422 320 307 338 389 306 18-11-10 Tanggal Penimbangan No Tikus 2 3 Kontrol 353 302 Level 1 326 326 Level 2 367 421 Level 3 345 388 20-11-10 1 2 3 357 354 304 350 334 327 320 370 428 309 341 389 22-11-10 1 2 3 345 348 301 345 332 326 318 362 420 305 336 386 24-11-10 1 2 3 349 357 307 350 338 331 314 367 422 306 348 395 26-11-10 1 2 3 359 363 302 358 344 335 309 377 427 309 347 395 29-11-10 1 2 3 362 363 309 366 350 338 314 382 433 318 346 403 1-12-10 1 2 3 365 366 310 369 359 344 315 385 431 322 353 405 3-12-10 1 2 3 367 367 311 370 360 346 316 389 437 327 364 410 5-12-10 1 2 3 367 373 317 371 365 344 316 383 435 327 360 409 7-12-10 1 2 3 375 377 320 373 372 347 316 395 441 327 357 412 10-12-10 1 2 3 376 380 322 377 376 350 319 396 444 332 366 413 12-12-10 1 2 3 379 380 325 375 378 345 320 396 348 329 365 409 Lampiran 2 Data bobot badan (gr) kelompok tikus yang diberi ekstrak air daun pegagan Tanggal Penimbangan 22-2-11 No Tikus 1 2 3 4 5 Kontrol 179 182 158 134 184 Level 1 164 153 163 169 174 Level 2 167 176 146 159 148 Level 3 148 184 154 172 206 24-2-11 1 2 3 4 5 193 193 171 139 206 175 169 170 183 185 178 174 154 168 161 162 197 167 179 221 26-2-11 1 2 3 4 5 208 203 183 150 222 184 182 183 198 200 203 192 165 190 180 176 212 180 190 240 28-2-11 1 2 3 4 5 203 196 182 146 215 184 176 181 192 196 196 177 162 186 169 171 212 182 186 234 2-3-11 1 2 3 4 5 209 201 188 150 229 194 183 188 200 204 200 181 165 192 177 177 219 193 197 246 4-3-11 1 2 3 4 5 226 208 195 157 240 202 192 198 208 212 208 181 174 202 194 185 232 201 208 262 6-3-11 1 2 3 4 5 232 211 203 163 248 207 199 199 211 215 223 190 183 205 196 190 246 210 214 277 8-3-11 1 2 3 4 5 1 244 217 212 169 259 253 218 208 207 224 222 227 236 200 191 218 203 237 197 254 214 219 281 204 10-3-11 Tanggal Penimbangan No Tikus 2 3 4 5 Kontrol 234 222 176 278 Level 1 219 217 232 231 Level 2 203 202 226 218 Level 3 266 220 226 287 12-3-11 1 2 3 4 5 254 234 225 179 274 239 227 224 242 233 250 215 210 235 221 207 267 228 225 294 14-3-11 1 2 3 4 5 243 219 211 168 257 223 213 209 226 221 235 202 195 220 206 193 243 212 210 276 16-3-11 1 2 3 4 5 260 240 229 183 282 243 235 226 245 240 255 221 210 241 224 206 272 232 228 297 18-3-11 1 2 3 4 5 270 244 232 190 291 254 240 236 259 244 260 231 220 245 229 213 281 236 231 304 20-3-11 1 2 3 4 5 276 247 239 192 297 259 247 242 264 256 264 238 225 253 239 219 286 242 236 320 1 2 3 4 5 278 246 239 195 297 266 253 243 268 256 265 243 228 251 233 221 288 245 236 323 24-3-11 1 2 3 4 5 284 254 244 198 309 271 259 249 276 260 277 250 234 260 245 226 296 247 241 334 26-3-11 1 287 272 252 229 22-3-11 Tanggal Penimbangan No Tikus 2 3 4 Kontrol 256 246 200 Level 1 263 250 278 Level 2 236 262 237 Level 3 296 251 244 28-3-11 1 2 3 4 292 260 248 199 271 265 254 284 255 240 267 243 234 301 250 245 30-3-11 1 2 3 4 294 262 251 206 277 271 256 281 261 243 275 246 234 305 255 247 1-4-11 1 2 3 4 303 264 250 206 279 277 260 287 261 242 276 247 234 309 256 249 3-4-11 1 2 3 4 306 268 261 213 282 279 266 287 261 251 283 252 245 313 262 251 5-4-11 1 2 3 4 312 274 264 215 290 285 270 294 271 255 288 254 244 315 264 254 7-4-11 1 2 3 4 308 272 269 217 290 288 272 294 276 259 285 258 249 318 268 257 9-4-11 1 2 3 4 316 279 277 219 293 292 279 298 278 263 287 260 253 322 271 260 11-4-11 1 2 3 4 318 283 275 219 293 293 282 303 277 269 290 265 255 326 279 260 13-4-11 1 2 3 321 282 279 298 303 282 276 276 295 253 326 277 Tanggal Penimbangan No Tikus 4 Kontrol 224 Level 1 304 Level 2 272 Level 3 262 15-4-11 1 2 3 4 327 287 282 224 300 301 293 306 289 279 302 273 258 327 284 265 17-4-11 1 2 3 4 322 284 285 223 296 292 292 309 285 276 302 272 255 330 281 265 19-4-11 1 2 3 4 327 288 286 223 300 291 296 311 288 282 310 275 260 333 288 269 21-4-11 1 2 3 4 333 290 291 230 306 301 304 318 288 291 307 281 260 340 290 268 23-4-11 1 2 3 4 332 294 290 229 304 306 306 315 294 288 308 280 265 340 288 268 25-4-11 1 2 3 4 334 300 297 236 311 312 313 322 296 290 321 289 267 345 297 276 Lampiran 3 Data total konsumsi pakan (gr) dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan Tgl Pengukuran 16-10-10 17-10-10 18-10-10 19-10-10 20-10-10 21-10-10 22-10-10 23-10-10 24-10-10 25-10-10 26-10-10 27-10-10 28-10-10 29-10-10 30-10-10 31-10-10 1-11-10 2-11-10 3-11-10 4-11-10 5-11-10 6-11-10 7-11-10 8-11-10 9-11-10 10-11-10 11-11-10 12-11-10 13-11-10 14-11-10 15-11-10 16-11-10 17-11-10 18-11-10 19-11-10 20-11-10 21-11-10 22-11-10 23-11-10 24-11-10 25-11-10 26-11-10 27-11-10 28-11-10 Kontrol 104 108 108 115 115 113 113 101 93 97 91 80 79 88 75 74 70 64 68 84 81 68 60 83 99 48 58 56 58 58 56 60 65 62 56 56 102 70 67 70 67 67 93 40 Level 1 103 95 82 92 79 79 76 74 61 81 77 84 82 83 85 70 71 73 58 65 71 65 66 72 61 30 51 58 61 58 59 60 62 54 57 65 101 80 72 72 72 76 104 37 Level 2 84 100 79 94 77 91 90 69 73 96 92 94 97 90 85 80 81 90 81 90 88 85 70 92 79 40 59 66 69 66 66 65 57 60 60 61 112 83 68 68 69 65 98 49 Level 3 65 89 69 89 68 82 87 66 66 75 80 84 72 89 81 72 73 90 71 70 77 87 75 90 82 45 58 59 56 58 61 60 65 65 63 51 104 80 69 74 65 72 105 37 Tgl Pengukuran 29-11-10 30-11-10 1-12-10 2-12-10 3-12-10 4-12-10 5-12-10 6-12-10 7-12-10 8-12-10 9-12-10 10-12-10 11-12-10 12-12-10 13-12-10 Kontrol 60 64 104 59 57 64 65 64 71 73 108 65 69 66 68 Level 1 66 63 70 62 62 63 65 68 70 73 110 67 62 71 71 Level 2 62 65 64 66 64 60 63 67 72 73 116 65 57 69 80 Level 3 58 62 65 61 73 65 67 64 67 69 111 66 57 62 67 Lampiran 4 Data total konsumsi pakan (gr) dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak air daun pegagan Tgl Pengukuran 23-2-11 24-2-11 25-2-11 26-2-11 27-2-11 28-2-11 1-3-11 2-3-11 3-3-11 4-3-11 5-3-11 6-3-11 7-3-11 8-3-11 9-3-11 10-3-11 11-3-11 12-3-11 13-3-11 14-3-11 15-3-11 16-3-11 17-3-11 18-3-11 19-3-11 20-3-11 21-3-11 22-3-11 23-3-11 24-3-11 25-3-11 26-3-11 27-3-11 28-3-11 29-3-11 30-3-11 31-3-11 1-4-11 2-4-11 3-4-11 4-4-11 5-4-11 6-4-11 7-4-11 Kontrol 84 90 90 97 97 94 94 98 98 103 103 106 106 110 110 116 116 117 117 110 110 119 119 123 123 125 125 126 126 129 129 99 99 100 100 101 101 102 102 105 105 107 107 107 Level 1 82 88 88 95 95 93 93 97 97 101 101 103 103 108 108 113 113 117 117 109 109 119 119 123 123 127 127 129 129 132 132 106 106 107 107 109 109 110 110 111 111 114 114 114 Level 2 80 84 84 93 93 89 89 92 92 96 96 100 100 105 105 109 109 113 113 106 106 115 115 119 119 122 122 122 122 127 127 99 99 101 101 103 103 103 103 105 105 107 107 108 Level 3 86 93 93 100 100 99 99 103 103 109 109 114 114 117 117 120 120 122 122 113 113 124 124 127 127 130 130 131 131 134 134 102 102 103 103 104 104 105 105 107 107 108 108 109 Tgl Pengukuran 8-4-11 9-4-11 10-4-11 11-4-11 12-4-11 13-4-11 14-4-11 15-4-11 16-4-11 17-4-11 18-4-11 19-4-11 20-4-11 21-4-11 22-4-11 23-4-11 24-4-11 Kontrol 107 109 109 110 110 111 111 112 112 111 111 112 112 114 114 115 115 Level 1 114 116 116 117 117 119 119 120 120 119 119 120 120 123 123 123 123 Level 2 108 109 109 110 110 112 112 114 114 114 114 116 116 117 117 117 117 Level 3 109 111 111 112 112 112 112 113 113 113 113 115 115 116 116 116 116 Lampiran 5 Kelompok/ No Tikus Kontrol 1 2 3 4 Level 1 1 2 3 4 Level 2 1 2 3 4 Level 3 1 2 3 4 Data skor aktivitas dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan Titik pengamatan (4) (5) (6) (7) (1) (2) (3) (8) (9) (10) 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 2 1 2 2 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 2 4 3 2 2 4 2 1 3 4 3 1 1 4 2 1 1 4 1 1 1 4 2 2 2 4 4 3 1 4 2 1 2 3 4 3 4 1 2 4 4 2 4 4 4 1 2 4 4 1 3 4 4 1 2 4 4 1 2 4 4 1 4 4 4 4 4 4 4 1 3 4 4 4 4 4 4 2 2 2 2 3 3 4 2 4 1 3 3 4 2 4 4 4 4 4 3 4 2 4 3 4 4 4 4 4 4 4 3 4 4 4 4 4 4 4 Lampiran 6 Kelompok/ No Tikus Kontrol 1 2 3 4 5 Level 1 1 2 3 4 5 Level 2 1 2 3 4 5 Level 3 1 2 3 4 5 Data skor aktivitas dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak air daun pegagan Titik pengamatan (4) (5) (6) (7) (1) (2) (3) (8) (9) (10) 2 1 2 1 3 2 1 1 1 1 4 4 1 2 4 3 3 4 2 4 4 3 2 1 1 4 2 4 3 4 4 1 4 2 4 4 2 4 2 4 4 4 3 2 4 4 2 4 2 4 1 1 1 1 2 1 1 1 3 1 4 4 2 3 4 2 2 2 2 4 4 1 2 2 4 3 3 2 2 4 3 2 2 2 4 2 2 4 2 4 2 1 2 3 4 3 4 4 1 4 2 2 1 1 3 1 1 1 2 1 4 4 4 1 4 4 4 4 2 4 4 4 4 2 4 4 4 4 2 3 4 4 4 2 4 4 4 3 2 4 4 4 4 3 4 4 4 4 1 2 4 1 1 1 1 4 1 1 1 1 3 2 4 1 4 3 2 3 2 4 3 3 4 1 4 4 4 3 1 4 4 1 4 1 4 4 2 3 1 4 3 4 4 1 4 2 1 3 1 4 xxiii ABSTRACT ISKANDAR MIRZA. Effect of Gotu Kola (Centella asiatica (L.) Urban) Leaf Extract on the Cognitive Functions of Rats. Supervised by HADI RIYADI, ALI KHOMSAN, SRI ANNA MARLIYATI, EVY DAMAYANTHI, and ADI WINARTO The aim of the study was to explore the mechanism of Centella asiatica leaf extract in improvement of cognitive function. The study used Wistar male rats, Centella asiatica and reagents for extraction. The evaluated levels are 0, 100, 300 and 600 mg extract/kg body weight. The design was randomized block design with five replicates. The statistical analyzes method of variance with F-test was used in this study. The result indicated that the Centella asiatica extract contains P, K, Mg, Ca, Zn, Mn, and asiaticoside. The daily body weight rats gain of treatment group was not significantly different (p>0.05). The group on level of 300 mg/kg body weigh of ethanol extract gives a better hematological profile. The rats with level 2 and 3 showed more activitve from week to week, but not for those in level 1, as it was markly found stable. On T-maze test there are no control rats member reached the finish point, while the percentage of treated rats that reached the finish is various and the highest one is found on level 3 group. The rat activities of the level of 300 and 600 mg/kg body weigh showed significant increase compare to those in control (p<0.05). Further more, the extract also promoted treated rat to have better orientation in T-maze test. In this study, although the time to reach the finish was significantly different but did not describe the level of learning activity of each experimental group. While percentage and frequency on reaching the finish point and activity pattern seem to be more appropriate as indicator of activity level and learning process compare to the time limit in achievement of the finish point. The rat activity increased with increasing level treatment of Centella asiatica extract. Immunohistochemical staining showed that the population of neuronal cells positive for calbindin antibodies in the ethanol extract group was higher compared to control. Those results strongly indicated that the ethanol extract of Centella asiatica can improve cognitive function through enhance the nerves cells mechanism. Keywords: Centella asiatica, activity, cognitive, rats RINGKASAN ISKANDAR MIRZA. Pengaruh Penggunaan Ekstrak Daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap Fungsi Kognitif Tikus. Dibimbing oleh HADI RIYADI, ALI KHOMSAN, SRI ANNA MARLIYATI, EVY DAMAYANTHI, dan ADI WINARTO. Pegagan adalah salah satu jenis tanaman obat dari ordo Umbelliferae, famili Apiaceae. Pegagan adalah suatu tanaman merambat yang banyak dijumpai mulai dataran rendah sampai dataran tinggi, pada lahan terbuka maupun ternaungi dan tanah basah sampai kering. Manfaat pengobatan dari ekstrak pegagan mungkin berhubungan dengan keberadaan senyawa fenolik. Penggunaan pegagan untuk tujuan peningkatan fungsi kognitif telah lama digunakan. Berdasarkan bukti empiris dan hasil pengujian pra klinis menunjukkan bahwa pegagan mempunyai suatu reputasi untuk membangun kembali kemunduran fungsi kognitif. Penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengkaji pengaruh penggunaan ekstrak daun pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap peningkatan fungsi kognitif pada tikus dengan melihat pola aktivitas tikus, kepadatan neuroglia pada region hipokampus CA3 dan penanda biologisnya. Penelitian ini diawali dengan pengumpulan bahan baku dan analisis kandungan kimia dari berbagai bagian tanaman pegagan segar. Selanjutnya dilakukan ekstraksi terhadap masing-masing bagian tersebut dengan menggunakan pelarut air dan etanol 70%. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer dan dilanjutkan dengan menganalisis kandungan kimianya. Bagian tanaman pegagan yang terbaik kandungan kimianya dari masing-masing pelarut ditetapkan sebagai bahan uji pada hewan model. Level ekstrak pegagan yang digunakan pada penelitian ini 0 (kontrol), 100, 300 dan 600 mg ekstrak/kg bobot badan yang diuji pada tikus selama 8 minggu. Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok yang terdiri dari satu perlakuan pada empat tingkatan level dan lima ulangan. Unit percobaan terdiri dari 40 ekor tikus yang berumur lebih kurang 2 bulan yang diuji dengan ekstrak air dan ekstrak etanol daun pegagan. Pengujian ekstrak air dan etanol dilakukan pada waktu yang berbeda. Variabel yang diukur adalah konsumsi pakan, bobot badan, aktivitas dan tingkah laku dengan menggunakan metoda modifikasi Multiple T-maze dan profil darah rutin yang terdiri dari analisis kadar Hb, Packet Cell Volume (PCV), benda darah putih (BDP) dan benda darah merah (BDM) differensial leukosit. Untuk melihat perbedaan respon antar kelompok perlakuan digunakan analisis varian (ANOVA), dan apabila terdapat perbedaan respon antar kelompok perlakuan maka analisis dilanjutkan dengan uji beda Duncan. Analisis morfologi hipokampus diawali dengan mengorbankan tikus dan selanjutnya dilakukan pemanenan jaringan otak, lalu dimasukkan dalam larutan paraformaldehid 4%. Selanjutnya diproses lebih lanjut yang terdiri dari trimming, dehidrasi, clearing, parafinisasi, embedding, dan blocking. Jaringan yang telah diblok selanjutnya dipotong dengan mikrotom dengan ketebalan lebih kurang 5 µm dan selanjutnya dilakukan pemeriksaan dengan metoda imunohistokimia. Variabel yang diukur adalah sel-sel yang positif terhadap masing-masing antibodi yang digunakan dan juga kepadatan sel-sel glial. Secara kualitatif daun, tangkai daun dan keseluruhan tanaman pegagan mempunyai senyawa alkaloid, flavonoid, dan glikosida yang sama kuatnya, sedangkan untuk senyawa steroid bagian tangkai daun dan keseluruhan tanaman mempunyai kualitas yang lebih tinggi daripada di bagian daun. Kadar air pegagan segar berkisar antara 87-88%. Kadar abu pada bagian daun dan keseluruhan tanaman lebih baik dibandingkan dengan pada bagian tangkai daun. Kandungan protein pada pegagan segar berkisar antara 7-16%. Kadar sari dalam air tertinggi dijumpai di bagian tangkai daun. Kadar sari dalam alkohol tertinggi dijumpai pada bagian campuran (daun dan tangkai daun). Hampir semua unsur kimia lebih banyak dijumpai di bagian daun kecuali kandungan K yang lebih banyak dijumpai di bagian tangkai daun. Kandungan asiatikosida di bagian daun juga lebih banyak dibandingkan dengan tangkai daun. Jumlah mineral yang paling banyak dijumpai di dalam bahan segar adalah unsur K dan Ca. Di dalam ekstrak banyak ditemukan mineral makro dan mikro kecuali unsur Fe dan Cu. Semua jenis mineral yang dianalisis lebih banyak ditemukan di dalam ekstrak air dibandingkan di dalam ekstrak etanol, sedangkan kandungan asiatikosida lebih banyak ditemukan di dalam ekstrak etanol. Unsur Ca dan P di dalam ekstrak ditemukan dalam perbandingan yang ideal. Kadar asiatikosida dalam ekstrak dari masing-masing bagian tanaman berkisar antara 15,59-16,44%. Selama periode percobaan semua tikus yang diberikan ekstrak etanol dan ekstrak air pegagan tidak menunjukkan tanda-tanda sakit dan juga tidak menunjukkan penurunan bobot badan. Respon pertambahan bobot badan harian antar perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Total asupan pakan antar kelompok perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Hasil analisis darah lengkap menunjukkan bahwa gambaran darah berada dalam batasan normal dan bahkan menunjukkan kecenderungan yang lebih baik dibandingkan dengan kontrol. Jumlah benda darah merah (BDM) dan eosinofil pada kelompok tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak etanol menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05). Terdapat 3 jenis tingkah laku yang dominan yang dijumpai pada tikus yaitu berjalan, memanjat dan membaui. Tikus yang aktif menunjukkan aktivitas berjalan, membaui dan memanjat dinding maze yang sangat tinggi. Diduga bahwa motivasi tikus untuk bergerak melewati setiap lorong adalah karena tikus berusaha untuk keluar dari lorong yang ada di depannya yang belum dilaluinya, dan apabila lorong yang di depannya telah buntu, maka tikus akan bergerak dengan sangat cepat kembali ke kotak start dan tidak kembali lagi ke titik finish. Aktivitas tikus yang diberi ekstrak etanol dari kelompok level 1, pada minggu pertama dan ketiga, aktivitasnya tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p>0,05), dan berbeda nyata dengan kelompok level 2 dan 3 pada minggu ketiga dan keempat (p<0,05). Tikus kontrol pada kelompok yang diberi ekstrak etanol tidak ada yang mencapai titik finish. Pada kelompok level 1, persentase tikus yang mencapai titik finish cenderung stabil, sedangkan pada kelompok level 2 dan 3 terjadi peningkatan dari minggu ke minggu. Persentase tikus yang mencapai titik finish dari kelompok level 2 dan 3 berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p<0,05) dan tidak berbeda nyata dengan kelompok level 1 (p>0,05). Frekuensi pencapaian titik finish pada kelompok tikus yang diberikan ekstrak air tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (p>0,05), namun demikian kelompok level 2 frekuensi pencapaian titik finish lebih baik dibandingkan dengan kelompok level lainnya. Tikus yang aktif, aktivitas memanjat di dalam maze dapat mencapai lebih dari 20 kali selama 5 menit. Tikus yang diberikan ekstrak air kurang aktif dibandingkan dengan aktivitas tikus yang diberikan ektrak etanol. Aktivitas tikus yang diberikan ekstrak air tidak menunjukkan perbedaan antar kelompok (p>0,05) kecuali pada minggu ketiga, dan secara umum tikus pada kelompok level 2 lebih baik daripada kelompok level lainnya. Hasil pewarnaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi GFAP menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan kepadatan sel-sel glial antar kelompok perlakuan. Pada kelompok yang diberi ekstrak etanol, penampakan populasi sel neuron yang positif terhadap antibodi calbindin D28k lebih banyak dibandingkan dengan control. Pewarnaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi dopamine, TNF dan CRP tidak menghasilkan reaksi positif. 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perkembangan ilmu pengetahuan tentang mekanisme kerja otak mengalami lompatan yang luar biasa. Hasil penelitian yang telah diperoleh saat ini sangat bermanfaat untuk kehidupan manusia dan juga dapat dijadikan sebagai acuan untuk penelitian lebih lanjut yang berkaitan dengan kemampuan fungsi kognitif (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Kognitif adalah kemampuan berfikir dan memberikan rasional, termasuk proses mengingat, menilai, orientasi, persepsi dan memperhatikan. Kemampuan berfikir erat kaitannya dengan fungsi otak, karena kemampuan seseorang untuk berfikir dapat dipengaruhi oleh keadaan otak. Dengan demikian, kelainan pada fungsi otak dapat berpengaruh secara langsung kepada fungsi kognitif seseorang. Daya ingat adalah sesuatu yang sangat penting dari fungsi kognitif manusia. Daya ingat akan mengalami kemunduran dengan bertambahnya usia pada sebagian orang berusia setengah baya dan lanjut. Masalah penuaan dan kapasitas kerja semakin penting untuk didiskusikan karena kapasitas kerja pada usia tua sering tidak sepadan dengan tuntutan-tuntutan pekerjaan sehingga dapat mengakibatkan stress, masalah-masalah kesehatan dan angka kematian yang tinggi, misalnya karena penyakit kardiovaskular, bunuh diri atau kecelakaan (Hartanto 1996). Pada proses otak menjadi tua terjadi perubahan anatomi sel-sel neuron atau sel-sel otak, dan jumlah sel neuron mengalami penurunan di berbagai bagian otak. Di bagian hipokampus yang merupakan pusat pantauan memori juga terjadi penurunan jumlah sel neuron dalam jumlah besar. Secara klinis, pada orang usia lanjut kemunduran fungsi memori digolongkan ke dalam gangguan memori fisiologis dan gangguan memori patologis yang disebabkan oleh penyakit otak misalnya Alzheimer (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Dengan demikian, memahami mekanisme kerja otak akan memudahkan untuk memahami bagianbagian fungsinya serta cara penanggulangannya apabila terjadi gangguan dan menjadi dasar dalam penerapan penanggulangan kemampuan kognitif (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Pengobatan pada kelainan fungsi kognitif dapat dilakukan dengan pendekatan medis moderen atau gizi/pangan fungsional atau kombinasinya. Pada kondisi normal, fungsi kognitif dapat dioptimalkan dengan mengkonsumsi pangan fungsional yang bermanfaat terhadap fungsi kognitif secara tepat disamping mengkonsumsi zat gizi lainnya secara berimbang dan menerapkan pola hidup sehat. Demikian juga pada kondisi dimana fungsi kognitif tidak dicapai secara maksimal, pemberian pangan fungsional juga dapat membantu memperbaiki fungsi kognitif. Salah satu pangan fungsional yang bermanfaat untuk meningkatkan fungsi kognitif adalah pegagan (Centella asiatica). Pegagan adalah salah satu jenis tanaman obat dari ordo Umbelliferae (Babu et al. 1995), famili Apiaceae (Sharma & Jaimala 2003) mempunyai manfaat pengobatan yang tinggi (Babu et al. 1995). Tanaman obat tersebut pada umumnya dikenal sebagai Gotukola dan Marsh Pennywort (AS) (Sharma & Jaimala 2003). Pegagan adalah suatu tanaman merambat, tumbuh di tempat lembab di India dan negara Asia lainnya (Rao et al. 2007) terutama ditemukan di Asia bagian selatan (Wang et al. 2005). Di Indonesia, pegagan banyak dijumpai mulai dataran rendah sampai dataran tingggi, pada lahan terbuka maupun ternaungi dan tanah basah sampai kering (Widowati et al. 1992). Pegagan telah digunakan berabad-abad sebagai tanaman obat dan tercantum di dalam Pharmacopoeia Perancis tahun 1884, demikian pula pada tradisi kuno Chinese Shennong Herbal sekitar 2000 tahun yang lalu, dan juga pada Indian Ayurvedic Medicine sekitar 3000 tahun yang lalu. Pegagan juga dikenal sebagai rasayana pada penggunaan Ayurveda sebagai tonikum otak dan penyembuh luka (Sharma & Jaimala 2003). Manfaat pengobatan dari ekstrak pegagan mungkin berhubungan dengan keberadaan senyawa fenolik (Zainol et al. 2003). Dengan demikian, pegagan menjadi sangat penting berdasarkan atas peran kritisnya pada pencegahan penyakit (Shetty et al. 2008). Penggunaan pegagan untuk tujuan peningkatan fungsi kognitif telah lama dilakukan. Pada pengobatan sistem ayurvedic, yang merupakan pengobatan sistem alternatif di India, menggunakan daun pegagan untuk meningkatkan memori (Rao et al. 2007). Berdasarkan bukti empiris dan hasil pengujian pra klinis menunjukkan bahwa pegagan mempunyai suatu reputasi untuk membangun kembali kemunduran fungsi kognitif pada pengobatan tradisional dan pada hewan model (Wattanathorn et al. 2008). Pada pengujian daya ingat, dilaporkan bahwa pemberian jus daun segar pegagan selama periode pertumbuhan cepat pada tikus neonatal dapat meningkatkan kemampuan mengingat. Tikus yang diberi jus daun segar pegagan dengan dosis yang lebih tinggi (4 dan 6 mL) dengan lama pemberian 2-6 minggu menghasilkan jumlah alternasi yang lebih tinggi dan juga memberikan peningkatan prosentase respon alternasi yang benar dibandingkan dengan kontrol (Rao et al. 2005). Hasil pemeriksaan secara histologis menunjukkan terjadinya peningkatan pada panjang dendritik (intersection) dan jumlah titik percabangan dendritik, yaitu pada dendrit apikal dan dendrit basal pada tikus muda pada masa pertumbuhan cepat yang diberi pegagan 4 dan 6 mL/kg bobot badan per hari untuk periode waktu yang lebih panjang (4 dan 6 minggu). Dengan demikian, ekstrak daun segar pegagan dapat digunakan untuk meningkatkan dendrit neuronal pada keadaan stres dan neurodegeneratif serta kelainan memori (Rao et al. 2006). Pengujian pada orang tua yang sehat yang diberi ekstrak pegagan sebanyak 750 mg/hari selama 2 bulan dapat meningkatkan persentase akurasi kerja memori dan berpotensi untuk mengurangi kemunduran yang berhubungan dengan umur pada fungsi kognitif dan ketidakteraturan suasana hati pada orang tua yang sehat. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak tanaman pegagan memberikan pengaruh pada kecepatan dan kualitas kerja memori (Wattanathorn et al. 2008). Uraian tersebut di atas menunjukkan bahwa pegagan berpotensi sebagai tanaman obat untuk meningkatkan fungsi kognitif, namun mekanismenya belum jelas dan bahkan sebagian peneliti menyebutnya tidak diketahui. Oleh karena itu, melalui penelitian ini diharapkan dapat menjelaskan sebagian dari serangkaian mekanisme peningkatan fungsi kognitif akibat penggunaan ekstrak pegagan pada tikus. Tujuan Tujuan Umum Penelitian ini secara umum bertujuan untuk mengkaji pengaruh penggunaan ekstrak daun pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap peningkatan fungsi kognitif dengan menggunakan tikus sebagai model. Tujuan Khusus Secara khusus penelitian ini bertujuan untuk: 1. Mengetahui komposisi kandungan gizi dan bahan aktif pegagan. 2. Mengetahui efek/peran ekstrak pegagan terhadap: a. Parameter umum metabolisme tubuh (bobot badan dan profil darah perifer) b. Aktivitas dan tingkat pembelajaran dalam pengenalan jalur finish T-maze c. Populasi neuron positif terhadap calbindin dan glial pada area CA3 d. Mengetahui perubahan bahan aktif seluler pada area CA3 3. Mengetahui level efektif terhadap peningkatan fungsi kognitif Manfaat Manfaat yang diharapkan dari hasil penelitian ini adalah: 1. Menghasilkan jenis ekstrak yang sesuai untuk tujuan penggunaan sebagai material peningkatan memori dan penghambat kemunduran fungsi memori. 2. Menghasilkan data kandungan bahan aktif dan bahan gizi lainnya dari pegagan. 3. Menghasilkan data gambaran darah rutin, kimia darah, histologi neuroglia dan penanda biologis. 4. Menjelaskan sebagian dari serangkaian mekanisme peningkatan fungsi kognitif karena penggunaan ekstrak daun pegagan pada tikus. Hipotesis Rumusan hipotesis yang dapat diajukan dari penelitian ini adalah sebagai berikut: H1: Perlakuan ekstrak daun pegagan dapat meningkatkan fungsi kognitif. H1: Terdapat perbedaan antar perlakuan ekstrak air daun pegagan dan ekstrak etanol daun pegagan terhadap gambaran darah, bobot badan, aktivitas dan gambaran histokimia hipokampus. 7 TINJAUAN PUSTAKA Pengobatan Alternatif Pengobatan alternatif didefinisikan sebagai terapi atau praktek di luar dari praktek medis konvensional sebagai mana yang diajarkan dalam sebagian besar sekolah medis. Perhatian terhadap praktek penggunaan obat alternatif saat ini telah meningkat, baik di tingkat konsumen maupun di lingkungan ilmiah. National Institutes of Health, Office of Alternative Medicine telah ditetapkan pada tahun 1992 untuk menguji dan meneliti sebagian dari kebanyakan peluang terapi alternatif. Sasaran dari Office of Alternative Medicine adalah untuk memodifikasi konsep dari “alternatif,” ke arah istilah “komplementer” untuk menggambarkan terapi yang mungkin saja berguna untuk suatu intervensi yang menyeluruh di dalam praktek medis yang konvensional. Beberapa penanganan yang dianggap sebagai praktek medis outside mainstream US, misalnya akupunktur, telah menjadi bagian dari perawatan medis standar di beberapa Negara eropa (Borchers et al. 1997). Jenis lain dari complementary or alternative medicine (CAM), seperti acupressure, botanical remedies, homeopathy, dan mind-body therapies, juga diterima di berbagai tingkat dengan ketetapan medis, demikian pula di masyarakat umum dari berbagai negara (Farnsworth 1993 Dalam Borchers et al. 1997). Hasil estimasi World Health Organization (WHO) bahwa pada awal tahun l990-an 80% populasi dunia tinggal di negara-negara berkembang dan 80% tidak mempunyai akses untuk atau memilih menggunakan obat berstandar Barat (Borchers et al. 1997). Sebagai gantinya, mereka diarahkan ke obat tradisional, dengan kata lain, CAM adalah untuk pelayanan kesehatan primer mereka (Farnsworth 1993 Dalam Borchers et al. 1997). Jumlah orang yang menggunakan atau bentuk lain dari CAM dengan cepat meningkat di seluruh dunia, bahkan diantara mereka terdapat orang yang mampu untuk menggunakan obat berstandar Barat (Goldbeck-Wood et al. 1996 Dalam Borchers et al. 1997). Efek zat gizi terhadap penyakit degeneratif kronis telah menjadi salah satu wilayah penelitian yang menarik, yang menyempurnakan konsep dari zat gizi optimal, dari hanya mencegah terjadinya penyakit karena defisiensi nutrisi ke mengurangi resiko penyakit kronis (Shils & Rude 1996 Dalam Borchers et al. 1997). Suatu kelompok zat gizi yang berperan penting dalam hal pencegahan penyakit adalah antioksidan (Borchers et al. 1997). Terkecuali manfaat antioksidatifnya, tanaman mengandung banyak senyawa yang mempunyai efek yang berpotensi baik terhadap banyak penyakit dan hal ini adalah salah satu dari alasan utama mengapa para ilmuwan, menunjukkan peningkatan minat pada medicinal botanicals. Sadar akan banyak pertanyaan yang tidak terjawab di sekitar penggunaan obat herbal, National Institutes of Health’s Office of Alternative Medicine bekerjasama dengan Food and Drug Administration mensponsori suatu pertemuan dari orang-orang yang terlibat dalam manufaktur serta distribusi CAM untuk mendiskusikan 1) keamanan dan kemanjuran medicinal botanicals, dan 2) bukti yang diperlukan untuk mengijinkan pemberian label efektif dalam penanganan dari penyakit spesifik. Hal ini menegaskan bahwa pengalaman dari negara lain mungkin memberikan suatu model demikian pula petunjuk untuk regulasi dari beberapa klaim kesehatan (Borchers et al. 1997). Obat Herbal sebagai Obat Tradisional Obat herbal adalah campuran kompleks, sekurang-kurangnya pemrosesannya (misalnya bagian-bagian tanaman yang direbus untuk dibuat teh). Bersama dengan komponen lainnya seperti akupunktur atau pijatan yang juga termasuk dalam katagori penyembuhan tradisional, obat herbal digunakan untuk pengobatan dalam suatu jangkauan yang lebih luas terhadap gejala dan penyebab penyakit (Plaeger 2003). Penggunaan herbal untuk pengobatan penyakit dalam suatu tradisi penyembuhan kuno itu dimulai di Asia lebih dari 3,000 tahun yang lalu (Nestler 2002 Dalam Plaeger 2003). Oleh praktisi abad ke-19 dan 20 pengobatan tersebut sebagian besar telah diabaikan karena pengaruh pengobatan ala Barat. Memasuki abad ke-21 praktek penyembuhan ramuan obat herbal, seperti obat tradisional Cina (Traditional Chinese Medicine/TCM), Kampo Jepang, dan Ayurveda India, dengan cepat meningkat penerimaannya di Barat (Plaeger 2003). Kebangkitan kembali praktek pengobatan tradisional telah banyak dijelaskan (Ernst & Pittler 2002 Dalam Plaeger 2003), tetapi kenyataannya bahwa obat herbal dan obat alami lainnya atau pengobatan alternatif dengan cepat berasimilasi menjadi praktek medis ala Barat (Plaeger 2003). Pada tahun 1998, dalam suatu survey dilaporkan bahwa 75% dari dokter Jepang telah meresepkan obat Kampo, dan dalam asuransi kesehatan nasional Jepang (Japanese National Health Insurance) sekarang ini juga tercakup pengobatan Kampo (Borchers el al. 2000 Dalam Plaeger 2003). Walaupun pada abad ke-20 Cina dengan cara yang sama mengadopsi pengobatan ala Barat sebagai pengobatan ortodoks, Institute of Chinese Medicine senilai $64 juta, sekarang ini sedang dibangun di Hong Kong, dan Taiwan serta daratan Cina juga sedang memompa dana ke penelitian formula tradisional (Normile 2003 Dalam Plaeger 2003). Diperkirakan bahwa pada tahun 1997 dan 1998, orang Amerika telah menghabiskan lebih dari $4 milyar terhadap obat herbal (Ernst & Pittler 2002 Dalam Plaeger 2003). Minat Amerika terhadap pengobatan dengan obat tradisional bukan semata-mata hanya untuk penggemar makanan kesehatan atau penduduk West Coast saja (Plaeger 2003). Untuk menambah dorongan lebih lanjut pada beberapa penelitian telah tersedia dana penelitian yang sangat memadai untuk penelitian obat herbal tradisional. Pada tahun 1998, National Institutes of Health mendirikan National Center for Complementary and Alternative Medicine, yang merupakan suatu ekspansi yang sebelumnya Office of Alternative Medicine, dengan 2002 anggaran penelitian lebih dari $100 juta. National Center for Complementary and Alternative Medicine sekarang ini telah membiayai empat pusat penelitian yang mengkhususkan pada penelitian botanikal dan banyak menginisiasi untuk membiayai pelatihan penelitian dari pengobatan alternatif (http://nccam.nih.gov/). Selain dari pada itu, National Institute of Allergy and Infectious Diseases telah mendanai penelitian manfaat imunomodulatori dari obat herbal serta efek terapeutiknya terhadap penyakit infeksi. National Institutes of Health didirikan yang berminat pada penyakit spesifik (misalnya National Cancer Institute and the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases) untuk mendukung penelitian tentang pengobatan herbal (Plaeger 2003). Sehubungan dengan keterbatasan ekonomi, sediaan modern medical healthcare di negara-negara berkembang seperti India adalah masih suatu pencapaian yang sulit untuk dijangkau. Sehingga penggunaan obat alternatif menjadi sangat penting dalam penanganan berbagai penyakit. Fenomena ini juga dialami di Indonesia yang masyarakatnya masih banyak yang miskin. Obat- obatan yang paling umum digunakan dari obat modern seperti aspirin, antimalaria, anti-kanker, digitalis, dan lain-lain awalnya berasal dari sumber tanaman. Ke depan, harus dapat dilihat pengobatan terintegrasi dan diharapkan bahwa penelitian obat alternatif akan membantu mengidentifikasikan mana obat yang aman serta efektif daripada marginalnya, klaim dan penemuan medis yang tak lazim (Sagrawat & Khan 2007). Dalam pengobatan tradisional, bagian tanaman yang berbeda dipercaya mempunyai manfaat pengobatan yang spesifik termasuk kemampuan untuk menstimulasi mekanisme melawan penyakit (Craig 1999; Jones 1996 Dalam Punturee et al. 2005). Pasar dan Permintaan Tanaman Obat Permintaan produk bahan alam untuk tujuan kesehatan dan kebugaran terus meningkat. Menurut laporan Convention on Biological Diversity (CBD), pasar herbal dunia tahun 2000 mencapai 43 miliar US$, nilai penjualan suplemen bahan alam mencapai 20 M US$ (Dennin 2000 dalam Komarawinata 2007) atau 30% dari nilai penjualan produk yang berasal dari bahan alam. Kontribusi Indonesia terhadap pasar herbal dunia baru 100 juta US$. Nilai perdagangan dunia meningkat menjadi 60 miliar US$ tahun 2002, pada tahun 2010 diprediksi menjadi 300 miliar US$ (Bodecker 2003 dalam Komarawinata 2007). Omset penjualan produk tanaman obat Indonesia saat ini baru mencapai 3 triliun rupiah dan diharapkan meningkat menjadi 8 triliun rupiah pada tahun 2010. Di Amerika Serikat, konsumsi tanaman obat naik hampir mendekati 15% setiap tahunnya (Marwick 1995 Dalam Borchers et al. 1997). Sebagian botanikal dapat diperoleh atau dibeli, baik keseluruhan dari tanaman, atau bagian-bagian daripadanya, atau dapat diperoleh sebagai teh, serbuk, ekstrak cair, kapsul, atau tablet (Wuest & Gossel 1995 Dalam Borchers et al. 1997). Di Amerika Serikat, ekstrak tanaman secara umum dijual sebagai food supplements sehingga pertimbangan konsumen untuk memenuhi kebutuhan zat gizi kelihatannya terjamin (Borchers et al. 1997). Dalam konteks ini adalah menarik untuk dicatat bahwa hal itu telah diketahui untuk beberapa dekade dimana zat gizi dan kesehatan adalah saling berhubungan (Feigin 1997 Dalam Borchers et al. 1997). Indonesia mempunyai keragaman hayati yang cukup luas, mempunyai prospek yang cukup cerah dalam pengembangan produk obat-obatan dan pangan fungsional berbasis bahan alami. Potensi Indonesia untuk menghasilkan obatobatan atau pangan fungsional berbasis bahan alami sangat tinggi, mengingat Indonesia kaya akan kekayaan hayati tumbuhan obat yang mencapai 7000 jenis dan pengetahuan tradisional untuk pemanfaatan tumbuhan obat dari berbagai etnis yang mencapai 370 etnis. Di negara lain, penggunaan ekstrak tanaman untuk tujuan pengobatan dan kebugaran telah banyak dilakukan, karena di dalam ekstrak tanaman mengandung beberapa senyawa, yang dapat memainkan peran penting terhadap fungsi fisiologis dengan cara spesifik yang dimilikinya (Sharma & Jaimala 2003). Namun di Indonesia, penelitian tentang tanaman obat serta pengetahuan tradisional untuk produk alam masih sangat terbatas. Oleh karena itu investigasi yang luas dan mendalam tentang khasiat berbagai macam tanaman obat termasuk diantaranya tanaman obat pegagan atau pegagan perlu dilakukan. Penelitian tentang Manfaat Pegagan Dilaporkan bahwa pegagan bermanfaat untuk berbagai keadaan klinis misalnya sebagai antibakteri (Taemchuay et al. 2008), antisestoda (Temjenmongla & Yadav 2005) larvasida (Rajkumar & Jebanesan 2005), anti-inflamasi dan antinosiseptif (Somchit et al. 2004) antioksidan (Hamida et al. 2002; Veerendra & Gupta 2002; Zainol et al. 2003; Gnanapragasam et al. 2007; Hussin et al. 2007; Shetty et al. 2008), antitumor (Babu et al. 1995; Punturee et al. 2005), imunostimulan (Punturee et al. 2005; Wang et al. 2004; Wang et al. 2005), penyembuhan luka (Rao Vishnu et al. 1996; Shukla et al. 1999; Hong et al. 2005; Shetty et al. 2008; Suwantong et al. 2008), radio protektif (Sharma & Jaimala 2003), dan fungsi kognitif (Veerendra & Gupta 2002; Rao et al. 2005; Rao et al. 2006; Rao et al. 2007; Wattanathorn et al. 2008). Tabel 1 berikut ini menyajikan sebagian dari hasil penelitian tentang manfaat pegagan terhadap kesehatan. Tabel 1 Beberapa hasil penelitian tentang pegagan Indikasi o Anti-inflamasi Ekstrak air pegagan pada level 10, 30, 100 dan 300 mg/kg bobot badan memperlihatkan aktivitas antinociceptive dan aktivitas antiinflamasi o Imunostimulasi Deasetilasi dan carboxyl-reduction, pektin dan produk turunannya yang terdapat di dalam pegagan menunjukkan aktivitas imunostimulasi o Antithrombotik Ekstrak metanol (45 mg/kg) dan etanol pegagan (14 mg/kg bobot badan) bermanfaat untuk pencegahan penyakit yang berhubungan dengan gaya hidup seperti hipertensi, kardiopati dan apopleksia serebral yang disebabkan oleh pengapuran pembuluh darah (arteriosclerosis). o Tulang dan Sendi Pengujian in vitro, fraksi pegagan 10 µg/mL dapat menghambat degradasi tulang rawan, menghambat pelepasan IL-1ß dan produksi nitric okside oleh eksplan tulang rawan o Tumor Pengujian dengan metoda brine shrimp lethality test, ekstrak etanol pegagan 100, 500 dan 1000 µg/mL tidak menunjukkan aktivitas sitotoksik. Peneliti Somchit et al. 2004 Wang et al. 2005 Satake et al. 2007 Hartog et al. 2009 Padmaja et al. 2002 Ekstrak metanol pegagan dapat memperlambat perkembangan tumor solid dan tumor asites dan mempunyai tingkat keracunan selektif terhadap sel tumor serta memberikan manfaat anti-tumor yang potensial dengan cara menstimulasi sistem kekebalan. Level efektif dari fraksi aseton ekstrak metanol adalah 17 µg/mL untuk Ehrlich ascites tumour cells, 22 µg/mL untuk Dalton’s lymphoma ascites tumour cells dan 8 µg/mL untuk mouse lung fibroblast. Babu et al. 1995 Di samping sitotoksik langsung terhadap sel tumor, ekstrak air pegagan 100 mg/kg bobot badan juga dapat mencegah karsinogenesis dengan cara memodulasi respon imun (meningkatkan produksi IL-2 dan TNF-α), sedangkan ekstrak etanol menunjukkan aktivitas imunosuppressif (menurunkan produksi IL-2 dan TNF-α) Punturee et al. 2005 Indikasi  Antisestoda Aktivitas antisestoda yang moderat telah dilaporkan untuk ekstrak etanol daun pegagan pada konsentrasi 5 - 40 mg/mL, dengan waktu rata-rata kematian parasit berkisar dari 4 – 14,66 jam  Larvisidal Ekstrak etanol daun pegagan pada konsentrasi 6,84 ppm (19 °C) dan 1,12 ppm (31°C) dapat membunuh 50% larva Culex quinquefasciatus Peneliti Temjenmongla & Yadav 2005 Rajkumar & Jebanesan 2005  Antibakteri Ekstrak air pegagan mempunyai nilai minimum inhibitory Taemchuay et al. concentration pada konsentrasi 2-3 mg/ml terhadap bakteri 2008 Staphylococcus aureus  Penyembuhan Luka Pemberian ekstrak etanol daun pegagan 800 mg/kg bobot badan selama 10 hari dapat memacu penyembuhan luka pada tikus dan juga mampu mengatasi reaksi hambatan penyembuhan luka oleh steroid Shetty et al. 2008 Senyawa asitikosida dari tanaman pegagan diyakini sebagai senyawa aktif yang berhubungan dengan penyembuhan luka Suwantong et al. 2008 Pemberian ekstrak air pegagan dalam bentuk suspensi propylene glycol 5% secara topikal dapat meningkatkan kandungan kolagen pada jaringan luka Rao Vishnu et al. 1996 Aplikasi larutan yang mengandung 0,2% dan 0,4% asiatikosida secara topikal pada marmut normal demikian pula pada yang diabetik atau pemberian 1 mg/kg bobot badan secara oral dapat meningkatkan tingkat penyembuhan luka yang ditandai dengan peningkatan sintesa kolagen dan kekuatan tensil dari jaringan yang luka Shukla et al. 1999 Ekstrak pegagan telah digunakan di Eropa untuk penanganan penyembuhan luka Maquart et al. 1999  Perlukaan Lambung Pemberian ekstrak air pegagan pada tikus dengan dosis 10 dan 20 mg/kg bobot badan mempu mencegah terjadinya tukak lambung karena pemakaian obat anti inflamasi (indomethacin)  Kecerdasan Sripanidkulchai et al. 2007 Indikasi Pemberian ekstrak air pegagan pada level 200 dan 300 mg/kg bobot badan tikus selama 14 hari dapat meningkatkan kinerja belajar dan memori Peneliti Veerendra & Gupta 2002 Pemberian jus daun segar pegagan selama periode pertumbuhan cepat pada tikus neonatal dapat meningkatkan kinerja memori Rao et al. 2005 Pemberian ekstrak daun segar pegagan 0,158-0,474 g/kg bobot badan tikus dapat menstimulus pertumbuhan dendritik neuronal, sehingga dapat digunakan untuk meningkatkan dendrit neuronal pada stres dan neurodegeneratif serta kelainan memori Rao et al. 2006 Pemberian jus daun segar pegagan dapat meningkatkan arborisasi dendritik di neuron amygdaloid tikus Rao et al. 2007 Pemberian ekstrak pegagan 750 mg per hari selama 2 bulan Wattanathorn et berpotensi untuk mengurangi kemunduran fungsi kognitif al. 2008 yang berhubungan dengan umur dan ketidakteraturan suasana hati pada orang tua yang sehat  Antioksidan Ekstrak etanol dari semua bagian pegagan memperlihatkan aktivitas antioksidatif yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak air. Bagian akar menunjukkan aktivitas tertinggi daripada bagian lainnya Hamida et al. 2002 Pemberian ekstrak air 100-300 mg/kg bobot badan tikus dapat meningkatkan kemampuan belajar dan memori serta manfaat antioksidan dengan cara mengurangi peroksidasi lemak dan memperbanyak enzim antioksidan endogenus di dalam otak Veerendra & Gupta 2002 Aksesi pegagan yang berbeda mempunyai aktivitas antioksidatif yang berbeda pula. Bagian daun mempunyai aktivitas antioksidatif yang tinggi, diikuti bagian akar dan tangkai Zainol et al. 2003 Ekstrak air pegagan 200 mg/kg bobot badan tikus efektif menetralkan perubahan enzim mitokhondria dan sistem pertahanan mitokhondria (mengurangi kardiomiopati mitokhondria) Gnanapragasam et al. 2007 Pemberian 5% tepung dan 0,3% ekstrak pegagan dalam Hussin et al. Indikasi makanan dapat memperbaiki stres oksidatif dengan cara mengurangi peroksidasi lemak melalui perubahan sistem pertahanan antioksidan Ekstrak alkohol pegagan 800 mg/kg bobot badan tikus dapat menigkatkan konsentrasi antioksidan, protein dan lysyl oxidase dan mengurangi peroksidasi lemak Peneliti 2007 Shetty et al. 2008 Pegagan Pegagan merupakan tanaman merambat yang tumbuh di tempat lembab di India dan negara Asia lainnya (Rao et al. 2007), terutama ditemukan di Asia bagian selatan (Wang et al. 2005). Ekstrak tanaman pegagan mengandung beberapa senyawa yang dapat berperan pada fungsi fisiologi dengan cara spesifik yang dimilikinya (Sharma & Jaimala 2003). Pegagan adalah tanaman obat dari famili Apiaceae/Umbelliferae (Sharma & Jaimala 2003), dan menurut Babu et al. (1995), pegagan merupakan salah satu tanaman dari famili Umbelliferae yang mempunyai manfaat pengobatan yang tinggi. Tanaman obat ini pada umumnya dikenal sebagai Gotukola dan Marsh Pennywort (AS) (Sharma & Jaimala 2003). Gambar 1 Tanaman pegagan Di Thailand, tanaman ini umumnya dikenal sebagai Buabok dan biasanya diminum sebagai teh atau jus (Farnsworth & Bunyapraphatsara 1992 Dalam Punturee et al. 2005). Di Indonesia, pegagan banyak dijumpai mulai di dataran rendah sampai di dataran tinggi, pada lahan terbuka maupun ternaungi dan tanah basah sampai kering (Widowati et al. 1992). Pegagan dapat diklasifikasikan sebagai berikut: Klas : Dicotyledenae Sub-Klas : Polypetalae Series : Calyciflorae Order : Umbellales Famili : Umbelliferae (Apiaceae) Genus : Centella Spesies : asiatica Pegagan telah digunakan berabad-abad sebagai tanaman obat dan tercantum di dalam Pharmacopoeia Perancis tahun 1884, demikian pula pada tradisi kuno Chinese Shennong Herbal sekitar 2000 tahun yang lalu, dan juga pada Indian Ayurvedic Medicine sekitar 3000 tahun yang lalu (Sharma & Jaimala 2003). Menurut Satake et al. (2007) pegagan juga telah digunakan di seluruh dunia untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit. Pegagan juga dikenal sebagai rasayana pada penggunaan Ayurveda sebagai tonikum otak dan penyembuh luka (Sharma & Jaimala 2003), dan juga pegagan menjadi sangat penting berdasarkan peran kritisnya pada pencegahan penyakit (Shetty et al. 2008). Manfaat pengobatan dari ekstrak pegagan mungkin berhubungan dengan keberadaan senyawa fenolik yang dikandungnya (Zainol et al. 2003). Kandungan Kimia Ekstrak air pegagan mengandung senyawa asiatikosida, asam asiatik, triterpines, centoic acid, centellic acid dan esternya. Ekstrak tanaman ini juga kaya akan vitamin, mineral dan nutrien yang secara umum tidak beracun terhadap tubuh. Disamping senyawa tersebut, juga banyak dijumpai senyawa lainnya termasuk asam askorbik (Sharma & Jaimala 2003), dan senyawa pektin yang mengandung arabinose, rhamnose, galactose, xylose serta galacturonic acid (Wang et al. 2005), serta sterol bebas (Mangas et al. 2008). Di dalam pegagan juga ditemukan senyawa flavonoid lainnya seperti castilliferol, castillicetin, dan isochlorogenic acid (Subban et al. 2008). Menurut Zhang et al. (2009), selain asiatikosida, pegagan juga mengandung madekassosida, brahmosida, brahminosida dan thankunisida yang merupakan komponen utama dari triterpene dalam bentuk saponin triterpenoid. Diantara senyawa aktif tersebut, asam asiatik merupakan suatu senyawa triterpin yang digunakan dalam penanganan demensia dan dapat meningkatkan kognisi (Rao et al. 2005). Asam asiatik tersebut adalah suatu metabolit aktif dari asiatikosida, dan juga merupakan senyawa ionik (Thongnopnua 2008). Rumus kimia, rumus molekul dan berat molekul dari senyawa asiatikosida, madekassosida, asam madekassik dan asam asiatik disajikan pada Tabel 2 (Aziz et al. 2007). Tabel 2 Rumus kimia, rumus molekul dan berat molekul dari senyawa asiatikosida, madekassosida, asam madekassik dan asam asiatik Senyawa aktif Rumus molekul Asiatikosida C 48 H 78 O 19 Madekassosida C 48 H 78 O 20 Asam madekassik C 30 H 48 O 6 Asam asiatik C 30 H 48 O 5 Sumber: (Aziz et al. 2007) Berat molekul 958 974 504 488 Gambar berikut menjelaskan struktur asiatikosida, madekassosida, asam madekassik dan asam asiatik (Aziz et al. 2007). Gambar 2 Struktur dari asiatikosida, madekassosida, asam madekassik, dan asam asiatik. Asiatikosida (R1 = H; R2 = O-glu-glu-rham), Madekassosida (R1 = OH; R2 = O-glu-glu-rham), Asam madekassik (R1 = OH; R2 = OH), Asam asiatik (R1 = H; R2 = OH) (Aziz et al. 2007). Distribusi senyawa asiatikosida dan madekassosida di dalam bagian organ spesifik pegagan adalah berbeda, dimana bagian daun mengandung senyawa tersebut yang lebih tinggi (Aziz et al. 2007). Zainol et al. (2003) juga melaporkan bahwa ekstrak daun mengandung senyawa fenolik yang tertinggi pada semua aksesi tanaman pegagan, diikuti oleh akar sementara konsentrasi paling rendah adalah pada bagian tangkai daun, dengan aktivitas antioksidatif yang serupa. Sedangkan menurut Kim et al. (2007), asiatikosida dan madekassosida dihasilkan dalam jumlah yang sedikit di dalam bagian akar (Tabel 3). Tabel 3 Kandungan asiatikosida dan persentase distribusi dari setiap jaringan dari keseluruhan bagian tanaman pegagan Asiatikosida Kandungan (mg/g BK) Distribusi (%) Daun 9,56 + 0,91 82,6 Tangkai daun 1,85 + 0,07 15,9 Akar 0,17 + 0,01 1,5 ND Node 0 Keseluruhan tanaman 4,32 + 0,35 Sumber: Kim et al. (2007). BK = Berat Kering, ND = Tidak ada data Jaringan Pegagan dari dua fenotip yang berbeda memperlihatkan perbedaan pada kandungan asiatikosida dan madekassosida. Pada phenotype-Smoot kandungan asiatikosida dan madekassosida lebih tinggi dibandingkan dengan phenotypeFringed. Kandungan asiatikosida dan madekassosida pada tanaman yang diregenerasi bervariasi sesuai dengan medium regenerasi yang digunakan. Kandungan rata-rata dari kedua senyawa tersebut paling banyak dijumpai di dalam daun (Aziz et al. 2007). Variasi kandungan kimia juga dijumpai di antara populasi pegagan (Zhang et al. 2009). Peningkatan senyawa target yang dihasilkan pada pegagan dapat dilakukan dengan suatu protokol transformasi genetik yang efisien menggunakan strain R1000 dari Agrobacterium rhizogenes yang mengandung encoding pCAMBIA1302 gen hygromycin phosphotransferase (hpt) dan green fluorescence protein (mgfp5) (Kim et al. 2007). Kandungan senyawa aktif tersebut juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan, dimana kondisi lingkungan harus optimal untuk memaksimalkan sintesa senyawa aktif tersebut. Variasi kandungan asiatikosida di dalam pegagan juga berhubungan dengan asal tanaman. Tanaman yang diperoleh dari ketinggian 609 m di atas permukaan laut mengandung 0,11 % asiatikosida per daun kering, sedangkan yang diperoleh dari ketinggian yang lebih rendah yaitu 5 m di atas permukaan laut mengandung hampir setengah nilai tersebut (Aziz et al. 2007). Jalur biosintesis senyawa asiatikosida dan madekassosida masih belum diketahui secara pasti (Aziz et al. 2007), namun diduga bahwa sintesis asiatikosida adalah melalui jalur squalene (Gambar 3). Gambar 3 Jalur biosintesis asiatikosida di dalam tanaman pegagan. HMGCoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A), MVA (mevalonic acid), IPP (isopentenyl diphosphate), DMAPP (dimethylallyl diphosphate), FPP (farnesyl diphosphate), CYS (cycloartenol synthase), bAS (βamyrin synthase), LUS (lupeol synthase) (Aziz et al. 2007). Manfaat Pegagan Antibakteri, Antisestoda dan Larvisidal Pemanfaatan pegagan sebagai phytochemical telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Dinyatakan bahwa pegagan dapat bertindak sebagai alternatif yang tepat untuk insektisida sintetis pada masa mendatang karena relatif aman, tidak mahal, dan banyak tersedia di banyak area (Rajkumar & Jebanesan 2005). Ekstrak kasar pegagan, terutama sekali yang diekstrak dengan air, mempunyai efek antibakteri terhadap Staphylococcus aureus (Taemchuay et al. 2008), antisestoda (Temjenmongla & Yadav 2005), larvisida dan menghambat munculnya Culex quinquefasciatus serta dapat digunakan secara langsung dalam volume yang kecil di habitat air atau pada tempat pembiakan ukuran terbatas di sekitar manusia (Rajkumar & Jebanesan 2005). Aktivitas biologis dari ekstrak tanaman ini berhubungan dengan senyawa phenol, terpenoid, dan alkaloid yang ada di dalam tanaman tersebut. Senyawa ini secara bersama-sama atau secara terpisah berperan untuk menghasilkan aktivitas larvisidal dan menghambat munculnya nyamuk dewasa Culex quinquefasciatus. Ekstrak ini dapat digunakan untuk mengontrol larva Culex quinquefasciatus pada cakupan temperatur yang luas (Rajkumar & Jebanesan 2005). Ekstrak daun pegagan dapat menyebabkan kematian larva Culex quinquefasciatus pada semua temperature yang diuji. Pada 24 jam, LC 50 (Lethal Concentration) adalah 1,12 ppm pada 31°C dan nilai LC 50 meningkat mencapai 6,84 ppm dengan menurunnya temperatur menjadi 19°C (Tabel 4) (Rajkumar & Jebanesan 2005). Tabel 4 Aktivitas larvisidal dari ekstrak daun pegagan terhadap Culex quinquefasciatus pada lima temperatur yang berbeda. Temperatur (oC) 19 22 25 28 31 Sumber: LC 50 (ppm) 6,84+1,32a 5,64+1,57b 3,92+1,23c 2,79+1,43d 1,12+1,23e 95% Confidence limit (ppm) 4,85-8,79 3,78-7,56 2,22-4,82 1,37-3,57 0,22-2,08 LC 90 (ppm) 9,12+2,12a 8,32+1,82b 6,78+1,47c 5,28+1,43d 3,63+1,57e 95% Confidence limit (ppm) 5,92-12,57 4,98-11,39 4,06-8,71 3,32-7,19 2,68-4,52 Rajkumar & Jebanesan (2005). Nilai dalam kolom dengan superscript yang berbeda adalah perbedaan signifikan pada tingkat P<0,05 (DMRT test). Anti-inflamasi dan Antinosiseptif Ekstrak air pegagan memperlihatkan aktivitas antinosiseptif. Aktivitas antinosiseptif tersebut sama dengan aspirin tetapi tidak lebih kuat dibandingkan dengan morfin. Ekstrak pegagan juga memperlihatkan aktivitas anti-inflamatori. Efek antiinflamatori tersebut sama dengan asam mefenamat yaitu sejenis obat antiinflamatori non-steroid. Pemberian ekstrak pegagan 2 mg/kg menunjukkan aktivitas antiinflamatori dan pemberian dengan dosis yang lebih besar memberikan aktivitas yang lebih efektif dari asam mefenamat. Penemuan ini memberikan alasan penggunaan secara tradisional dari tanaman ini pada penanganan peradangan atau rheumatik (Somchit et al. 2004). Aktivitas Antioksidan Aktivitas antioksidan dari suatu tanaman sangat ditentukan oleh kandungan senyawa aktif yang dijumpai di dalam tanaman tersebut. Dilaporkan bahwa antioksidan alami dari tanaman memperkuat pertahanan antioksidan endogenus dari kerusakan reactive oxygen species (ROS) dan membangun kembali keseimbangan optimal dengan cara menetralkan reactive species (Shetty et al. 2008) juga dapat memberikan perlindungan dari kerusakan oksidatif (Hussin et al. 2007). Ekstrak air dari keseluruhan tanaman pegagan mempunyai dua efek yaitu untuk meningkatkan kemampuan belajar dan memori serta sebagai antioksidan dengan cara mengurangi peroksidasi lemak serta memperbanyak enzim antioksidan endogenus di dalam otak (Veerendra & Gupta 2002). Laporan lainnya menyebutkan bahwa pemberian ekstrak pegagan dapat meningkatkan konsentrasi antioksidan, protein dan lysyl oxidase serta mengurangi kadar lipid peroksidasi (Shetty et al. 2008). Efek ini kemungkinan berhubungan dengan kehadiran senyawa flavonoid, quersetin, katekhin dan rutin, yang diketahui adalah sebagai antioksidan yang kuat (Hussin et al. 2007). Aktivitas enzim penanda kardiak (laktat dehydrogenase, kreatin fosfokinase, amino transferase), enzim siklus TCA (isositrat dehydrogenase, αketoglutarat dehydrogenase, malat dehydrogenase), enzim penanda respirasi (NADH-dehydrogenase, sytochrom-C-oksidase), dan enzim antioksidan mitokhondria (glutathion peroksidase, glutathione, superokside dismutase, katalase) pada tikus yang diinduksi dengan adriamycin dapat diturunkan dan tingkat peroksidasi lemak dapat ditingkatkan dengan pemberian pegagan. Aktivitas protektif dari pegagan terhadap kardiotoksisitas menunjukkan bahwa efek protektif ini merupakan efek yang utama dari manfaat antioksidannya (Gnanapragasam et al. 2007). Data ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak air pegagan sebanyak 200 mg/kg bobot badan secara oral, efektif menetralkan perubahan pada enzim mitokhondria dan sistem pertahanan mitokhondria. Dilaporkan juga bahwa ekstrak air dari pegagan tidak hanya memiliki keuntungan antioksidan tetapi juga mengurangi tingkat kerusakan mitokhondria. Manfaat dari pegagan tersebut menawarkan sesuatu yang penting untuk mengurangi kardiomiopati mitokhondria yang merupakan faktor pembatas dalam terapi antineoplastik (Gnanapragasam et al. 2007). Pegagan juga mempunyai efek stimulatori terhadap antioksidan seluler serta sistem kekebalan yang mungkin dapat dimanfaatkan untuk penggunaan profilaktik terhadap sejumlah penyakit pada manusia seperti penyakit kardiovaskuler dan kelainan yang berhubungan dengan stres (Shetty et al. 2008). Veerendra & Gupta (2002) melaporkan bahwa diantara dosis ekstrak air yang diuji terhadap parameter stres oksidatif, hanya dosis 200 dan 300 mg/kg menunjukkan penurunan malondialdehyde (MDA) pada otak dengan meningkatkan simultan pada level glutathione. Kadar MDA yang rendah pada tikus yang diberi ekstrak dan tepung pegagan juga dilaporkan oleh Hussin et al. (2007), yang mengindikasikan telah terjadi pengurangan peroksidasi lemak pada tikus tersebut. Pengurangan produksi MDA tersebut menunjukan terjadinya hambatan peroksidasi lemak. Pengurangan MDA membuktikan bahwa pegagan mempunyai aktivitas antioksidasi yang baik sekali (Hussin et al. 2007). Pemberian 300 mg/kg bobot badan ekstrak air pegagan dapat memberikan peningkatan level katalase tetapi tidak ada perubahan pada level superoxide dismutase (SOD) (Veerendra & Gupta 2002), sedangkan pada laporan lainnya menyebutkan bahwa pemberian pegagan dapat mengurangi aktivitas superoxide dismutase pada minggu ke 25 (Hussin et al. 2007). Peningkatan aktivitas katalase adalah sebagai respon terhadap akumulasi H 2 O 2 , sedangkan penurunan aktivitas superoxide dismutase kemungkinan karena kemampuan senyawa antioksidan yang terdapat di dalam pegagan (Hussin et al. 2007). Penurunan aktivitas superoxide dismutase pada tikus yang disupplementasi dengan pegagan menunjukkan kebutuhan yang lebih rendah akan enzim dan ini mengindikasikan efek protektif dari tanaman ini dalam serangan stres oksidatif (Hussin et al. 2007). Pemberian 100 mg/kg bobot badan, tidak memberikan perubahan pada parameter antioksidan kecuali terhadap level glutathione (Veerendra & Gupta 2002). Laporan lainnya menyebutkan bahwa ekstrak etanol dari semua bagian pegagan memperlihatkan aktivitas antioksidatif yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak air, sementara pegagan yang diekstrak dengan light petroleum ether menunjukkan aktivitas yang lebih rendah (Hamida et al. 2002). Aktivitas antioksidatif juga ditentukan oleh jenis aksesi (Zainol et al. 2003). Selain aksesi, bagian yang berbeda dari pegagan (daun, tangkai daun, dan akar) juga memperlihatkan aktivitas antioksidatif yang berbeda pula (Hamida et al. 2002). Bagian daun dari pegagan mempunyai aktivitas antioksidatif yang tinggi, diikuti bagian akar dan tangkai daun (Zainol et al. 2003), sedangkan Hamida et al. (2002) melaporkan bahwa bagian akar menunjukkan aktivitas antioksidatif tertinggi daripada bagian lainnya. Perbedaan aktivitas antioksidatif dari bagian yang berbeda dari pegagan mungkin saja sehubungan dengan reduksi hidroperoksida, inaktivasi radikal bebas, selasi dari ion logam atau kombinasi daripadanya (Zainol et al. 2003). Perbedaan aktivitas antioksidatif juga ditentukan oleh beberapa faktor lainnya seperti mekanisme yang berbeda dari metoda yang berbeda, struktur dari senyawa fenolik yang berbeda, dan mungkin juga sehubungan dengan efek sinergistik dari senyawa yang berbeda. Faktor lainnya yang menentukan aktivitas antioksidatif potensial dari senyawa fenolik adalah stabilitas dari bentuk radikal aroxy dalam struktur dari senyawa itu sendiri (Zainol et al. 2003). Mekanisme, demikian pula senyawa spesifik yang bertanggungjawab terhadap manfaat oksidatif yang diamati dari pegagan masih belum jelas. Diduga bahwa terdapat hubungan yang kuat antara aktivitas antioksidatif dan senyawa fenolik, sehingga dapat dikatakan bahwa senyawa fenolik tersebut mungkin bertanggungjawab terhadap aktivitas antioksidatif dari pegagan. Walaupun senyawa fenolik tersebut mempunyai kontribusi utama terhadap aktivitas antioksidatif pada pegagan, namun ciri-ciri dari senyawa tersebut masih belum diketahui (Zainol et al. 2003). Antiproliferatif Dilaporkan bahwa telah diperoleh 10 senyawa antiproliferatif dari ekstrak pegagan dari bagian aerialnya. Sepuluh senyawa antiproliferatif tersebut adalah 11,12-dehydroursolic acid lactone, asam ursolik, asam pomolik, 2α ,3αdihydroxyurs-12-en-28-oic acid, 3-epimaslinic acid, asam asiatik, asam korosolik, 8-acetoxy-1,9-pentadecadiene-4,6-diyn-3-ol, β-sitosterol 3-O-β-glucopyranoside, dan asam rosmarinik (Yoshida et al. 2005). Antithrombotik Pegagan adalah tanaman obat yang juga bermanfaat untuk pencegahan penyakit yang berhubungan dengan gaya hidup seperti hipertensi, kardiopati dan apopleksia serebral yang disebabkan oleh pengapuran pembuluh darah (arteriosclerosis). Efek dari pemberian kronis yaitu dengan frekuensi pemberian dua kali sehari untuk 14 hari terhadap hambatan kereaktivan platelet dan koagulasi dinamis dapat memicu sirkulasi darah untuk menghilangkan stasis darah. Fase larutan EtOAc dari ekstrak MeOH memperlihatkan aktivitas hambatan yang paling kuat untuk menghambat kereaktifan platelet dan koagulasi dinamis, sedangkan fase larutan n-BuOH juga memperlihatkan hambatan kereaktifan platelet tetapi tidak mempengaruhi koagulasi dinamis (Satake et al. 2007). Senyawa 3,5-di-O-caffeoylquinic acid menunjukkan kemampuan untuk menghambat aktivasi platelet (anti-thrombotic) dan hambatan koagulasi dinamis, sehingga mendukung fakta bahwa senyawa ini mempunyai efek antihipertensi. Komponen aktif lainnya seperti asiatikosida yang merupakan saponin utama dari tanaman ini, tidak menghambat kereaktifan platelet dan koagulasi dinamis, demikian juga dengan senyawa 1,5-disubstituted isomer dan flavonoid. Efek hambatan terhadap reaksi platelet dan koagulasi dinamis menunjukkan aktivitas yang maksimum pada konsentrasi 0,4 mg/kg bobot badan, dan menurun pada konsentrasi 4 mg/kg bobot badan serta 0,2 mg/kg bobot badan (Satake et al. 2007). Sitotoksisitas Manfaat pegagan terhadap anti tumor masih belum konsisten. Terdapat laporan yang mengatakan bahwa ekstrak etanol pegagan tidak menunjukkan aktivitas sitotoksik (Padmaja et al. 2002) sedangkan pada laporan lainnya dinyatakan bahwa pegagan mempunyai efek sitotoksisitas (Babu et al. 1995). Pegagan memberikan manfaat sitotoksik dan anti-tumor yang potensial (Babu et al. 1995). Aktivitas kemopreventif atau antikanser tersebut mungkin diperoleh melalui aktivitas imunostimulasi (Punturee et al. 2005). Stimulasi sistem kekebalan ini secara langsung menyebabkan sitotoksik terhadap sel tumor serta diyakini bahwa ekstrak kasar dan fraksi yang dipurifikasi mempunyai tingkat keracunan selektif terhadap sel tumor (Babu et al. 1995). Di samping sitotoksik langsung terhadap sel-sel tumor, pegagan dapat mencegah karsinogenesis dengan cara memodulasi respon imun. Dilaporkan juga bahwa ekstrak air pegagan mendesak aktivitas imunostimulasi terhadap proliferasi mitogenstimulasi dari human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Ekstrak air pegagan juga meningkatkan produksi IL-2 dan TNF-α pada human PBMCs (Punturee et al. 2005). Penelitian secara in vivo, menunjukkan bahwa tikus yang diberi ekstrak air pegagan (100 mg/kg bobot badan) menunjukkan respon yang lebih tinggi terhadap antibodi primer dan sekunder. Berbeda dengan ekstrak air, ekstrak etanol pegagan menunjukkan aktivitas imunosupresif. Hal itu ditandai dengan pengurangan proliferasi mitogen-stimulated human PBMCs dan produksi IL-2 serta TNF-α. Produksi TNF-α yang berlebihan berhubungan dengan berbagai penyakit termasuk penyakit infeksi, penyakit autoimun dan kanker. Dengan demikian, hambatan produksi TNF-α oleh ekstrak etanol dari pegagan mungkin saja penting. Walaupun, mekanisme yang tepat dari efek ini tidak jelas, namun mekanisme tersebut mungkin saja dimediasi oleh interaksi antara komponen aktif dari ekstrak dan sel molekul atau faktor-faktor pertumbuhan yang terlibat dalam aktivasi mitogen. Kemungkinan aktivitas yang lain adalah mungkin saja interferensi dengan sel signaling (Punturee et al. 2005). Berbeda dengan pengujian secara in vivo, pengujian sitotoksisitas secara in vitro menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan fraksi yang dipurifikasi menunjukkan efek sitotoksisitas terhadap berbagai line yang ditransformasikan, demikian juga aktivitas terhadap sel fibroblast. Efek cell sitotoksisitas terhadap multiplikasi sel mouse lung fibroblast (L-929) secara in vitro dari ekstrak metanol pegagan dan fraksi aseton dari kolom khromatografi memberikan hasil yang bermanfaat pada konsentrasi 100 µg/mL. Demikian juga dengan pemberian secara oral dari ekstrak metanol pegagan dan fraksi aseton dapat memperlambat perkembangan tumor solid dan tumor asites. Konsentrasi ekstrak etanol yang diperlukan untuk menghasilkan 50% kematian sel adalah 62 µg/mL untuk EAC (Ehrlich ascites tumour cells) dan 75 µg/mL untuk DLA (Dalton’s lymphoma ascites tumour cells) dan untuk fraksi yang dipurifikasi adalah 17 µg/mL untuk EAC dan 22 µg/mL untuk DLA (Babu et al. 1995). Pemberian ekstrak kasar dan fraksi yang dipurifikasi dapat mengurangi perkembangan murine solid tumour. Fraksi yang dipurifikasi dan senyawa fluorescent juga menghambat proliferasi sel L-929 di dalam kultur pada konsentrasi 8 dan 3,5 µg/mL. Fraksi yang dipurifikasi dan senyawa fluorescent menghambat sintesa DNA dengan pengurangan produksi (3H)-thymidine dan tidak mempunyai peran terhadap hambatan sintesa protein dan sintesa RNA. Fraksi yang dipurifikasi dan senyawa fluorescent kurang menyebabkan peningkatan (3H)-leucin dan (3H)-uridine, mungkin karena terjadi peningkatan transkripsi dan translasi sel tumor selama kematian sel (Babu et al. 1995). Pangan Fungsional Berdasarkan bukti ilmiah bahwa pegagan mengandung berbagai macam zat gizi dan juga dapat memberikan berbagai manfaat kesehatan maka pegagan dapat dikatagorikan sebagai nutraceutical dan pangan fungsional karena telah terbukti dapat mengobati dan mencegah terjadinya penyakit disamping sebagai gizi dasar. Terdapat beberapa definisi tentang pangan fungsional yang dikeluarkan oleh lembaga Internasional. Menurut International Food Information Council (IFIC), pangan fungsional adalah makanan atau komponen makanan yang dapat memberikan manfaat kesehatan di luar gizi dasar. International Life Sciences Institute of North America (ILSI), mendefinisikan pangan fungsional adalah pangan yang secara fisiologis komponen bahan aktifnya memberikan manfaat kesehatan di luar gizi dasar. Health Canada mendefinisikan bahwa pangan fungsional adalah makanan yang mirip dalam hal tampilannya dengan makanan konvensional, dikonsumsi sebagai bagian dari diet biasa, dengan manfaat fisiologis mengurangi risiko penyakit kronis diluar fungsi gizi dasar. Nutrition Business Journal mengklasifikasikan pangan fungsional sebagai makanan yang diperkaya dengan bahan-bahan tambahan atau konsentrat yang dapat meningkatkan kesehatan atau kinerja. Pangan fungsional termasuk sereal yang diperkaya, roti, minuman olahraga, makanan ringan fortifikasi, makanan bayi, makanan siap saji, dan banyak lagi yang lainnya (Wildman & Kelley, 2007). Tren terbaru dalam pemasaran pangan fungsional menunjukkan bahwa beberapa manfaat produk menjadi hal yang paling umum yang ditawarkan oleh produsen kepada konsumen. Ketertarikan konsumen untuk mengkonsumsi pangan fungsional untuk tujuan kesehatan tidak lepas dari bukti ilmiah dari khasiat pangan fungsional, penetahuan gizi, promosi dan penawaran produk yang lebih beragam untuk dijual. Konsumen cenderung akan merespon dengan berbagai latar belakang misalnya kondisi kesehatan dan tingkat pengetahuan. Teratanavat & Hooker (2006) melaporkan bahwa manfaat kesehatan dan kealamihan produk pangan fungsional lebih dipilih oleh konsumen, namun preferensi tersebut tergantung pada tingkat pendidikan individu, pendapatan, dan perilaku pembelian makanan. Berdasarkan bentuk produk pangan fungsional, zat gizi alami lebih disukai oleh konsumen daripada produk fortifikasi. Produk pangan fungsional yang diterima oleh konsumen biasanya melibatkan beberapa tahap yang berbeda dari suatu konsep untuk pelaksanaan pasar yang berhasil. Dimulai dengan menterjemahkan konsep penting menjadi prototipe yang diterima dan bermanfaat. Prototipe tersebut kemudian memerlukan penilaian untuk efikasi dan pengujian keamanan melalui hewan coba dan manusia. Publikasi data efikasi dan keamanan pangan merupakan tahap akhir dari suatu proses pengembangan pangan fungsional (Jones & Jew 2007). Pengembangan dan pemasaran produk pangan fungsional agak rumit, mahal dan berisiko. Selain hambatan teknologi, aspek legislatif, serta tuntutan konsumen perlu dipertimbangkan ketika mengembangkan pangan fungsional. Penerimaan konsumen adalah faktor kunci untuk sukses dalam bernegosiasi peluang pasar (Siró et al. 2008). Otak dan Hipokampus Otak adalah pusat dari sistem saraf pada semua hewan vertebrata, dan merupakan organ yang paling kompleks dari tubuh. Secara visual, bagian dalam otak terdiri dari daerah yang warna gelap (grey matter) yang dipisahkan oleh warna lebih terang (white matter). Otak dari semua spesies terutama terdiri dari dua jenis sel yaitu sel neuron dan sel glial. Sel glial juga dikenal sebagai glia atau neuroglia ada beberapa jenis, dan melakukan sejumlah fungsi penting, namun neuron biasanya dianggap sebagai sel yang paling penting di otak. Jumlah sel neuron dan sel glial pada pria lebih banyak 24% dari wanita. Pada wanita jumlah keseluruhan neuron neokorteks dan sel glial adalah 49,3 miliar dan pada pria 65,2 miliar (Pelvig 2008). Neuron memiliki manfaat yang unik karena mampu mengirim sinyal ke sel target yang jauh sekalipun. Neuron berkomunikasi dengan neuron lainnya melalui serabut protoplasma panjang yang disebut akson yang membawa potensial aksi ke bagian yang jauh dari otak atau tubuh. Neuron menghasilkan sinyal listrik yang berjalan di sepanjang akson. Ketika sinyal listrik mencapai persimpangan (sinaps), mengakibatkan neurotransmiter dilepaskan dan mengikat pada reseptor pada sel lain dan dengan demikian mengubah aktivitas listriknya. Sinaps merupakan elemen fungsional utama dari otak. Sumber: www.loni.ucla.edu/data/rat/ Gambar 4 Sumber: synapses.bu.edu/anatomy/hippo/hippo2.stm Anatomi otak pada posisi pandangan coronal. Inside adalah bagian hipokampus yang dibagi menjadi subdevisi CA1, CA2 dan CA3 (CA = Cornu Ammonis) Fungsi penting dari otak adalah membangun komunikasi sel ke sel, dan sinaps merupakan titik dimana komunikasi terjadi. Fungsi otak sangat tergantung pada kemampuan neuron untuk mengirim sinyal elektrokimia ke sel lain, dan kemampuan sel neuron untuk merespon dengan tepat terhadap sinyal-sinyal elektrokimia yang diterima dari sel lain. Sifat listrik dari neuron dikendalikan oleh berbagai proses biokimia dan metabolik, terutama interaksi antara neurotransmiter dan reseptor yang terjadi pada sinaps. Jaringan otak memerlukan sejumlah besar energi dan tergantung pada volume otak. Sebagian besar spesies vertebrata memerlukan antara 2-8% metabolisme basal ke otak dan pada manusia meningkat hingga 20-25%. Gambar 5 Struktur sel neuron (http://en.wikipedia.org/wiki/File: Chemical_ synapse_schema_cropped.jpg Hipokampus adalah komponen utama dari otak manusia dan vertebrata lainnya. Hipokampus mempunyai sistem limbik dan memainkan peran penting dalam konsolidasi informasi dari memori jangka pendek ke memori jangka panjang dan navigasi spasial. Manusia dan mamalia lainnya memiliki dua hipokampus, satu di setiap sisi otak. Hipokampus sangat erat kaitannya dengan korteks serebral, dan pada primata terletak di lobus temporal medial, di bawah permukaan kortikal. Hipokampus terdiri dari dua bagian utama yaitu Ammon's horn dan dentate gyrus, yang pada awalnya digambarkan sebagai pes hippocampi major dan pes hippocampi minor. Kerusakan pada hipokampus juga bisa terjadi akibat kekurangan oksigen (hipoksia), ensefalitis, atau epilepsi lobus temporal medial. Orang yang mengalami kerusakan hipokampus bilateral akan mengalami anterograde amnesia yaitu mempertahankan memori baru. ketidakmampuan untuk membentuk atau Pada hewan pengerat, hipokampus telah dipelajari secara ekstensif sebagai bagian dari sistem otak yang bertanggung jawab untuk memori spasial dan navigasi. Oleh karena berbagai jenis sel saraf yang tersusun rapi di dalam lapisan di hipokampus, sehingga sering digunakan sebagai model untuk mempelajari neurofisiologi. Secara historis, pada awalnya diduga bahwa hipokampus berfungsi dalam sistem penciuman, namun hanya sedikit orang yang percaya bahwa penciuman adalah fungsi utamanya. Saat ini sudah ada kesepakatan umum bahwa hipokampus memainkan peran penting dalam memori, namun sifat yang tepat dari peran ini masih banyak diperdebatkan. Peran hipokampus dalam fungsi kognitif dipopulerkan oleh O'Keefe dan muridnya Dostrovsky pada tahun 1971 yang menemukan neuron di hipokampus tikus yang menjelaskan tentang aktivitas tikus dalam lingkungannya. Selanjutnya pada tahun 1978 O'Keefe & Lynn Nadel menyusun buku yang diberi judul The Hipokampus as a Cognitive Map. Sel di hipokampus yang bertanggung jawab dalam memberi respon adalah sel pyramidal dan sel granula di dentate gyrus yang terdapat di hipokampus lapisan padat. Tipe sel neuronal utama dari hipokampus adalah sel piramidal. Walaupun neuron piramidal sebagian besar neuron pada CA3, namun ada juga kelompok dari interneuron yang heterogen. Pada tingkat dorsal, sel-sel kecil (dengan ukuran diameter soma ~300 µm2 atau 20 µm) terletak di dalam otot dentate gyrus dan mempunyai total panjang dendritik 8–11 mm. Sel-sel besar (dengan ukuran diameter soma ~700 µm2 atau 30 µm), terletak di bidang distal, mempunyai total panjang dendritik 16–19 mm. Total panjang dendritik tidak berhubungan dengan panjang aksonal karena sel piramidal di bagian proksimal dari CA3, dengan keseluruhan poros tempat dendritik yang paling pendek, mempunyai pohon aksonal yang paling besar (Witter 2007). Stres sosial yang kronis mendorong penurunan jumlah titik percabangan dan total panjang dendritik di pohon dendritik apikal dari neuron CA3 piramidal (Mckittrick et al. 2000). Banyak sel piramidal ventral mempunyai pohon dendritik yang besar juga cenderung mempunyai pohon aksonal yang lebih besar dibandingkan dengan yang di posisi dorsal. Distribusi dari pohon dendritik sel CA3 piramidal lebih lanjut bervariasi tergantung pada dimana badan sel terletak sepanjang poros melintang (Witter 2007). Secara bilateral ukuran soma CA3 secara positif berhubungan dengan umur. Somata CA3 lebih kecil dibandingkan dengan somata CA2. Variabilitas pada bentuk soma atau ukuran meningkat dengan bertambahnya umur di kedua sub bidang, sementara variabilitas pada orientasi soma kurang berhubungan dengan pertumbuhan otak. Di awal perkembangan terdapat persamaan dalam pola pertumbuhan hemisfer di CA3 dan CA2. Somata CA2 adalah 34% dan 32% lebih besar dari somata CA3 di sisi kiri dan kanan. Secara bilateral, ukuran soma meningkat secara linear dengan pertumbuhan otak. Demikian juga variabilitas ukuran soma meningkat secara sistematis ketika otak bertumbuh. Di sisi lain, secara bilateral variabilitas dalam orientasi soma kurang berhubungan dengan berat otak, dan secara konsisten ke arah negatif. Korelasi antara kepadatan neuronal dan berat otak mengungkapkan satu pola konsisten yang kuat di kedua sub bidang. Hubungan yang kuat antara ukuran soma dan kepadatan hanya ditemukan pada CA3 kanan. Pola pertumbuhan yang serupa diamati di dua sisi berkenaan dengan ukuran soma dan variabilitas dari ukuran, bentuk, dan orientasi. Ketika neuron pada sub bidang hipokampus ini tumbuh lebih besar, kepadatan merosot, yang menunjukkan kematangan dari neuron. Rendahnya nilai korelasi mengisyaratkan laju maturasi neuronal lambat. Secara bilateral, ukuran neuron dan perbedaan bentuk meningkat dengan berat otak (umur), sedangkan keteraturan di dalam orientasi neuronal adalah sama (Zaidel 1999). Neuron pada CA3, baik sel piramidal demikian pula interneuron, menerima input masif dari sel granul di dentate gyrus, yang disebut sistem serat mossy. Secara proksimal di dalam CA3, serat mossy didistribusikan ke superfisial lapisan sel piramidal. Bagian distal dari CA3 menerima input serat mossy secara preferensial dari sel granul pada blade tertutup dari dentate gyrus. Permulaan input dari bagian berbeda dari dentate gyrus dapat juga menggunakan pengaruh yang berbeda sepanjang pohon dendritik dari CA3 piramidal individual demikian pula dapat secara selektif menginervasi kelompok tertentu dari neuron CA3. Pada kebanyakan ujung distal dari bagian dorsal dari CA3, populasi sel CA3 piramidal sebagian besar mengintegrasikan input dari keseluruhan dorsal ujung dentate gyrus, fitur itu tidak ada pada level proksimal dan pertengahan transversal demikian pula pada level CA3 ventral. Dalam hal keterkaitan fungsional, peran CA3 di luar jejaring yang autoasosiatif menyediakan input ke CA1. Di bagian distal CA3, dan lebih khususnya pada level dorsal, neuron CA3 individual menerima input serat mossy yang berasal dari bagian dorsal yang tersebar luas ke lokasi neuron penerima. Dengan demikian distal CA3 neuron ini mengintegrasikan output dari bagian yang cukup besar dari dentate gyrus. Bagian proksimal dari CA3 mungkin saja secara fungsional berbeda dari bagian distal. Distribusi transversal dari input serat mossy infrapiramidal dapat berubah tergantung pada pengalaman behavioral (Witter 2007). Restrukturisasi morfologis dari pohon dendrit sel CA3 piramidal mungkin saja bagian dari respon adaptip normal terhadap stres, dari langkah pertama dalam kaskade yang mendorong ke arah kematian sel pyramidal. Beberapa observasi mendukung hipotesis bahwa remodeling dendritik tidak perlu merepresentasikan suatu respon mengenai patologis terhadap stres. Penyusutan pohon dendritik dengan stres berpotensi memberikan fungsi adaptip dengan cara membatasi input ke neuron CA3 piramidal, dengan demikian penyaringan informasi ekstraneous keluar selama waktu stress. Penyusunan kembali vesikel kecil dekat zona aktif sinaptik adalah disertai dengan hipertropi mitokhondrial, menegaskan bahwa, setelah stres kronis, terminal serat mossy meningkatkan output eksitatori. Beberapa kemungkinan manfaat dari remodeling dapat terjadi bersama dengan pengurangan yang kecil pada spasial learning (Mckittrick et al. 2000). Kognitif Kognitif adalah kemampuan berfikir dan memberikan rasional, termasuk proses mengingat, menilai, orientasi, persepsi dan memperhatikan. Kemampuan berfikir erat kaitannya dengan fungsi otak, karena kemampuan seseorang untuk berfikir dipengaruhi oleh keadaan otak. Hampir semua makhluk mampu memodifikasi perilakunya sebagai hasil dari pengalaman. Perilaku didorong oleh aktivitas otak, sehingga perubahan perilaku juga diikuti dengan perubahan dalam otak. Hipokampus dan korteks serebral sangat berperan pada fungsi tersebut. Pada proses otak menjadi tua terjadi perubahan anatomi sel-sel neuron atau sel-sel otak, dan jumlah sel neuron mengalami penurunan di berbagai bagian otak. Di bagian hipokampus yang merupakan pusat pantauan memori juga terjadi penurunan jumlah sel neuron dalam jumlah besar. Tulving & Markowitsch (1998) melaporkan bahwa hipokampus sangat berperan pada kemampuan memori seseorang. Orang yang mengalami kerusakan pada hipokampus dapat menimbulkan gangguan pada memori episodik yaitu ketidakmampuan untuk mengingat rincian peristiwa tertentu. Secara klinis, pada orang usia lanjut kemunduran fungsi memori digolongkan ke dalam gangguan memori fisiologis dan gangguan memori patologis yang disebabkan oleh penyakit otak misalnya Alzheimer (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Dilaporkan juga bahwa penuaan yang normal juga akan memberi perubahan pada struktur hipokampus dan biokimia hipokampus (Driscoll et al. 2003). Dengan demikian, kelainan pada fungsi otak akan berpengaruh secara langsung kepada fungsi kognitif seseorang. Perkembangan ilmu pengetahuan tentang mekanisme kerja otak saat ini mengalami lompatan yang luar biasa, dan hasil penelitian yang telah diperoleh saat ini sangat bermanfaat untuk kehidupan manusia dan juga dapat dijadikan sebagai acuan untuk penelitian lebih lanjut yang berkaitan dengan kemampuan fungsi kognitif (Sidiarto & Kusumoputro 2003). Dengan demikian, memahami mekanisme kerja otak akan memudahkan untuk memahami bagian-bagian fungsinya serta cara penanggulangannya apabila terjadi gangguan dan menjadi dasar dalam penerapan penanggulangan kemampuan kognitif (Sidiarto & Kusumoputro 2003) dan peningkatan fungsi kognitif. 35 KERANGKA PEMIKIRAN Kemampuan fungsi kognitif sangat dipengaruhi oleh keadaan otak. Asupan zat gizi yang baik dan berimbang selama masa kehamilan sampai dengan usia periode emas, sangat membantu untuk mengoptimalkan fungsi kognitif. Apabila pada periode tersebut kecukupan zat gizi tidak terpenuhi maka fungsi kognitif tidak dapat dicapai secara maksimal. Penyakit atau kelainan pengembangan kemampuan kognitif baik karena perolehan atau karena faktor lingkungan, atau karena faktor bertambahnya usia juga merupakan salah satu faktor predisposisi terjadinya penurunan fungsi kognitif. Pada kondisi normal, fungsi kognitif dapat dioptimalkan dengan mengkonsumsi pangan fungsional yang bermanfaat terhadap fungsi kognitif secara tepat disamping mengkonsumsi zat gizi lainnya secara berimbang dan menerapkan pola hidup sehat. Demikian juga pada kondisi dimana fungsi kognitif tidak dicapai secara maksimal, pemberian pangan fungsional juga dapat membantu memperbaiki fungsi kognitif. Kemunduran fungsi kognitif dapat dicegah atau diatasi dengan cara pendekatan medis moderen atau pendekatan gizi terutama penggunaan pangan fungsional. Penanganan dengan cara pendekatan medis moderen biasanya terdapat beberapa hambatan, diantaranya belum ada teknologi yang benar-benar sesuai, memerlukan biaya yang cukup mahal, tingkat keamanannya rendah, dan efektifitasnya masih dipertanyakan. Pendekatan dengan cara gizi terutama dengan menggunakan pangan fungsional memberikan beberapa keuntungan diantaranya tidak memerlukan biaya yang tinggi, tingkat keamanan yang tinggi dan dapat diaplikasi secara langsung oleh masyarakat. Berdasarkan bukti empiris pegagan telah digunakan secara meluas di India untuk semua golongan umur pada pengobatan sistem ayurvedic, yaitu suatu sistem pengobatan alternatif untuk meningkatkan memori. Di Indonesia, pegagan umumnya digunakan untuk sayur sebagai lalapan, sedangkan untuk tujuan meningkatkan memori belum dikenal secara meluas. Perbaikan fungsi kognitif karena penggunaan pegagan belum diketahui secara pasti Data sebelumnya menyatakan bahwa di dalam pegagan mengandung mineral makro dan mikro, asiatikosida dan zat gizi lainnya. Diantara senyawa tersebut, asiatikosida diduga berperan pada perbaikan fungsi kognitif, namun mekanismenya belum diketahui, apakah mekanismenya langsung melalui kinerja neuron atau melalui aktivitas antioksidan. Keberadaan mineral makro dan mikro serta zat gizi lainnya yang terdapat di dalam pegagan juga belum diketahui secara pasti, apakah keberadaan senyawa tersebut dapat memperbaiki sistem metabolism umum yang pada akhirnya memperbaiki fungsi kognitif, atau senyawa tersebut langsung memperbaiki kinerja saraf. Oleh karena itu, kajian tentang mekanisme peningkatan fungsi kognitif dan analisis kandungan bahan aktif yang terdapat di dalam pegagan sangat diperlukan sebelum pangan fungsional tersebut direkomendasikan kepada masyarakat luas untuk tujuan meningkatkan memori. Lebih jauh, sebelum pegagan direkomendasikan untuk tujuan sebagaimana disebut di atas, perlu dilakukan uji empiris menggunakan hewan model. Beberapa variabel penting yang menjadi fokus pengamatan dalam penelitian ini guna menjelaskan mekanisme peningkatan memori adalah sebagai berikut: a. Penentuan jenis ekstrak dan bahan ekstrak yang potensial untuk tujuan meningkatkan fungsi memori. b. Analisis komponen bahan aktif dan unsur kimia lainnya yang terdapat dalam masing-masing bahan ekstrak. c. Pengamatan tingkah laku dan keaktifan hewan model dengan menggunakan metode labirin. d. Analisis terhadap gambaran darah yang meliputi defferensial leukosit, Hb, Packet Cell Volume (PCV), total leukosit dan eritrosit e. Analisis penanda biologis yang mengindikasikan keadaan fungsi memori seperti, GFAP, calbindin, dopamin, CRP, TNF-α dengan metode imunohistokimia f. Pertumbuhan neuronal pada region CA3 dari hipokampus yang mencakup struktur kepadatan neuronal dengan metode histokimia. Data tentang pertumbuhan neuronal karena pemberian pegagan sudah tersedia namun masih parsial sehingga belum menjawab pengaruh dari pegagan terhadap peningkatan fungsi memori. Oleh karena itu sangat diperlukan data yang menggambarkan mekanisme yang berhubungan dengan peningkatan fungsi kognitif, sehingga mampu menjawab sebagian dari mekanisme peningkatan kecerdasan. Dengan demikian, penelitian ini diharapkan mampu memberikan kontribusi terhadap manfaat pegagan pada peningkatan fungsi memori. Data yang diperoleh diharapkan dapat menjadi acuan untuk program pengembangan dan pemanfaatan tanaman pegagan sebagai tanaman obat atau pangan fungsional. Kerangka pemikiran disajikan pada Gambar 6. • Penyakit • Kelainan pengembangan (perolehan/lingkungan) • Usia • Asupan makanan KUALITAS FUNGSI KOGNITIF Peningkatan fungsi kognitif Pendekatan medis modern Pendekatan gizi (pangan fungsional) • Blm ada teknologi yang sesuai • Biaya cukup mahal • Tingkat keamanannya rendah • Efektivitasnya? • Mineral makro • Mineral mikro • Zat gizi lainnya • • • • • Telah diketahui secara meluas Biaya rendah Tingkat keamanan tinggi Dapat diaplikasi langsung Efektifitasnya? Pegagan Metabolisme umum Kinerja saraf Kinerja Otot Kognitif Gambar 6 Kerangka Pemikiran Asiatikosida Antioksidan 39 METODE PENELITIAN Penelitian 1. Penyiapan Ekstrak Pegagan dan Analisis Kandungan Zat Gizi Tujuan: Mendapatkan bahan ekstrak dan data kandungan kimia yang terdapat pada berbagai bagian tanaman pegagan yang bermanfaat untuk kesehatan. Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di laboratorium Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro) Bogor. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari pegagan segar, etanol teknis 70%, aquades, dan bahan untuk analisis kimia. Untuk analisis fitokimia bahan yang digunakan terdiri dari daun pegagan segar, kloroform, amoniak, H 2 SO 4 , pereaksi Dragendorf, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, metanol, air, etanol, eter, pereaksi Liebermen Burchard dan FeCl 3 . Bahan yang digunakan untuk analisis bahan aktif terdiri dari etanol p.a, metanol, asetonitrit, toluene, oli vacuum dan silica gel 60F 254. Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari alat yang digunakan untuk melakukan ekstraksi yang terdiri dari ekstraktor destilasi, rotavapor, blender, eksikator, oven, kertas dan kain saring. Untuk analisis fitokimia dan analisis bahan aktif, alat yang digunakan terdiri dari Thin Layer Chromatography (TLC) Scanner, cawan porselen, aufhauser, hot plate, labu didih, kondensor, eksikator, oven, tanur, alat pendorong dan hitter mantel. Sumber Pegagan Jenis pegagan yang digunakan pada penelitian ini adalah aksesi Bojolali yang berasal dari kebun percobaan Balittro, Gunung Putri, Cipanas yang ditanam pada hamparan terbuka pada kondisi tanah yang seragam. Lokasi kebun tersebut berada pada ketinggian 1500 m dpl. Pegagan yang digunakan pada penelitian ini berumur lebih kurang 90 hari dan telah dipanen beberapa kali. Penyiapan Bahan Ekstrak dan Skrining Penyiapan bahan ekstrak diawali dengan pemanenan pegagan yang dilakukan pada pagi hari dan selanjutnya segera dilakukan penyortiran di lokasi untuk menghindari kerusakan bahan baku pegagan. Kegiatan penyortiran yang dilakukan adalah memisahkan tanaman pegagan menjadi 3 bagian yaitu daun, tangkai daun dan keseluruhan bagian tanaman (kecuali stolon dan akar). Selanjutnya bagian tanaman yang telah disortir tersebut dimasukkan ke dalam kantong plastik yang terpisah. Jumlah masing-masing bagian tanaman pegagan tersebut adalah sebanyak 3 kg. Sebelum diekstraksi, terlebih dahulu pegagan tersebut dicuci ringan agar tidak banyak zat gizi yang hilang. Setelah pencucian selanjutnya dilakukan pemeriksaan fitokimia untuk mengetahui mutu awal dari pegagan dalam keadaan segar. Ekstraksi dan Maserasi Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengektraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua pelarut diuapkan dan serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Proses ekstraksi bahan nabati atau tumbuhan dapat dilakukan berdasarkan teori penyarian. Penyarian merupakan suatu proses pemindahan massa dari bahan ke cairan penyari. Beberapa metode penyarian antara lain: maserasi, perkolasi, dan soxhletasi. Maserasi merupakan proses penyarian yang paling sederhana dan banyak digunakan untuk menyari bahan obat yang berupa serbuk simplisia halus. Simplisia ini direndam dalam cairan penyari sampai meresap dan melemahkan susunan sel sehingga zat-zat akan larut. Serbuk simplisia yang akan disari ditempatkan dalam wadah atau bejana bermulut besar, ditutup rapat kemudian dikocok berulang-ulang sehingga memungkinkan pelarut masuk ke seluruh permukaan serbuk simplisia. Masing-masing bagian pegagan sebanyak 3 kg dicampur dengan pelarut air (aquades) untuk mendapatkan ekstrak air, dan pelarut etanol 70% untuk mendapatkan ekstrak etanol dengan perbandingan 1 bagian daun dan 5 bagian Bahan baku segar, disortasi (daun, tangkai daun, gabungan) Pencucian (Air) Ekstraksi Aquadest Penghancuran 4 jam, 250-500 rpm Maserasi Penyaringan Bahan: Pelarut = 1:5 Etanol Penghancuran Pengadukan Analisis mutu awal (analisis proksimat, skrining fitokimia, analisis bahan aktif, analisis mineral) Pengadukan Maserasi Ampas Penyaringan Filtrat Filtrat Penguapan (rotavapor) Penguapan (rotavapor) Ekstrak kental (oleoresin) Ekstrak kental (oleoresin) Analisis mutu Analisis mutu Pengujian pada tikus Gambar 7 Diagram alir pembuatan ekstrak pegagan pelarut, lalu dihancurkan dengan menggunakan blender. Kemudian masingmasing campuran tersebut diekstrak (diaduk) selama 4 jam. Setelah 4 jam, mixer dimatikan dan didiamkan (dimaserasi) selama 24 jam, lalu disaring secara bertahap menggunakan kain dan kertas saring. Hasil saringan berupa filtrat selanjutnya diuapkan menggunakan alat rotavapor pada 60 oC sehingga dihasilkan ekstrak kental. Selanjutnya ekstrak kental tersebut dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer. Kemudian dilakukan analisis kandungan bahan aktif pada masing-masing ekstrak dengan menggunakan TLC Scanner. Dua jenis ekstrak dari bagian tanaman yang mempunyai kandungan bahan aktif asiatikosida yang paling tinggi dipilih sebagai bahan uji untuk diuji ke tikus model. Semua proses dilakukan sesuai dengan prosedur standar Laboratorium Balittro. Diagram alir penyiapan ekstrak disajikan pada Gambar 7. Variabel yang Diukur Analisis Fitokimia Analisis fitokimia dilakukan berdasarkan Harborne (1987) untuk mengetahui mutu awal dari pegagan segar. Alasan lain melakukan analisis fitokimia ialah untuk menentukan ciri senyawa aktif (Harborne, 1996). Identifikasi yang dilakukan adalah uji alkaloid, tannin, flavonoid, saponin, steroid, dan triterpenoid. Uji Alkaloid: Sebanyak 1 gram daun digerus dan ditambahkan 1,5 mL kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 5 tetes H 2 SO 4 2M. Fraksi asam dibagi menjadi 3 tabung kemudian masing-masing ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat pada pereaksi Wagner. Uji Flavonoid dan Fenolik Hidrokuinon. Sebanyak 1 g contoh ditambah metanol 30% sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya ditaruh kedalam spot plate (papan uji) dan kemudian ditambahkan NaOH 10% (b/v) atau H2SO4 pekat. Terbentuknya warna merah karena penambahan NaOH menunjukkan adanya senyawa fenolik hidrokuinon sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan H2SO4 pekat menunjukkan adanya flavonoid. Uji Saponin: Setengah gram daun ditambahkan air secukupnya dan dipanaskan selama lima menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok selama ± 10 menit. Timbulnya busa yang bertahan lebih dari 10 menit menunjukkan adanya saponin. Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 2 g contoh ditambah 25 mL etanol 30% lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambah eter. Lapisan eter dipipet dan diujikan pada spot plate dengan menambahkan pereaksi Liebermen Buchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid. Uji Tannin: Lima gram daun ditambahkan air kemudian dididihkan selama beberapa menit. Disaring dan filtrat ditambahkan dengan 3 tetes FeCl3. Warna biru tua atau hitam kehijauan yang terbentuk menunjukkan adanya tanin. Analisis Proksimat Analisis proksimat merupakan analisis kandungan makro zat dalam suatu bahan makanan. Analisis proksimat dilakukan dengan menggunakan metode grafimetri dan untuk analisis kadar abu dan abu tak larut asam dilanjutkan dengan menggunakan alat Muffel Furnase. Analisis kadar sari yang terlarut dalam air dan alkohol juga dilakukan dengan menggunakan metode grafimetri. Analisis Kadar Air Analisis kadar air dilakukan untuk mengukur banyaknya kadar air yang terkandung di dalam bahan yang dianalisis yang dinyatakan dalam persen. Penentuan kadar air dalam bahan uji dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu metode pengeringan dengan oven biasa, metode destilasi, metode kimia dan metode khusus (kromatografi dan nuclear magnetic resonance/NMR). Pada penelitian ini pengujian kadar air dilakukan dengan metode aufhauser. Sepuluh gram pegagan segar dihaluskan dan selanjutnya dimasukkan ke dalam labu didih 250 mL. seluruhnya. Ditambah toluena hingga bahan terendam Labu didih tersebut dihubungkan dengan alat aufhauser dan kondensor yang dipasang secara seri. Labu dipanaskan di atas hot plate selama 3 jam, selanjutnya didinginkan. Setelah dingin, tetesan air yang menempel di dinding kondensor dan di dinding alat aufhauser didorong dengan menggunakan alat pendorong hingga air berada di dalam leher skala alat aufhauser. Selanjutnya dilakukan pembacaan skala yang menunjukkan jumlah mL air yang dihasilkan. Kadar air adalah volume air yang dihasilkan (mL) dibagi dengan bobot contoh, dikali dengan 100%. Kadar Abu Penentuan abu total digunakan untuk berbagai tujuan, yaitu selain sebagai parameter nilai gizi dalam bahan makanan juga untuk mengetahui baik tidaknya suatu proses pengolahan, serta untuk mengetahui jenis bahan yang digunakan. Pengukuran kadar abu bertujuan untuk mengetahui besarnya kandungan mineral yang terdapat dalam bahan uji. Mineral sebagai senyawa anorganik dapat ditetapkan dengan cara pengabuan. Pembakaran akan menghancurkan senyawasenyawa organik ke dalam bentuk gas yang mudah terbang, sedangkan mineral sebagai senyawa anorganik akan tinggal dalam bentuk abu yang kadarnya dapat diketahui melalui penimbangan. Terlebih dahulu cawan porselen dipanaskan selama 15 menit di dalam oven. Selanjutnya didinginkan dalam eksikator selama 15-20 menit, lalu ditimbang bobot cawan kosong. Ke dalam cawan kosong ditambah contoh sebanyak 2 gram, lalu dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 400 oC dan setelah asapnya hilang suhu dinaikkan menjadi 800 oC dan didiamkan selama 5-8 jam. Selanjutnya didiamkan di dalam eksikator lalu ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu adalah berat cawan kosong yang ditambah contoh setelah dipanaskan dikurangi dengan berat cawan kosong, dibagi dengan berat contoh, dikali 100%. Kadar Sari Larut dalam Air Pengukuran sari larut dalam air dilakukan untuk mengetahui seberapa banyak komponen dalam bahan uji yang terlarut dalam air. Lima gram bahan contoh dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. Selanjutnya ditambahkan kloroform-air dengan perbandingan 1:1 sebanyak 1/3 volume labu ukur. Didiamkan selama 24 jam dan sesekali dikocok. Dihimpitkan dengan kloroformair hingga batas tera, lalu disaring dengan kertas saring kasar. Filtratnya dipipet sebanyak 25 mL, dimasukkan ke dalam cawan penguap lalu diuapkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama 3-4 jam. Didinginkan dalam eksikator selama 20 menit, lalu ditimbang sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air adalah berat cawan kosong yang ditambah dengan contoh setelah dipanaskan dikurangi dengan berat cawan kosong, dibagi dengan berat contoh, dikali dengan faktor pengeceran, dikali dengan 100%. Kadar Sari Larut dalam Alkohol Pengukuran kadar sari yang larut dalam alkohol dilakukan untuk mengetahui seberapa banyak komponen dalam bahan uji yang terlarut dalam alkohol. Lima gram bahan contoh dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. Selanjutnya ditambahkan alkohol 96% sebanyak 1/3 volume labu ukur. Didiamkan selama 24 jam dan sesekali dikocok. Dihimpitkan dengan alkohol sampai tanda tera, lalu disaring dengan kertas saring kasar. Filtratnya dipipet sebanyak 25 mL, dimasukkan ke dalam cawan penguap lalu diuapkan dalam oven dengan suhu 105 oC selama 3-4 jam. Didinginkan dalam eksikator selama 20 menit, lalu ditimbang sampai bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam alkohol adalah berat cawan kosong yang ditambah dengan contoh setelah dipanaskan dikurangi dengan berat cawan kosong, dibagi dengan berat contoh, dikali dengan faktor pengeceran, dikali dengan 100%. Analisis Kandungan Kimia Pegagan Analisis kimia yang dilakukan terhadap bahan segar dan ekstrak pegagan terdiri dari analisis kadar mineral (K, Na, Mg, Ca, Cu, Zn, Fe, Mn dan P) dan analisis bahan aktif (asiatikosida) dengan metoda TLC Scanner. Analisis Mineral Analisis mineral dilakukan dengan metoda Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) yang merupakan salah satu teknik analisis untuk mengukur jumlah unsur berdasarkan jumlah energi cahaya yang diserap oleh unsur tersebut dari sumber cahaya yang dipancarkan. Prinsip kerja alat ini berdasarkan penguapan larutan sampel, kemudian logam yang terkandung di dalamnya diubah menjadi atom bebas. Atom tersebut mengabsorpsi radiasi dari sumber cahaya yang dipancarkan dari lampu katoda (hollow cathode lamp) yang mengandung unsur yang akan dianalisis. Banyaknya penyerapan radiasi kemudian diukur pada panjang gelombang tertentu menurut jenis unsur yang dianalisis. Pengolahan dan Analisis Data Setiap data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dan dianalisis secara diskriptif dengan kaidah yang telah ditetapkan guna menjawab pertanyaan dan tujuan yang telah ditetapkan. Pengolahan dan analisis data dilakukan secara bertahap yang diawali dengan pengumpulan dan entri data. Penelitian 2. Pengujian Ekstrak Pegagan pada Hewan Model Tujuan: Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun pegagan terhadap pertambahan bobot badan, asupan pakan, gambaran darah, aktivitas dan fungsi kognitif pada tikus. Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari ekstrak etanol dan ekstrak air pegagan, tikus jantan breed Wistar yang berumur lebih kurang 2 bulan sebanyak 40 ekor, sonde lambung, kandang dan peralatannya serta maze model Multiple T yang telah dimodifikasi. Pakan tikus yang digunakan adalah pakan standar (PT Indofeed) yang sesuai dengan status fisiologis hewan coba. Kandungan nutrisi pakan yang diberi untuk semua tikus disajikan pada Tabel 5. Sebelum dimulai penelitian, semua tikus terlebih dahulu diadaptasi dengan pakan yang digunakan dalam penelitian ini selama 7 hari. Selama masa adaptasi, pakan dan air minum diberi secara ad libitum dan pada masa perlakuan jumlah pakan yang diberi adalah sebanyak 10% dari bobot badan. Setiap tikus dari masing-masing perlakuan diberi kesempatan untuk memperoleh pakan dan minuman secara bebas. Pakan diberi dalam wadah khusus dan terhindar dari pencemaran. Bentuk kandang yang digunakan adalah bentuk kandang kelompok yang terpisah, yang dilengkapi dengan wadah pakan, minuman, dan tempat penampungan kotoran. Tabel 5 Kandungan nutrisi pakan tikus Komposis nutrisi Protein Lemak Serat Abu TDN Ca:P Kandungan 23% 4% 5% 9% 2 650 ME/kkal 1:0,8 Penentuan Level Pegagan Penentuan level yang digunakan mengacu kepada jumlah pegagan yang layak dikonsumsi per hari, dan juga berdasarkan kepada level yang telah digunakan oleh peneliti sebelumnya. Level yang pernah digunakan oleh peneliti sebelumnya tidak mengacu kepada kandungan bahan aktifnya. Level yang digunakan adalah berdasarkan gram bahan ekstrak per kg bobot badan hewan coba. Level pemberian oral yang telah pernah dicoba berkisar antara 0,5 – 300 mg per kg bobot badan dengan lama pemberian paling sedikit satu kali dan paling lama 4 bulan. Rao et al. (2006) menggunakan level 0,158 – 0,474 mg ekstrak daun segar per kg bobot badan per hari untuk melihat pengaruhnya terhadap pertumbuhan neuron dendritik hipokampus CA3. Dilaporkan bahwa level tertinggi dengan waktu pemberian yang paling lama memberi pengaruh yang lebih baik terhadap pertumbuhan neuron dendritik dibandingkan dengan level rendah dengan waktu pemberian yang singkat (Rao et al. 2006). Oleh karena terdapat variasi level yang sangat tinggi, maka pada penelitian ini terlebih dahulu dilakukan penelitian pendahuluan untuk mendapatkan level yang tepat. Setelah diperoleh level yang tepat, selanjutnya ditetapkan 4 level perlakuan yaitu level 0 (kontrol), 100, 300 dan 600 mg ekstrak/kg bobot badan yang diuji pada tikus selama 8 minggu. Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok yang terdiri dari satu perlakuan pada empat tingkatan level dan lima ulangan. Desain penelitian dimaksud seperti disajikan Gambar 8. Unit percobaan terdiri dari 40 ekor tikus yang berumur lebih kurang 2 bulan yang diuji dengan ekstrak air dan ekstrak etanol pegagan. Pengujian ekstrak air dan etanol dilakukan pada waktu yang berbeda. Tikus n = 40 ekor Ekstrak Air Ekstrak Etanol Kontrol 0 mg/kg BB n=5 Kontrol 0 mg/kg BB n=5 Level 1 100 mg/kg BB n=5 Level 1 100 mg/kg BB n=5 Level 2 300 mg/kg BB n=5 Level 2 300 mg/kg BB n=5 Level 3 600 mg/kg BB n=5 Level 3 600 mg/kg BB n=5 Gambar 8 Desain penelitian Untuk mendapatkan validitas eksternal yang tinggi maka masing-masing set percobaan (kontrol dan perlakuan) didesain atas 5 ulangan. Hewan percobaan dan ekstrak pegagan diperoleh dari sumber yang seragam sehingga dapat mengurangi pengaruh variabel lain selain variabel yang diteliti atau variabel perlakuan. Penempatan tikus di masing-masing set percobaan didasarkan kepada pola aktivitasnya yaitu aktif dan tidak aktif. Tikus-tikus yang aktif dan tidak aktif ditempatkan pada masing-masing set percobaan secara acak sehingga semua tikus dari masing-masing blok tersebut mendapat kesempatan yang sama terhadap setiap set percobaan. Ekstrak pegagan diberi secara oral dengan menggunakan sonde lambung dan ekstrak tersebut terlebih dahulu dilarutkan dengan air suling dalam volume yang sama yaitu 1 mL untuk setiap set percobaan. Untuk kelompok kontrol juga diberi air suling sebanyak yang diberi atau yang digunakan pada kelompok perlakuan yaitu 1 mL. Variabel yang Diukur Konsumsi Pakan Total pakan yang dikonsumsi diukur pada setiap harinya dan direkap dalam asupan mingguan. Rata-rata konsumsi pakan per ekor tikus per hari pada masing-masing kelompok percobaan adalah total pakan yang dikonsumsi dibagi dengan jumlah tikus pada masing kelompok percobaan dan selang waktu pengukuran (g/ekor/hari). Bobot Badan Penimbangan bobot badan masing-masing tikus dilakukan pada setiap 2 hari dengan menggunakan timbangan standar. Pertambahan bobot badan harian (g/hari) adalah total bobot badan dikurangi dengan bobot badan awal kemudian dibagi dengan selang waktu pengukuran. Aktivitas dan Tingkah Laku Pengamatan aktivitas dan tingkah laku dilakukan terhadap semua tikus. Kategori aktivitas dibagi atas 4 kategori dengan memberi skor 1-4 yaitu sangat aktif = 4; aktif = 3; kurang aktif = 2 dan tidak aktif = 1. Diskripsi untuk masingmasing skor kategori adalah sebagai berikut: Sangat Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze secara terus-menerus melakukan aktivitas membaui dan berjalan, memanjat dinding T-maze dan mencapai titik finish kurang dari 5 menit. Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze secara terus-menerus melakukan aktivitas membaui dan berjalan, memanjat dinding T-maze namun tidak mencapai titik finish. Kurang Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze, aktivitas membaui dan berjalan dilakukan berkisar 0,5 menit, memanjat dinding Tmaze jarang dilakukan, selanjutnya diam dan tidak mencapai titik finish. Tidak Aktif : Setelah dimasukkan ke dalam T-maze, aktivitas membaui dan berjalan dilakukan berkisar 0,5 menit, memanjat dinding Tmaze tidak dilakukan, selanjutnya diam dan tidak mencapai titik finish. Pengamatan dilakukan dengan selang waktu 2 hari sekali dengan menggunakan metoda modifikasi Multiple T-maze (http://www.ratbehavior.org) (Gambar 9). Gambar 9 Model modifikasi multiple T-maze (http://www.ratbehavior.org) Data yang diamati adalah waktu yang dibutuhkan untuk melewati alat tersebut, persentase tikus yang mencapai titik finish serta data aktivitas dan tingkah laku lainnya yang mungkin muncul selama percobaan tersebut berlangsung. Analisis Darah Rutin Analisis darah rutin terdiri dari pemeriksaan differensial leukosit, kadar Hb, Packet Cell Volume (PCV), benda darah putih (BDP) dan benda darah merah (BDM). Pemeriksaan darah rutin ini dilakukan terhadap semua tikus dari masingmasing blok perlakuan yang dilakukan. Pemeriksaan darah rutin ini dilakukan setelah hewan coba dikorbankan. Pengolahan dan Analisis Data Setiap data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dan dianalisis secara statistik dengan kaidah yang telah ditetapkan guna menjawab pertanyaan dan tujuan yang telah ditetapkan. Pengolahan dan analisis data dilakukan secara bertahap yang diawali dengan pengumpulan dan entri data. Untuk melihat perbedaan antar kelompok perlakuan digunakan analisis varian (ANOVA). Untuk mengetahui perbedaan antar kelompok perlakuan dilanjutkan dengan uji beda Duncan. Penelitian 3. Analisis Morfologi Hipokampus Tujuan: Mendapatkan data tentang pengaruh pemberian ekstrak daun pegagan terhadap gambaran morfologi hipokampus tikus. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian terdiri dari jaringan otak yang telah difiksasi dengan paraformaldehid 4%, antibodi PGF, antibodi monoclonal anti human calbindin (Novocastra. Lab), antibodi anti-tumor necrosis factor/TNF (Boster (Boster Biological Technology Ltd), antibodi anti-C-reactive protein/CRP (Boster (Boster Biological Technology Ltd), antibodi poliklonal anti-dopamine (Abcam Inc), antibodi anti- glial fibrillary acidic protein (GFAP), antibodi anti-vimentin (VIM), antibodi anti-desmin (DES), antibodi serotonin, antibodi toludin, larutan untuk dehidrasi, larutan untuk clearing, parafin, mikrotom dan mikroskop. Penyiapan Preparat Pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) Pewarnaan HE dilakukan untuk mengamati struktur umum jaringan otak. Tahapan yang dilakukan dalam pewarnaan ini dimulai dengan deparafinisasi, yaitu penghilangan parafin dengan memasukkan preparat ke dalam larutan xylol III, II, I secara berseri. Tahap selanjutnya adalah rehidrasi, yaitu dengan memasukkan jaringan otak ke dalam larutan alkohol absolut sampai dengan alkohol 70% secara berseri. Selanjutnya jaringan otak direndam di dalam air keran, kemudian di dalam aquadest. Jaringan otak selanjutnya diwarnai dengan pewarna hematoxylin dan dilanjutkan dengan perendaman dalam aquadest. Selanjutnya jaringan otak diwarnai dengan menggunakan eosin alcohol, dan dilanjutkan dengan perendaman kembali dalam aquadest. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan alkohol bertingkat serta penjernihan (clearing) dengan menggunakan xylol. Selanjutnya jaringan otak ditutup dengan cover glass (mounting). Pewarnaan Immunohistokimia Pewarnaan immunohistokimia diawali dengan memasukkan preparat jaringan otak ke dalam inkubator 65 oC selama 5 menit dan selanjutnya didinginkan pada suhu kamar lebih kurang selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan deparafinisasi secara berseri dimulai dari xylol III sampai dengan xylol I masing-masing 3 menit. Berikutnya dilakukan rehidrasi secara berseri dimulai dari alkohol absolut III sampai dengan alkohol absolut I dan alcohol teknis 96% sampai dengan alcohol teknis 70%, dan kemudian preparat direndam di dalam dionize water masing-masing 10-15 menit. Langkah selanjutnya adalah menghilangkan peroksidase endogen pada preparat dengan cara mencelupkan preparat dalam 50 mL larutan metanol yang dicampur dengan 0,5 mL H 2 O 2 dalam keadaan gelap selama 15 menit. Penghilangan peroksidase harus dilakukan dengan segera, kalau terlambat hasilnya positif semua. Selanjutnya preparat dicuci dengan distilled water (DW) sebanyak 2 kali masing-masing 5-10 menit, dilanjutkan mencuci dengan phosphate buffer saline (PBS) sebanyak 2 kali masing-masing 5-10 menit. Preparat selanjutnya diinkubasi dengan normal serum (10% dalam PBS) selama 30-60 menit untuk memblok antigen non spesifik agar tidak mengacaukan reaksi. Setelah itu, preparat dicuci kembali dengan menggunakan PBS sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit. Langkah berikutnya preparat diinkubasi dengan antibodi primer yang telah ditetapkan pada suhu 4°C (disimpan di dalam refrigerator) selama 1-2 malam. Selanjutnya dikeluarkan dari refrigerator dan dibiarkan pada suhu kamar lebih kurang 1 jam, kemudian dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali masing-masing 10 menit. Langkah berikutnya preparat diinkubasi dalam antibodi sekunder dako envision peroxydase system (DEPS) (50-60 µl/preparat pada suhu 37 oC dalam keadaan gelap selama 30-60 menit. Selanjutnya dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit. Kemudian divisualisasi dengan diaminobenzidin (DAB) 10 mg dalam 50 mL tris buffer dan 50 µl H 2 O 2 . Selanjutnya dicuci dengan DW (stoping point). Jika dianggap perlu dapat juga dilakukan counterstain dengan hematoxylin. Langkah akhir pewarnaan ini adalah dehidrasi, clearing, dan mounting. Variabel yang Diukur Data yang diamati pada penelitian ini adalah sel-sel yang positif terhadap masing-masing antibodi yang digunakan dan juga kepadatan sel-sel astrosit. Pengolahan dan Analisis Data Setiap data yang diperoleh dalam penelitian ini diolah dan dianalisis secara diskriptif dengan kaidah yang telah ditetapkan guna menjawab pertanyaan dan tujuan yang telah ditetapkan. 55 HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian 1. Penyiapan Ekstrak Pegagan dan Analisis Kandungan Zat Gizi Hasil Analisis Kualitatif Komponen Kimia Pegagan Segar Fitokimia atau kimia tumbuhan telah berkembang menjadi disiplin ilmu tersendiri, berada diantara kimia organik bahan alam dan biokimia tumbuhan, serta berkaitan erat dengan keduanya. Bidang perhatian fitokimia adalah keanekaragaman senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh tumbuhan, yaitu mengenai struktur kimia, biosintesis, perubahan serta metabolismenya, penyebaran secara alamiah dan fungsi biologis. Analisis fitokimia atau uji fitokimia merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik seperti alkaloid, senyawa fenol (termasuk flavonoid), steroid, saponin, dan terpenoid. Uji ini sangat bermanfaat untuk memberikan informasi jenis senyawa kimia yang terdapat pada tumbuhan. Senyawa-senyawa ini merupakan metabolit sekunder yang mungkin dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat. Analisis ini merupakan tahapan awal dalam isolasi senyawa bahan alam sehingga menjadi panduan bersama-sama dengan uji aktivitas biologis senyawa tersebut. Salah satu tujuan pengelompokan senyawa-senyawa aktif ini adalah untuk mengetahui hubungan biosintesis dan famili tumbuhan. Informasi ini sangat berguna bagi ahli sintesis kimia organik untuk memprediksi senyawa aktif tersebut sehingga dapat lebih berkhasiat. Tanaman yang diuji fitokimianya dapat berupa tanaman segar, kering yang berupa rajangan, serbuk, ekstrak atau dalam bentuk sediaan (Harborner, 1996). Uji fitokimia yang dilakukan berdasarkan pada reaksi yang menghasilkan warna atau endapan. Selama bertahun-tahun uji warna sederhana dan reaksi tetes dikembangkan untuk menunjukkan adanya senyawa tertentu atau golongan tertentu karena sudah terbukti khas dan peka. Uji fitokimia masih sering digunakan dalam pencirian senyawa karena mudah dan tidak memerlukan peralatan yang rumit akan tetapi kadang kala tidak dapat memberikan hasil yang memuaskan (Harborner, 1996). Hasil analisis fitokimia secara kualitatif terhadap masing-masing bagian pegagan segar aksesi Boyolali disajikan pada Tabel 6. Dipilihnya aksesi Boyolali dalam penelitian ini karena aksesi ini merupakan salah satu dari nomor harapan yang mempunyai potensi hasil dan mutu yang baik dan telah direkomendasikan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik, Cimanggu Bogor. Bermawie et al. (2008) dan Nugroho (2009) melaporkan bahwa terdapat keragaman pada sifat morfologi kualitatif dan kuantitatif antar aksesi dan masing-masing aksesi mempunyai keunggulan yang berbeda. Data pada Tabel 6 menunjukkan bahwa secara kualitatif daun, tangkai daun dan campuran tanaman pegagan mengandung senyawa alkaloid yang sama kuatnya. Alkaloid merupakan golongan zat tumbuhan sekunder yang terbesar, pada umumnya mencakup senyawa yang bersifat basa dan mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan sebagai bagian dari sistem siklik. Banyak alkaloid bersifat terpenoid dan yang lainnya berupa senyawa aromatic yang mengandung gugus basa sebagai gugus rantai samping. Fungsi alkaloid dalam tumbuhan masih sangat kabur, meskipun masing-masing senyawa telah dinyatakan terlibat sebagai pengatur tumbuh, penghalau atau penarik serangga (Harborner, 1996). Senyawa alkaloid juga bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan parasit plasmodium falciparum (Lusiana 2009) dan anti mikroba (Kurniasari 1999) Flavonoid di bagian daun, tangkai daun dan campuran tanaman pegagan juga ditemukan dalam kualitas yang sama yaitu positif lemah. Berdasarkan strukturnya, semua flavonoid merupakan turunan senyawa induk flavon yang terdapat berupa tepung putih dan semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama. Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air dan dapat diekstrak dengan etanol 70%. Flavonoid berupa senyawa fenol, sehingga warnanya berubah bila ditambah basa atau ammonia. Flavonoid umumnya terdapat dalam tumbuhan yang berpembuluh, dan terikat pada gula sebagai glikosida serta aglikon flavonoid yang manapun yang mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida (Harborner, 1996). Fungsi flavonoid adalah sebagai antioksidan penangkap radikal bebas, dan kemampuan daya antioksidan dari setiap isolat adalah berbeda (Sunarni et al. 2007). Zainol et al. (2008) melaporkan bahwa bagian yang berbeda dari pegagan menghasilkan kandungan fitokimia yang berbeda pula. Keberadaan senyawa flavonoid dan senyawa fenolik lainnya di dalam pegagan sangat penting karena mempunyai efek multifungsi dengan donor hidrogen yang efektif (Zainol et al. 2003) dan juga sebagai antioksidan yang kuat (Hussin et al. 2007). Keberadaan flavonoid di dalam daun kemungkinan dipengaruhi oleh proses fotosintesis sehingga pada daun muda tidak banyak ditemukan senyawa tersebut. Keberadaan senyawa alkaloid dengan senyawa fenol dan terpenoid memberikan efek biologis yang baik dari tanaman ini (Rajkumar & Jebanesan 2005). Tabel 6 Kandungan fitokimia dari masing-masing bagian pegagan No Senyawa 1 Alkaloid 2 Saponin 3 Tanin 4 Fenolik 5 Flavonoid 6 Triterpenoid 7 Steroid 8 Glikosida Keterangan: + ++ +++ Daun ++ + + + Hasil pemeriksaan Tangkai Daun Campuran ++ ++ + + +++ +++ + + : Negatif : Positif lemah : Positif : Positif kuat Hasil analisis juga menunjukkan bahwa kandungan steroid di bagian daun lebih lemah (+) dibandingkan dengan bagian tangkai daun (+++) dan keseluruhan tanaman (+++). Steroid adalah molekul kompleks yang larut di dalam lemak dengan empat cincin yang saling bergabung. Steroid yang paling banyak dijumpai adalah sterol yang merupakan steroid alkohol (Lehninger 1982). Sterol adalah triterpena yang kerangka dasarnya adalah sistem cincin siklopentana perhidrofenantrena. Sterol yang terdapat pada tumbuhan tinggi terdapat dalam bentuk bebas dan sebagai glukosida sederhana (Harborne 1996). Kandungan steroid pada tanaman pegagan juga dipengaruhi oleh tingkat naungan. Pegagan yang ditanam di bawah naungan 55% lebih banyak mengandung steroid dibanding dengan naungan 65% (Musyarofah et al. 2007). Di samping tingkat naungan, ketersedian unsur hara juga berpengaruh terhadap kandungan steroid (Kristina et al. 2009). Hasil analisis terhadap kandungan glikosida di bagian daun, tangkai daun dan campuran tanaman pegagan menunjukkan kualitas yang sama yaitu positif lemah. Kandungan glikosida yang diperoleh dalam penelitian ini berbeda dengan laporan sebelumnya yang menyebutkan bahwa glikosida di dalam pegagan terdeteksi sangat kuat (++++) (Kristina et al. 2009; Nugroho 2009; Bermawie et al. 2008). Untuk senyawa saponin, tanin, fenolik dan triterpenoid tidak terdeteksi secara kualitatif. Samy et al. (2011), melaporkan bahwa tannin dan flavonoid tidak terdeteksi pada analisis fitokimia. Sementara Kristina et al. (2009) melaporkan bahwa senyawa tersebut terdeteksi pada analisis fitokimia. Tidak terdeteksinya senyawa tersebut dalam proses pengujian fitokimia dapat disebabkan karena jumlah material yang dianalisis tidak mencapai jumlah minimal yang dibutuhkan di dalam bahan yang dianalisis (Zainol et al. 2008), asal bahan yang berbeda, dan mungkin juga karena waktu pengambilan sampel yang berbeda. Kandungan Zat Gizi Pegagan Segar Hasil analisis kandungan zat gizi dari pegagan segar secara rinci disajikan pada Tabel 7. Tabel 7 Hasil analisis kandungan zat gizi pegagan segar No 1 2 3 4 5 6 7 Jenis Pemeriksaan Kadar air Kadar abu Kadar abu tak larut asam Kadar sari dalam air Kadar sari dalam alkohol Kadar serat Kadar Protein Daun 88,13 1,27 0,05 3,20 2,65 1,85 16,27 Hasil analisis (%) Tangkai Daun Daun + T. Daun 88,39 87,15 1,01 1,31 0,11 0,03 5,14 4,25 3,67 4,18 2,45 2,19 14,49 7,01 Kadar Air Kadar air merupakan salah satu karakteristik yang sangat penting pada bahan pegagan karena kandungan air dalam bahan pangan menentukan acceptability (penerimaan), kesegaran dan daya tahan bahan pangan (Winarno 1997). Kadar air yang tinggi mengakibatkan mudahnya bakteri, kapang dan khamir untuk berkembang biak, sehingga akan terjadi perubahan pada bahan Buckle et al. (2007). Menurut Pramono (2005) jika kadar air dalam bahan masih tinggi dapat mendorong enzim melakukan aktivitasnya mengubah kandungan kimia yang ada dalam bahan menjadi produk lain yang mungkin tidak lagi memiliki efek farmakologi seperti senyawa aslinya. Hasil analisis kadar air pada pegagan segar berkisar antara 87-88%, dan bagian daun serta tangkai daun mempunyai persentase sedikit lebih tinggi dibandingkan dengan keseluruhan bagian tanaman. Nurjanah (2008) melaporkan bahwa terdapat perbedaan kadar air pada tanaman pegagan dari aksesi yang berbeda. Kadar air tertinggi dijumpai pada aksesi Cilember (87,25%) dan terendah pada aksesi Smukren (75,18%), sedangkan aksesi Boyolali 81,45%. Data ini menunjukkan bahwa terdapat variasi pada nilai kadar air meskipun dari aksesi yang sama. Afrida (2009) melaporkan bahwa tanaman pegagan yang dipupuk dengan fosfor tidak memberi pengaruh terhadap kandungan kadar air. Kadar Abu Abu adalah zat anorganik sisa hasil pembakaran suatu bahan organik. Penentuan abu total digunakan untuk berbagai tujuan, yaitu selain sebagai parameter nilai gizi dalam bahan makanan juga untuk mengetahui baik tidaknya suatu proses pengolahan, serta untuk mengetahui jenis bahan yang digunakan. Penentuan kadar abu dilakukan dengan cara mengoksidasikan semua zat organik pada suhu yang tinggi, yaitu sekitar 600 oC sekitar 3-5 jam dan kemudian dilakukan penimbangan zat yang tertinggal setelah proses pembakaran tersebut dan berat abu yang tertinggal menunjukkan kadar abu (Indrayan et al. 2005). Hasil analisis kadar abu menunjukkan bahwa pada bagian daun dan keseluruhan tanaman mempunyai persentase yang lebih baik dibandingkan dengan pada bagian tangkai daun. Data ini sejalan dengan hasil analisis mineral, bahwa sebagian besar kandungan mineral banyak dijumpai dibagian daun dan keseluruhan tanaman. Hasil analisis kadar abu yang diperoleh pada penelitian ini lebih rendah dibandingkan dengan laporan Odhav et al. (2007). Kadar Protein Protein merupakan makromolekul yang terdiri dari polipeptida yang mempunyai rantai yang amat panjang, tersusun atas banyak unit asam amino. Masing-masing asam amino tersebut dihubungkan oleh suatu ikatan kovalen yang disebut ikatan peptida. Sebanyak dua puluh jenis asam amino berbeda terdapat secara alami dalam protein. Setiap protein dibedakan satu sama lain karena masing-masing mempunyai sekuen unit asam amino sendiri-sendir. Protein dibagi menjadi dua golongan utama yaitu protein globular dan protein serabut. Penggolongan ini berdasarkan bentuk dan sifat-sifat fisik tertentu. Protein globular rantai atau rantai-rantai polipeptida berlipat rapat-rapat menjadi bentuk globular atau bulat yang padat. Protein globular biasanya larut di dalam air dan hampir semua mempunyai fungsi gerak atau dinamik. Protein serabut bersifat tidak larut di dalam air, merupakan molekul serabut panjang, dengan rantai polipeptida yang memanjang pada satu sumbu dan tidak berlipat menjadi bentuk globular. Hampir semua protein serabut memberikan peranan strukturan atau pelindung (Lehninger 1982). Salah satu cara yang paling banyak digunakan untuk menentukan kandungan protein suatu sediaan tumbuhan adalah berdasarkan reaksi warna antara pereaksi Folin-Ciocalteu dan ikatan polipeptida. Kandungan protein dapat juga ditentukan berdasarkan serapan UV pada panjang gelombang tertentu. Jumlah protein juga dapat dianalisis dengan cara mikro-Kjeldahl, berdasarkan penguraian dengan H 2 SO 4 yang mengandung K 2 SO 4 -CuSO 4 , kemudian titrasi ammonia yang dibebaskan (Harborne 1996). Hasil analisis kandungan protein pada pegagan segar berkisar antara 716%, dan bagian daun serta keseluruhan bagian tanaman mempunyai persentase yang lebih tinggi dibandingkan dengan bagian tangkai daun. Kandungan protein yang diperoleh pada penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan laporan Odhav et al. (2007) dan Kormin (2005). Lailani (2008) melaporkan bahwa kandungan protein total pada tanaman pegagan in vitro lebih tinggi dibanding dengan pegagan lapang. Diduga bahwa perbedaan kandungan protein tersebut karena perbedaan unsur hara pada media atau tanah. Kadar Sari dalam Air dan Sari dalam Alkohol Analisis kadar sari dalam air menunjukkan bahwa persentase tertinggi dijumpai di dalam bagian tangkai daun. Data ini menunjukkan bahwa bagian tangkai daun mempunyai kelarutan yang lebih baik di dalam air dibandingkan dengan dua bagian lainnya. Untuk analisis kadar sari dalam alkohol menunjukkan bahwa persentase tertinggi dijumpai pada keseluruhan bagian tanaman. Data secara keseluruhan menunjukkan bahwa kadar sari dalam air lebih baik dibandingkan dengan kadar sari dalam alkohol. Analisis Mineral Komposisi kandungan zat gizi mempunyai peran penting untuk meningkatkan kesehatan. Data hasil analisis kandungan mineral dan asiatikosida pegagan disajikan pada Tabel 8. Zainol et al. (2008) melaporkan bahwa bagian yang berbeda dari pegagan menghasilkan kandungan fitokimia yang berbeda pula. Laporan tersebut sejalan dengan hasil yang diperoleh dari penelitian ini, dimana di bagian daun kandungan asiatikosida lebih banyak dibandingkan dengan bagian tangkai daun. Hampir semua unsur kimia lebih banyak dijumpai di bagian daun kecuali kandungan K yang lebih banyak dijumpai di bagian tangkai daun. Rasyid et al. (2011) melaporkan bahwa kandungan K pada pegagan segar adalah sebesar 2,19%. Kandungan K tersebut lebih rendah dibandingkan dengan hasil yang diperoleh pada penelitian ini. Perbedaan nilai ini mungkin saja disebabkan karena metoda analisis yang digunakan berbeda atau karena aksesi pegagan yang berbeda. Kandungan asiatikosida di bagian daun juga lebih banyak dibandingkan dengan tangkai daun. Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini sejalan dengan laporan Aziz et al. (2007) yang melaporkan bahwa distribusi asiatikosida lebih banyak dijumpai di bagian daun, dibandingkan akar dan tangkai daun meskipun kandungan asiatikosida juga dipengaruhi oleh jenis pegagan, dan keadaan ini dijumpai pada semua aksesi pegagan (Zainol et al. 2008), demikian juga pada tanaman pegagan hasil kultur jaringan (Kim et al. 2004). Tabel 8 No Data hasil analisis kandungan mineral dan asiatikosida di dalam bagian yang berbeda dari pegagan segar Unsur kimia 1 P 2 K 3 Na 4 Mg 5 Ca 6 Cu 7 Zn 8 Fe 9 Mn 10 Asiatikosida Keterangan: ttd: Tidak terdeteksi Daun 0,0249 2,36 ttd 1,58 2,06 0,0062 0,0091 0,0801 0,0046 2,48 Hasil pemeriksaan (%) Daun+T. Daun Tangkai Daun 0,0139 0,0334 2,72 2,69 ttd ttd 1,49 0,83 2,14 1,00 0,0087 0,0137 0,0055 0,0051 0,0505 0,0660 0,0008 0,0009 2,46 2,39 Kandungan asiatikosida sangat ditentukan oleh asal dan jenis (aksesi) pegagan. Bermawie et al. (2008) melaporkan bahwa kandungan asiatikosida dari 16 aksesi yang dianalisis berkisar antara 0,15-1,49%, kandungan asiatikosida yang tertinggi diperoleh dari pegagan asal Ungaran Jawa Tengah (1,49%) dan Sumedang Jawa Barat (1,37%), sedangkan aksesi Gunung Putri hanya mengandung 0,23%. Kandungan asiatikosida dari pegagan aksesi Gunung Putri yang diperoleh dalam penelitian ini lebih tinggi dari pada yang dilaporkan oleh Bermawie et al. (2008). Bermawie et al. (2008) melaporkan bahwa kandungan asiatikosida pada pegagan aksesi Manoko yang ditanam di Cicurug Sukabumi adalah sebesar 0,15%, sedangkan hasil penelitian Riyadi et al. (2011) melaporkan bahwa kandungan asiatikosida dari pegagan aksesi Manoko yang ditanam di Manoko adalah sebesar 0,66%. Data ini menunjukkan bahwa kandungan asiatikosida juga sangat dipengaruhi oleh tempat penanamannya terutama ketinggian tempat penanamannya. Cicurug dan Manoko adalah dua lokasi yang sangat berbeda ketinggian tempatnya, dimana Cicurug berada pada ketinggian 550 m dpl, sedangkan Manoko berada pada ketinggian 1200 m dpl. Data ini juga mengindikasikan bahwa kandungan asiatikosida di dalam pegagan kemungkinan akan diperoleh secara maksimal jika ditanam di tempat asalnya. Data di atas menunjukkan bahwa kandungan asiatikosida sangat dipengaruhi oleh faktor genetik dan lingkungan. Tabel 9 Hasil analisis proksimat dan komposisi kimia per 100 g bahan segar Kandungan zat gizi Hasil analisis Referensi Kadar air (g) 87,15 ND Kadar abu (g) 1,31 2,06 a; 2,54f Kadar abu tak larut asam (g) 0,03 ND Kadar sari dalam air (g) 4,25 ND Kadar sari dalam alkohol (g) 4,18 ND Kadar serat (g) 2,19 18,33d; 1,92f Protein (g) 14,49 2,4a; 4,58c; 9,94d; 3f 174 a; 1.994,28c; 1.060d; 2.425f Ca (mg) 2.140 17 a; 370d; 327f P (mg) 13,9 345 a K (mg) 2.720 107,8 a Na (mg) ttd Mg (mg) 87 a; 271f 1.490 Fe (mg) 14,86 a; 43,26 c; 32d; 18f 50,5 Zn (mg) 0,97 a; 3,93b; 20f 5,5 Cu (mg) 0,24 a; 0,55 b; 7f 8,7 Cr (mg) 0,046 a NA Mn (mg) 23f 4,6 Asiatikosida ( %) 2,46 1,04e; 0,66c Keterangan: ttd: Tidak terdeteksi NA: Tidak dianalisis ND: Tidak ada data a. Gupta et al, 2005 b. Atukorala & Waidyanatha, 1987 c. Riyadi et al, 2011 d. KIRDI 2009- Laboratory analysis report on Centella asiatica Dalam Kiuru et al. 2010 e. Bermawie et al, 2008 f. Odhav et al, 2007 Kandungan triterpenoid dan steroid juga sangat dipengaruhi oleh tingkat naungan. Meskipun tingkat naungan 75% dapat menghasilkan panjang tangkai daun yang cukup maksimal, namun secara kualitatif, kandungan triterpenoid dan steroid pada jenis pegagan tertentu sangat kuat terdeteksi pada tingkat naungan 25% sedangkan pada jenis pegagan lainnya tingkat naungan tidak mempunyai pengaruh yang negatif (Kurniawati et al. 2005). Hampir semua mineral yang dianalisis paling banyak dijumpai di dalam bagian daun dan keseluruhan tanaman, sedangkan pada bagian tangkai daun semua unsur kimia yang dianalisis juga dijumpai namun jumlahnya lebih sedikit dibandingkan dengan dua bagian tanaman lainnya kecuali terhadap unsur K, Cu dan Fe. Jumlah mineral yang paling banyak dijumpai di dalam bahan segar (daun, tangkai dan keseluruhan tanaman) adalah unsur K dan Ca. Kadar protein juga paling banyak dijumpai di dalam daun dan keseluruhan bagian tanaman, sedangkan kadar asiatikosida relatif sama di semua bagian daun. Perbandingan kandungan antara komposisi kimia hasil analisis seluruh bagian tanaman pegagan segar dengan referensi disajikan pada Tabel 9. Data pada Tabel 9 menunjukkan bahwa terdapat variasi yang cukup tinggi antara hasil analisis dengan data referensi. Perbedaan nilai ini dapat saja terjadi karena perbedaan cara analisis, penanganan pascapanen, asal dan jenis (aksesi) bahan yang digunakan. Kandungan Komposisi Kimia Ekstrak Pegagan Ekstrak merupakan kumpulan senyawa-senyawa dari berbagai golongan yang terlarut di dalam pelarut yang sesuai, termasuk didalamnya senyawasenyawa aktif atau yang tidak aktif (Sidik & Mudahar 2000). Ekstraksi bahan tumbuhan obat dengan pelarut yang sesuai (air, alkohol dan pelarut organik lain) menjadi ekstrak cair atau ekstrak kering banyak dilakukan untuk tujuan standarisasi sediaan obat herba sekaligus memberi keuntungan dari segi formulasi sediaannya (Sinambela 2003). Pemilihan pelarut sangat penting dalam proses ekstraksi sehingga bahan berkhasiat yang akan ditarik dapat tersari secara sempurna. Departemen Kesehatan merekomendasikan air, dan alkohol untuk cairan penyari ekstrak untuk keperluan bahan baku obat tradisional (Farouq 2003). Hasil Analisis Proksimat Ekstrak Kering Hasil analisis proksimat dari ekstrak etanol dan ekstrak air daun pegagan disajikan pada Tabel 10. Tabel 10 Hasil analisis proksimat dari ekstrak kering daun pegagan No 1 2 3 4 5 Jenis pemeriksaan Kadar air Kadar abu Kadar lemak Kadar karbohidrat Protein Hasil pemeriksaan (%) Ekstrak etanol Ekstrak air b/b b/k b/b b/k 2,16 6,44 3,26 3,33 3,21 3,43 2,14 2,19 2,13 2,28 89,82 91,80 85,54 91,43 2,61 2,67 2,68 2,86 Perbandingan hasil analisis proksimat antara basis basah dan basis kering terhadap kadar air, kadar abu, kadar lemak dan protein dari masing-masing ekstrak cenderung tidak terlalu berbeda kecuali terhadap kadar karbohidrat pada ekstrak air. Kadar karbohidrat menunjukkan nilai yang paling tinggi dibandingkan dengan parameter proksimat lainnya, dengan demikian kadar dalam basis kering juga menjadi lebih tinggi dibandingkan dengan nilai pada basis basah. Kadar karbohidrat di dalam ekstrak etanol pada basis basah cenderung lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak air, namun pada basis kering kadarnya cenderung sama karena kadar air dalam ekstrak air cenderung lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol sehingga pengaliannya juga menjadi lebih tinggi. Mineral Berdasarkan hasil analisis dapat diketahui bahwa di dalam bahan ekstrak banyak ditemukan mineral makro dan mikro kecuali unsur Fe dan Cu. Odhav et al. (2007), Gupta et al. (2005) dan Atukorala & Waidyanatha (1987) juga melaporkan bahwa di dalam pegagan banyak dijumpai mineral makro dan mikro seperti Ca, P, K, Na, Mg, Fe, Zn, Cu dan Mn. Manfaat klinis dari pegagan ini mungkin saja bukan hanya karena senyawa asiatikosida tapi juga mungkin karena unsur makro dan mikro mineral tersebut. Linder (2006) melaporkan bahwa makro dan mikromineral memegang peranan penting dalam berbagai reaksi dan sistim metabolisme tubuh. Kadar mineral yang terdapat di dalam bahan ekstrak dipengaruhi oleh jenis pelarut yang digunakan. Semua mineral lebih banyak ditemukan di dalam ekstrak air dibandingkan di dalam ekstrak etanol (Tabel 11), sedangkan kandungan asiatikosida (di dalam daun) cenderung lebih banyak ditemukan di dalam ekstrak etanol (16,03% vs 15,77%) (Tabel 12). Berdasarkan hasil analisis dapat diketahui bahwa di dalam ekstrak air dan etanol tidak ditemukan unsur Fe dan Cu (Tabel 11) sedangkan hasil dari analisis bahan segar, unsur tersebut ada ditemukan (Tabel 8). Artinya, proses ekstraksi kemungkinan dapat menyebabkan hilangnya sebagian dari mineral penting di dalam bahan baku. Unsur Ca dan P di dalam ekstrak ditemukan dalam perbandingan yang ideal, dimana kadar Ca lebih tinggi dibandingkan dengan P kecuali pada ekstrak air kering pada bagian tangkai daun dijumpai dalam imbangan yang tidak ideal (0,19% vs 0,11%). Tabel 11 Kandungan mineral dari ekstrak kering daun pegagan Jenis mineral Fe P K Na Ca Mg Cu Mn Zn Ekstrak air (%) b/b b/k 0 0 0,25 0,27 5,83 6,23 0,0370 0,0396 11,11 11,87 2,07 2,21 0 0 0,0030 0,0032 0,0042 0,0045 Ekstrak etanol (%) b/b b/k 0 0 0,11 0,11 5,09 5,20 0,0294 0,0301 0,78 0,80 1,23 1,26 0 0 0,0012 0,0012 0,0010 0,0010 Kandungan Asiatikosida Kandungan asiatikosida disajikan pada Tabel 12. Kadar asiatikosida dari masing-masing bagian tanaman berkisar antara 15,59-16,44%. Asiatikosida adalah senyawa yang paling aktif dari 3 triterpen lainnya (Maquart et al. 1999) dan merupakan unsur utama dari tanaman pegagan (Zhang et al. 2009). Di dalam pegagan banyak ditemukan senyawa triterpenoid, dan senyawa utama yang mempunyai aktivitas antioksidan yang kuat adalah senyawa asiatikosida (Zainol et al. 2008). Dilaporkan bahwa pemberian pegagan dapat meningkatkan kemampuan memori dan pembelajaran pada tikus muda. Hal ini mungkin saja berhubungan dengan aktivitas antioksidan, anti inflamasi, neuroprotektif, prokolinergik dan anti-kolinergik dari berbagai komponen yang terdapat di dalam tanaman pegagan (Joshi & Parle 2006). Hasil analisis menunjukkan bahwa kandungan asiatikosida di masingmasing bagian tanaman berbeda, dan tertinggi dijumpai di bagian daun. Hasil analisis ini sejalan dengan yang dilaporkan oleh Kim et al. (2004) dan Aziz et al. (2007) bahwa bahwa produksi asiatikosida terutama terjadi di bagian daun. Kandungan asiatikosida dari bagian tanaman yang berbeda disajikan pada Tabel 12. Tabel 12 Kadar asiatikosida dari bahan ekstrak yang berbeda Jenis Bahan Ekstrak etanol kering (daun) Ekstrak air kering (daun) Ekstrak air kental (tangkai) Keterangan: ND (Tidak dianalisis) Kadar asitikosida (%) b/b b/k 16,03 16,38 15,77 16,66 15,59 ND Penelitian 2. Pengujian Ekstrak Pegagan pada Hewan Model Pertambahan Bobot Badan dan Asupan Pakan Selama periode percobaan semua tikus yang diberi ekstrak etanol dan ekstrak air pegagan tidak menunjukkan tanda-tanda sakit dan juga tidak menunjukkan penurunan bobot badan (Gambar 10 dan 11). Respon pertambahan bobot badan harian antar perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Hasil penelitian ini sama dengan Anand et al. (2012) dan Meutia & Ibrahim (2008) tapi tidak sejalan dengan Rao et al. (2006) dan Babu et al. (1995) yang melaporkan bahwa tikus yang diberi pegagan meningkat bobot badannya dibandingkan dengan kontrol. Gambar 10 Kurva pertambahan bobot badan dari masing-masing kelompok yang diberi ekstrak etanol Hasil pertambahan bobot badan yang didapat menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun pegagan tidak mengubah pola pertumbuhan yang terdapat pada kontrol. Kondisi demikian mungkin dapat diartikan bahwa ekstrak etanol pegagan aman terhadap pola pertumbuhan karena tidak berpotensi menurunkan atau menaikkan bobot badan. Pola yang sama juga ditemukan pada pemberian ekstrak air pegagan yang pola pertumbuhannya juga sama, hal ini menegaskan bahwa pemberian ekstrak pegagan tidak merubah pola dasar pertumbuhan hewan coba. Gambar 11 Kurva pertambahan bobot badan dari masing-masing kelompok yang diberi ekstrak air Total asupan pakan antar kelompok perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Hal yang sejalan juga dilaporkan oleh Meutia & Ibrahim (2008). Semua kelompok menunjukkan penurunan asupan mingguan. Tabel 13 Respon pertambahan bobot badan (g) dan asupan mingguan (g) pada perlakuan dengan ekstrak etanol Level (mg ekstrak/kg BB) 0 100 300 (Kontrol) Level 1 Level 2 270 + 25a Bobot Badan Awal (g) 266 + 13a 287 + 42a Bobot Badan Akhir (g) 362 + 32a 369 + 18a 391 + 67a a a Pertambahan BB Harian (g/hr) 1,42 + 0,19 1,59 + 0,34 1,61 + 0,39a a a Asupan Minggu 1 (g) 27,71 + 1,06 21,64 + 2,54 21,96 + 2,07a Asupan Minggu 2 (g) 22,46 + 2,05a 19,36 + 2,01a 21,82 + 2,86a Asupan Minggu 3 (g) 18,43 + 1,77a 17,61 + 2,05a 21,25 + 1,10a Asupan Minggu 4 (g) 18,79 + 3,29a 16,05 + 2,97a 19,50 + 3,26a Asupan Minggu 5 (g) 19,76 + 1,10a 19,57 + 0,90a 21,10 + 1,44a Asupan Minggu 6 (g) 23,76 + 4,78a 25,62 + 3,86a 25,05 + 5,87a Asupan Minggu 7 (g) 22,71 + 7,44a 22,10 + 6,58a 22,29 + 4,97a Asupan Minggu 8 (g) 24,29 + 5,30a 24,57 + 5,44a 24,57 + 6,41a Asupan Minggu 9 (g) 22,56 + 0,51a 22,67 + 1,73a 22,89 + 3,83a Total asupan (g) 145,90+4,64a 137,06+4,59a 145,71+4,05a Keterangan: Huruf superskrip yang sama pada baris yang sama menyatakan tidak (p>0,05). Parameter 600 Level 3 268 + 26a 368 + 42a 1,54 + 0,25a 19,61 + 2,68a 19,00 + 2,20a 19,07 + 1,79a 19,64 + 2,44a 20,38 + 1,15a 24,52 + 5,40a 21,95 + 6,83a 24,24 + 5,65a 20,67 + 1,67a 137,88+4,23a berbeda nyata Pada kelompok kontrol, penurunan asupan mingguan terjadi sampai akhir pengamatan, kelompok level 1 dan 2 sampai minggu kelima sedangkan pada kelompok level 3 sampai minggu ketiga. Untuk kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol (Tabel 13), pada minggu pertama, asupan tertinggi dijumpai pada kelompok kontrol yaitu mencapai 10% dari bobot badan, sedangkan pada kelompok level 1 dan 2 sebesar 8%, dan pada kelompok level 3 sebesar 7% dari bobot badan. Pada minggu ketiga, semua kelompok hanya mengkonsumsi pakan sekitar 6% dari bobot badan. Asupan pakan mingguan dan total asupan antar kelompok perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05). Kaitan antara total asupan pakan dengan aktivitas tidak menunjukkan hubungan yang linier karena tikus perlakuan level 1 dan 3 mengkonsumsi jumlah pakan yang lebih sedikit dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol dan cenderung sama dengan tikus perlakuan level 2, sedangkan data aktivitas menunjukkan bahwa tikus pada perlakuan level 1, 2 dan 3 lebih aktif dibandingkan dengan tikus kelompok kontrol. Data ini mengindikasikan bahwa peningkatan aktivitas tikus pada penelitian ini tidak mengakibatkan peningkatan asupan pakan. Pada umumnya, peningkatan aktivitas akan mengakibatkan peningkatan penggunaan energi. Pada penelitian ini, diduga bahwa pemberian ekstrak etanol daun pegagan dapat menyebabkan efisiensi penggunaan energi. Tabel 14 Respon pertambahan bobot badan dan asupan pakan mingguan pada perlakuan dengan ekstrak air Level (mg ekstrak/kg BB) 0 100 300 600 (Kontrol) Level 1 Level 2 Level 3 Bobot Badan Awal (g) 163+22a 162+7a 157+14a 165+17a a a a Bobot Badan Akhir (g) 292+41 315+5 299+15 296+35a a a a Pertambahan BB Harian (g) 2,07+0,38 2,46+0,08 2,29+0,28 2,13+0,41a Asupan Minggu 1 (g) 18,46+0,93a 18,11+0,96a 17,49+0,99a 19,14+1,06a a a a Asupan Minggu 2 (g) 20,69+0,88 20,29+0,76 19,46+0,94 21,97+1,10a a a a Asupan Minggu 3 (g) 22,74+0,70 22,46+0,75 21,74+0,66 23,63+0,78a Asupan Minggu 4 (g) 24,57+0,57a 24,77+0,80a 23,83+0,63a 25,51+0,58a a a a Asupan Minggu 5 (g) 25,19+0,45 26,44+0,32 25,03+0,39 26,04+0,57a a a a Asupan Minggu 6 (g) 25,82+0,59 27,64+0,43 26,04+0,39 26,43+0,40a Asupan Minggu 7 (g) 27,11+0,35a 28,86+0,35a 27,18+0,28a 27,57+0,40a a a a Asupan Minggu 8 (g) 27,86+0,13 29,86+0,13 28,43+0,35 28,25+0,25a a a a Asupan Minggu 9 (g) 28,50+0,31 30,60+0,34 29,20+0,11 28,95+0,11a a a a Total asupan (g) 297,90+3,21 308,40+4,16 294,06+3,82 306,92+3,06a Keterangan: Huruf superskrip yang sama pada baris yang sama menyatakan tidak berbeda nyata (p>0,05). Parameter Pada kelompok yang diberi ekstrak air (Tabel 14), asupan pakan dari minggu pertama sampai dengan minggu ke sembilan juga tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (p>0,05) antar kelompok perlakuan. Jumlah asupan pakan dari masing-masing kelompok perlakuan yang diberi ekstrak air meningkat dari minggu ke minggu. Hal ini disebabkan karena meningkatnya bobot badan sehingga jumlah asupan pakannya juga meningkat. Gambaran Darah Lengkap Semua tikus yang diberi ekstrak pegagan dalam jumlah yang tinggi (600 mg/kg bobot badan per hari) selama periode percobaan tidak menunjukkan tandatanda toksik. Keadaan ini didukung oleh hasil analisis darah lengkap yang menunjukkan bahwa gambaran darah dari tikus tersebut berada dalam batasan normal dan bahkan menunjukkan kecenderungan yang lebih baik dibandingkan dengan kontrol. Data gambaran darah lengkap (Tabel 15 dan 16) tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak etanol dan ekstrak air daun pegagan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05), kecuali terhadap jumlah benda darah merah (BDM) dan eosinofil (Tabel 17). Tabel 15 Rata-rata gambaran darah lengkap tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak etanol Kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) BDM (Juta/mm3) 7,02+2,1a 7,58+0,5ab 8,22+0,3c 7,90+4,4bc PCV (%) 37,33+11,8a 47,83+0,6a 44,67+0,8a 43,67+25,2a Hb (g%) 14,77+1,8a 15,28+0,9a 17,04+1,7a 15,32+7,81 a BDP (Ribu/mm3) 7,18+4,9a 8,72+2,0a 10,33+1,3a 8,40+4,7a Keterangan: Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (p<0,05), BDM (Benda Darah Merah), PCV (Packet Cell Volume), Hb (hemoglobin), BDP (Benda Darah Putih) Secara statistik, jumlah BDM pada tikus level 2 dan 3 berbeda nyata (p<0,05) dengan kelompok kontrol, level 2 tidak berbeda nyata dengan level 3 (p>0,05) namun berbeda nyata dengan level 1 (p<0,05), sedangkan PCV, Hb dan BDP tidak berbeda nyata (p>0,05) antar kelompok perlakuan. Data benda darah putih yang diperoleh pada penelitian ini berbeda dengan yang dilaporkan Jayathirtha dan Mishra (2004), bahwa tikus yang diberi ekstrak metanol dapat meningkatkan jumlah sel darah putih. Tikus pada kelompok yang diberi ekstrak etanol, meskipun nilai PCV, Hb dan total benda darah putih tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (p>0,05) dengan kontrol, namun nilai gambaran darah tersebut cenderung lebih baik dibandingkan dengan nilai pada kelompok kontrol. Terdapat variasi antara hasil yang diperoleh pada penelitian ini dengan laporan sebelumnya. Sihombing & Tuminah (2011) melaporkan bahwa tikus Wistar jantan yang berumur 3 bulan dengan rata-rata bobot badan 156 g mempunyai nilai BDM 8,46 juta/mm3, PCV 45,12%, Hb 14,94 g/dL dan BDP 5,74 ribu/mm3. Data gambaran darah tersebut menunjukkan bahwa kelompok level 2 (300 mg/kg bobot badan) yang diberi ekstrak etanol cenderung lebih baik dibandingkan dengan kelompok lainnya. Hal ini ditandai dengan nilai BDM, Hb dan BDP yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok lainnya, sedangkan nilai PCV lebih baik pada kelompok level 1. Tingginya nilai BDM pada kelompok perlakuan berkonsekuensi pada peningkatan nilai PCV dan Hb menuju nilai normal atas, terutama pada level 300 mg/kg bb. Smith & Mangkoewidjojo dalam Anwar 1988 melaporkan bahwa nilai BDM, Hb dan BDP tikus putih adalah berturut-turut 7,2-9,6 juta/mm3, 15-16 g/100 mL, dan 5-13 ribu/mm3. Rendahnya nilai BDM pada level 600 mg/kg bb sangat mungkin mengindikasikan ketepatan level 300 mg/kg bb dalam pemakaian 8 minggu. Hubungan antara nilai Hb dan fungsi kognitif telah dilaporkan oleh Jacobsen et al. (2004), bahwa terdapat perubahan yang negatif pada kinerja kognitif pasien kanker yang mengalami penurunan nilai Hb. Jumlah BDP tikus yang diberi perlakuan level 2 adalah tertinggi diantara kelompok yang ada. Keadaan demikian mengindikasikan dengan kuat bahwa ekstrak pegagan yang diberi menginduksi pengeluaran sel darah ke sirkulasi. Peningkatan nilai BDP pada tikus yang diberi ekstrak etanol menandakan bahwa pegagan juga bermanfaat sebagai imunostimulan. Peran pegagan sebagai imunostimulan juga pernah dilaporkan oleh Wang et al. (2005) dan Punturee et al. (2005). Imunostimulan adalah suatu istilah yang menunjukkan adanya suatu perubahan yang memperkuat penekanan dari indikator faktor kekebalan seluler dan humoral serta faktor pertahanan nonspesifik (Sagrawat & Yaseen 2007). Tikus yang diberi ekstrak air nilai BDP lebih rendah dibandingkan dengan kontrol. Data ini mengindikasikan bahwa ekstrak air kemungkinan kurang bermanfaat sebagai imunostimulan. Hal ini berbeda dengan laporan Punturee et al. (2005) yang melaporkan bahwa ekstrak air pegagan dengan level 100 mg/kg BB menunjukkan respon yang tinggi terhadap antibodi primer dan sekunder dibandingkan dengan kelompok kontrol. Ekstrak etanol pegagan menunjukkan aktivitas imunosupresif yang ditandai dengan pengurangan proliferasi mitogenstimulated human PBMCs dan produksi IL-2 serta TNF-α. Tabel 16 Rata-rata gambaran darah lengkap tikus setelah 2 bulan pemberian ekstrak air kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) BDM (Juta/mm3) 7,38+0,3a 7,05+0,8a 7,92+1,7a 7,94+0,7a PCV (%) 42,06+4,5a 39,81+5,7a 39,56+9,8a 43,56+3,1a Hb (g%) 14,81+1,3a 13,76+1,9a 13,99+3,4a 15,14+1,3a BDP (Ribu/mm3) 12,09+1,5a 6,71+4,3a 8,31+4,9a 9,20+2,7a Keterangan: Huruf superskrip yang sama pada kolom yang sama menyatakan tidak berbeda nyata (p>0,05). BDM (Benda Darah Merah), PCV (Packet Cell Volume), Hb (hemoglobin), BDP (Benda Darah Putih) Tabel 17 Rata-rata gambaran differensial benda darah putih pada tikus yang diberi ekstrak etanol kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) L 73+18,0a 78+9,0a 70+0,6a 86+52,6a Differensial BDP (%) N M a 25+17,8 2+1,0a 19+8,6a 2+1,0a 26+2,7a 4+2,0a 12+3,9a 2+1,2a E 1+1,2ab 1+1,0b 0a 1+0,5ab Keterangan: Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (p<0,05), L (limfosit), N (netrofil), M (monosit) dan E (eosinofil) Perbedaan ini mungkin saja disebabkan oleh perbedaan kandungan senyawa kimia yang berperan pada sistem imun. Wang et al. (2005) melaporkan bahwa pektin yang merupakan kompleks polisakarida heterogen yang terdapat di dalam tanaman pegagan berperan sebagai imunostimulan. Punturee et al. (2005) tidak melaporkan kandungan karbohidrat dari masing-masing ekstrak yang digunakan. Pada penelitian ini, kandungan karbohidrat di dalam ekstrak etanol cenderung lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak air (89,82% vs 85,54%), sehingga perbedaan pada sistem imun seluler ini sangat dimungkinkan karena perbedaan pada kandungan karbohidrat, dengan asumsi jika kandungan pektin ekivalen dengan kandungan karbohidrat dari masing-masing ekstrak tersebut. Perbedaan pada respon imun seluler ini berkontribusi pada nilai differensial leukosit. Pada tikus yang diberi ekstrak etanol (kecuali pada level 2) nilai limfosit cenderung lebih tinggi, sedangkan nilai netrofil lebih rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol. Sebaliknya pada tikus yang diberi ekstrak air nilai limfosit lebih rendah, sedangkan nilai netrofil lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol. Lebih tingginya nilai netrofil pada tikus yang diberi ekstrak air sangat mungkin terkait dengan keberadaan mikroba yang mudah tumbuh dalam ekstrak air. Secara umum dapat ditegaskan bahwa ekstrak etanol lebih baik dari pada ekstrak air dalam meningkatkan profil hematologi. Volume darah merah dan nilai hematokrit juga dipengaruhi oleh jenis kelamin dan bobot badan. Tikus Wistar dengan bobot badan 114,22 g, memiliki volume darah merah sebanyak 2,12 mL/100 g dan hematokrit 40%, sedangkan tikus dengan bobot badan 270,19 memiliki volume darah merah sebanyak 2,27 mL/100 g dan hematokrit 43,94% (Lee & Blaufox, 1985). Tabel 18 Rata-rata gambaran differensial benda darah putih pada tikus yang diberi ekstrak air kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) L 82+4,4a 74+6,1a 76+3,9a 78+4,3a Differensial BDP (%) N M a 14+3,3 4+2,7a 20+5,3a 4+1,0a 20+2,5a 3+1,6a 15+4,2a 6+2,2a E 1+1,5a 1+1,0a 1+0,6a 1+1,2a Keterangan: L (limfosit), N (netrofil), M (monosit) dan E (eosinofil) Pola Aktivitas Tikus Pengamatan aktivitas tikus dilakukan setiap 2 hari sekali terhadap semua tikus dari setiap kelompok dengan menggunakan lorong T-maze, dan aktivitas tersebut direkap dalam aktivitas mingguan. Terdapat 3 jenis tingkah laku yang dominan dijumpai pada tikus yang diuji yaitu berjalan, memanjat dan membaui. Aktivitas perawatan tubuh juga dijumpai selama di dalam kotak Maze, namun aktivitas ini tidak umum dijumpai. Aktivitas perawatan tubuh hanya sesekali dijumpai pada tikus-tikus yang termasuk dalam kategori aktif. Aktivitas perawatan tubuh dilakukan dengan menggunakan kedua kaki depan dengan cara menjilati kedua kaki depan tersebut, lalu mulai mengusap-usap bagian muka dan dilanjutkan pada bagian tubuh lainnya. Tikus yang aktif menunjukkan aktivitas berjalan, membaui dan memanjat dinding maze yang sangat tinggi. Aktivitas memanjat dinding maze yang sangat tinggi dijumpai pada saat tikus baru dilepaskan dari kotak start, setelah melewati kotak maze bagian start, aktivitas memanjat berkurang. Aktivitas membaui dari tikus yang aktif sangat tinggi, dan aktivitas membaui ini dilakukan terus menerus selama tikus berada di dalam kotak maze. Aktivitas membaui ini dilakukan ke segala arah, dan lebih sering dilakukan ke lantai kotak maze, diduga bahwa aktivitas membaui ini dilakukan untuk mengenal lorong-lorong yang akan dilaluinya. Motivasi tikus untuk melewati setiap lorong belum diketahui secara pasti. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pakan yang disediakan di titik finish bukan faktor utama yang menyebabkan tikus bergerak untuk melewati lorong, karena setiap tikus yang telah mencapai titik finish tidak pernah mengambil pakan yang telah disediakan. Diduga bahwa motivasi tikus untuk bergerak melewati setiap lorong adalah karena tikus berusaha untuk keluar dari lorong yang ada di depannya yang belum dilaluinya, dan apabila lorong yang di depannya telah buntu, maka tikus akan bergerak dengan sangat cepat kembali ke kotak start dan tidak kembali lagi ke titik finish. Tikus yang aktif akan terus bergerak di dalam kotak maze selama di depannya belum ditemukan lorong yang buntu. Perlakuan Pemberian Ekstrak Etanol Distribusi tikus dari masing-masing kelompok perlakuan berdasarkan skor kategori aktivitas dan rataan skor kategori disajikan pada Tabel 19. Hasil pengamatan aktivitas pada masing-masing kelompok perlakuan menunjukkan bahwa tikus dari kelompok kontrol menunjukkan aktivitas yang tidak konsisten dan secara umum menunjukkan tingkah laku yang tidak aktif. Pada minggu pertama dan ketiga skor rata-rata kategori aktivitas kelompok level 1 tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p>0,05), dan berbeda nyata dengan kelompok level 2 dan 3. Di seluruh minggu kelompok level 2 dan 3 lebih aktif dari pada kelompok level 1 dan kontrol. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Rao et al. (2006) yang melaporkan bahwa tikus yang diberi ekstrak daun lebih aktif dibandingkan dengan tikus kontrol dan kalau diberi dengan level yang lebih tinggi dalam periode yang lama dapat memberikan pengaruh yang positif terhadap proses pembelajaran dan memori. mengindikasikan adanya peningkatan kekuatan otot. Tikus yang aktif Mato et al. (2011) melaporkan bahwa pemberian ekstrak pegagan sebanyak 500 dan 750 mg/hari selama 2 bulan dapat meningkatkan performa fisik pada manula sehat yang ditandai dengan meningkatnya kekuatan otot pada bagian ekstremitas bawah. Tabel 19 Distribusi tikus dari masing-masing kelompok perlakuan berdasarkan skor kategori aktivitas dan rataan skor kategori Kelompok 4 (Sangat aktif) Minggu I Kontrol 0 Level 1 12,5 Level 2 62,5 Level 3 25,0 Minggu II Kontrol 0 Level 1 25,0 Level 2 50,0 Level 3 37,5 Minggu III Kontrol 0 Level 1 25,0 Level 2 58,3 Level 3 75,0 Minggu IV Kontrol 0 Level 1 33,3 Level 2 83,3 Level 3 91,7 Huruf superskrip yang berbeda pada Distribusi tikus (%) 3 2 (Aktif) (Kurang aktif) 1 (Tidak aktif) Skor rata-rata katagori 0 12,5 0 25,0 50,0 50,0 25,0 50,0 50,0 25,0 12,5 0 1,1+1,1b 1,4+0,9ab 2,1+0,9a 1,7+1,2a 0 25,0 12,5 25,0 0 25,0 12,5 25,0 100,0 25,0 25,0 12,5 1,0+1,2b 1,6+0,7a 1,9+0,9a 1.9+1,4a 8,3 0 0 16,7 33,3 25,0 16,7 8,3 58,3 50,0 25,0 0 1,1+1,0b 1,3+1,3b 1,9+1,2a 3,1+1,4a 0 8,3 91,7 1,0+0,8c 25,0 25,0 16,7 1,7+1,1b 8,3 0 8,3 3,1+1,2a 8,3 0 0 3,6+1,1a kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (P<0,05); 4 = Sangat aktif; 3 = Aktif; 2 = Kurang aktif; 1 = Tidak aktif Pengaruh yang positif ini mungkin karena perubahan struktural, neurokimia dan neurofisiologikal di dalam otak tikus (Rao et al. 2005). Laporan lainnya menyebutkan bahwa peningkatkan kemampuan memori dan pembelajaran pada tikus muda mungkin berhubungan dengan aktivitas antioksidan, anti inflamasi, neuroprotektif, pro-kholinergik dan anti-kholinergik dari berbagai komponen yang terdapat di dalam tanaman pegagan (Joshi & Parle 2006). Dilaporkan bahwa senyawa aktif yang terdapat di dalam pegagan efektif dalam melindungi neuron dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh paparan akibat kelebihan glutamat (Lee et al. 2000). Peningkatan aktivitas tikus seiring dengan meningkatnya level ekstrak yang diberikan mengindikasikan adanya peningkatan asupan zat gizi yang berpengaruh terhadap kontraksi otot. Linder (2006) melaporkan bahwa kalsium merupakan mineral makro yang juga berperan pada kontraksi otot. Kontraksi otot terutama diatur oleh konsentrasi Ca++ bebas di dalam sitosol. Berbagai stimulus yang menginduksi kontraksi otot memicu peningkatan Ca++ bebas di dalam sitosol. T-maze yang digunakan untuk mengukur pola aktivitas merupakan stimulus yang menyebabkan peningkatan Ca++ di dalam sitosol. Oleh karena kandungan kalsium pada level 3 lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok lainnya, maka peningkatan aktivitas pada level 3 sangat dimungkinkan. Persentase tikus dari masing-masing kelompok yang mencapai titik finish setelah diberi ekstrak etanol disajikan pada Tabel 20. Tabel 20 Persentase tikus yang mencapai titik finish setelah diberi ekstrak etanol Kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) Minggu I 0,00 12,50 37,50 12,50 % tikus yang mencapai finish Minggu II Minggu III Minggu IV 0,00 0,00 0,00 37,50 25,00 33,33 50,00 58,33 83,33 50,00 66,67 91,67 Data yang diperoleh menunjukkan bahwa tidak ada satu ekorpun dari tikus kontrol yang mencapai titik finish, sedangkan pada kelompok level 1, 2 dan 3 persentase tikus yang mencapai titik finish bervariasi. Pada kelompok level 1, persentase tikus yang mencapai titik finish cenderung stabil, sedangkan pada kelompok level 2 dan 3 terjadi peningkatan dari minggu ke minggu. Hal ini sesuai dengan laporan Rao Mohandas (2005) bahwa tikus yang diberi pegagan dengan level yang lebih rendah selama 2 minggu belum memberikan efek yang berarti, namun tikus yang diberi pegagan dengan level yang lebih tinggi menunjukkan adanya perbaikan yang signifikan dalam perilaku belajar. Pola aktivitas tikus juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Suaskara et al. (2007) melaporkan bahwa pemaparan cahaya dapat mengubah pola aktivitas tikus dan aktivitas tikus cenderung meningkat sebanding dengan lama cahaya. Dalam penelitian ini digunakan pencahayaan yang sama sehingga semua tikus berada dalam keadaan lingkungan yang sama. Dari 10 kali pengamatan (Tabel 21), frekuensi tikus yang mencapai titik finish dari kelompok level 2 dan 3 berbeda nyata dengan kelompok kontrol (p<0,05) dan tidak berbeda nyata dengan kelompok level 1 (p>0,05). Rata-rata waktu yang diperlukan untuk mencapai titik finish (Tabel 21) dari tikus yang diberi ekstrak etanol menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0,05) antara kelompok level 2 dan 3 dengan kelompok kontrol, namun tidak berbeda nyata dengan level 1 (p>0,05). Meskipun waktu mencapai titik finish berbeda nyata namun tidak menggambarkan tingkat aktivitas dari masing-masing kelompok percobaan, karena pola aktivitas tikus di dalam kotak maze tidak hanya berjalan, dan bahkan waktu di dalam maze banyak digunakan untuk aktivitas memanjat. Tabel 21 Rata-rata frekuensi dan waktu pencapaian titik finish setelah pemberian ekstrak etanol selama 10 kali pengamatan Pencapaian finish Frekuensi Persentase a Kontrol 0,00+0,00 0 Level 1 (100 mg/kg bb) 2,75+3,59ab 27,5 Level 2 (300 mg/kg bb) 6,00+4,08b 60,0 Level 3 (600 mg/kg bb) 6,00+2,45b 60,0 Kelompok Waktu pencapaian (menit) 0,00+0,00a 0,98+1,06ab 1,69+0,94b 1,49+0,64b Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (P<0,05). Tikus yang aktif, aktivitas memanjat di dalam maze dapat mencapai lebih dari 20 kali selama 5 menit. Dengan demikian, waktu yang diperlukan untuk mencapai titik finish bukan merupakan indikator yang baik untuk mengukur aktivitas dan kecerdasan tikus coba. Berdasarkan data pola aktivitas yang diperoleh, data persentase dan frekuensi pencapaian titik finish serta pola aktivitas di dalam maze lebih tepat digunakan sebagai indikator untuk mengukur tingkat aktivitas dan kecerdasan dibandingkan waktu yang diperlukan untuk pencapaian titik finish, karena pola aktivitas, persentase dan frekuensi pencapaian titik finish konsisten di masing-masing kelompok percobaan. Data gambaran darah pada kelompok yang diberi ekstrak etanol sejalan dengan gambaran aktivitasnya. Data gambaran aktivitas menunjukkan bahwa kelompok yang diberi ekstrak etanol lebih aktif dibandingkan dengan kelompok yang diberi ekstrak air. Data ini menggambarkan bahwa aktivitas sangat terkait dengan gambaran darah umum terutama dengan total benda darah merah, PCV, Hb dan total benda darah putih. Perlakuan Pemberian Ekstrak Air Aktivitas tikus yang diberi ekstrak air tidak lebih baik dibandingkan dengan aktivitas tikus yang diberi ektrak etanol (Tabel 22). Tabel 22 Kelompok Distribusi tikus dari masing-masing kelompok perlakuan berdasarkan skor kategori aktivitas dan rataan skor kategori 4 (Sangat aktif) Skor katagori aktivitas (%) 3 2 (Aktif) (Kurang aktif) Minggu I Kontrol 37,5 Level 1 12,5 Level 2 75,0 Level 3 37,5 Minggu II Kontrol 50,0 Level 1 12,5 Level 2 62,5 Level 3 37,5 Minggu III Kontrol 41,7 Level 1 25,0 Level 2 66,7 Level 3 41,7 Minggu IV Kontrol 16,7 Level 1 41,7 Level 2 41,7 Level 3 25,0 Huruf superskrip yang berbeda pada 1 (Tidak aktif) Skor rata-rata katagori 25,0 25,0 0 37,5 25,0 50,0 25,0 0 12,5 12,5 0 25,0 1,9 +1,1a 1,5 +0,9a 2,7 +0,9a 1,9 +1,2a 0 12,5 12,5 12,5 37,5 75,0 25,0 12,5 12,5 0 0 37,5 1,9 +1,2a 1,5 +0,7a 2,5 +0,9a 1,6 +1,4a 16,7 16,7 16,7 16,7 41,7 16,7 0 8,3 0 41,7 16,7 33,3 2,0+1,0ab 1,5 +1,3b 2,4 +1,2a 1,7 +1,4ab 33,3 50,0 0 1,7 +0,8a 0 50,0 8,3 1,8 +1,1a 16,7 25,0 16,7 1,8 +1,2a 16,7 41,7 16,7 1,6 +1,1a kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (P<0,05); 4 = Sangat aktif; 3 = Aktif; 2 = Kurang aktif; 1 = Tidak aktif Data pengamatan menunjukkan bahwa aktivitas tikus yang diberi ekstrak air tidak menunjukkan perbedaan antar kelompok (p>0,05) kecuali pada minggu ketiga, aktivitas tikus kelompok level 2 berbeda (p<0,05) dengan aktivitas tikus kelompok level 1, namun tidak berbeda dengan kontrol dan level 3 (p>0,05). Secara umum tikus pada kelompok level 2 lebih baik daripada kelompok level lainnya. Data aktivitas tikus yang diberi ekstrak air tidak menunjukkan hasil yang memuaskan, karena hampir semua parameter aktivitas yang diamati tidak menunjukkan hasil yang berbeda nyata dengan kontrol. Data ini mengindikasikan bahwa ekstrak air pegagan kurang bermanfaat jika digunakan untuk memperbaiki aktivitas dan pembelajaran pada tikus. Data ini tidak sejalan dengan laporan Veerendra & Gupta (1995) yang mengatakan bahwa ekstrak air pegagan memiliki efek meningkatkan fungsi kognitif. Laporan lainnya menyebutkan bahwa ekstrak etanol mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih baik dibandingkan dengan ekstrak air (Hamid et al. 2002). Data ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol mempunyai efek yang konsisten terhadap fungsi kognitif, sedangkan ekstrak air sebaliknya. Tabel 23 Persentase tikus yang mencapai titik finish setelah diberi ekstrak air Kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) % tikus yang mencapai finish Minggu I Minggu II Minggu III Minggu IV 50,00 37,50 33,33 16,67 12,50 12,50 25,00 41,67 62,50 62,50 66,67 41,67 50,00 37,50 41,67 25,00 Hasil pengamatan mengindikasikan bahwa ekstrak air pegagan lebih bermanfaat terhadap penambahan bobot badan dibandingkan terhadap aktivitas. Frekuensi pencapaian titik finish pada kelompok tikus yang diberi ekstrak air (Tabel 24) tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan (p>0,05), namun demikian kelompok level 2 frekuensi pencapaian titik finish lebih baik dibandingkan dengan kelompok level lainnya. Tabel 24 Rata-rata frekuensi dan waktu pencapaian titik finish setelah pemberian ekstrak air selama 10 kali pengamatan Kelompok Kontrol Level 1 (100 mg/kg bb) Level 2 (300 mg/kg bb) Level 3 (600 mg/kg bb) Pencapaian finish Frekuensi Persentase 3,25+2,75 32,5 2,50+1,91 25,0 6,00+4,24 60,0 3,75+2,87 37,5 Waktu pencapaian (menit) 0,57+0,11a 0,55+0,32a 0,97+0,48a 0,96+0,16a Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan berbeda nyata (P<0,05). Penelitian 3. Analisis Morfologi Hipokampus Imunohistokimia Jaringan Otak Pewarnaan imunohistokimia dilakukan dengan tujuan untuk mendeteksi kandungan atau komponen aktif yang ada dalam jaringan atau sel dengan penggunaan antibodi tertentu. Prinsip dasar pewarnaan ini adalah adanya ikatan antara antigen dan antibodi. Pada penelitian ini menggunakan beberapa jenis antibodi yang dianggap dapat memberi keterangan tentang mekanisme terjadinya peningkatan aktivitas (kognitif) pada tikus. Antibodi dimaksud adalah Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), calbindin-28k, dopamin, TNF-α, dan CRP. Profil Sel Neuroglia Terdapat 3 tipe sel glial di sistem susunan saraf pusat, dan ketiga sel glial tersebut dijumpai lebih dari setengah dari semua sel yang ada di otak. Sel glial berperan dalam pengolahan informasi di sistem susunan saraf pusat (Newman 2003). Berbagai kelainan klinis dapat mengurangi jumlah sel glial diantaranya keadaan depresi (Cotter et al. 2001) dan stres hipoksia (Sturrock 1976). Dilaporkan bahwa stres dapat meningkatkan kompleksitas internal dari mikroglia yaitu meningkatkan ramifikasi (percabangan) tanpa mengubah area keseluruhan yang ditempati oleh sel dan efek ini lebih jelas dalam sel yang lebih besar (Hinwood 2012). ED0 Gambar 12 Hasil pewarnaan dengan antibodi GFAP pada bagian hipokampus pada kelompok kontrol yang diberi ekstrak etanol daun pegagan. Skala bar = 30 µm Sel mikroglial adalah sel makrofag dalam sistem susunan saraf pusat. Selsel ini berasal dari mesodermal/mesenchymal dan bermigrasi ke seluruh wilayah dari sistem susunan saraf pusat, lalu menyebar melalui parenkim otak. Melalui signaling pathways sel-sel mikroglia bisa berkomunikasi dengan sel neuron dan sel-sel sistem kekebalan tubuh. Setelah terdeteksi adanya tanda-tanda lesi otak atau disfungsi sistem saraf, selanjutnya sel mikroglial menjalani proses, aktivasi kompleks, dan seterusnya sel-sel mikroglia berubah menjadi “sel mikroglial yang diaktifkan." Bentuk sel mikroglia yang telah diaktifkan memiliki kapasitas untuk melepaskan sejumlah besar substansi yang dapat bertindak merugikan atau bermanfaat bagi sel-sel sekitarnya. Sel mikroglial yang telah diaktifkan dapat bermigrasi ke lokasi cedera, berproliferasi, menfagosit sel dan kompartemen selular (Kettenmann et al. 2011). ED3 Gambar 13 Hasil pewarnaan dengan antibodi GFAP pada bagian hipokampus pada Kelompok level 3 yang diberi ekstrak etanol daun pegagan. Skala bar = 30 µm Pada penelitian ini, untuk melihat ekspresi dan kepadatan sel glial pada masing-masing kelompok perlakuan digunakan antibodi GFAP. Hasil pewarnaan secara imunohistokimia menunjukkan bahwa perbedaan kepadatan sel-sel glial antar kelompok perlakuan tidak jauh berbeda (Gambar 12 dan 13). Jumlah sel glial bahwa kelompok kontrol 691, kelompok yang diberi ekstrak air 624 dan kelompok yang diberi ekstrak etanol 678. Kemungkinan jumlah sel glial akan sangat berbeda apabila otak dalam keadaan tidak sehat, karena salah satu fungsi sel glial adalah sebagai makrofag. Data ini menunjukkan bahwa pada penelitian ini ekstrak pegagan tidak memberi pengaruh kepada populasi glial meskipun secara klinis pemberian ekstrak pegagan memberi pengaruh yang positif terhadap pola aktivitas dan gambaran darah. Diduga bahwa peningkatan kognitif yang ditandai dengan peningkatan aktivitas karena pemberian ekstrak etanol daun pegagan tidak melalui neuroglial pathways. Meskipun sel glial berperan dalam pengolahan informasi di sistem susunan saraf pusat (Newman 2003) dan juga pada sistem kekebalan tubuh (Kettenmann 2011), namun pada penelitian ini tidak menunjukkan perubahan pada kepadatan populasinya. Ekspresi Sel yang Positif terhadap Antibodi Calbindin D28k Penelitian tentang kemampuan Ca2+ untuk mengikat protein calbindin D28k untuk memodulasi peningkatan konsentrasi ion Ca2+ bebas intraseluler di ganglion tikus telah dilakukan oleh Chard et al. (1993), dan dilaporkan bahwa calbindin D28k efektif sebagai buffer ion Ca2+ dalam lingkungan seluler sehingga dapat mengatur Ca2+-dependent dari fungsi neuron. Dilaporkan bahwa persentase calbindin D28k endogen di ganglia dewasa mencapai lebih kurang 10% (Chard et al. 1993). Antibodi calbindin biasanya digunakan untuk melihat diferensiasi neuroblas menjadi sel neuron dewasa dan mengevaluasi kehilangan sel neuron di daerah hipokampus. Pewarnaan immuno dengan calbindin memperlihatkan gradasi dalam intensitas antara neuron dari populasi yang berbeda. Hal ini merupakan suatu fenomena yang kompatibel dengan keberadaan berbagai konsentrasi protein tersebut. Calbindin sangat baik sebagai penanda anatomi neuron yang dapat dimanfaatkan untuk memvisualisasikan secara selektif neuron tertentu dan pathways dalam sistem saraf pusat dan sistem saraf perifer. Calbindin terbentuk di semua jalur utama dari sistem limbik kecuali di forniks. Calbindin terutama berhubungan dengan neuron dengan akson yang panjang (sel Golgi tipe I) seperti pada neuron talamus, neuron strionigral, neuron Meynert nucleus basalis, sel Purkinje serebelum, dan sel ganglion vestibular. Gambar 14 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok kontrol yang diberi ekstrak etanol. Skala bar = 30 µm Gambar 15 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok level 1 yang diberi ekstrak etanol. Skala bar = 30 µm Calbindin juga ditemukan di beberapa sel akson yang pendek sel (Golgi tipe II), misalnya di interneuron sumsum tulang belakang di lapisan II dan interneuron dari korteks serebral. Calbindin juga terdeteksi di beberapa sel ependymal dan paling banyak di pusat vegatatif dari hipotalamus (Celio 1990). Pada penelitian ini, ekspresi sel neuron yang positif terhadap calbindin dari masing-masing kelompok perlakuan menunjukkan perbedaan (Gambar 14, 15, 16 dan 17). Hasil Imunohistokimia pada area hipokampus CA3 kelompok penerima ektraks etanol daun pegagan menunjukan angka rata-rata populasi sel yang positif terhadap Calbindin lebih besar (39,56 vs 34,75) dengan kontrol. dibandingkan Peningkatan yang terjadi sangat mungkin mengindikasikan terjadinya peningkatan pembentukan ATP yang terkait dengan peningkatan aktivitas dan pencapaian titik finish pada T-maze test yang dilakukan. Gambar 16 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok level 2 yang diberi ekstrak etanol. Skala bar = 30 µm Mekanisme peningkatan aktivitas tikus yang diberi ekstrak etanol diduga terkait dengan pembentukan calbindin. Calbindin akan menjadi bentuk aktif apabila terikat dengan protein allosteric effector. Selanjutnya calbindin bentuk aktif tersebut akan merangsang pembentukan ATP dari glikogen otot dengan bantuan glycogen posporilasekinase yang pada akhirnya akan merangsang terjadinya kontraksi otot. Mekanisme peningkatan aktivitas juga terkait dengan aktivitas metabolisme di dalam jaringan otot. Aktivitas metabolisme di dalam jaringan otot harus disertai dengan suplai darah yang optimal dan pada setiap serat otot juga harus dilengkapi dengan beberapa kapiler untuk memperkaya vaskularisasi (deVries & Housh 1994). Dengan demikian dapat dipahami bahwa pencapaian peningkatan aktivitas tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan juga terkait dengan terjadinya perbaikan pada sistem sirkulasi darah (profil hematologi). Gambar 17 Hasil pewarnaan dengan antibodi calbindin D28k pada bagian hipokampus untuk kelompok level 3 yang diberi ekstrak etanol. Skala bar = 30 µm Calbindin dipahami sebagai calcium binding protein yang terkait dengan metabolisme seluler terkait dengan pertukaran dan pengaturan Ca dalam sel. Pada sel saraf Calbindin dilaporkan dapat berperan sebagai buffer untuk ion Ca2+ (Chard et al. 1993) yang dapat mencegah kerusakan sel karena peningkatan konsentrasi Ca+ baik pada sel saraf maupun sel lain yang mengandung protein ini (Leranth & Ribak 1991). Chard et al. (1993) juga melaporkan bahwa Calbindin dapat juga berperan sebagai neurotransmiter. Peningkatan populasi sel positif calbindin pada kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol dapat dipahami bahwa sel yang mengalami peningkatan metabolisme meningkat dan sangat mungkin bermakna bahwa sel-sel yang dalam kondisi siap kerja (standby) juga miningkat. Ekspresi Sel yang Positif terhadap Antibodi Dopamin Reseptor dopamin adalah target utama untuk neuroleptik tipikal dan atipikal. Untuk memahami kontribusi fungsionalnya dari neuron yang mengandung dopamin maka dapat digunakan antibodi anti-peptida. Dilaporkan bahwa reseptor dopamine terdistribusi di korteks serebral, hipokampus, ganglia basalis, serebelum, dan otak tengah (Khan et al. 1998). Defagot (1997) juga melaporkan bahwa reseptor dopamin terdistribusi secara meluas di dalam sistem saraf pusat tikus dan tertinggi dijumpai di dalam korteks frontal hipokampus (CA1, CA2, CA3 dan dentate gyrus), korteks entorhinal, putamen kaudatus, nukleus akkumbens, tuberkulum olfaktorius, otak kecil, nukleus supraoptik dan sustansia nigra. Gambar 18 Hasil pewarnaan dengan antibodi dopamin pada bagian hipokampus Kelompok level 2 yang diberi ekstrak daun etanol. Skala bar = 30 µm Pada penelitian ini, pewarnaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi dopamin tidak menghasilkan reaksi positif (Gambar 18). Artinya, pemberian ekstrak etanol daun pegagan tidak berpengaruh pada penampakan selsel yang positif terhadap dopamine. Dengan demikian, diduga bahwa peningkatan aktivitas tikus pada penelitian tidak melalui mekanisme neurotransmiter dopamin. Ekspresi Sel yang Positif terhadap Antibodi CRP dan TNF Hasil pewarnaan dengan antibodi TNF (Gambar 19) dan CRP (Gambar 20) tidak menunjukkan reaksi positif pada semua kelompok perlakuan. Artinya, pada penelitian ini pemberian ekstrak etanol daun pegagan tidak berpengaruh pada ekspresi sel-sel yang positif terhadap CRP dan TNF. Gambar 19 Hasil pewarnaan dengan antibodi TNF pada bagian hipokampus kelompok level 1 yang diberi ekstrak daun etanol. Skala bar = 30 µm Gambar 20 Hasil pewarnaan dengan antibodi CRP pada bagian hipokampus kelompok level 2 yang diberi ekstrak daun etanol. Skala bar = 30 µm Hal ini mungkin saja karena tikus yang digunakan pada penelitian ini masih berumur muda (berumur lebih kurang 4 bulan pada saat dikorbankan) dan sel neuron belum mengalami degenerasi sehingga ekspresi sel neuron yang positif terhadap antibodi tersebut tidak ditemukan. Dilaporkan bahwa TNF endogen memainkan peran penting dalam fungsi kognitif pada saat usia tua (McAfoose et al. 2009), sedangkan pada kondisi non-inflamasi kadar TNF yang rendah tampaknya penting untuk fungsi kognitif normal (Baune et al. 2008). 92 PEMBAHASAN UMUM Berdasarkan bukti empiris menunjukkan bahwa pegagan yang kaya mineral, bahan gizi dan bahan aktif telah lama digunakan untuk tujuan meningkatkan fungsi memori. Hasil analisa kandungan kimia dan fitokimia dari daun pegagan yang digunakan dalam penelitian mengandung mineral baik yang makro maupun mikro cukup beragam, demikian juga kandungan zat gizi seperti karbohidrat dan protein serta bahan aktif lain seperti senyawa asiatikosida ditemukan dalam jumlah yang relative cukup tinggi, sebagaimana dilaporkan oleh hasil peneliti-peneliti sebelumnya. Diantara senyawa tersebut, asiatikosida diduga berperan pada perbaikan fungsi kognitif. Keberadaan mineral makro dan mikro serta zat gizi lainnya yang terdapat di dalam pegagan belum banyak digali perannya dalam perbaikan metabolism sel. Berdasarkan hasil analisis fitokimia atau uji fitokimia yang merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik maka dapat diketahui bahwa di dalam pegagan ditemukan senyawa alkaloid, flavonoid, steroid dan glikosida. Laporan lainnya menyebutkan bahwa, selain senyawa tersebut juga ditemukan senyawa lainnya seperti saponin, tannin, triterpenoid dan fenolik. Tidak terdeteksinya beberapa senyawa tersebut dalam proses pengujian fitokimia dapat disebabkan karena jumlah material yang dianalisis tidak mencapai jumlah minimal yang dibutuhkan di dalam bahan yang dianalisis (Zainol et al. 2008), atau asal tanaman yang berbeda, dan mungkin juga karena waktu pengambilan sampel yang berbeda. Fungsi senyawa-senyawa yang ada dilaporkan selain terkait dengan fungsi kognitif dapat sebagai insektisida, anti parasit, anti mikroba, antioksidan penangkap radikal bebas dan juga berfungsi sebagai donor hidrogen yang efektif. Hasil pengamatan aktivitas proses pengenalan lorong dalam T-maze pada kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol sebanyak 300 mg/kg bobot badan memberikan peningkatan aktivitas yang tidak berbeda nyata dengan tikus yang diberi ekstrak etanol sebanyak 600 mg/kg bobot badan. Gambaran peningkatan persentase dari tikus yang mencapai finish juga peningkatan aktivitas dalam lorong T-maze dapat dipahami sebagai keberhasilan individu dalam mengenali lorong buntu dan keberhasilan mengingat jalur menuju titik finish. Hasil demikian menggambarkan dengan jelas adanya pengaruh pemberian ekstrak pegagan, mengingat pada periode yang sama perubahan tidak ditemukan pada kelompok kontrol. Bila mengenali lorong dan mengingat jalur menuju finish dapat dipahami sebagai proses belajar maka hasil pengamatan aktivitas menegaskan bahwa pemeberian ekstrak pegagan dapat meninngkatkan fungsi kognitif. Hasil analisa darah pada tikus yang diberi ekstrak etanol sebanyak 300 mg/kg bobot badan, cenderung memiliki Hb yang lebih tinggi dan peningkat seiring dengan meningkatnya nilai persen hematokrit/PCV yang disebabkan oleh meningkatanya jumlah sel darah merah yang beredar pada sirkulasi perifer. Gambaran darah demikian sangat mungkin menjelaskan bahwa pemberian ektrak pegagan pengeluaran darah merah ke sirkulasi perifer, sehingga meningkatkan nilai Hb yang secara fisiologis menggambarkan tingkat kecukupan asupan gizi. Peningkatan nilai Hb yang pada akhirnya akan meningkatkan kemampuan mengikat jumlah O2 untuk didestribusikan ke seluruh sel dalam jaringan tubuh.. Peningkatan jumlah O2 terangkut akan menjamin pemenuhan kebutuhan metabolisme aerob dalam sel yang terjadi dalam pemenuhan energi untuk Gambar 21 Mekanisme penyerapan Ca dari usus (Sumber: http://quizlet.com/ 4867071/16-calcium-physiology-flash-cards/) aktivitas. Hal ini selaras dengan hasil pengamatan aktivitas yang meningkat pada kelompok tikus yang diberi ekstrak pagagan. Peningkatan aktivitas otot motorik tentunya ada beberapa faktor yang berperan di dalamnya selain ketersediaan O2, diantaranya ketersediaan Ca++, mineral makro secaara umum (Ca, F dan Mg) sangat dominan peranannya pada aktivitas neuromuskular yang mencakup penyediaan energi dan transmisi impuls syaraf. Demikian juga halnya dengan aktivitas fungsi syaraf, mineral makro juga mempunyai peran yang cukup penting. Ketersediaan Ca++ tentunya dipengaruhi oleh penyerapan Ca++ di dalam usus, dan penyerapan Ca++ tersebut dipengaruhi oleh keberadaan calcium binding protein. Gambar 21 menjelaskan mekanisme penyerapan Ca++ dari usus yang difasilitasi oleh calcium binding protein. Linder (2006) melaporkan bahwa kalsium merupakan mineral makro yang juga berperan pada kontraksi otot. Kontraksi otot terutama diatur oleh konsentrasi Ca++ bebas di dalam sitosol. Berbagai stimulus yang menginduksi kontraksi otot memicu peningkatan Ca++ bebas di dalam sitosol. Funsi Ca++ intraseluler selain berperan pada kontraksi otot, juga terlibat dalam sekresi neurotransmiter, hormon dan enzim, aktivasi limfosit dan proliferasi. Gambar 22 Mekanisme terjadinya kontraksi otot yang diperantarai oleh penggunaan Ca dan ATP (Sumber: http://www.easyvigour.net.nz/ trigger_ points/h_triggerpoint4.htm) Peran Ca++ dalam mekanisme terjadinya kontraksi otot secara umum terkait dengan ketersediaan energy (ATP) di dalam sel otot. Secara singkat proses kontraksi terjadi karena pemendekan unit sarkomir otot lurik yang disusun oleh serat aktin dan myosin. Ketersediaan Ca++ dan energi yang tinggi dalam myosin akan mengikat aktin dan terjadi kontraksi. Secara skematis proses terjadinya kontraksi dijelaskan pada gambar 22. Kontraksi otot juga dirangsang oleh calcium binding protein yang sudah terikat dengan protein allosteric effector. Selanjutnya calcium binding protein bentuk aktif tersebut merangsang pembentukan ATP dari glikogen otot dengan bantuan glycogen posporilasekinase yang pada akhirnya merangsang terjadinya kontraksi otot. Pembentukan ATP pada mekanisme kontraksi otot tidak hanya berasal dari glikogen otot, tapi dapat juga dari sumber lainnya (Gambar 23). Gambar 23 Penggunaan ATP pada kontraksi (Sumber: http://users.rcn.com/ Jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/M/Muscle.htm1) Hasil Imunohistokimia pada area hipokampus CA3 kelompok penerima ektraks etanol daun pegagan menunjukan angka rata-rata populasi sel yang positif terhadap Calbindin lebih besar (39,56 %) dibandingkan dengan control (34,75 %) Berdasarkan penjelasan tentang mekanisme terjadinya kontraksi otot maka dapat dipahami bahwa peningkatan populasi sel yang positif terhadap Calbindin yang terjadi sangat mungkin mengindikasikan terjadinya peningkatan pembentukan ATP yang terkait dengan peningkatan aktivitas dan pencapaian titik finish pada Tmaze test yang dilakukan. Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa calbindin merupakan faktor utama yang menyebabkan terjadinya peningkatan aktivitas. Pada penelitian ini, pengaruh calbindin tidak hanya pada pemanfaatan ATP sebagai sumber energi untuk kontraksi otot tapi juga efektif sebagai buffer ion Ca2+ dalam lingkungan seluler sehingga dapat mengatur Ca2+-dependent dari fungsi neuron, dengan demikian kerja neuron di bagian CA3 hipokampus lebih optimal. Keberadaan asiatikosida yang terkandung di dalam ekstrak pegagan dan gambaran hematologi yang didapat setidaknya dapat diajukan dua pendekatan mekanisme yang mungkin dapat menjelaskan kerja ekstrak pegagan dalam meningkatkan fungsi kognitif. Kemungkinan mekanisme pertama terkait dengan fungsi pegegan sebagai tonikum seperti yang dipahami berkemampuan dalam memperbaiki metabolism sel secara umum. Peningkatan metabolisme pada sel otot kerangka berdampak pada kesiapan tikus dalam beraktivitas di dalam Tmaze sebagaimana terlihat pada kelompok yang diberi ekstrak pegagan. Pada kemungkinan mekanisme ke dua sangat mungkin terkait dengan fungsi senyawa asiatikosida yang dapat berperan sebagai anti-oksidan yang mampu mengamankan sel saraf dari kerusakan oksidatif. Gambar 24 Skema peningkatan fungsi kognitif setelah pemberian ekstrak daun pegagan selama 8 minggu Berdasarkan data yang diperoleh pada penelitian dengan menggunakan tikus usia produktif dapat dijelaskan bahwa peningkatan fungsi kognitif yang diperoleh karena pemberian ekstrak etanol daun pegagan dicapai melalui peningkatan kinerja neuron hipokampus di region CA3 yang ditandai dengan meningkatnya populasi sel yang positif terhadap calbindin dan kinerja otot melalui peningkatan aktivitas (neuro muskular). Peningkatan tersebut diperoleh melalui perbaikan metabolisme secara umum yang ditandai dengan adanya unsur mineral makro dan mikro serta pengaruh dari asiatikosida dan senyawa flavonoid yang berfungsi sebagai antioksidan penangkap radikal bebas. Secara skematis peningkatan fungsi kognitif dijelaskan pada Gambar 24. Data ini mengindikasikan bahwa penggunaan sebanyak 300 mg/kg bobot badan untuk jangka waktu pemakaian 8 minggu adalah lebih tepat. Berdasarkan data tersebut dapat dipahami bahwa efek klinis yang ditimbulkan pada penggunaan ekstrak etanol daun pegagan tidak menggambarkan hubungan linier dengan jumlah pemberian. Laporan sebelumnya menyebutkan bahwa ekstrak air pegagan bermanfaat untuk fungsi kognitif sedangkan ekstrak etanol tidak memberi pengaruh yang positif, namun sebaliknya pada penelitian ini. Jika dilihat dari keberadaan jenis mineral yang dianalisis, di dalam ekstrak air semua mineral yang dianalisis kandungannya lebih banyak dibandingkan dengan ekstrak etanol. Berdasarkan kandungan mineral, seharusnya ekstrak air pegagan memberikan pengaruh yang lebih baik dibandingkan dengan ekstrak etanol, namun pada penelitian ini hasil yang diperoleh sebaliknya. Berdasarkan data tersebut dapat dipahami bahwa efek dari suatu sediaan tidak hanya dipengaruhi oleh kandungan zat gizinya tapi juga dipengaruhi oleh faktor lainnya misalnya kemampuan usus untuk menyerap zat gizi tersebut. 98 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Di dalam ekstrak etanol dan ekstrak air daun pegagan terkandung mineral makro dan mikro serta senyawa asiatikosida. Ekstrak etanol daun pegagan bermanfaat untuk meningkatkan profil hematologi dan aktivitas. Ekstrak etanol dan ekstrak air daun pegagan tidak berpengaruh terhadap pertambahan bobot badan harian. Profil hematologi pada kelompok level 2 yang diberi ekstrak etanol cenderung lebih baik dibandingkan dengan kelompok lainnya. Terdapat 3 jenis tingkah laku yang dominan pada tikus yaitu berjalan, memanjat dan membaui. Tikus yang aktif cenderung mempunyai gambaran darah lengkap yang lebih baik. Tikus kontrol menunjukkan tingkah laku yang tidak aktif. Tikus dari kelompok yang diberi ekstrak etanol menunjukkan peningkatan aktivitas dari minggu ke minggu. Tikus kontrol tidak ada yang mencapai titik finish, sedangkan pada kelompok perlakuan persentase tikus yang mencapai titik finish bervariasi dan tertinggi di jumpai pada level 3. Pada penelitian ini, waktu untuk mencapai titik finish tidak menggambarkan tingkat aktivitas dari masingmasing kelompok percobaan. Persentase dan frekuensi pencapaian titik finish serta pola aktivitas di dalam maze lebih tepat digunakan sebagai indikator untuk mengukur tingkat aktivitas dan kecerdasan. Secara imunohistokimia, populasi sel neuron yang positif terhadap antibodi calbindin pada kelompok yang diberi ekstrak etanol lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol. Ekstrak pegagan tidak berpengaruh terhadap populasi sel glial pada hipokampus di region CA3. Dengan demikian dapat ditegaskan bahwa salah satu mekanisme peningkatan fungsi kognitif karena pemberian ekstral etanol daun pegagan yang digambarkan dengan peningkatan aktivitas adalah melalui mekanisme calbindin pathways. Berdasarkan parameter profil hematologi, aktivitas dan populasi neuron yang positif terhadap calbindin maka kelompok level 2 yang diberi ekstrak etanol daun pegagan (300 mg ekstrak/kg bobot badan, ekivalen dengan 48,09 mg asiatikosida/kg bobot badan) memberi pengaruh yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok lainnya. Ekstrak etanol daun pegagan bermanfaat untuk meningkatkan aktivitas dan pembelajaran pada tikus. Saran Perlu dilakukan penelitian yang lebih luas tentang mekanisme, aplikasi pada manusia dan peluang pasar yang mencakup: 1. Penelitian praklinis pada kelompok umur yang lebih muda (1-2 minggu) dan kelompok umur tua (>2 tahun). 2. Pengujian klinis sebagai pangan fungsional atau suplemen pada semua kelompok umur dengan berbagai macam varian produk berbasis pegagan. 3. Uji efikasi pada berbagai macam keadaan klinis. 4. Kajian potensi pegagan sebagai pangan fungsional dan obat tradisional. 5. Uji daya terima dan keamanan produk dari berbagai macam varian produk. PENGARUH PENGGUNAAN EKSTRAK DAUN PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban) TERHADAP FUNGSI KOGNITIF TIKUS ISKANDAR MIRZA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 100 DAFTAR PUSTAKA Afrida A. 2009. Pengaruh pemupukan fosfor terhadap pertumbuhan dan produksi tanaman pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) di dataran tinggi. Skripsi. Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor, Bogor. Anand T, Kumar GP, Ilaiyaraja N, Khanum F, Bawa AS. 2012. Effect of asiaticosida rich extract from Centella asiatica (L.) Urb. on physical fatigue induced by weight-loaded forced swim test. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances, 7(9):832-841. Anwar R. 1988. Pengaruh pemberian ekstrak daun gamal Gliricidia sepium (Jacq) Steud. Terhadap beberapa nilai hematologis tikus putih (Rattus norvegicus strain albino. Disertasi. Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor. Atukorala, TMS, Waidyanatha US de S. 1987. Zinc and copper content of some common foods. J. Natn. Sci. Coun. Sri Lanka, 15(1): 61-69. Aziz ZA et al. 2007. Production of asiaticoside and madecassoside in Centella asiatica in vitro and in vivo. Biologia Plantarum, 51 (1): 34-42. Babu TD, Kuttan G, Padikkala J. 1995. Cytotoxic and anti-tumour properties of certain taxa of umbelliferae with special reference to Centella asiatica (L.) Urban. Journal of Ethnopharmacology, 48: 53-57. Baune BT, Wiede F, Braun A, Golledge J, Arolt V, Koerner H. 2008. Cognitive dysfunction in mice deficient for TNF- and its receptors. American Journal of Medical Genetics Part B: Neuropsychiatric Genetics, 147B(7):10561064. Bermawie N, Purwiyanti S, Mardiana. 2008. Keragaan sifat morfologi, hasil dan mutu plasma nutfah pegagan (Centella asiatica (L.) Urban.). Bul. Littro, 19(1):1- 17. Borchers AT et al. 1997. Complementary Medicine: A review of immunomodulatory effects of Chinese herbal medicines. Am J Clin Nutr, 66: 1303-12. Buckle KA, Edward RA, Fleet GH, Wootton M. 2007. Ilmu Pangan. Purnomo H, Adiono, Penerjemah; Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Food Science. Celio MR. 1990. Calbindin D-28k and parvalbumin in the rat nervous system. Neuroscience, 35:375-47. Chard PS, Bleakman D, Christakost S, Fullmer CS, Miller RJ. 1993. Calcium buffering properties of calbindin D28k and parvalbumin in rat sensory neurones. Journal of Physiology, 472:341-357. Cotter D, Mackay D, Landau S, Kerwin R, Everall I. 2001. Reduced glial cell density and neuronal size in the anterior cingulate cortex in major depressive disorder. Arch Gen Psychiatry, 58:545-553. Defagot MC, Malchiodi EL, Villar MJ, Antonelli MC. 1997. Distribution of D4 dopamine receptor in rat brain with sequence-specific antibodies. Molecular Brain Research, 45:1-12. devRies HA, Housh TJ. 1994. Physiology of exercise for physical education, athletics and exercise science. 5th ed. Brown & Benchmark Publishers, Medison, Wisconsin Dubuque, Iowa. Driscoll et al. 2003. The Aging Hippocampus: Cognitive, biochemical and structural findings. Cerebral Cortex, 13:1344-1351. Farouq. 2003. Ekstrak sebagai salah satu pengembangan bentuk obat tradisional. Seminar POKJANAS TOI XXIII. Unversitas Pancasila, Jakarta. hal. 12. Gnanapragasam et al. 2007. Adriamycin induced myocardial failure in rats: Protective role of Centella asiatica. Molecular and Cellular Biochemistry, 294: 55–63. Gupta S, Lakshmi AJ, Manjunath MN, Prakash J. 2005. Analysis of nutrient and antinutrient content of underutilized green leafy vegetables. LWT, 38: 339– 345. Hamid AA, Shah ZM, Muse R, Mohamed S. 2002. Characterisation of antioxidative activities of various extracts of Centella asiatica (L) Urban. Food Chemistry, 77: 465–469. Harborne JB. 1987. Metode fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. K Padmawinata, I Sudiro, penerjemah; Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Method. Harborne JB. 1996. Metode Fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. K Padmawinata, I Sudiro, Penerjemah; Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Method. Hartanto H. 1996. Penuaan dan Kapasitas Kerja. Doewes M, penerjemah; Jakarta: EGC Penerbit Buku Kedokteran. Terjemahan dari: Aging and working capacity. Hartog A, Smit HF, M van der KV, Hoijer MA, Garssen J. 2009. In vitro and in vivo modulation of cartilage degradation by a standardized Centella asiatica fraction. Experimental Biology and Medicine, first published online March 23, as doi:10.3181/0810-RM-298. Hinwood M, Ross JT, Janine LC, Sarah BB, Trevor AD, Walker FR. 2012. Chronic Stress Induced Remodeling of the Prefrontal Cortex: Structural reorganization of microglia and the inhibitory effect of minocycline. Cereb. Cortex, June 17 Hong SS, Kim JH, Hong L, Shim CK. 2005. Advanced formulation and pharmacological activity of hydrogel of the titrated extract of C. asitica. Arch Pharm Res, 28 (4): 502-508. Hussin et al. 2007. Protective effect of Centella asiatica extract and powder on oxidative stress in rats. Food Chemistry, 100: 535–541. Indrayan AK, Sharma S, Durgapal D, Kumar N, Kumar M. 2005. Determination of nutritive value and analysis of mineral elements for some medicinally valued plants from Uttaranchal. Current Science, 89(7): 1252-1255. Jacobsen et al. 2004. Relationship of hemoglobin levels to fatigue and cognitive functioning among cancer patients receiving chemotherapy. Journal of Pain and Symptom Management, 28(1):7–18. Jayathirtha MG, S H Mishra. 2004. Preliminary immunomodulatory activities of methanol extracts of Eclipta alba and Centella asiatica. Hytomedicine International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology, 11(4):361365. Jones PJ, Jew S. 2007. Functional food Development: Concept to reality. Trends in Food Science & Technology, 18(7): 387-390. Joshi, H, Parle M. 2006. Brahmi rasayana improves learning and memory in mice. eCAM, 3(1):79–85. Kettenmann H, Hanisch UK, Noda M, Verkhratsky A. 2011. Physiology of microglia. Physiol Rev, 91: 461-553. Khan ZU, Gutierrez A, Martin R, Penafiel A, Rivera A, Calle ADL. 1998. Differential Regional and Cellular Distribution of Dopamine D2-Like Receptors: An immunocytochemical study of subtype-specific antibodies in rat and human brain. The Journal Of Comparative Neurology, 402:353-371. Kim et al. 2007. Enhanced production of asiaticoside from hairy root cultures of Centella asiatica (L.) Urban elicited by methyl jasmonate. Plant Cell Rep, 26: 1941–1949. Kim OT, Kim MY, Hong MH, Ahn JC, Hwang B. 2004. Stimulation of asiaticoside accumulation in the whole plant cultures of Centella asiatica (L.) Urban by elicitors. Plant Cell Rep, 23:339–344. Kiuru P, Kirigua VO, Mukiama TK, Mathini K, Cheluget W, Manyeki L. 2010. Effect of media substrates on growth and yield of pennywort (Centella asiatica (L.). 12th KARI Scientific Conference Proceeding. 593-596. Komarawinata HD. 2007. Budidaya dan pascapanen tanaman obat untuk meningkatkan kadar bahan aktif. Unit Riset Pengembangan PT. Kimia Farma. Kormin S. 2005. The effect of heat processing on triterpene glycosides and Antioxidant activity of herbal pegaga (Centella asiatica L. Urban) drink. Thesis. Engineering (Bioprocess) Faculty of Chemical and Natural Resources Engineering Universiti Teknologi Malaysia. Kristina NN, Kusumah ED, Lailani PK. 2009. Analisis fitokimia dan penampilan polapita protein tanaman pegagan (Centella asiatica) hasil konservasi in vitro. Bul. Littro, 20(1):11 – 20. Kurniasari D. 1999. Identifikasi dan uji senyawa alkaloid daun tembakau terinfeksi Virus Mozaik. Skripsi. Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Diponegoro, Semarang. Kurniawati A, Darusman LK, Rachmawati RY. 2005. Pertumbuhan, produksi dan kandungan triterpenoid dua jenis pegagan (Centella asiatica L. (Urban) sebagai bahan obat pada berbagai tingkat naungan. Bul. Agron, 33(3): 62 – 67. Lailani PK. 2008. Analisis keragaman protein dan fitokimia tanaman pegagan (Centella asiatica) hasil perbanyakan in vitro. Skripsi. Program Studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Lee, HB, Blaufox MD. 1985. Blood volume in the rat. J Nucl Med, 25:72-76. Lee et al. 2000. Asiatic acid derivatives protect cultured cortical neurons from glutamate-induced excitotoxicity. Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 108: 75–86. Lehninger AL. 1982. Dasar-dasar biokimia. Thenawidjaya M, Penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry. Leranth C, Ribak CE. 1991. Calcium-Binding Proteins are Concentrated in the CA2 Field of the Monkey Hippocampus: A possible key to this region's resistance to epileptic damage. Exp Brain Res, 85(1):129-36. Linder MC. 2006. Biokimia nutrisi dan metabolism dengan pemakaian secara klinis. Ed. M.C. Linder. (Penerjemah Aminuddin Parakkasi). UI-PRESS. Lusiana H. 2009. Isolasi dan uji anti plasmodium secara in vitro senyawa alkaloid dari Albertisia papuana Becc. Tesis. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor. Mangas et al. 2008. Triterpenoid saponin content and the expression level of some related genes in calli of Centella asiatica. Biotechnol Lett. 30:1853– 1859. Mato L et al. 2001. Centella asiatica improves physical performance and healthrelated quality of life in healthy elderly volunteer. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 1-7 Maquart et al. 1999. Triterpenes from Centella asiatica stimulate extracellular matrix accumulation in rat experimental wounds. European Journal of Dermatology. 9 (4): 289-96. McAfoose J, Koerner H, Baune BT. 2009. The effects of TNF deficiency on agerelated cognitive performance. Psychoneuroendocrinology, 34(4): 615-619. Mckittrick et al. 2000. Chronic social stress reduces dendritic arbors in CA3 of hippocampus and decreases binding to serotonin transporter sites. Synapse, 36:85–94. Meutia N, Ibrahim N. 2008. Pengaruh pemberian ekstrak daun pegagan (Centella asiatica) peroral pada nafsu makan kadar glukosa dan kadar ghrelin dalam plasma darah tikus. http://repository.usu.ac.id/handle/123456789/6172. Musyarofah N, Susanto S, Aziz SA, Kartosoewarno S. 2007. Respon tanaman pegagan (Centella asiatica L. Urban) terhadap pemberian pupuk alami di bawah naungan. Bul. Agron. 35(3): 217-224 Newman EA. 2003. Glial cell inhibition of neurons by release of ATP. The Journal of Neuroscience, 23(5):1659-1666. Nugroho AA. 2009. Evaluasi potensi hasil dan mutu enam nomor harapan pegagan (centella asiatica L. (urban)) pada dua lokasi dataran rendah. Skripsi. Program Studi Pemuliaan Tanaman dan Teknologi Benih, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor Nurjanah NN. 2008. Studi karakter agronomi pada 17 aksesi pegagan (Centella asiatica (L.) Urban). Skripsi. Program Studi Agronomi, Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor, Bogor. Odhav B, Beekrum S, Akula U, Baijnath H. 2007. Preliminary assessment of nutritional value of traditional leafy vegetables in KwaZulu-Natal, South Africa. Journal of Food Composition and Analysis, 20:430-435. Padmaja et al. 2002. Brine shrimp lethality bioassay of selected Indian medicinal plants. Fitoterapia, 73: 508–510. Pelvig DP, Pakkenberg H, Stark AK, Pakkenberg B. 2008. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiol Aging, 29(11):1754-62. Plaeger SF. 2003. Clinical immunology and traditional herbal medicines. Clin. and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (3): 337–338. Pramono S. 2005. Penanganan pasca panen dan pengaruhnya terhadap efek terapi obat alam. Seminar Pokjanas TOI XXVIII. Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. Bogor. Hal.1-6. Punturee K, Christopher PW, Watchara K, Usanee V. 2005. Immunomodulatory activities of Centella asiatica and Rhinacanthus nasutus extracts. Asian Pacific J Cancer Prev, 6: 396-400. Rajkumar S, Jebanesan A. 2005. Larvicidal and adult emergence inhibition effect of Centella asiatica Brahmi (Umbelliferae) against mosquito Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). African Journal of Biomedical Research, 8: 31 – 33. Rao MKG, Rao MS, Rao GS. 2005. Centella asiatica (Linn) induced behavioural changes during growth spurt period in neonatal rats. Neuroanatomy, 4: 18–23. ______, et al. 2006. Centella asiatica (L.) leaf extract treatment during the growth spurt period enhances hippocampal CA3 neuronal dendritic arborization in rats. eCAM, 3 (3): 349–357. ______, et al. 2007. Enhancement of amygdaloid neuronal dendritic arborization by fresh leaf juice of Centella asiatica (Linn) during growth spurt period in rats. eCAM Advance Access published August 13. Rao VG, Shivakumar HG, Parthasarathi G. 1996. Influence of aqueous extract of Centella as/at/ca (Brahmi) on experimental wounds in albino rats. Indian Journal of Pharmacology, 28 : 249-253. Rasyid R, Mahyuddin, Agustin M. 2011. Pemeriksaan kadar kalium dan natrium pada herba Centella asiatica (L) Urban dengan metoda fotometri nyala. Scientia, 1(2): 12-16. Riyadi H, Marliyati SA, Yuliani S, Mulyawanti I, Mirza I. 2011. Pengembangan produk pangan fungsional berbasis pegagan (Centella asiatica) sebagai peningkat daya ingat. Laporan KKP3T, Institut Pertanian Bogor Bekerjasama dengan Sekretariat Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Sagrawat H, Yaseen KM. 2007. Immunomodulatory Plants: phytopharmacological review. Pharmacognosy Reviews. 1: 248-260. A Samy RP, Ignacimuthu, Vincent TKC. 2011. Antimicrobial and phytochemical analysis of Centella asiatica (L.). Nature Precedings: hdl:10101/npre. 2011.6033.1. Satake T, Kamiya K, Yin A, Oishi T, Yamamoto J. 2007. The anti-thrombotic active constituents from Centella asiatica. Biol. Pharm. Bull. 30(5): 935— 940. Sharma R, Jaimala. 2003. Alteration of acid phosphatase activity in the liver of gamma irradiated mouse by Centella asiatica. Asian J. Exp. Sci, 17 (1&2): 1-9. Shetty BS, Udupa SL, Udupa AL. 2008. Biochemical analysis of granulation tissue in steroid and Centella asiatica (Linn) treated rats. Pharmacologyonline, 2: 624-632. Shukla et al. 1999. In vitro and in vivo wound healing activity of asiaticoside isolated from Centella asiatica. Journal of Ethnopharmacology, 65: 1–11. Sidiarto LD, Kusumoputro S. 2003. Memori anda setelah usia 50. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press). Sidik, Mudahar H. 2000. Ekstraksi tumbuhan obat, metode dan faktor-faktor yang mempengaruhi mutunya. Makalah pada seminar sehari Perhipba Komasariat jakarta. Universitas 17 Agustus 1945. Jakarta 8 hal. Sihombing M, Tuminah S. 2011. Perubahan nilai hematologi, biokimia darah, bobot organ dan bobot badan tikus putih pada umur berbeda. Jurnal Veteriner, 12(1): 58-64 Sinambela JS. 2003. Standarrisasi sediaan obat herba. Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXIII. Universitas Pancasila, Jakarta. Hal.10. Siró I, Kápolna E, Kápolna B, Lugasi A. 2008. Functional food product development, marketing and consumer acceptance: A review. Appetite, 51(3): 456-467. Somchit et al. 2004. Antinociceptive and antiinflammatory effects of Centella asiatica. Indian J Pharmacol, 36: 377-380. Sripanidkulchai K, Techataweewan N, Tumsan Y, Pannangrong W, Sripanidkulchai B. 2007. Prevention of indomethacin-induced gastric ulcers in rats by extract from leaves of Centella asiatica. Siriraj Med J, 59: 122-124. Sturrock RR. 1976. Changes in the total number of neuroglia, mitotic cells and necrotic cells in the anterior limb of the mouse anterior commnissure following hypoxic stress. J. Anat. 122( 2):447-453. Suaskara IBM, Kusumorini N, Nurhidayat. 2007. Pertumbuhan dan aktivitas anak tikus pada pemaparan Cahaya yang berbeda. http://ejournal.unud.ac.id/ abstrak/naskah%20i%20b%20suaskara%20tikus%20_3_%20rtf.pdf. Subban R, Veerakumar A, Manimaran R, Hashim KM, Balachandran I. 2008. Two new flavonoids from Centella asiatica (Linn.). J Nat Med. 62: 369– 373. Sunarni T, Pramono S, Asmah R. 2007. Flavonoid antioksidan penangkap radikal dari daun kepel (Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook f. & Th.). Majalah Farmasi Indonesia, 18(3):111-116. Suwantong O, Ruktanonchai U, Supaphol P. 2008. Electrospun cellulose acetate fiber mats containing asiaticoside or Centella asiatica crude extract and the release characteristics of asiaticoside. Polymer, 49: 4239–4247. Taemchuay D, Rukkwamsuk T, Sukpuaram T, Ruangwises N. 2008. A study on antibacterial activity of crude extracts of Asiatic Pennywort and Water Pennywort against Staphylococcus aureus. 34th Congress on Science and Technology of Thailand. Temjenmongla, Arun KY. 2005. Anticestodal efficacy of folklore medicinal plants of Naga tribes in North-East India. Afr. J. Trad. CAM, 2 (2): 129 – 133. Teratanavat R, Hooker NH. 2006. Consumer valuations and preference heterogeneity for a novel functional food. Journal of Food Science, 71(7): S533–S541. Thongnopnua P. 2008. High-performance liquid chromatographic determination of asiatic acid in human plasma. Thai J. Pharm. Sci. 32: 10-16. Tulving E, Markowitsch HJ. 1998. Episodic and Declarative Memory: Role of the hippocampus. Hippocampus, 8:198–204. Veerendra KMH, Gupta YK. 2002. Effect of different extracts of Centella asiatica on cognition and markers of oxidative stress in rats. J. Ethnopharmacol. 79: 253–260. Wang XS, Duan JY, Fang JN. 2004. Structural features of a polysaccharide from Centella asiatica. Chinese Chemical Letters, 15 (2): 187 – 190. Wang XS, Liu L, Fang JN. 2005. Immunological activities and structure of pectin from Centella asiatica. Carbohydrate Polymers, 60 : 95–101. Wattanathorn et al. 2008. Positive modulation of cognition and mood in the healthy elderly volunteer following the administration of Centella asiatica. Journal of Ethnopharmacology, 116: 325–332. Widowati L, Pudjiastuti D, Idrari, Sundari D. 1992. Beberapa informasi khasiat keamanan dan fitokimia tanaman pegagan (Centella asiatica L. Urban). Warta Tumbuhan Obat Indonesia. 1 (2): 39-42. Wildman REC, Kelley M. 2007. Nutraceuticals and Functional Foods. Handbook of nutraceuticals and functional foods. 2nd ed. Edited by Robert E.C. Wildman. CRC Press-Boca Raton London New York. 1-21. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia. Witter MP. 2007. CA3 and Memory/Review: Intrinsic and extrinsic wiring of CA3: Indications for connectional heterogeneity. Learn. Mem. 14: 705-713. Yoshida et al. 2005. Antiproliferative constituents from umbelliferae plants VII. Active triterpenes and rosmarinic acid from Centella asiatica. Biol. Pharm. Bull. 28(1) 173—175. Zaidel DW. 1999. Quantitative morphology of human hippocampus early neuron development. The Anatomical Record, 254:87–91. Zainol MK, Abd-Hamid A, Yusof S, Muse R. 2003. Antioxidative activity and total phenolic compounds of leaf, root and petiole of four accessions of Centella asiatica (L.) Urban. Food Chemistry, 81: 575–581. Zainol NA, Voo SC, Sarmidi MR, Aziz RA. 2008. Profiling of Centella asiatica (L.) Urban Extract. The Malaysian Journal of Analytical Sciences, 12 (2): 322 -327. Zhang et al. 2009. Chemical fingerprinting and hierarchical clustering analysis of Centella asiatica from different locations in China. Chromatographia, 69 (1/2): 51–57. LAMPIRAN Lampiran 1 Data bobot badan (gr) kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan Tanggal Penimbangan 9-10-10 No Tikus 1 2 3 4 Kontrol 273 293 281 243 Level 1 278 283 253 266 Level 2 304 240 299 322 Level 3 243 266 295 268 11-10-10 1 2 3 4 259 275 268 234 276 281 239 260 299 236 289 321 246 264 310 276 13-10-10 1 2 3 4 248 263 257 224 263 266 230 245 286 227 278 310 236 257 292 266 15-10-10 1 2 3 4 255 277 270 237 299 298 259 278 318 248 307 346 255 283 327 292 17-10-10 1 2 3 4 266 289 279 247 307 309 266 282 331 258 319 356 257 294 328 302 19-10-10 1 2 3 4 277 303 305 262 318 316 275 294 341 263 324 368 264 302 335 308 21-10-10 1 2 3 4 276 304 292 255 322 324 280 295 339 269 328 372 270 307 342 318 23-10-10 1 2 3 4 289 310 266 309 321 332 282 291 349 274 332 377 277 314 348 324 25-10-10 1 2 3 4 295 321 317 276 328 336 286 299 365 287 339 387 283 319 351 329 Tanggal Penimbangan 27-10-10 No Tikus 1 2 3 4 Kontrol 304 328 313 278 Level 1 333 342 291 304 Level 2 362 288 344 393 Level 3 282 329 356 342 29-10-10 1 2 3 4 315 331 322 284 337 347 296 306 365 292 350 395 288 328 360 342 31-10-10 1 2 3 4 320 335 325 285 338 349 296 306 369 294 354 402 293 336 362 344 2-11-10 1 2 3 4 318 338 320 288 340 335 302 309 376 301 360 403 296 337 367 350 4-11-10 1 2 3 4 323 345 327 290 341 303 328 312 378 303 355 406 293 335 362 354 6-11-10 1 2 3 4 322 334 327 293 340 301 321 309 378 305 360 411 295 335 373 360 8-11-10 1 2 3 4 332 343 336 291 349 306 313 317 376 310 364 416 301 340 379 360 10-11-10 1 2 3 336 345 298 344 309 321 318 354 412 309 339 373 12-11-10 1 2 3 335 340 295 346 309 319 313 356 416 304 338 378 14-11-10 1 2 3 343 351 303 350 321 332 319 370 424 312 340 392 16-11-10 1 2 3 1 346 355 303 354 348 327 330 349 320 367 422 320 307 338 389 306 18-11-10 Tanggal Penimbangan No Tikus 2 3 Kontrol 353 302 Level 1 326 326 Level 2 367 421 Level 3 345 388 20-11-10 1 2 3 357 354 304 350 334 327 320 370 428 309 341 389 22-11-10 1 2 3 345 348 301 345 332 326 318 362 420 305 336 386 24-11-10 1 2 3 349 357 307 350 338 331 314 367 422 306 348 395 26-11-10 1 2 3 359 363 302 358 344 335 309 377 427 309 347 395 29-11-10 1 2 3 362 363 309 366 350 338 314 382 433 318 346 403 1-12-10 1 2 3 365 366 310 369 359 344 315 385 431 322 353 405 3-12-10 1 2 3 367 367 311 370 360 346 316 389 437 327 364 410 5-12-10 1 2 3 367 373 317 371 365 344 316 383 435 327 360 409 7-12-10 1 2 3 375 377 320 373 372 347 316 395 441 327 357 412 10-12-10 1 2 3 376 380 322 377 376 350 319 396 444 332 366 413 12-12-10 1 2 3 379 380 325 375 378 345 320 396 348 329 365 409 Lampiran 2 Data bobot badan (gr) kelompok tikus yang diberi ekstrak air daun pegagan Tanggal Penimbangan 22-2-11 No Tikus 1 2 3 4 5 Kontrol 179 182 158 134 184 Level 1 164 153 163 169 174 Level 2 167 176 146 159 148 Level 3 148 184 154 172 206 24-2-11 1 2 3 4 5 193 193 171 139 206 175 169 170 183 185 178 174 154 168 161 162 197 167 179 221 26-2-11 1 2 3 4 5 208 203 183 150 222 184 182 183 198 200 203 192 165 190 180 176 212 180 190 240 28-2-11 1 2 3 4 5 203 196 182 146 215 184 176 181 192 196 196 177 162 186 169 171 212 182 186 234 2-3-11 1 2 3 4 5 209 201 188 150 229 194 183 188 200 204 200 181 165 192 177 177 219 193 197 246 4-3-11 1 2 3 4 5 226 208 195 157 240 202 192 198 208 212 208 181 174 202 194 185 232 201 208 262 6-3-11 1 2 3 4 5 232 211 203 163 248 207 199 199 211 215 223 190 183 205 196 190 246 210 214 277 8-3-11 1 2 3 4 5 1 244 217 212 169 259 253 218 208 207 224 222 227 236 200 191 218 203 237 197 254 214 219 281 204 10-3-11 Tanggal Penimbangan No Tikus 2 3 4 5 Kontrol 234 222 176 278 Level 1 219 217 232 231 Level 2 203 202 226 218 Level 3 266 220 226 287 12-3-11 1 2 3 4 5 254 234 225 179 274 239 227 224 242 233 250 215 210 235 221 207 267 228 225 294 14-3-11 1 2 3 4 5 243 219 211 168 257 223 213 209 226 221 235 202 195 220 206 193 243 212 210 276 16-3-11 1 2 3 4 5 260 240 229 183 282 243 235 226 245 240 255 221 210 241 224 206 272 232 228 297 18-3-11 1 2 3 4 5 270 244 232 190 291 254 240 236 259 244 260 231 220 245 229 213 281 236 231 304 20-3-11 1 2 3 4 5 276 247 239 192 297 259 247 242 264 256 264 238 225 253 239 219 286 242 236 320 1 2 3 4 5 278 246 239 195 297 266 253 243 268 256 265 243 228 251 233 221 288 245 236 323 24-3-11 1 2 3 4 5 284 254 244 198 309 271 259 249 276 260 277 250 234 260 245 226 296 247 241 334 26-3-11 1 287 272 252 229 22-3-11 Tanggal Penimbangan No Tikus 2 3 4 Kontrol 256 246 200 Level 1 263 250 278 Level 2 236 262 237 Level 3 296 251 244 28-3-11 1 2 3 4 292 260 248 199 271 265 254 284 255 240 267 243 234 301 250 245 30-3-11 1 2 3 4 294 262 251 206 277 271 256 281 261 243 275 246 234 305 255 247 1-4-11 1 2 3 4 303 264 250 206 279 277 260 287 261 242 276 247 234 309 256 249 3-4-11 1 2 3 4 306 268 261 213 282 279 266 287 261 251 283 252 245 313 262 251 5-4-11 1 2 3 4 312 274 264 215 290 285 270 294 271 255 288 254 244 315 264 254 7-4-11 1 2 3 4 308 272 269 217 290 288 272 294 276 259 285 258 249 318 268 257 9-4-11 1 2 3 4 316 279 277 219 293 292 279 298 278 263 287 260 253 322 271 260 11-4-11 1 2 3 4 318 283 275 219 293 293 282 303 277 269 290 265 255 326 279 260 13-4-11 1 2 3 321 282 279 298 303 282 276 276 295 253 326 277 Tanggal Penimbangan No Tikus 4 Kontrol 224 Level 1 304 Level 2 272 Level 3 262 15-4-11 1 2 3 4 327 287 282 224 300 301 293 306 289 279 302 273 258 327 284 265 17-4-11 1 2 3 4 322 284 285 223 296 292 292 309 285 276 302 272 255 330 281 265 19-4-11 1 2 3 4 327 288 286 223 300 291 296 311 288 282 310 275 260 333 288 269 21-4-11 1 2 3 4 333 290 291 230 306 301 304 318 288 291 307 281 260 340 290 268 23-4-11 1 2 3 4 332 294 290 229 304 306 306 315 294 288 308 280 265 340 288 268 25-4-11 1 2 3 4 334 300 297 236 311 312 313 322 296 290 321 289 267 345 297 276 Lampiran 3 Data total konsumsi pakan (gr) dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan Tgl Pengukuran 16-10-10 17-10-10 18-10-10 19-10-10 20-10-10 21-10-10 22-10-10 23-10-10 24-10-10 25-10-10 26-10-10 27-10-10 28-10-10 29-10-10 30-10-10 31-10-10 1-11-10 2-11-10 3-11-10 4-11-10 5-11-10 6-11-10 7-11-10 8-11-10 9-11-10 10-11-10 11-11-10 12-11-10 13-11-10 14-11-10 15-11-10 16-11-10 17-11-10 18-11-10 19-11-10 20-11-10 21-11-10 22-11-10 23-11-10 24-11-10 25-11-10 26-11-10 27-11-10 28-11-10 Kontrol 104 108 108 115 115 113 113 101 93 97 91 80 79 88 75 74 70 64 68 84 81 68 60 83 99 48 58 56 58 58 56 60 65 62 56 56 102 70 67 70 67 67 93 40 Level 1 103 95 82 92 79 79 76 74 61 81 77 84 82 83 85 70 71 73 58 65 71 65 66 72 61 30 51 58 61 58 59 60 62 54 57 65 101 80 72 72 72 76 104 37 Level 2 84 100 79 94 77 91 90 69 73 96 92 94 97 90 85 80 81 90 81 90 88 85 70 92 79 40 59 66 69 66 66 65 57 60 60 61 112 83 68 68 69 65 98 49 Level 3 65 89 69 89 68 82 87 66 66 75 80 84 72 89 81 72 73 90 71 70 77 87 75 90 82 45 58 59 56 58 61 60 65 65 63 51 104 80 69 74 65 72 105 37 Tgl Pengukuran 29-11-10 30-11-10 1-12-10 2-12-10 3-12-10 4-12-10 5-12-10 6-12-10 7-12-10 8-12-10 9-12-10 10-12-10 11-12-10 12-12-10 13-12-10 Kontrol 60 64 104 59 57 64 65 64 71 73 108 65 69 66 68 Level 1 66 63 70 62 62 63 65 68 70 73 110 67 62 71 71 Level 2 62 65 64 66 64 60 63 67 72 73 116 65 57 69 80 Level 3 58 62 65 61 73 65 67 64 67 69 111 66 57 62 67 Lampiran 4 Data total konsumsi pakan (gr) dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak air daun pegagan Tgl Pengukuran 23-2-11 24-2-11 25-2-11 26-2-11 27-2-11 28-2-11 1-3-11 2-3-11 3-3-11 4-3-11 5-3-11 6-3-11 7-3-11 8-3-11 9-3-11 10-3-11 11-3-11 12-3-11 13-3-11 14-3-11 15-3-11 16-3-11 17-3-11 18-3-11 19-3-11 20-3-11 21-3-11 22-3-11 23-3-11 24-3-11 25-3-11 26-3-11 27-3-11 28-3-11 29-3-11 30-3-11 31-3-11 1-4-11 2-4-11 3-4-11 4-4-11 5-4-11 6-4-11 7-4-11 Kontrol 84 90 90 97 97 94 94 98 98 103 103 106 106 110 110 116 116 117 117 110 110 119 119 123 123 125 125 126 126 129 129 99 99 100 100 101 101 102 102 105 105 107 107 107 Level 1 82 88 88 95 95 93 93 97 97 101 101 103 103 108 108 113 113 117 117 109 109 119 119 123 123 127 127 129 129 132 132 106 106 107 107 109 109 110 110 111 111 114 114 114 Level 2 80 84 84 93 93 89 89 92 92 96 96 100 100 105 105 109 109 113 113 106 106 115 115 119 119 122 122 122 122 127 127 99 99 101 101 103 103 103 103 105 105 107 107 108 Level 3 86 93 93 100 100 99 99 103 103 109 109 114 114 117 117 120 120 122 122 113 113 124 124 127 127 130 130 131 131 134 134 102 102 103 103 104 104 105 105 107 107 108 108 109 Tgl Pengukuran 8-4-11 9-4-11 10-4-11 11-4-11 12-4-11 13-4-11 14-4-11 15-4-11 16-4-11 17-4-11 18-4-11 19-4-11 20-4-11 21-4-11 22-4-11 23-4-11 24-4-11 Kontrol 107 109 109 110 110 111 111 112 112 111 111 112 112 114 114 115 115 Level 1 114 116 116 117 117 119 119 120 120 119 119 120 120 123 123 123 123 Level 2 108 109 109 110 110 112 112 114 114 114 114 116 116 117 117 117 117 Level 3 109 111 111 112 112 112 112 113 113 113 113 115 115 116 116 116 116 Lampiran 5 Kelompok/ No Tikus Kontrol 1 2 3 4 Level 1 1 2 3 4 Level 2 1 2 3 4 Level 3 1 2 3 4 Data skor aktivitas dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak etanol daun pegagan Titik pengamatan (4) (5) (6) (7) (1) (2) (3) (8) (9) (10) 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 2 1 2 2 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 2 4 3 2 2 4 2 1 3 4 3 1 1 4 2 1 1 4 1 1 1 4 2 2 2 4 4 3 1 4 2 1 2 3 4 3 4 1 2 4 4 2 4 4 4 1 2 4 4 1 3 4 4 1 2 4 4 1 2 4 4 1 4 4 4 4 4 4 4 1 3 4 4 4 4 4 4 2 2 2 2 3 3 4 2 4 1 3 3 4 2 4 4 4 4 4 3 4 2 4 3 4 4 4 4 4 4 4 3 4 4 4 4 4 4 4 Lampiran 6 Kelompok/ No Tikus Kontrol 1 2 3 4 5 Level 1 1 2 3 4 5 Level 2 1 2 3 4 5 Level 3 1 2 3 4 5 Data skor aktivitas dari masing-masing kelompok tikus yang diberi ekstrak air daun pegagan Titik pengamatan (4) (5) (6) (7) (1) (2) (3) (8) (9) (10) 2 1 2 1 3 2 1 1 1 1 4 4 1 2 4 3 3 4 2 4 4 3 2 1 1 4 2 4 3 4 4 1 4 2 4 4 2 4 2 4 4 4 3 2 4 4 2 4 2 4 1 1 1 1 2 1 1 1 3 1 4 4 2 3 4 2 2 2 2 4 4 1 2 2 4 3 3 2 2 4 3 2 2 2 4 2 2 4 2 4 2 1 2 3 4 3 4 4 1 4 2 2 1 1 3 1 1 1 2 1 4 4 4 1 4 4 4 4 2 4 4 4 4 2 4 4 4 4 2 3 4 4 4 2 4 4 4 3 2 4 4 4 4 3 4 4 4 4 1 2 4 1 1 1 1 4 1 1 1 1 3 2 4 1 4 3 2 3 2 4 3 3 4 1 4 4 4 3 1 4 4 1 4 1 4 4 2 3 1 4 3 4 4 1 4 2 1 3 1 4
Dokumen baru
Dokumen yang terkait

Effect of gotu kola (Centella asiatica (L.) U..

Gratis

Feedback